BRPI0718009B1

BRPI0718009B1 - suporte de ligação de afinidade, metodo para preparar o referido suporte, uso do mesmo, e ensaio de afinidade

Info

Publication number: BRPI0718009B1
Application number: BRPI0718009A
Authority: BR
Inventors: James L Sackrison; Joshua C Soldo
Original assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 2006-11-01
Filing date: 2007-11-01
Publication date: 2016-02-16
Also published as: WO2008057366A8; IL198490A0; BRPI0718009A2; AU2007317996A2; EP2069790B1; ES2537564T3; JP2010508513A; AU2007317996B9; WO2008057366A3; US20080176340A1; AU2007317996B2; US8518714B2; CN101529251A; CN101529251B; US20120077284A1; MX2009004354A; EP2069790A2; KR101457716B1; HK1129462A1; IL198490A

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "SUPORTE DE LIGAÇÃO DE AFINIDADE, MÉTODO PARA PREPARAR O REFERIDO SUPORTE, USO DO MESMO, E ENSAIO DE AFINIDADE".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica a prioridade do Pedido de Patente Provisório US 60/863.820, depositado em 1 de novembro de 2006.

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a suportes tendo superfícies de ligação que são não-saturadas ou não-saturadas e orientadas, incluindo suportes que têm superfícies de ligação compreendendo ligantes para uso em ensaios de afinidade. Aspectos particulares da invenção referem-se a superfícies de ligação compreendendo biotina, ou biotina e um fixador de ligante específico de biotina, tal como estreptavidina (SA). Superfícies de ligação para imunoensaios são proporcionadas, incluindo superfícies de ligação que compreendem antígenos ou anticorpos, ou fragmentos dos mesmos. Outras modalidades da presente invenção referem-se a superfícies de suporte sólidas bloqueadas e micropartículas dispersas. São descritos também métodos para fabricar e usar tais suportes.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Superfícies de ligação são usadas em uma ampla variedade de aplicações incluindo, por exemplo, ensaios de afinidade. Superfícies de ligação convencionais são tipicamente preparadas por maximização da quantidade de fixadores de ligante por área superficial unitária da superfície de suporte de fase sólida. Embora os resultados de abordagens convencionais em uma superfície de suporte com uma alta densidade de fixadores de ligante, a simples maximização do número de fixadores de ligante em uma superfície de suporte não aperfeiçoa invariavelmente o desempenho da superfície de ligação. Algumas superfícies de ligação convencionais usadas em ensaios de afinidade maximizam a capacidade de ligação por revestimento direto de um fixador de ligante tal como um anticorpo, ou um fixador de ligante específico de biotina tal como SA, sobre uma fase sólida e bloqueiam a fase sólida com albumina sérica bovina (BSA) ou ovalbumina. Embora isto maximize a capacidade de ligação de antígeno ou de biotina da superfície de ligação, os respectivos anticorpos ou fixadores de ligantes específicos de biotina ficam concentrados sobre a superfície de ligação sem orientação específica, e estratégias de bloqueio tradicionais não necessariamente impedem ou reduzem a retirada dos anticorpos ou fixadores de ligante específicos de biotina da superfície de ligação. Ainda, a retirada pode resultar em sensitividade fraca do ensaio (razão de subótima de sinal para ruído), acuidade, precisão, estabilidade, ou capacidade de fabricação, ou combinações das mesmas. Retirada de superfície de ligação e orientação aleatória pode reduzir a eficácia ou capacidade da superfície de ligação devido ao impedimento estérico. Por conseguinte, há uma necessidade por superfícies de ligações aperfeiçoadas e composições e métodos para fabricar as superfícies de ligação aperfeiçoadas que não se baseiem em simplesmente maximizar a densidade dos fixadores de ligante em uma superfície de ligação. SUMÁRIO DA INVENÇÃO São descritos superfícies de ligação não-saturadas ou não-saturadas e orientadas, métodos para fabricar superfícies de ligação não-saturadas ou não-saturadas e orientadas, e métodos para fabricar componentes de superfícies não-saturadas ou não-saturadas e orientadas. Também descritos são métodos e composições para superfícies de ligação não-saturadas ou não-saturadas e orientadas para ensaios de afinidade, tais como, por exemplo, imunoensaios.

Em um aspecto, a invenção proporciona métodos e composições para preparar uma porção de captura não-saturada ou não-saturada e orientada para um imunoensaio, em que a porção de captura é não-saturada ou não-saturada e orientada em virtude da ligação a uma superfície de ligação não-saturada ou não-saturada e orientada. Em uma modalidade específica, a porção de captura compreende uma imunoglobulina ou fragmento da mesma, em que a porção de captura é imobilizada sobre a superfície de ligação não-saturada ou não-saturada e orientada por associação com um ligante imobilizado em um acoplador de suporte, em que o acoplador de suporte é imobilizado sobre um suporte de fase sólida. Em uma modalidade específica, a imunoglobulina ou fragmento da mesma é biotinilada, a imuno- globulina biotinilada ou fragmento da mesma é associado a um fixador de ligante específico de biotina (porção de ligação de biotina), e o fixador de ligante específico de biotina é associado à biotina anexada ao suporte diretamente ou através de um acoplador de suporte. Em uma modalidade específica, o acoplador de suporte compreende uma proteína, e o suporte de fase sólida compreende uma micropartícula.

Em um outro aspecto, a invenção proporciona um método para realizar um imunoensaio usando um suporte que tem uma superfície de ligação não-saturada ou não-saturada e orientada, em que o método compreende empregar uma imunoglobulina ou um fragmento da mesma para um ana-lito, em que a imunoglobulina ou fragmento da mesma é uma superfície de ligação não-saturada ou não-saturada e orientada. Em várias modalidades, a natureza não-saturada ou não-saturada e orientada da imunoglobulina ou fragmento da mesma é determinada pela natureza não-saturada ou não-saturada e orientada da superfície de ligação com a qual a imunoglobulina ou fragmento da mesma é ligado.

Em um outro aspecto, a invenção proporciona um suporte tendo uma superfície de ligação não-saturada ou não-saturada e orientada, compreendendo ligantes acoplados ao suporte, tanto diretamente como indiretamente, via acoplagem a um acoplador de suporte, que é acoplado ao suporte, em que os ligantes estão presentes em uma densidade de cerca de 1,0 x 10'3 a cerca de 5,0 x 10'1 micromols de ligante por metro quadrado de suporte, ou cerca de 0,5 x 10‘2 a cerca de 2,0 x 10'1 micromols de ligante por metro quadrado de suporte, ou cerca de 1,0 x 10'2 a cerca de 1,6 x 10‘1 micromols de ligante por metro quadrado de suporte, ou cerca de 1,0 x 10'2 a cerca de 2,0 x 10'1 micromols de ligante por metro quadrado de suporte, ou alternativamente os ligantes estão presentes em uma densidade de cerca de 0,5 x 10'4 a cerca de 10 x 10"4 micromols de ligante por miligrama (mg) de micropartículas, ou cerca de 1,0 x 10‘4 a cerca de 5,5 x 10'4 micromols de ligante por miligrama de micropartículas. Em várias modalidades, os acopla-dores de suporte estão presentes no suporte de ensaio em uma densidade de cerca de 1,2 x 10"2 micromols de ligante por metro quadrado a cerca de 7,5 micromols de ligante por metro quadrado do suporte de ensaio. Em várias modalidades, os ligantes estão associados aos fixadores de ligante, em que os fixadores de ligante estão presentes em uma densidade de menos que cerca de 0,4 x 10'2 a menos que cerca de 8 x 10'2 micromols de fixador de ligante por metro quadrado de suporte, ou em uma densidade de cerca de 1,0 x 1CT2 a cerca de 5,0 x 10'2 micromols por metro quadrado do suporte de ensaio.

As modalidades da presente invenção são direcionadas para terem uma porção de captura presente no suporte de ensaio em uma densidade de cerca de 1,0 x 10'4 micromols por metro quadrado a cerca de 2,0 x 10'2 micromols por metro quadrado do suporte de ensaio. Em várias modalidades, a superfície de ligação compreende ainda uma porção de captura, em que a porção de captura está presente em uma densidade menor que cerca de 2 x 103 a menos que cerca de 4 x 10'2 micromols de porção de captura por metro quadrado de suporte. Em uma modalidade específica, o ligante (por exemplo, biotina) está presente em uma densidade de cerca de 1,9 x 10'2 a cerca de 1,6 x 10'1 micromols de ligante por metro quadrado de suporte, o fixador de ligante (por exemplo, uma porção de ligação de biotina tal como SA) está presente em cerca de 1,0 x 10'2 a cerca de 5,0 x 10'2 micromols por metro quadrado do suporte de ensaio, ou cerca de 1,2 x 10'2 a menos que cerca de 4,6 x 10‘2 micromols de fixador de ligante por metro quadrado de suporte, e a porção de captura (por exemplo, uma porção de captura biotinilada tal como anticorpo específico de analito biotinilado) está presente em uma densidade de cerca de 2,5 x 10‘3 a cerca de 1,4 x 10'2 de porção de captura por metro quadrado de suporte. Em pelo menos uma modalidade da presente invenção, o acoplador de suporte é opcional. Em tal modalidade, o ligante poderia ser biotina ou um derivado do mesmo.

Em uma modalidade específica, o ligante compreende biotina ou um derivado da mesma. Em uma outra modalidade específica, o fixador de ligante compreende uma porção de fixador de ligante, ou um fragmento da mesma, tais como, por exemplo, avidina, SA, neutravidina, um fragmento de SA, um fragmento de avidina, um fragmento de neutravidina, ou mistura dos mesmos. Em várias modalidades, a porção de captura compreende um ou mais de um anticorpo, um fragmento de ligação de um anticorpo, um receptor, um ligante de um receptor, um hormônio, um receptor de um hormônio, uma enzima, um substrato de uma enzima, um oligonucleotídeo de fita simples, um polinucleotídeo de fita simples, um oligonucleotídeo de fita dupla, um polinucleotídeo de fita dupla, um antígeno, um peptídeo, ou uma proteína. Em várias modalidades, os ligantes são acoplados ao suporte através de acopladores de suporte, e os acopladores de suporte estão, por sua vez, acoplados ao suporte. Em uma modalidade específica, os acopladores de suporte compreendem proteína. Em uma modalidade específica, a proteína é BSA, ovalbumina, um fragmento de BSA, um fragmento de ovalbumina, ou misturas dos mesmos. Em uma modalidade específica, o suporte é uma mi-cropartícula. Em uma modalidade específica, a superfície de ligação tem cerca de 1 x 10'2 a cerca de 5 x 10'1 micromols de ligante por metro quadrado de suporte, ou alternativamente, a superfície tem cerca de 2 x 10'2 a cerca de 2 x 10"1 micromols de ligante por metro quadrado de suporte. Em uma outra modalidade específica, a superfície de ligação tem cerca de 1,9 x 10'2 a cerca de 1,6 x 10'1 micromols de ligante por metro quadrado de suporte. Em uma outra modalidade específica, a superfície de ligação tem cerca de 1,6 x 10'2 a cerca de 6,6 x 10'2 micromols de ligante por metro quadrado de suporte. Em uma outra modalidade específica, a superfície de ligação tem cerca de 1,6 x 10'2 a cerca de 3,2 x 10'2 micromols de ligante por metro quadrado de suporte. Em uma outra modalidade específica, a superfície de ligação tem cerca de 1,6 x 10'2 a cerca de 2,0 x 10"1 micromols de ligante por metro quadrado de suporte.

Em várias modalidades, a superfície de ligação compreende um fixador de ligante anexado ao ligante e uma porção de captura anexada ao fixador de ligante, em que a porção de captura está presente em uma densidade, em várias modalidades, de cerca de 75% da densidade do ligantes, de cerca de 50% da densidade do ligante, e de cerca de 25% da densidade do ligante.

Em uma modalidade específica, o ligante compreende biotina, a biotina é acoplada ao suporte através de um acoplador de uma proteína de acoplador de suporte selecionada de BSA, ovalbumina, um fragmento de ovalbumina, ou misturas dos mesmos, a biotina é anexada ao fixador de li-gante compreendendo uma porção de ligação de biotina selecionada de avi-dina, SA, neutravidina, um fragmento de SA, um fragmento de avidina, um fragmento de neutravidina, ou misturas dos mesmos, e a porção de ligação de biotina é anexada a uma porção de captura biotinilada, em que a porção de captura é selecionada do grupo que consiste em um ou mais de um anticorpo, um fragmento de ligação de um anticorpo, um receptor, um ligante de um receptor, um hormônio, um receptor de hormônio, uma enzima, um substrato de uma enzima, um oligonucleotídeo de fita simples, um oligonucleotí-deo de fita dupla, um polinucleotídeo de fita simples, um polinucleotídeo de fita dupla, um antígeno, um peptídeo, ou uma proteína.

Em um outro aspecto, a invenção proporciona um suporte que tem uma superfície de ligação não-saturada e orientada, compreendendo: uma pluralidade de acopladores de suporte dispostos sobre o suporte; e li-gantes acoplados aos acopladores de suporte; em que os ligantes são não-saturados e são orientados sobre a superfície de um modo que proporcionam ligantes estericamente acessíveis. Em uma modalidade específica, os ligantes são associados aos fixadores de ligante bi ou multivalentes capazes de se associarem especificamente aos ligantes, e a superfície de ligação é substancialmente isenta de ligante livre, não ligado.

Em várias modalidades, os acopladores de suporte são acoplados a cerca de 1,9 x 10'2 a cerca de 1,6 x 10'1 micromols de ligante por metro quadrado de suporte.

Os acopladores de suporte podem ser acoplados ao suporte a-través de associação covalente ou não-co va lente. Em várias modalidades, os acopladores de suporte são covalentemente acoplados ao suporte. Em modalidades nas quais os acopladores de suporte são covalentemente acoplados ao suporte, qualquer química de ligação adequada conhecida da técnica pode ser usada para anexar o acoplador de suporte ao suporte. Químicas de ligação adequadas incluem, mas sem-limitação, a ligação através de um ou mais grupos funcionais selecionados do grupo que consiste em car-boxila, hidroxila, tosila, epóxi, aldeído, amina, amida, hidrazida, isotiocianato, maleimida, e sulfidrila. Em uma modalidade específica, o acoplador de suporte é covalentemente ligado ao suporte usando química de tosila para ligação.

Os acopladores de suporte podem compreender qualquer substância adequada que pode ser acoplada a um suporte e também a um ligan-te. O acoplamento ao suporte e o acoplamento ao ligante podem ser cova-lentes. Acopladores de suporte adequados incluem, mas sem-limitação, ma-cromoléculas, tais como, por exemplo, proteínas ou outros polímeros. Em várias modalidades, o acoplador de suporte compreende proteína. A proteína pode ser, por exemplo, um monômero, um dímero, um multímero, ou uma proteína de fusão. Em modalidades específicas, a proteína compreende pelo menos uma de albumina, tal como, por exemplo, BSA, ovalbumina, um fragmento de ovalbumina, ou misturas dos mesmos.

Em várias modalidades, os ligantes compreendem biotina. Rea-gentes de biotina adequados para anexar a biotina a uma superfície de suporte ou a um acoplador de suporte incluem reagentes marcadores de ami-na-biotina reativa tais como, por exemplo, sulfo-NHS-biotina, sulfo-NHS-LC-biotina, sulfo-NHS-LC-LC-biotina, sulfo-NHS-SS-biotina, NHS-PE04-biotina, NHS-biotina, NHS-LC-biotina, NHS-LC-LC-biotina, PFP-biotina, TFP-PEO-biotina, ou NHS-iminobiotina trifluoroacetamida, reagentes marcadores de sulfidril-biotina reativa tais como, por exemplo, maleimida-PECVbiotina, bio-tina-BMCC, PEO-iodoacetil biotina, iodoacetil-LC-biotina, ou biotina-HPDP, reagentes marcadores de carboxil-biotina reativa, tal como, por exemplo, biotina PEO-amina ou biotina PEO-LC-amina, reagentes marcadores de car-boidrato-biotina reativa tal como, por exemplo, biocitina hidrazida, biotina hidrazida, ou biotina-LC-hidrazida, ou agentes marcadores de biotina fotor-reativa tal como, por exemplo, psoraleno-PEO-biotina. Em uma modalidade específica, o ligante compreende biotina e é anexado ao suporte ou ao acoplador de suporte usando o reagente marcador de amina-biotina reativa sul-fo-NHS-LC-biotina.

Em modalidades nas quais os ligantes compreendem biotina, a superfície de ligação sobre o suporte pode compreender ainda um fixador de ligante associado à biotina. Em certas modalidades, o fixador de ligante compreende uma porção ligante de biotina. Em várias modalidades, a porção de ligação de biotina compreende proteína, por exemplo, pelo menos uma de uma proteína de ligação de biotina tais como avidina, SA, neutravi-dina, um fragmento de SA, um fragmento de avidina, um fragmento de neu-travidina, ou misturas dos mesmos. A porção de ligação de biotina poderia compreender também uma proteína de fusão, tal como, por exemplo, avidina fundida a uma proteína de ligação diferente.

Em várias modalidades, os acopladores de suporte compreendem uma proteína e o ligante compreende biotina, e a proteína é biotinilada em uma baixa razão de entrada de biotina, de modo que os acopladores de suporte têm uma razão de incorporação menor que ou igual a 5 rnols de biotina por mol de acoplador de suporte. Em uma modalidade específica, a proteína é BSA, ovalbumina, um fragmento de BSA, um fragmento de ovalbu-mina, ou misturas das mesmas.

Em várias modalidades, nas quais a superfície de ligação sobre o suporte compreende uma porção de ligação de biotina, a superfície de ligação sobre o suporte compreende ainda uma porção de captura biotinilada associada à porção de ligação de biotina. A porção de captura biotinilada pode compreende um espaçador, por exemplo, em que o espaçador está entre a porção de biotina e a porção de captura. A porção de captura biotinilada pode compreender qualquer porção de captura adequada de acordo com a substância a ser capturada. Porções de captura adequadas incluem pelo menos um de um anticorpo, um fragmento de ligação de um anticorpo, um receptor, um ligante de um receptor, um hormônio, um receptor de hormônio, uma enzima, um substrato de uma enzima, um oligonucleotídeo de fita simples, um oligonucleotídeo de fita dupla, um polinucleotídeo de fita simples, um polinucleotídeo de fita dupla, um antígeno, um peptídeo, ou uma proteína.

Em várias modalidades, a superfície de ligação sobre o suporte compreende ainda um copolímero em bloco que compreende um grupo de cabeça hidrofóbica flanqueado por pelo menos duas caudas hidrofílicas, em que a grupo de cabeça hidrofóbica contata o suporte. O comprimento das caudas hidrofílicas podem ser, cada uma, independentemente, de cerca de 2 a cerca de 2,5 vezes tão longa quanto o grupo de cabeça. O copolímero em bloco pode compreender uma estrutura de fórmula geral I, tendo um bloco de poli(óxido de propileno) e um bloco de poli(óxido de etileno), H0(C2H40)x(C3H60)y(C2H40)zH (I), em que x e y são selecionados de modo que o bloco de poli(óxido de propileno) se associa ao suporte. Em uma modalidade específica, x é cerca de 100 a cerca de 135, y é cerca de 40 a cerca de 75 e z é cerca de 100 a cerca de 135. Em outras modalidades, x é cerca de 110 a cerca de 125, y é cerca de 60 a cerca de 70, e z é cerca de 110 a cerca de 125. Em várias modalidades, o copolímero em bloco tem um peso molecular médio de cerca de 12.700 daltons (Da)-17.400 Da; ou um peso molecular médio de cerca de 9.000 a cerca de 18.000 Da. Em modalidades específicas, o copolímero em bloco tem um peso molecular médio de cerca de 9.840 Da a cerca de 14.600 Da. Em uma modalidade específica, o copolímero em bloco tem um peso molecular médio de cerca de 14.600 Da. Em uma outra modalidade específica, o copolímero em bloco tem um peso molecular médio de cerca de 12.600 Da.

Em várias modalidades, o suporte compreende um polímero ou copolímero orgânico. Em várias modalidades, o polímero ou copolímero orgânico é hidrofóbico. Tais polímeros adequados incluem, mas sem-limitação, poliestireno, poli(divinilbenzeno), copolímero de estireno-acilato, copolímero de estireno-butadieno, copolímero de estireno-divinilbenzeno, poli(estireno-oxietileno), poli(metacrilato de metila), poliuretano, poliglutaraldeído, polieti-leno imina, polivinilpirrolidona, Ν,Ν'-metileno bis-acrilamida, poliolefinas, po-lietileno, polipropileno, poli(cloreto de vinila), poliacrilonitrila, polissulfona, poli(éter sulfona), materiais pirolisados, copolímeros em bloco, e copolíme-ros dos acima, silicones, ou sílica. Em uma modalidade específica, o suporte compreende estireno e divinilbenzeno, e é revestido com uma camada de poliuretano.

Em várias modalidades, o uso de um polímero ou copolímero que é hidrofóbico resultará em um suporte com um ângulo de contato na água de mais que cerca de 60°. Em várias modalidades, usar um polímero ou copolímero que é hidrofóbico resultará em um suporte com um ângulo de contato com água de mais que cerca de 70°.

Em várias modalidades, o suporte compreende uma micropartí-cula. Em uma modalidade específica, a micropartícula compreende um material paramagnético ou superparamagnético, tal como, por exemplo, óxido de ferro ferromagnético Fe304 ou Fe203. Os termos "paramagnético" e "superparamagnético" referem-se a materiais que sofrem uma força em um gradiente de campo magnético, mas não se tornam permanentemente mag-netizados. Em uma modalidade específica, o suporte compreende ferro na forma da magemita, ou Fe203. Em várias modalidades, o diâmetro médio da partícula está na faixa de 100 nm a 22.900 nm. Em uma modalidade específica, o diâmetro médio da micropartícula está na faixa de cerca de 750 nm a cerca de 3.000 nm. Em uma outra modalidade específica, o diâmetro médio da micropartícula está na faixa de cerca de 950 nm a cerca de 1.150 nm.

Em um outro aspecto, é proporcionado um suporte modificado para um ensaio, compreendendo: um suporte que compreende um ou mais materiais selecionados do grupo que consiste em poliestireno, poli (divinilbenzeno), copolímero de estireno-acilato, copolímero de estireno-butadieno, copolímero de estireno-divinilbenzeno, poli(estireno-oxietileno), poli (metacri-lato de metila), poliuretano, poliglutaraldeído, polietileno imina, polivinilpirroli-dona, Ν,Ν'-metileno bis-acrilamida, poliolefinas, polietileno, polipropileno, poli(cloreto de vinila), poliacrilonitrila, polissulfona, poli(éter sulfona), materiais pirolisados, copolímeros em bloco, e copolímeros do acima, silicones, ou sílica; uma proteína anexada ao suporte, em que a proteína compreende uma biotina, em que são menos que 5 rnols de biotina acoplada por mol de proteína; uma porção de ligação de biotina associada à biotina, em que a porção de ligação de biotina é pelo menos bivalente; uma porção de captura biotinilada associada à porção de ligação de biotina, em que a porção de captura biotinilada é selecionada do grupo que consiste em pelo menos um de um anticorpo, um fragmento de ligação de um anticorpo, um receptor, um ligante de um receptor, um hormônio, um receptor de hormônio, uma enzima, um substrato de uma enzima, um oligonucleotídeo de fita, simples, um oligonucleotídeo de fita dupla, um polinucleotídeo de fita simples, um polinu-cleotídeo de fita dupla, um antígeno, um peptídeo, ou uma proteína; um co-polímero em bloco que contata o suporte, em que o copolímero em bloco compreende um grupo de cabeça de poli(óxido de propileno) flanqueado por caudas de poli(óxido de etileno), em que o grupo de cabeça de poli(óxido de propileno) contata o suporte, e em que as caudas de poli(óxido de etileno) são, independentemente, cerca de 2 a cerca de 2,5 vezes tão longas quanto o grupo de cabeça de poli(óxido de propileno), e em que o peso molecular médio do copolímero em bloco é de cerca de 9.840 Da a cerca de 17.400 Da. O suporte modificado pode compreender uma micropartícula. Em uma modalidade específica, a micropartícula compreende um material paramag-nético ou superparamagnético tal como Fe2C>3, e o diâmetro médio da micropartícula está na faixa de 950 nm a 1.150 nm. Em uma modalidade específica, a porção de captura biotinilada compreende uma imunoglobulina ou fragmento da mesma.

Em um outro aspecto, é descrito um método para revestir um suporte, que compreende: combinar ligantes e acopladores de suporte em uma razão de entrada de ligantes para acopladores de suporte selecionada para resultar em uma mistura de complexos de ligante::acoplador de suporte em que os complexos de ligante::acoplador de suporte são pelo menos substancialmente isentos de ligante livre; e anexar covalentemente os complexos de ligante::acoplador de suporte a um suporte. Em uma modalidade específica, a razão de entrada de ligante para acopladores de suporte é menor que ou igual a 8 rnols de ligante:1 mol de acoplador de suporte. Alternativamente, a razão de entrada de ligantes para acopladores de suporte é menor que ou igual a 4 rnols de ligante:1 mol de acoplador de suporte.

Em uma modalidade específica, os ligantes do método compre- endem biotina, em que o ligante compreende um reagente marcador de a-mina-biotina reativa tal como sulfo-NHS-LC-biotina.

Em várias modalidades, os acopladores de suporte compreendem uma proteína e o ligante compreende biotina, e a proteína é biotinilada em uma razão de entrada baixa de biotina, de modo que os acopladores de suporte tenham uma razão de incorporação de menos que 5 rnols de biotina por mol de acoplador de suporte. Em uma modalidade específica, a proteína é BSA, ovalbumina, um fragmento de BSA, um fragmento de ovalbumina, ou misturas dos mesmos.

Em um outro aspecto, é descrito um método para revestir micro-partículas, compreendendo: expor as micropartículas a um dispersante para formar uma dispersão, em que as micropartículas compreendem superfícies de ligação que contêm ligantes e acopladores de suporte que são acoplados para produzir complexos de ligante::acoplador de suporte e o dispersante compreende um copolímero em bloco tendo um grupo de cabeça hidrofóbica flanqueado por grupos de cauda hidrofílica; e expor a dispersão a fixadores de ligante que se associam aos ligantes dos complexos de ligante::acoplador de suporte.

Em uma modalidade específica do método para revestimento, o ligante compreende biotina, e é acoplado ao suporte ou ao acoplador de suporte com um reagente marcador de amina-biotina reativa, tal como sulfo-NHS-LC-biotina. Em várias modalidades, os acopladores de suporte compreendem proteína, conforme descrição acima para suportes que têm uma superfície de ligação não-saturada ou não-saturada e orientada. Em uma modalidade específica, a proteína compreende BSA, ovalbumina, um fragmento de BSA, um fragmento de ovalbumina, ou misturas dos mesmos.

Em várias modalidades do método de revestimento, o fixador de ligante compreende uma porção de ligação de biotina. Em uma modalidade específica, a porção de ligação de biotina é pelo menos bivalente e compreende pelo menos uma de avidina, SA, neutravidina, um fragmento de SA, um fragmento de avidina, um fragmento de neutravidina, ou misturas dos mesmos.

Em várias modalidades, o método de revestimento compreende ainda associar uma porção de captura biotinilada à porção de ligação de bio-tina. Em uma modalidade específica do método de revestimento, a porção de captura biotinilada compreende pelo menos um de um anticorpo, um fragmento de ligação de um anticorpo, um receptor, um ligante de um receptor, um hormônio, um receptor de hormônio, uma enzima, um substrato de uma enzima, um oligonucleotídeo de fita simples, um oligonucleotídeo de fita dupla, um polinucleotídeo de fita simples, um polinucleotídeo de fita dupla, um antígeno, um peptídeo, ou uma proteína. Em uma modalidade específica, a porção de captura biotinilada compreende um espaçador.

Em um outro aspecto, é proporcionado um método para fabricar uma superfície de ligação não-saturada ou não-saturada e orientada sobre um suporte, que compreende: preparar uma mistura de porções que se associam ao analito com porções preenchendo espaço, para formar uma mistura diluída; e expor a mistura a um suporte de ensaio sob condições suficientes para associar às porções ao analito e porção de preenchimento de espaço para acoplagem com o suporte e formar uma superfície de ligação não-saturada ou não-saturada e orientada que é não-saturada com respeito ao número de porções que se associa ao analito que são acopladas com a superfície de suporte. Como usada aqui, uma porção que se associa ao analito pode ser qualquer molécula, tal como uma proteína, um anticorpo, ou ácido nucleico, que quando ligado a uma superfície de suporte se associará, ou diretamente ou indiretamente, através de uma molécula de ligação, com um analito de interesse; isto é, ela formará parte da superfície de ligação. Como usada aqui, uma porção de preenchimento de espaço é qualquer molécula, tal como uma proteína, anticorpo, ou ácido, que se acoplarão com uma superfície de suporte, mas não se associarão, ou diretamente, ou indiretamente, através de uma molécula de ligação, com um analito de interesse. A porção de preenchimento de espaço não formará parte da superfície de ligação, com um analito de interesse. A porção de preenchimento de espaço não formará parte da superfície de ligação, mas funcionará para ocupar espaço sobre a superfície de suporte e impedir a ligação de excesso de por- ções que se associam ao analito.

Em um outro aspecto, é proporcionado um método para fabricar uma superfície de ligação não-saturada ou não-saturada e orientada sobre um suporte, que compreende: diluir uma mistura de complexos de ligan-te::acoplador de suporte com acoplador de suporte que carece de ligantes, para formar uma mistura diluída; e expor a mistura diluída a um suporte sob condições suficientes para que o complexos de ligante::suporte se acoplem ao suporte e formem uma superfície de ligação não-saturada ou não-saturada e orientada.

Em várias modalidades do método para fabricar um superfície não-saturada ou não-saturada e orientada sobre um suporte, em que o suporte compreende uma micropartícula, a superfície de ligação não-saturada tem cerca de 0,5 x 10'4 a cerca de 10 x 10'4 micromols de ligante por miligrama (mg) de micropartículas, cerca de 1,0 x 1CT4 a cerca de 5,5 x 10'4 mi-cropartículas de ligante por miligrama de micropartículas, ou cerca de 2 x 10' 4 a cerca de 4 x 10'4 micromols de ligante por miligrama de micropartículas. Em modalidades específicas do método para preparar um superfície de ligação não-saturada ou não-saturada e orientada sobre uma superfície sobre um suporte, em que o suporte compreende uma micropartícula, a superfície não-saturada ou não-saturada e orientada tem cerca de 1,0 x 10'4 a cerca de 5.5 x 10'4 micromols de ligante por miligrama de micropartículas, ou cerca de 1.6 x 10'4 a cerca de 4,9 x 10'4 micromols de ligante por miligrama de micropartículas.

Em modalidades específicas do método para fabricar uma superfície não-saturada ou não-saturada e orientada sobre um suporte, o suporte é áspero e a superfície não-saturada ou não-saturada e orientada tem cerca de 1,0 x 10'2 a cerca de 2,0 x 10'1 micromols de ligante por metro quadrado. Alternativa, a superfície de ligação tem cerca de 1,9 x 10'2 a cerca de 6.6 x 10'2 micromols de ligantes por metro quadrado. Em outras modalidades específicas do método para fabricar uma superfície não-saturada ou não-saturada e orientada sobre um suporte, o suporte é liso e a superfície de ligação não-saturada ou não-saturada e orientada tem cerca de 3,3 x 10'2 a cerca de 1,6 x 10'1 micromols de ligante por metro quadrado. Em outras modalidades específicas do método para fabricar uma superfície de ligação não-saturada ou não-saturada e orientada sobre um suporte, a superfície de ligação não-saturada ou não-saturada e orientada, áspera, tem cerca de 1,9 x 10'2 a cerca de 6,6 x 10'2 micromols de acoplador de suporte por metro quadrado, e a superfície de ligação não-saturada ou não-saturada e orientada, lisa, tem cerca de 2,7 x 10'2 a cerca_de 7,1 x 10'2 micromols de acoplador de suporte por metro quadrado. O termo "áspero" inclui uma/norfologia similar à da couve-flor ou porosa. O termo "liso" refere-se a uma morfologia substancialmente lisa, e substancialmente esférica. Para micropartículas como o mesmo diâmetro, a superfície de suporte "áspera" terá uma área de superfície de suporte maior que a superfície de suporte "lisa" devido à área superfície de suporte aumentada fornecida pelas ranhuras, furos, ou poros da superfície de suporte áspera. Os micromols reais do acoplador de suporte, ligante, fixador de ligante, porção de captura etc, se enquadrarão em qualquer ponto entre as áreas de superfície de suporte ásperas e lisas, calculadas, já que nem toda a área de superfície estará estericamente disponível para fixação do ligante, ou do acoplador de suporte.

Em várias modalidades do método para fabricar uma superfície de ligação não-saturada ou não-saturada e orientada sobre um suporte, o acoplador de suporte compreende proteína, conforme descrição acima para o suporte que tem uma superfície de ligação não-saturada ou não-saturada e orientada. Em uma modalidade específica, um fragmento de BSA, um fragmento de ovalbumina, ou misturas dos mesmos.

Em um outro aspecto, é proporcionado um método para fabricar uma superfície de ligação não-saturada ou não-saturada e orientada sobre um suporte, que compreende: preparar uma mistura de complexos de ligan-te::acoplador de suporte com acoplador de suporte em qualquer razão de entrada de ligante para acoplador de suporte; diluir a mistura de complexos de ligante::acoplador de suporte com o acoplador de suporte que não está complexado com ligante para formar uma mistura diluída; e expor a mistura diluída a um suporte sob condições suficientes para que os complexos de ligante::acoplador de ligante e o acoplador de suporte se acoplem ao suporte, formando uma superfície de ligação não-saturada ou não-saturada e orientada. O suporte compreendendo o ligante pode ser então tratado de acordo com qualquer método adequado descrito aqui. O acoplador de suporte pode compreender um ou mais de uma proteína ou polímero de não proteína. Em várias modalidades, o ligante é complexado ao acoplador de suporte através de grupos funcionais sobre o acoplador de suporte. Uma porção do número de grupos funcionais sobre um ou mais acopladores de suporte pode ser eliminado ou neutralizado antes de expor o acoplador de suporte ao ligante, reduzindo, do mesmo modo, o número de ligante que pode complexar com acoplador de suporte. Todos ou somente alguns dos acopladores de suporte expostos ao ligante na preparação da mistura de complexos de ligante::acoplador de suporte podem ter um ou mais grupos funcionais neutralizados.

Em um outro aspecto, a invenção proporciona uma superfície de ligação para um imunoensaio, em que a superfície de ligação compreende uma pluralidade de ligantes que são capazes de se ligarem a um fixador de ligante que pode ser ligar a uma porção de captura de interesse. Os ligantes da superfície de ligação são não-saturados ou não-saturados e orientados sobre um suporte, e os ligantes são ou (a) fixados diretamente ao suporte, ou (b) são fixados através de um acoplador de suporte e o acoplador de suporte é fixado ao suporte. Em várias modalidades, a superfície de ligação é substancialmente isenta de ligantes livres (isto é, não ligados). Em uma modalidade específica, o suporte compreende uma micropartícula, da ordem de cerca de um mícron a cerca de cinco micra de diâmetro, o ligante compreende biotina, e a biotina é complexada a um acoplador de suporte que compreende proteína. Em modalidades específicas, o ligante compreende biotina, o fixador de ligante compreende uma proteína de ligação de biotina, o acoplador de suporte compreende BSA, ovalbumina, um fragmento de BSA, um fragmento de ovalbumina, ou misturas dos mesmos, e a BSA, ovalbumina, fragmento de BSA, fragmento de ovalbumina, ou misturas dos mesmos são biotinilados por biotinilação de baixa razão de entrada. Em uma modali- dade específica, a proteína de ligação de biotina é SA, e um anticorpo bioti-nilado está presente sobre a superfície de ligação revestida com SA, em que o anticorpo biotinilado é selecionado de modo a capturar um analito de interesse em um imunoensaio, por exemplo, um imunoensaio competitivo ou um imunoensaio em sanduíche. A superfície de ligação sobre o suporte do imunoensaio pode ser feito usando-se qualquer método adequado descrito aqui.

Em um outro aspecto, um suporte tendo uma superfície de ligação não-saturada ou não-saturada e orientada é proporcionado, o qual compreende: uma pluralidade de acopladores de suporte dispostos sobre o suporte; e, ligantes acoplados com os acopladores de suporte; em que os acopladores de suporte estão presentes sobre o suporte em uma densidade de cerca de 1,6 x 10'2 a cerca de 7,1 x 10'2 micromols por metro quadrado do suporte. Em várias modalidades, o acoplador de suporte compreende uma proteína. Em uma modalidade específica, a proteína é BSA ovalbumina, um fragmento de BSA, um fragmento de ovalbumina, ou misturas dos mesmos. Em várias modalidades, o ligante compreende biotina. Em uma modalidade específica, a biotina está presente em uma densidade de cerca de 1,9 x 10'2 a cerca de 1,6 x 10'1 micromols de biotina por metro quadrado de suporte. Em várias modalidades, a superfície de ligação compreende um fixador de ligante capaz de se associar especificamente aos ligantes. Em várias modalidades, o fixador de ligante está presente em uma densidade de cerca de 1,2 x 10'2 a cerca de 4,6 x 10'2 micromoles de fixador de ligante por metro quadrado do suporte. Em várias modalidades, o ligado de ligante é avidina, SA, neutravidina, um fragmento de SA, um fragmento de avidina, um fragmento de neutravidina, ou misturas dos mesmos. Em várias modalidades, a superfície de ligação compreende ainda uma porção de captura capaz de se associar especificamente ao fixador de ligante. Em várias modalidades, a porção de captura está presente em uma densidade de cerca de 2,5 x 10'3 a cerca de 1,4 x 10'2 micromols de porção de captura por metro quadrado de suporte. Em uma modalidade específica, a porção de captura compreende uma imunoglobulina ou fragmento da mesma.

Em um outro aspecto, é proporcionado um suporte tendo uma superfície de ligação não-saturada ou não-saturada e orientada, que compreende: uma pluralidade de acopladores de suporte dispostos no suporte; e, ligantes acoplados aos acopladores de suporte; em que os acopladores de suporte estão presentes no suporte em uma densidade de cerca de 1,3 x 10'4 a cerca de 2,1 x 10'4 micromols do acoplador de suporte por mg do suporte. Em várias modalidades, o ligante compreende biotina. Em uma modalidade específica, a biotina está presente em uma densidade de cerca de 1,6 x 10'4 a cerca de 4,9 x 10'4 micromols de biotina por mg de suporte. Em várias modalidades, a superfície de ligação compreende um fixador de ligante capaz de se associar especificamente aos ligantes. Em várias modalidades, o fixador de ligante está presente em uma densidade de cerca de 1,0 x 10'4a cerca de 1,4 x 1CT4 micromols de fixador de ligante por mg do suporte. Em várias modalidades, o fixador de ligante é avidina, SA, neutravidina, um fragmento de SA, um fragmento de avidina, um fragmento de neutravidina, ou misturas dos mesmos. Em várias modalidades, a superfície de ligação compreende ainda uma porção de captura capaz de se associar especificamente ao fixador de ligante. Em várias modalidades, a porção de captura está presente em uma densidade de cerca de 2,1 x 10'5 a cerca de 4,1 x 10'5 micromols de porção de captura por mg de suporte. Em uma modalidade específica, a porção de captura compreende uma imunoglobulina biotinilada ou fragmento da mesma.

Em um outro aspecto, é proporcionada uma superfície de ligação sobre um suporte, em que a superfície de ligação liga especificamente não mais que 4,0 x 10'4 micromols de biotina por mg de suporte. Em uma modalidade específica, o suporte compreende micropartículas e liga especificamente cerca de 2,5 x 10'5 a não mais que cerca de 4,0 x 10'4 micromols de biotina por mg de micropartículas. Em uma modalidade específica, o suporte compreende micropartículas e especificamente liga cerca de 7,5 x 10'5 a cerca de 3,5 x 10'4 micromols de biotina por mg de micropartículas. Em uma outra modalidade específica, o suporte compreende micropartículas e liga especificamente cerca de 1,0 x 10'4 a cerca de 3,0 x 10"4 micromols de biotina por mg de micropartículas. Em várias modalidades, o suporte com- preende biotina ligada ao suporte (diretamente ou através de um acoplador de suporte) em associação com uma porção de ligação de biotina, tal como, por exemplo, SA, e as capacidades de ligação de biotina ditas acima referem-se à habilidade da porção de ligação de biotina (por exemplo, SA) de se ligar à biotina livre.

Em um outro aspecto, é proporcionada uma superfície de ligação, em que a superfície de ligação se liga a não mais que cerca de 1,3 x 10' 1 micromols de biotina por metro quadrado de suporte. Em uma modalidade específica, o suporte liga especificamente cerca de 3,0 x 10'3 a não mais que cerca de 1,3 x 10'1 micromols de biotina por metro quadrado de suporte. Em uma modalidade específica, o suporte liga especificamente cerca de 8,9 x 10'3 a cerca de 1,2 x 10'1 micromol de biotina por metro quadrado de suporte. Em uma modalidade específica, o suporte liga especificamente cerca de 1,2 x 10'2 a cerca de 9,9 x 10'2 micromols de biotina por metro quadrado de suporte. Em várias modalidades, o suporte compreende biotina ligada ao suporte (diretamente ou através de um acoplador de suporte) associada a uma porção de ligação de biotina, tal como, por exemplo, SA, e as capacidades de ligação de biotina ditas acima referem-se à habilidade da porção de ligação de biotina (por exemplo, SA) de se ligar à biotina livre. A menos que de outro modo estabelecido, ou implícito no relatório descritivo, quaisquer das modalidades descritas em conexão com qualquer método ou composição em particular descrita aqui podem ser usadas em combinação com quaisquer outras modalidades descritas aqui.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1A ilustra um processo para preparar uma SA não-saturada e orientada sobre uma superfície de ligação de micropartícula pa-ramagnética (PMP). A Figura 1B é uma continuação da ilustração do processo da Figura 1A. A Figura 2 ilustra uma modalidade da invenção que compreende uma superfície de suporte sólido; BSA ou ovalbumina covalentemente ligada à superfície de suporte; biotina covalentemente ligada à BSA ou à ovalbumi- na; estreptavidina, neutravidina ou avidina associada à biotina; e um anticorpo associado à estreptavidina, neutravidina, ou avidina. A Figura 3 ilustra algumas orientações possíveis da molécula de biotina sobre uma molécula de BSA em um método de biotinilação de baixa razão de entrada. A Figura 4 ilustra revestir uma fase sólida com uma BSA biotini-lada de baixa razão de entrada para preparar uma superfície de ligação não-saturada. A Figura 5 ilustra usar copolímeros em bloco como agentes blo-queadores para superfície de suporte de fase sólida. A Figura 6 ilustra usar copolímeros em bloco como agentes de dispersão para superfícies de ligação compreendendo biotina. A Figura 7 ilustra revestir uma superfície de ligação biotinilada, bloqueada com um copolímero em bloco, com SA. A Figura 8 ilustra aplicar várias porções de captura biotiniladas a uma superfície de ligação revestida com SA sobre uma superfície de suporte de fase sólida feita de acordo com a invenção. A Figura 9A ilustra uma superfície de ligação de micropartícula revestida com SA convencional ou padrão revestida com um anticorpo bioti-nilado ou fragmento Fab. A Figura 9B ilustra uma micropartícula revestida com SA não-saturada e orientada revestida com um anticorpo biotinilado ou fragmento Fab.

Figura 10, nos painéis A e B, ilustra a área de superfície ligável aumentada em associação ao uso de uma etapa de dispersão da invenção. A Figura 11 ilustra a análise de retirada da biotina de um suporte sólido de biotina-BSA revestido com SA depois de 3 dias a 4°C ou a 37°C. A Figura 12 mostra dados em formato de tabela para estudos de reprodutibilidade de do processo (manufaturabilidade) do Exemplo 5. A Figura 13 mostra os dados em formato de tabela para outros estudos de reprodutibilidade do processo (manufaturabilidade) do Exemplo 6.

Figura 14A mostra dados em formato de tabela para estudos de estabilidade intensificada do Exemplo 7. A Figura 14B é uma continuação da tabela da Figura 14A, mostrando os dados para estudos de estabilidade intensificada do Exemplo 7. A Figura 15A ilustra os resultados da análise de escamação. A Figura 15B é uma outra ilustração dos resultados da análise de retirada. A Figura 16A mostra dados em formato de tabela para cálculos de densidade da superfície de ligação, real, do Exemplo 11, para vários lotes de micropartículas preparadas de acordo com as modalidades da invenção. A Figura 16B mostra dados em formato de tabela para cálculos de densidade de superfície de ligação rela para micropartículas preparadas de acordo com as modalidades da invenção, derivadas de dados de micropartículas usando a suposição aproximada. A Figura 16C mostra outros dados em formato de tabela para cálculos da área de superfície de ligação assumindo uma superfície de suporte lisa, para vários lotes de micropartículas preparadas de acordo com as modalidades da invenção. A Figura 16D mostra dados na forma de tabela para cálculos de densidade de superfície de ligação, assumindo uma superfície de suporte lisa preparada de acordo com as modalidades da invenção, derivados dos dados de micropartículas. A Figura 17 é um quadro esquemático que ilustra a diferença entre uma superfície de ligação não-saturada da invenção e uma superfície de ligação não-saturada e orientada da invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA A presente invenção é baseada, pelo menos em parte, na percepção que desenhar superfícies de ligação: (a) por associar menos que uma quantidade saturante do ligante rende complexos contendo porção de captura que são esparsamente dispersos através da superfície de ligação do suporte em uma orientação espacial acessível, e, opcionalmente, (b) por posicionar o ligante em tandem e, sequencialmente, outras porções compo- nentes dos complexos contendo porção de captura, em uma orientação (física) estrutural linear ou quase linear, pode resultar em superfícies de ligação com qualidades mais desejáveis para condução de ensaios, tais como ensaios de afinidade (por exemplo, imunoensaios ou ensaios de ácido nuclei-cos), que desenhar superfície de ligação por simplesmente concentração da superfície de suporte por aumento da densidade de ligantes.

As abordagens convencionais para preparar as superfícies de ligação são tipicamente almejadas para maximização da quantidade de li-gante por área unitária do suporte sem considerar a acessibilidade e/ou orientação dos ligantes, resultando, frequentemente, em concentração dos ligantes sobre o suporte. Maximizar o ligante por área unitária sobre uma superfície de ligação pode levar à degradação do desempenho da superfície de ligação devida, pelo menos em parte, aos efeitos estéricos. A degradação do desempenho pode resultar também da retirada em excesso dos ligantes da superfície de ligação.

Como usado aqui, o termo "acoplado com", ou seus equivalentes gramaticais, significa uma ligação covalente ou não-covalente ou interação entre duas porções. O termo "acoplado com" não tem por objetivo cono-tar orientação ou direção do acoplamento.

Como usado aqui, o termo "proteína de fusão" engloba proteínas recombinantes (tais como proteínas quiméricas), proteínas híbridas, e proteínas derivadas sinteticamente. Seu uso é bem conhecido da técnica.

Superfícies de ligação não-saturadas ou não-saturadas e orientadas, de acordo com a invenção, incluem superfícies de ligação que são construídas por acoplar menos que uma quantidade saturante de ligante em um suporte (por exemplo, por fixação direta ao suporte ou por fixação a um acoplador de suporte que está fixado ao suporte). Uma superfície de ligação que é "não-saturada" com respeito ao ligante é uma superfície de ligação que tem uma densidade submáxima de ligante por área de superfície unitária do suporte, ou uma densidade submáxima do ligante por peso unitário do suporte. Em uma modalidade específica da presente invenção, os ligantes da superfície de ligação não-saturada são espacialmente orientados. Como usado aqui, o termo "espacialmente orientado", ou seus equivalentes gramaticais, refere-se às porções que são espalhadas sobre a distância ou área. Em outras palavras, as porções são orientadas ou espaçadas sobre a superfície do suporte de modo que elas não toquem substancialmente a vizinha mais próxima.

Uma densidade "submáxima" de ligante por área de superfície unitária de suporte refere-se a uma superfície de ligação que não está saturada com respeito ao número de ligantes que pode estar presente sobre a superfície de suporte. Por exemplo, uma superfície de suporte que está saturada com ligantes tem a percentagem máxima de ligante que pode ser colocada sobre uma superfície de suporte sob um dado conjunto de condições, representada por 100% (por exemplo, um dado complexo de ligante::acopla-dor de suporte, em que o acoplador de suporte está saturado com o ligante, e o complexo está disposto em sua densidade mais alta possível sobre um suporte sob condições que promovem ligação máxima do complexo de ligante: :acoplador de suporte ao suporte).

Superfícies de ligação não-saturadas ou não-saturadas e orientadas podem ser particularmente desejáveis para superfícies de ligação empregadas em imunoensaios. A maioria dos ensaios emprega uma superfície de ligação em um suporte. Em muitas das mesmas aplicações, o suporte é uma micropartícula ou uma placa de microtítulo, onde a porção, que captura o analito, por exemplo, um antígeno, é construída sobre outras moléculas para formar complexos contendo porção de captura que se ligam ao analito. Um exemplo não-limitativo disso é um imunoensaio que tem uma imunoglo-bulina imobilizada sobre uma micropartícula. A imunoglobulina pode ser i-mobilizada diretamente sobre o suporte, ou a imunoglobulina pode ser acoplada (por exemplo, covalentemente) a outras moléculas que são, sucessivamente, imobilizadas sobre o suporte. A preparação de uma superfície de ligação não-saturada é descrita aqui para ambas as situações. Exemplos detalhados são proporcionados para a situação onde uma imunoglobulina ou fragmento da mesma, não está diretamente ligado ao suporte, mas está, em vez disso, associado às outras porções que são fixadas ao suporte. O termo "acoplado" inclui (a) ligação covalente (por exemplo, através de uma ou mais ligações de carbono-carbono, ligações de carbono-nitrogênio, ligações de carbono-oxigênio etc, ou direta ou indiretamente), e (b) ligação não-covalente (ou indireta ou diretamente).

Entidades que são conhecidas por interagirem especificamente uma com a outra podem ser covalentemente acopladas. Um exemplo não-limitativo de entidades que são conhecidas por interagirem especificamente e que podem ser covalentemente acopladas é um antígeno e seu anticorpo específico, que podem ser feitos para ligação covalente através de, por e-xemplo, química de acoplamento.

Entidades que não interagem especificamente uma com a outra podem ser covalentemente acopladas. Um exemplo não-limitativo de entidades que não são conhecidas por interagirem especificamente uma com a outra e que podem ser covalentemente acopladas é SA e BSA, que podem ser feitas para ligação covalente, através, por exemplo, de química de acoplamento.

Exemplos de ligação não-covalente incluem afinidade, iônica, van der Waals (por exemplo, forças dipolo-dipolo ou de London), ponte de hidrogênio (por exemplo, entre duplexos de polinucleotídeos), e interações hidrofóbicas. Quando a associação é não-covalente, a associação entre as entidades é preferivelmente específica. Exemplos não-limitativos de associações não-covalentes incluem a interação de ligação entre a biotina e proteína de ligação de biotina, tal como avidina, SA, neutravidina, um fragmento de SA, um fragmento de avidina, um fragmento de neutravidina, ou misturas dos mesmos; a ligação de um Fab biotinilado, uma imunoglobulina biotinila-da ou fragmento da mesma, uma molécula pequena biotinilada (tal como, por exemplo, um hormônio ou um ligante de um receptor), um polinucleotí-deo biotinilado, uma macromolécula biotinilada (por exemplo, uma proteína ou um polímero natural ou sintético) a uma proteína de ligação de biotina tais como avidina, SA, neutravidina, um fragmento de SA, um fragmento de avidina, um fragmento de neutravidina, ou misturas dos mesmos; a ligação de um substrato a sua enzima; a ligação de uma glicoproteína a uma lectina específica para a glicoproteína; a ligação de um ligante a um receptor específico para o ligante; a ligação de um anticorpo a um antígeno contra o qual o anticorpo é produzido; e a formação duplex entre um polinucleotídeo e um polinucleotídeo complementar ou substancialmente complementar; etc.

Exemplos particulares são proporcionados para uma micropartí-cula tendo proteína biotinilada (complexo de ligante::acoplador de suporte) ligada à micropartícula, em que a proteína biotinilada é revestida com SA (porção de ligação de biotina), e a micropartícula revestida com SA-proteína biotinilada é então revestida com uma imunoglobulina biotinilada ou fragmento biotinilado da mesma (porção de captura biotinilada), que é usada para capturar um analito em uma ensaio, ou para se ligar a uma outra imunoglobulina ou fragmento da mesma, que é usado para capturar um analito em um imunoensaio (por exemplo, IgG biotinilado de Bode x Camundongo é usado para capturar um IgG de camundongo x Antígenol, que é usado para captura do Antígenol). A natureza não-saturada da proteína biotinilada sobre a superfície de suporte é refletida no revestimento de SA, que é também não-saturado em virtude da natureza não-saturada da biotina com a qual ela se associa, o que resulta em não saturação da imunoglobulina biotinilada (ou fragmento de imunoglobulina biotinilada) que captura o analito, ou não saturação da imunoglobulina biotinilada (ou fragmento de imunoglobulina biotinilada) que captura a imunoglobulina adicional ou fragmento que captura o analito.

Em várias modalidades da presente invenção, o ligante pode ser covalentemente ligado ao acoplador de suporte ou não-covalentemente ligado ao acoplador de suporte. Em uma modalidade específica, o ligante é covalentemente ligado ao acoplador de suporte e o fixador de ligante é pelo menos bivalente. Em uma outra modalidade específica, o ligante é biotina e é covalente ligado ao suporte e o fixador de ligante é uma pelo menos porção bivalente, tal como estreptavidina, avidina, ou neutravidina, um fragmento de estreptavidina, um fragmento de avidina, um fragmento de neutravidina, ou misturas dos mesmos. Em modalidades em que o fixador de ligante é pelo menos bivalente, acoplar covalentemente o ligante ao suporte pode re- sultar em uma superfície de ligação mais estável, na medida em que a retirada de excesso de ligante é reduzida ou abolida.

Em outras modalidades, acoplar covalentemente o ligante ao acoplador de suporte é opcional. Por exemplo, quando o ligante é um fragmento de anticorpo com um sítio de ligação simples, o ligante pode ser não-covalentemente acoplado ao acoplador de suporte.

Por conseguinte, a invenção compreende métodos e composições para fornecer uma quantidade não-saturada de uma porção de captura para um imunoensaio, em que a porção de captura é não-saturada em virtude de se ligar à superfície de suporte não-saturada. Em várias modalidades, a porção de captura pode ser usada para capturar outras porções de captura. Por exemplo, um suporte revestido com biotina-BSA (complexo de ligante: :acoplador de suporte), revestido com SA (fixador de ligante), que é revestido com IgG biotinilado de Bode x Camundongo pode ser ainda revestido com, por exemplo, um IgG de Camundongo x TSH, que pode ser então usado para capturar analito de TSH. A densidade dos componentes sobre uma superfície de suporte pode ser expressa em uma variedade de modos. Para suportes particulados, tais como, por exemplo, micropartículas, é conveniente discutir a densidade de um componente da superfície de ligação em termos do peso unitário da micropartícula, por exemplo, micromols do componente (por exemplo, ligan-tes, tal como biotina; fixadores de ligante, tal como SA; porções de captura, tal como IgG biotinilado específico de analito; etc) por mg micropartículas. Para suportes não particulados, tais como, por exemplo, placas de microtítu-lo, é conveniente discutir a densidade do componente em termos de área de superfície do suporte, tal como, por exemplo, micromols de fixador de ligante por metro quadrado. A densidade do componente em uma superfície de suporte pode ser expressa para um ligante (por exemplo, a biotina das micropartículas de biotina-BSA dos Exemplos, em termos de ligação de biotina) ou qualquer outro componente incorporado sobre a superfície de suporte (por exemplo, nas micropartículas de BSA-biotina dos Exemplos, em termos de SA ligada com a micropartícula, ou imunoglobulina biotinilada específica de analito ligada com a SA).

Devido à quantidade menos saturante do ligante que é acoplado com (direta ou indiretamente através de, por exemplo, uma proteína) o suporte, camadas sucessivas de fixadores de ligantes serão não-saturadas, e a densidade dos fixadores de ligante acima da camada do ligante fixado ao suporte compreenderá uma densidade sucessivamente menor (por exemplo, micromols sucessivamente menores por mg de micropartícula, ou micromols por metro quadrado). Assim, para o exemplo de uma micropartícula biotinila-da de acordo com a invenção, a densidade de SA na superfície de suporte será menor que a densidade do acoplador de suporte de BSA, que será menor que a densidade do ligante de biotina (estimada antes da adição de SA) na superfície de suporte.

Por conseguinte, em várias modalidades para um suporte parti-culado, tal como uma micropartícula de cerca de 1,0 mícron de diâmetro, ou para um suporte não particulado (por exemplo, uma placa de microtítulo), em que o acoplador de suporte é significantemente maior que o ligante (por e-xemplo, um acoplado de suporte de albumina tem um p.m. de cerca de 66.000 Da, e um ligante de biotina tem um p.m. de cerca de 244 Da), a densidade do fixador de ligante (por exemplo, SA) é de cerca de 10% a cerca de 90% menor que a densidade do complexo de ligante::acoplador de suporte (por exemplo, biotina-BSA), em várias modalidades, cerca de 30% a cerca de 70% menor que a densidade do complexo de ligante::acoplador de suporte, e, em várias modalidades, cerca de 40% a cerca de 60% menor que a densidade do complexo de ligante::acoplador de suporte. Em uma modalidade específica, o fixador de ligante compreende uma porção de ligação de biotina, tal como, por exemplo, SA, e o ligante compreende biotina acoplada com um acoplador de suporte, tal como, por exemplo, BSA ou ovalbumina ou mistura dos mesmos, ou um fragmento de BSA ou ovalbumina ou misturas dos mesmos.

Em várias modalidades, uma porção de captura, fixada a um fixador de ligante, em que o fixador ligante é, sucessivamente, associado a um ligante, é também não-saturada. A densidade da porção de captura so- bre a partícula ou sobre o suporte não partículas em várias modalidades é de cerca de 10% a cerca de 90% menor que a densidade do fixador de li-gante, em várias modalidades cerca de 30% a cerca de 70% menor que a densidade do fixador de ligante, e em várias modalidades de cerca de 40% a cerca de 60% menor que a densidade do fixador de ligante.

Um outro modo de expressar o nível de saturação é em comparação com a quantidade máxima de ligante que pode ser acoplado com um suporte. Em várias modalidades, uma superfície de suporte que é não-saturada com respeito ao ligante terá menos que 100% de ligante acoplado. Por exemplo, a percentagem de ligante sobre a superfície de suporte pode ser de cerca de 10% a cerca de 90% da quantidade máxima do ligante que pode ser colocado sobre a superfície de suporte. Ou a porcentagem de ligante sobre a superfície de suporte pode ser cerca de 20% a cerca de 80% da quantidade máxima de ligante que pode ser colocada sobre a superfície de suporte. Ou a percentagem de ligante sobre a superfície de suporte pode ser cerca de 30% a cerca de 70% da quantidade máxima de ligante que pode ser colocada sobre a superfície de suporte. A percentagem ótima de ligante sobre a superfície de suporte (em que o número máximo de ligante é de 100%) é a percentagem (ou faixa de percentagem) do ligante que proporciona a melhor razão de sinal para ruído, a menor dissociação de ligante da superfície de ligação, a maior estabilidade (na(s) temperatura(s) relevante(s) para a aplicação), e uma variância relativamente baixa em estudos de validação em comparação com superfícies de ligação convencionais (por exemplo, menos que 10%, mais preferivelmente 5% ou menos). Como explicado em outro lugar do presente relatório descritivo, o acoplador de suporte é opcional. Por exemplo, o ligante pode ser biotina, ou um derivado da mesma, que é acoplado à superfície de suporte de fase sólida.

Devido à quantidade menor que saturante de ligante que é acoplada (direta, ou indiretamente através, por exemplo, de uma proteína) ao suporte, camadas sucessivas de fixadores de ligante e porções de captura serão não-saturadas, e a densidade das camadas sucessivas de fixador de ligante e porção de captura em cima da camada do ligante acoplado ao su- porte compreenderá densidades sucessivamente menores (por exemplo, micromols sucessivamente menores por mg de micropartícula, ou micromols por metro quadrado). Assim, para o exemplo de uma micropartícula biotinila-da de acordo com a invenção, a densidade do IgG biotinilado (porção de captura biotinilada) sobre a superfície de suporte será menor que a densidade da SA (porção ligante de biotina), a densidade da SA sobre a superfície de suporte será menor que a densidade do acoplador de BSA acoplador de suporte (biotina-BSA), que será menor que a densidade da biotina (biotina-BSA; densidade da biotina estimada antes da AS) sobre a superfície de suporte.

Em uma modalidade específica, a superfície compreende biotina (biotina-BSA) em uma densidade de cerca de 1 x 10'5 a cerca de 5 x 10'2 micromols de biotina por mg de micropartículas, ou alternativamente em uma densidade de cerca de 1,6 x 10'4 a cerca de 4,9 x 10'4 micromols de biotina por mg de micropartículas. Em outras modalidades, a superfície compreende BSA (biotina-BSA) em uma densidade de cerca de 1,6 x 10'4 a cerca de 4,9 x 10'4 micromols de BSA por mg de micropartículas, compreende SA em uma densidade de cerca de 1,0 x 10'4 x 10"4 a cerca de 1,0 x 10"4 micromols de SA por mg de micropartículas, ou compreende IgG biotinilado em uma densidade de cerca de 2,1 x 10‘5 a cerca de 4,1 x 10'5 micromols de IgG biotinilado por mg de micropartículas. Em uma modalidade específica, uma superfície de suporte áspera compreende biotina (biotina-BSA) em uma densidade de cerca de 1,9 x 10'2 a cerca de 6,6 x 10'2 micromols de biotina por metro quadrado, compreende BSA (biotina-BSA) em uma densidade de cerca de 1,6 x 10'2 a cerca de 2,9 x 10'2 micromols de BSA por metro quadrado, compreende SA em uma densidade de cerca de 1,2 x 10'2 a cerca de 1,9 x 10'2 micromols de SA por metro quadrado, e compreende IgG biotinilado em uma densidade de cerca de 2,5 x 10‘3 a cerca de 5,5 x 10'3 de IgG biotinilado por metro quadrado.

Um suporte que compreende uma superfície de ligação não-saturada ou não-saturada e orientada empregando qualquer ligante pode ser preparado de acordo com os métodos e composições aqui. Por exemplo, uma superfície ligante de oligonucleotídeo ou de polinucleotídeo pode ser não-saturada por ligação (diretamente ou através de um acoplador de suporte) de um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo a uma superfície em duas ou três ou quatro ou mais razões de entrada selecionadas de oligonucleotídeo ou polinucleotídeo para suporte ou para acoplador de suporte. Para começar, uma razão de entrada conveniente é uma razão de entrada conhecida da técnica, e então decréscimo da razão de entrada em etapas (por exemplo, pela metade, por um oitavo, por um décimo sexto etc), já que as razões de entrada conhecidas da técnica são geralmente selecionadas para maximizar a quantidade de ligante sobre uma superfície de suporte. Uma vez que o oligonucleotídeo ou polinucleotídeo foi fixado à superfície de suporte, a eficácia de ligação pode ser medida usando qualquer método adequado conhecido da técnica (por exemplo, quantificação de fluorescência ligada para um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo fluorescente complementar ao oligonucleotídeo ou polinucleotídeo ligante). Uma razão de entrada adequada de oligonucleotídeo ou polinucleotídeo ligante para acoplador de suporte ou suporte é determinada medindo-se a quantidade de sinal gerada pela superfície (por exemplo, pelo oligonucleotídeo ou polinucleotídeo ligado fluorescente complementar) para uma quantidade fixa de superfície de ligação (por exemplo, gramas de 1 mícron de micropartícula revestida com o ligante de oligonucleotídeo ou de polinucleotídeo). O nível desejável de saturação é obtido quando a razão da quantidade de sinal para o peso da micropartícula (todas as outras variáveis praticamente constantes) é a maior. Esse procedimento geral pode ser usado para avaliar o nível desejado de saturação sobre qualquer superfície desejada de ligação. Como usado aqui, um oligonucleotídeo é um ácido nucleico de cerca de 30 bases de comprimento ou mais. A percentagem ótima de ligante em uma superfície de ligante para uma dada aplicação pode ser determinada por aquele versado na técnica usando o mesmo tipo de métodos descritos aqui para aplicações com base em biotina. Por exemplo, se um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo é empregado como um ligante no lugar da biotina, o oligonucleotídeo ou o po- linucleotídeo pode ser acoplado a um acoplador de suporte (por exemplo, uma proteína ou nucleoproteína), e uma fase sólida adequada pode ser revestida com o oligonucleotídeo ou o polinucleotídeo e seu acoplador de suporte. Estudos de estabilidade, retirada ou dissociação, sinal-para-ruído, e de validação podem ser efetuados analogamente aos descritos aqui para obter a quantidade ótima de ligante por área de superfície unitária (por e-xemplo, 10% a 90% de máximo, 20% a 80% de máximo, 30% a 70% de máximo etc). Uma abordagem conveniente seria primeiramente maximizar a quantidade de oligonucleotídeo ou de polinucleotídeo por área de superfície unitária, e então empregar os métodos descritos aqui (por exemplo, em várias razões de entrada molares baixas de oligonucleotídeo ou de polinucleotídeo para o acoplador de suporte na preparação de complexos de ligante: :acoplador de suporte) para preparar uma superfície não-saturada e orientada, e comparar os resultados de estabilidade, dissociação, sinal-para-ruído, e de validação das várias preparações.

Orientar um ligante sobre uma superfície de ligante inclui orientar fisicamente o ligante, isto é, ajustando a colocação do ligante com respeito a sua vizinhança. Uma superfície de ligante que contém uma quantidade máxima de ligantes por acoplador de suporte em geral resulta em muitos ligantes que não são estericamente acessíveis e competição entre ligantes adjacentes intimamente espaçados para as moléculas de interesse para ligação com os ligantes do complexo. Como usado aqui, o termo orientação (estrutural) física, ou seus equivalentes gramaticais, significa que uma porção é manipulada de um modo tal que a maioria das porções é orientada para facear em uma direção particular. Em uma modalidade da presente invenção, a porção é orientada de modo que o sítio de reconhecimento ou o sítio de ligação é substancialmente orientado para longe da superfície de suporte. Em uma outra modalidade da invenção, as porções fisicamente orientadas são associadas em tandem. A orientação pode ser obtida pelo método aqui para qualquer par de ligante::acoplador de suporte. Um método de orientar um ligante sobre uma superfície de suporte compreende preparar os complexos de ligan- te::acoplador de suporte (exemplos de complexos de biotina-BSA são proporcionados aqui) em razões de entrada moleculares baixa de ligante para acoplador de suporte. Conforme descrito em algum lugar aqui, o objetivo de usar razões de entrada molares baixas de ligantes para acopladores de suporte é preparar complexos com um número controlado de ligantes acoplado por acoplador de suporte. A obtenção de um número controlado (isto é, submáximo) de ligantes por acoplador de suporte pode levar a uma melhor acessibilidade estérica dos ligantes sobre a superfície, menor interação entre ligantes adjacentes, distância mais uniforme (em média) entre os ligantes sobre a superfície de ligação, e estabilidade aperfeiçoada pelo provimento de uma superfície que é substancialmente isenta de ligante livre (por exemplo, prevenir ou diminuir a retirada do ligante).

As composições e métodos da invenção incluem aperfeiçoamentos em parâmetros de desempenho de ensaio compreendendo sensitividade (razão de sinal para ruído), acuidade, ensaio de precisão (ensaios quantitativos), reprodutibilidade de ensaio (ensaios qualitativos), e estabilidade, e em parâmetros de fabricação de ensaio tal como reprodutibilidade de processo de fabricação de micropartícula paramagnética (manufaturabilidade de PMP), ou combinações dos mesmos. Incluídos na invenção estão composições e métodos para: moléculas conjugadas de biotina não-saturada ou não-saturada e orientada usadas como ensaios de afinidade (por exemplo, anticorpo biotinilado não-saturado ou não-saturado e orientado usado como o anticorpo de captura de fase sólida em ensaios em sanduíche e competitivos); redução do ruído em ensaio ou resíduo associado à ligação não-específica ou interferência heterofílica; sinal de ensaio aumentado devido à dispersão intensificada de micropartículas (área de superfície disponível aumentada e taxas de colisão; distância de difusão de ensaio aumentada); sinal de ensaio aumentado devido à não saturação ou não saturação e orientação da SA (liberdade estérica para ligar moléculas grandes e pequenas conjugadas com a biotina, aperfeiçoando a eficácia de ligação); sinal de ensaio aumentado devido às moléculas conjugadas com a biotina de não saturação ou não saturação e orientação (liberdade estérica para capturar ou para ligar fixadores de compósitos grandes ou pequenos (porções de captura biotiniladas) e/ou analitos, fixador de analito aperfeiçoado (porção de captura biotinilada) e/ou reconhecimento de analito e atividade específica fixador de analito (porção de captura biotinilada); estabilidade de produto intensificada (eficácia de bloqueio aperfeiçoada e retirada de SA reduzido da superfície); e/ou robustez do imunoensaio e reprodutibilidade do processo aumentadas devido à otimização do processo usado para preparar SA não-saturada ou não-saturada e orientada em uma superfície de micropartícula. Em várias modalidades, a razão de sinal para ruído sobre uma superfície de suporte não-orientada ou não-saturada e orientada pode ser intensificada por titulação de diferentes níveis de fixador de ligante (por exemplo, SA) para ligante (por exemplo, biotina), e/ou titulação de diferentes níveis de porção de captura (por exemplo, anticorpo biotinilado) para o fixador de ligante (por exemplo, SA), de modo a obter uma razão ótima de sinal para ruído.

Em uma modalidade com base em uma micropartícula revestida com BSA biotinilada de razão de entrada baixa, bloqueada com o polímero em bloco Pluronic® F108 (disponível da BASF), dispersada com Pluronic® F108, e revestida com SA, a razão ótima de sinal para ruído e a capacidade de ligação de IgG em imunoensaios são obtidas usando-se as entradas de anticorpo biotinilado de 3 a 6 microgramas de IgG biotinilado por mg de mi-cropartículas. Não há troca significante da razão de sinal para ruído da capacidade de ligação de IgG com entradas de IgG maiores que 10 microgramas de IgG biotinilada por mg de micropartículas. As entradas de IgG menores que 3 microgramas de IgG biotinilada por mg de micropartículas resultam em um decréscimo significante da razão de sinal para ruído e capacidade de ligação de IgG, se aproximando de zero conforme a entrada de anticorpo se aproxima de zero.

Embora a discussão e exemplos aqui, e as figuras associadas, as presentes formulações da invenção empreguem biotina como um ligante, a invenção não está limitada a superfície de ligação tendo biotina. O que está descrito aqui pode ser generalizado para qualquer superfície de ligação cujos ligantes podem ser não-saturados ou não-saturados e orientados u- sando-se os métodos e composições descritos aqui. A descrição dada a seguir sobre superfície de ligação tendo biotina como ligante é usada para ilustrar certas composições e métodos para fazer as superfícies de ligação não-saturadas ou não-saturadas e orientadas.

Além disso, conforme explicado em outro lugar neste relatório descritivo, o acoplador de suporte é opcional. Assim, o acoplador de suporte é somente uma modalidade da invenção e a descrição do acoplador de suporte não tem por objetivo ser limitativa da presente invenção.

Superfícies de ligação que compreendem ligantes não-saturados e orientados são proporcionadas. As superfícies de ligante podem ser usadas para construir uma superfície de porções de captura adequadas para capturar qualquer molécula de interesse. A natureza não-saturada e a orientação dos ligantes sobre a superfície permitem a colocação de outros componentes, tais como porções de captura, cuja disposição sobre a superfície de ligação reflete a natureza não-saturada e a orientação dos ligantes subjacentes.

Os complexos de acoplador de ligante::suporte são proporcionados, os quais em várias modalidades são feitos empregando-se uma razão de entrada molar baixa do ligante para o acoplador de suporte de modo que há um número submáximo de ligantes disposto sobre o acoplador de suporte de acordo com os métodos descritos aqui, e de modo que a retirada é reduzida. Esses complexos podem ser usados para criar uma superfície de ligação não-saturada e orientada da invenção. As modalidades que usam uma razão de entrada baixa de ligante para acoplador de suporte na preparação do complexo de ligante::acoplador de suporte podem ser particularmente úteis quando os fixadores de ligante bi ou multivalentes são empregados (tal como, por exemplo, quando a biotina é um ligante e uma proteína de ligação de biotina bi ou multivalente tal como SA é o fixador de ligante). São proporcionados agentes de dispersão e métodos para preparar micropartículas compreendendo superfícies de ligação, bem como métodos para fabricar micropartículas com superfícies de ligação, por exemplo, empregando copolímeros em bloco tais como copolímeros em bloco Pluro- nic® na dispersão de micropartículas revestidas com biotina (ligante) antes de adicionar porções de ligação de biotina tal como SA (fixador de ligante). Copolímeros em bloco específicos Pluronic® que podem ser usados, e seus pesos moleculares médios numéricos, incluem F108 (cerca de 12.700-17.400 Da, média de cerca de 14.600 Da) e F127 (cerca de 9.840-14.600 Da, média de cerca de 12.600 Da). O comprimento do bloco de cada Pluronic® descrito aqui é aproximado, de acordo com o fabricante, já que o comprimento exato do bloco variará com as bateladas. A menos que de outro modo especificado ou aparente do contexto, pesos moleculares de copolímeros em bloco são expressos como pesos moleculares médios numéricos. Métodos são apresentados para preparar moléculas biotiniladas estáveis (por exemplo, biotina-BSA e biotina-ovalbumina) para uso no revestimento de superfícies usadas para capturar moléculas que têm dois ou mais domínios de ligação de biotina (por exemplo, avidina, SA, e neutravidina). Esses são, por suas vez, úteis para ligar porções de captura biotiniladas que podem capturar outras moléculas de interesse em ensaios de ligação (por exemplo, para anticorpos biotinilados, as moléculas de interesse são antíge-nos; para moléculas pequenas biotiniladas, as moléculas de interesse podem ser enzimas, anticorpos, ou proteínas de ligação que se ligam às moléculas pequenas; etc). São fornecidos exemplos particulares que empregam BSA biotinilada de razão de entrada baixa preparada pelo uso de uma razão de entrada molar baixa de biotina quando BSA está sendo biotinilada, para uso em revestimento de um suporte para capturar SA. A SA pode ser então complexada a uma porção de captura biotinilada adequada. Métodos são apresentados para revestir moléculas biotiniladas sobre um suporte para capturar, orientar, e associar uma quantidade menos que saturante de uma molécula tendo dois ou mais domínios de ligação de biotina (por exemplo, avidina, SA, ou neutravidina). Exemplos particulares são proporcionados, os quais ilustram um revestimento de biotina-BSA de razão de entrada molar baixa sobre uma superfície de PMP usada para capturar, orientar, e se associar a uma quantidade menos que saturante de SA. Métodos são apresentados que usam copolímeros em bloco como agentes bloqueadores para suportes revestidos com moléculas biotini-ladas e/ou não-biotiniladas. Exemplos particulares são proporcionados que ilustram o uso do copolímero em tribloco Pluronic® F108 como um agente bloqueador para PMPs revestidas com biotina-BSA de razão de entrada baixa. Métodos são apresentados para usar copolímeros em bloco como agentes de dispersão para micropartículas revestidas com moléculas biotiniladas e/ou não biotiniladas. Exemplos particulares são fornecidos, os quais ilustram o uso de Pluronic® F108 como um agente de dispersão para PMPs revestidas com biotina-BSA de razão de entrada baixa. Métodos são apresentados para usar copolímeros em bloco como agentes de dispersão para micropartículas revestidas com moléculas biotiniladas, durante o revestimento das moléculas contendo dois ou mais domínios de ligação de biotina (por exemplo, avidina, SA, e neutravidina). Exemplos particulares são fornecidos, os quais ilustram o uso de Pluronic® F 108 como um agente de dispersão durante o revestimento de SA sobre a superfície de PMPs revestidas com biotina-BSA de razão de entrada baixa (por exemplo, adicionando Pluronic® F108 para fazer uma monodispersão das micropartículas de biotina-BSA de razão de entrada baixa antes de adicionar SA). Métodos são apresentados para revestir, orientar, e associar menos que uma quantidade saturante de uma molécula que compreende dois ou mais sítios de ligação de biotina (por exemplo, avidina, SA, ou neutravidina) a uma superfície biotinilada. Exemplos particulares são proporcionados os quais ilustram revestir, orientar, e associar menos que uma quantidade saturante de SA sobre a superfície de PMPs revestidas com biotina-BSA de razão de entrada baixa. Métodos são apresentados para associar uma quantidade menos que saturante de, e opcionalmente orientar moléculas conjugadas com a biotina sobre uma superfície. Exemplos particulares são fornecidos, os quais ilustram revestir, orientar, e associar menos que uma quantidade saturante de conjugados contendo biotina (por exemplo, anticorpos biotinilados, frag- mentos Fab, moléculas pequenas, moléculas grandes, moléculas carreado-ras etc) sobre a superfície de PMPs especificamente revestidas com SA (isto é, não-saturada e orientada) para uso em ensaios de afinidade tal como, por exemplo, imunoensaios.

Ensaios de afinidade incluem ensaios que determinam a presença ou ausência de um analito em uma amostra, e/ou quantificam a quantidade de analito em uma amostra, direta ou indiretamente, com base em uma interação específica ou relativamente específica entre o analito e uma molécula que preferencialmente se liga ao analito. Ensaios de afinidade incluem ensaios que se baseiam em pelo menos algum respeito em uma afinidade de ligação específica ou relativamente específica de uma entidade pela outra. Ensaios de afinidade incluem, mas sem-limitação, ensaios que se baseiam em uma interação de ligação entre um receptor e um ligante, uma enzima e seu substrato, um polinucleotídeo e seu complemento ou complemento substancial, uma molécula pequena e uma proteína de ligação que se liga à molécula pequena com especificidade etc. Imunoensaios incluem ensaios que se baseiam na interação entre, por exemplo, um antígeno e um anticorpo que reconhece o antígeno. Imunoensaios também incluem, por exemplo, ensaios que empregam um anticorpo ou fragmento do mesmo para ligação a um antígeno de interesse em uma amostra. Ensaios de afinidade também incluem, por exemplo, ensaios competitivos e ensaios em sanduíche. Tais ensaios incluem aqueles que se baseiam em uma interação de um antígeno ligado à superfície para detectar um anticorpo de interesse em uma amostra, e aqueles que se baseiam em uma interação de um anticorpo ligado à superfície ou fragmento do mesmo para detectar um antígeno de interesse em uma amostra. Como usados aqui, os antígenos não são limitados a polipep-tídeos ou proteínas, mas podem incluir também moléculas pequenas (tais como, por exemplo, haptenos) e anticorpos (por exemplo, anticorpos podem ser usados como antígenos para gerar outros anticorpos que reconhecem os mesmos). Em geral, o antígeno, como usado aqui, inclui qualquer analito de interesse em uma amostra imunoensaiada com um anticorpo ou fragmento do mesmo usando as composições ou métodos da invenção.

Uma aplicação de certas modalidades das composições e métodos descritos aqui é apresentada nas Figuras 1A e 1B para o caso particular de orientar e associar menos que uma quantidade saturante de SA em uma superfície de PMP. Uma explicação mais detalhada de várias etapas neste processo é dada em outro lugar aqui.

Uma descrição geral de um processo para preparar uma superfície não-saturada e orientada é proporcionada para o caso de uma superfície que compreende BSA biotinilada, capaz de se ligar a SA, que, por sua vez, é capaz de se ligar a uma porção de captura biotinilada tal como, por exemplo, uma imunoglobulina ou fragmento da mesma. Muito da discussão e exemplos proporcionados dizem respeito a um sistema de biotina/SA, embora a invenção não esteja limitada às superfícies biotiniladas.

Deve se ter em mente que porque a discussão e exemplos empregam biotina, e a biotina é tipicamente empregada para se ligar a uma porção de ligação de biotina bi ou multivalente (tal como, por exemplo, SA), o fato de se empregar uma porção de ligação de biotina multivalente apresenta certos problemas que não podem ser encontrados com várias superfícies de ligação que não empregam um fixador de ligante multivalente. Um desses problemas é que quando se usa uma micropartícula biotinilada revestida com SA, retirada de biotina não-covalentemente ligada pode interferir no desempenho da superfície de ligação (por exemplo, biotina livre pode se dissociar e complexar com a SA). Em tal caso, esse fenômeno pode ser reduzido conduzindo-se uma biotinilação de razão baixa da BSA, em vez de biotinilar BSA com um excesso arbitrariamente grande de biotina, porque a biotinilação de razão de entrada baixa pode reduzir a quantidade de biotina não-covalentemente ligada que se associa à BSA.

Também, quando do revestimento de um suporte com uma porção multivalente tal como SA sobre uma micropartícula, pode ocorrer agregação durante o revestimento com SA. Isso de deve ao fato que cada molécula de SA se liga a mais que uma molécula de biotina. SA é uma proteína tetramérica com um peso molecular de aproximadamente 56.000 Da, e é um exemplo específico de uma molécula biológica que tem dois ou mais domí- nios de ligação de biotina. A interação de avidina-biotina é a interação não-covalente, mais forte, conhecida entre proteína e ligante, e cada uma das quatro subunidades de SA pode se ligar à biotina com uma constante de ligação Ka = 1015 Μ'1. A estrutura terciária de SA resulta em que seus quatro domínios de ligação de biotina ficam localizados sobre lados opostos da molécula. Se um dos domínios de ligação de biotina de SA se liga a uma superfície biotinilada, pelo menos dois dos mesmos três domínios de ligação de biotina não-ocupados estará pelo menos estericamente disponível para se ligar a porções de captura biotiniladas. Avidina e neutravidina são outros e-xemplos de proteínas tetraméricas que têm quatro domínios de ligação de biotina; elas diferem da SA em seu pl, solubilidade, e propriedades de ligação não-específicas.

Quando a superfície biotinilada é exposta à SA, SA livre se ligará com a botina da superfície, mas SA ligada com a superfície pode então se ligar à biotina ligada com uma outra micropartícula. Desse modo, agregados de micropartículas grandes podem se formar. Isso pode ser resolvido crian-do-se uma monodispersão de partículas na etapa de adição de SA.

Em resumo, o processo para preparar a superfície de biotina-SA sobre uma micropartícula começa com uma biotinilação de razão de entrada baixa de BSA. A BSA biotinilada de razão de entrada baixa é então acoplada a PMPs por ligação covalente das aminas primárias da BSA da biotina-BSA ao grupos funcionais da superfície das PMPs. As PMPs biotiniladas resultantes são suspensas em Pluronic® adequado por um tempo (etapa bloqueado-ra), rinsadas, e então isoladas. A seguir, as PMPs biotiniladas são suspensas em Pluronic® (uma etapa de dispersão intensificada), e SA é adicionada. As micropartículas são incubadas à temperatura ambiente por um tempo, rinsadas, e, então, isoladas. Uma vez isoladas, as moléculas biotiniladas adequadas (tais como porções de captura biotiniladas) podem ser adicionadas para qualquer aplicação de ensaio particular. A etapa bloqueadora mencionada acima usando Pluronic® adequado minimiza eventos de ligação artefatuais não-específicos envolvendo os sítios de ligação de outro modo não ocupados da superfície de ligação não-saturadas da invenção (Figuras 5 e 7) embora permitam associações específicas requeridas para gerar os complexos baseados em ligante do invenção. Tal bloqueio promove acessibilidade espacial (esférica) dos complexos baseados em ligante da invenção conforme suas porções se associam, e facilita uma orientação estrutural linear de cada complexo baseado em ligante da invenção na em que ele é formado, aumentando, assim, a probabilidade que cada complexo contendo a porção de captura resultante da invenção funcione para otimizar os parâmetros de desempenho de ensaio que incluem, como um exemplo que não pretende ser limitativo, a razão de sinal para ruído. Além disso, e como é verdadeiro para imunoensaios em geral, uma etapa bloqueadora também minimiza a ligação não-específica que pode ser descrita como eventos de ligação artefatuais em um imunoensaio envolvendo seus componentes e/ou superfícies de suporte que rendem subprodutos indesejáveis, que podem afetar adversamente os parâmetros de desempenho do ensaio incluindo, como um exemplo não-limitativo, a razão de sinal para ruído. Os efeitos adversos de tais eventos de ligação artefatuais na razão sinal para ruído podem tomar a forma de sinal reduzido, ruído aumentado, ou ambos. Por fim, já que associações específicas com ambas a superfície de suporte e a superfície de ligação são otimizadas, enquanto as associações não-específicas com estas superfícies são minimizadas, a retirada dos componentes com base em ligante da invenção das superfícies de suporte e de ligação das micropartículas ou microplacas é concomitantemente minimizado. Por tais razões, a etapa bloqueadora com um Pluronic® adequado resulta em aperfeiçoamentos do desempenho e da fabricação que afetam favoravelmente a sensitividade do ensaio (razão de sinal para ruído), acuidade do ensaio, precisão do ensaio (ensaios quantitativos), reprodutibili-dade do ensaio (ensaios qualitativos), estabilidade do ensaio, ou reprodutibi-lidade do processo de fabricação de PMP (manufaturabilidade de PMP), ou combinações dos mesmos. A etapa de dispersão intensificada, mencionada acima, usando um Pluronic® adequado antes da adição de SA, durante o processo de preparação da superfície de biotina-BSA sobre uma micropartícula, diminui a agregação das micropartículas e, concomitantemente, aumenta a área de superfície que está exposta sobre uma micropartícula (Figuras 6 e 10), produzindo, assim, o menor número de complexos com base em ligante sobre uma superfície de micropartícula indisponível para ligação. Tal inibição mediada por Pluronic® de agregação é útil para aplicações que incluem, mas sem-limitação, intensificar a manufaturabilidade da PMP (reprodutibilidade do processo de PMP) e aperfeiçoar o desempenho dos ensaios e kits nos quais tal PMP é usada. A manufaturabilidade da PMP é intensificada quando o nível de agregação das micropartículas de lote para lote da PMP é controlável antes, durante, e depois de um processo de fabricação de PMP. Depois do processo de fabricação de PMP, o desempenho dos ensaios usando tal PMP pode ser otimizado por meios que incluem, mas sem-limitação, expor as micropartículas a uma solução contendo Pluronic® antes da adição da amostra durante um imunoensaio e/ou expor as micropartículas a uma solução contendo Pluronic® antes da adição do substrato durante um imunoensaio. Por tais razões, a etapa de dispersão intensificada com Pluronic® adequado resulta em aperfeiçoamentos de desempenho e de fabricação que afetam favoravelmente a sensitividade do ensaio (razão de sinal para ruído), acuidade do ensaio, precisão do ensaio (ensaios quantitativos), reprodutibilidade do ensaio (ensaios qualitativos), estabilidade do ensaio, ou reprodutibilidade do processo de fabricação de PMP (manufaturabilidade de PMP), ou combinações dos mesmos. O processo é ilustrado nas Figuras 1A e 1B para certas modalidades que empregam tamanho uniforme (<5% CV) 1,0 μΜ MyOne® de PMP Dynal® ativado com tosila (nenhuma outra ativação de superfície é requerida) (Invitrogen Corporation), BSA biotinilada com razão de entrada baixa (4 de reagente de botina: 1 de BSA, copolímero em tribloco Pluronic® F108 (sintético, não-biológico; BASF), SA21 SA-PLUS® (congelado, nunca liofili-zado; ProZyme®), ímãs para separar e lavar as partículas (troca de tampão). Um processo de micropartícula envolve concentração de 25 mg de PMP/mL, misturamento aéreo e sonicação para ressuspender e dispersar as micropartículas para ressuspensões do processo, misturamento aéreo para incuba- ções do processo, temperatura elevada (38 a 42°C), e incubações de processo à temperatura ambiente, química de tosila para acoplar covalentemen-te a BSA biotinilada ao grupos de tosila da superfície da micropartícula através de grupos amino primários BSA, copolímero em tribloco de Pluronic® F108 para bloquear a superfície da micropartícula (remover passivamente a proteína absorvida, minimizar a ligação não-específica das proteínas à superfície da micropartícula), copolímero em tribloco Pluronic® F108 para mo-nodispersão de PMP, e acoplamento secundário (afinidade) da SA ao intermediário de PMP de biotina-BSA em presença do copolímero em tribloco Pluronic® F108 (reduz a agregação das micropartículas durante o processo de acoplagem da SA).

Um modo conveniente para visualizar o princípio por trás de bio-tinilação da razão de entrada baixa na fabricação de superfície não-saturadas ou não-saturadas e orientada é visualizar o processo de biotinila-ção através da lente de distribuição de Poisson. Os princípios que norteiam a ilustração a seguir são aplicáveis a todos os pares de ligante e acoplador de suporte (não somente a biotina e BSA). Acredita-se que o complexo de ligante::acoplador de suporte preparado usando uma razão de entrada baixa de ligante para acoplador de suporte resulta em uma orientação mais favorável da molécula de ligante quando o ligante acoplador de suporte é revestido sobre um suporte. Essa orientação mais favorável das moléculas de ligante contribui para a acessibilidade estérica do revestimento sobre o suporte. Para apenas fins de ilustração do princípio, e não a título de limitação a qualquer acoplador de suporte ou ligante particular, o fenômeno é ilustrado usando a aqui BSA biotinilada. A ilustração abaixo se aplica a qualquer ligante e acoplador de suporte em que o acoplador de suporte é capaz de se associar a mais que um ligante. Para ligantes e acopladores de suporte diferentes de biotina de BSA, uma razão de entrada de ligante para acoplador de suporte pode ser determinada como foi feito para BSA e biotina no E-xemplo 1 (vide a Tabela 1) por seleção de uma razão de entrada que proporciona uma estabilidade desejável, determinando uma substituição média (λ), e visualizando o efeito de orientação em uma distribuição adequada, por exemplo, distribuição de Poisson.

No caso de biotinilação de BSA, existe um grande número de sítios possíveis na sequência de aminoácidos da BSA que pode ser biotini-lada usando o reagente de biotinilação reativo com a amina primária sulfo-NHS-LC-biotina. Lisina, um aminoácido que contém uma amina primária livre, ocorre 59 vezes na sequência de aminoácidos de BSA. Contudo, somente cerca de 30 a 35 aminas primárias de lisina na BSA estão disponíveis para reagirem com os reagentes de biotinilação reativos com a amina primária. Por exemplo, aminas N-terminal podem ser encobertas, ou bloqueadas, dentro da estrutura terciária de BSA. Somente aminas primárias localizadas sobre a superfície da molécula (por exemplo, topo, fundo, lados, ranhuras, bolsas etc) estão disponíveis para biotinilação. Foi empiricamente determinado (vide Exemplo 1) que biotinilar a BSA em uma razão de entrada molar baixa de 4 mois de sulfo-NHS-LC-biotina por mol de BSA resulta em uma média de cerca de 1,63 molécula de biotina por molécula de BSA (vide Tabela 1).

Para biotinilação de BSA, assumindo uma reação aleatória da sulfo-NHS-LC-biotina com as moléculas de BSA (4 mois de sulfo-NHS-LC-biotina para 1 mol de BSA), e uma substituição média (λ) de 1,63 biotina por molécula de BSA, a distribuição de moléculas de BSA biotiniladas pode ser aproximada usando-se uma distribuição de Poisson (vide Figura 3: 20% de BSA têm zero de biotina; 32% de BSA têm 1 biotina; 26% de BSA têm 2 bio-tinas; 14% de BSA têm 3 BIOTINAS; 6% de BSA têm 4 biotinas; 2% de BSA têm 5 biotinas; e <1% de BSA tem 6 biotinas. Conforme ilustração na Figura 3, a distribuição de Poisson revela que pelo menos 50% dos complexos de biotina-BSA têm menos que ou igual a três biotinas por acoplador de suporte (isto é, BSA) na razão de entrada molar selecionada de biotina:BSA. A distribuição também revela que na razão de entrada molar selecionada, de 0 a seis biotinas são conjugadas por molécula de BSA. BSA biotinilada de razão de entrada baixa pode ser covalente-mente acoplada a um suporte porque a BSA tem cerca de 30 a 35 aminas primárias disponíveis para a química da amina primária e uma distribuição de Poisson prediz que de 0 a seis aminas primárias de BSA são conjugadas à biotina seguinte à biotinilação. Portanto, cerca de 24 a 35 aminas primárias estão ainda disponíveis para acoplarem covalentemente cada molécula de BSA a um suporte via química da amina primária (por exemplo, tosila, epóxi, carbodiimida etc). Aminas primárias disponíveis múltiplas podem aperfeiçoar a eficácia de acoplagem da BSA a um grupo funcional de um suporte e podem aperfeiçoar a estabilidade vias pontos de ligação múltiplos (isto é, mais que uma ligação covalente de suporte à BSA por molécula de BSA).

De acordo com as instruções do fabricante de reagente de manipulação (Pierce Chemical Co. Avidin-Biotin Chemistrv: A Handbook. M. Savage et al., 2a Edição, 1992, página 34), uma proteína biotinilada com 2,5 mois de biotina por mol de proteína pode resultar também em uma distribuição de Gaussian (conformada em sino) entre o grupo de proteínas. Embora algumas proteínas do grupo não tenha biotina incorporada, a maioria deve ter 2 a 3 mois de biotina incorporada, e uma porção muito pequena da grupo pode ter 5 mois de biotina incorporada. Já que a biotina pode ser conjugada com qualquer uma das aminas primárias disponíveis, ela é bem possível de produzir diferentes aminas disponíveis em cada molécula de BSA.

Uma ilustração de como a BSA biotinilada de razão de entrada baixa pode ser usada é mostrada na Figura 4, que mostra o acoplamento da razão de entrada baixa de biotina-BSA para uma fase sólida de micropartícu-la ativada com tosila de 1,0 mícron com grupos funcionais na superfície (isto é, ácido carboxílico, ativado com tosila, epóxi etc) usados para se ligarem covalentemente aos grupos funcionais de amino primário de biotina-BSA. O suporte resultante é não-saturado e orientado com respeito à biotina sobre sua superfície. Já que o conjugado de biotina-BSA (complexo de ligante::aço-plador de suporte) pode ter números diferentes de biotina por molécula de BSA, e a orientação da molécula de BSA e a localização da biotinas na superfície é aleatória, o conjugado de biotina-BSA se acoplará com a superfície de suporte de modo que aquelas biotinas que se estendem na solução sejam estericamente disponíveis como uma superfície de ligação, e aquelas biotinas que faceiam a superfície de suporte são estericamente indisponíveis como uma superfície de ligação. A maioria das micropartículas comercialmente disponíveis é baseada em poliestireno, e a absorção de proteína na superfície das micropartículas ocorre passivamente (por exemplo, por interação hidrofóbica e/ou iônica) e não-especificamente. Embora uma micropartícula ativada com tosi-la seja mostrada, o suporte pode ser ativado com qualquer grupo funcional adequado (por exemplo, ácido carboxílico, epóxi etc) que possa se ligar co-valentemente aos grupos funcionais de biotina-BSA (por exemplo, os grupos amino primário ou sulfidrila da BSA). Se cada épsilon amina sobre as superfícies das moléculas de BSA têm pK idêntico, a distribuição de biotina sobre a superfície da BSA deve ser Gaussian (Pierce Chemical Co., Avidin-Biotin Chemistrv: A Handbook. M. Savage et al, 2a Edição, 1992, p. 34). A Figura 4 ilustra uma superfície não-saturada feita associando-se covalentemente à biotina-BSA tendo uma substituição média (λ) de 1,63 biotina por molécula de BSA a um suporte de 1,0 mícron. Como pode ser visto da ilustração, a não saturação aqui é obtida, pelo menos em parte, por revestimento do suporte com BSA biotinilada com razão de entrada baixa.

Um outro método para obter uma superfície de ligação não-saturada sobre um suporte compreende preparar complexos de ligan-te::acoplador de suporte em uma razão de entrada molar selecionada de ligante para acoplador de suporte, preparar uma preparação diluída dos complexos resultantes de ligante::acoplador de suporte, e revestir o suporte usando a preparação diluída dos complexos de ligante::acoplador de suporte no processo para associar os complexos de ligante::acoplador de suporte com o suporte. Para superfícies biotiniladas, que ligam uma pelo menos porção de ligação de biotina bivalente, a razão de entrada molar selecionada é preferivelmente uma razão de entrada molar de biotina baixa para o acoplado de suporte reduzir a degradação de desempenho devido à retirada. Nesse método, a razão de entrada baixa não é responsável pelo caráter não-saturado do suporte resultante porque a natureza não-saturada dos ligantes acoplados ao suporte é obtida limitando-se a concentração de complexos de Iigante::acoplador de suporte por área unitária sobre o suporte em vez de se limitar à quantidade de ligantes por acoplador de suporte. Assim, por exemplo, usando este método, a BSA pode ser conjugada com a biotina em razões de entrada molares em excesso de 4 rnols de biotina por mol de BSA, embora a biotinilação seja preferivelmente efetuada em uma razão de entrada baixa de biotina de modo a reduzir a quantidade de biotina não-covalentemente ligada na superfície de ligação.

Embora em muitas circunstâncias seja desejável e/ou um desperdício biotinilar BSA (ou acoplar qualquer ligante com qualquer acoplador de suporte) em razões de entrada molares altas de ligante para acoplador de suporte (por exemplo, em uma razão de entrada molar de cerca de 20 ou mais rnols de reagente de biotinilação por mol de BSA), com éster método, os complexos de ligante::acoplador de suporte (por exemplo, biotina-BSA) preparados em tais razões de entrada altas podem ser também usados para fazer uma superfície de ligação não-saturada. Assim, com respeito a limitar a substituição média (λ) de ligantes por acoplador de suporte (por exemplo, biotinas por BSA), a limitação da saturação dos ligantes sobre um suporte pode ser obtida limitando a concentração dos complexos de ligante: :acoplador de suporte na reação que acopla os complexos de ligante: :acoplador de suporte ao suporte. O grau de saturação pode ser ainda controlado por, por exemplo, controle da taxa da reação por meio de, por exemplo, controle da temperatura da reação (por exemplo, resfriar os acoplamentos endotérmicos, ou aquecer para acoplamentos exotérmicos), seleção de uma química de acoplamento mais lenta ou menos reativa, limitação do tempo de reação etc.

Como dita acima, a maioria das micropartículas comercialmente disponíveis é baseada em poliestireno. A absorção de proteína passiva a tais superfícies através de, por exemplo, interação hidrofóbica/ou iônica é conhecida. O uso de agentes bloqueadores, tal como, por exemplo, pelo menos um Pluronic® é discutido aqui para diminuir a ligação não-específica. Tais agentes, conforme descritos em detalhes em algum lugar aqui, são também úteis para criar preparações monodispersas ou substancialmente monodispersas de micropartículas compreendendo superfícies de ligação.

Ilustrado na Figura 5 está o uso de copolímeros em bloco como agentes bloqueadores para fases sólidas, e para o caso particular de se usar um copolímero em bloco Pluronic® como agente bloqueador para micropartículas revestidas com BSA biotinilada de razão de entrada baixa. A ilustração é para o Pluronic® F108 (p.m. = 13.518 Da; balanço hidrofílico lipofílico (HLB) = 27), que bloqueia a superfície do polímero hidrofóbico da fase sólida e desloca, remove, ou retira passivamente a proteína absorvida sem remover a proteína covalentemente ligada. Então, a superfície permanece hidrofí-lica devido à presença de hidroxilas na superfície nas caudas do Pluronic®.

Pode ser usado qualquer copolímero em bloco adequado que tenha a capacidade de se associar à superfície de suporte e também estender uma cauda relativamente hidrofílica no meio circunvizinho. Copolímeros em tribloco (tal como, por exemplo, Pluronic® F108 da ASF) têm um grupo cabeça único de polipropileno hidrofóbico (PPO) de cerca de 17 a cerca 69 unidades monoméricas de comprimento, e duas caudas de polietileno hidrofílico (PEO) de 1 a cerca de 129 unidades monoméricas de comprimento, cada uma. O balanço hidrofílico lipofílico (HLB) dos copolímeros em tribloco está diretamente relacionado ao comprimento ou tamanho do grupo cabeça de PPO e as caudas de PEO e o valor HLB pode ser de 1 (insolúvel em á-gua) a 29 (altamente solúvel em água). Se o grupo cabeça de PPO tiver pelo menos 56 unidades monoméricas de comprimento, o grupo cabeça do copolímero em tribloco pode não somente agir como sonda hidrofóbica e se ligar fortemente a uma superfície hidrofóbica, mas ele pode também competir e deslocar uma outra molécula da mesma superfície hidrofóbica. Se ambas as caudas de PEO tiverem um comprimento de pelo menos 105 unidades monoméricas, elas podem se estender para a solução se distanciando da superfície de fase sólida. Os grupos hidroxila na extremidade de cada cauda de PEO fornecem um microambiente hidrofílico já que as caudas são longas o bastante e livres para se moverem de um lado para o outro na solução, e as caudas de hidroxila agem como uma barreira estérica para impedir que a absorção ou reabsorção da proteína passiva à superfície de suporte de fase sólida.

Com base na área de superfície teórica disponível, assumindo uma superfície lisa de uma micropartícula de 0,82 a 1,03 mícron com uma densidade de 1,5 g/cm3 (38,83 a 48,77 cm2 por mg de micropartícula), e a área de superfície interfacial teórica de uma molécula de Pluronic® F127 (15,1 a 20 nm2), a monocamada teórica de Pluronic® F127 sobre a superfície da partícula é calculada para ser de cerca de 4,05 x 10'4 a cerca de 5,43 x 10'4 nmols de Pluronic® F127 por mg de micropartícula. Análise fluorimétrica do Pluronic® F127 marcado com 5-(4,6-diclorotriazinil)aminofluoresceína (5-DTAF) indicou que cerca de 3,68 x 10‘4 a cerca de 8,37 x 10'4 mmols de Pluronic® F127 se ligam por micrograma de uma micropartículas esférica de 0,82 a 1,03 mícron.

Análise hemacitométrica foi usada para determinar a concentração mínima de Pluronic® F108, Pluronic® F127, e Tetronic® 908 requerida para romper completamente todos os agregados de PMP com base em poliestireno e resultar em monodispersão de micropartículas. Os estudos de otimização de concentração indicaram que o Pluronic® F108 criou uma monodispersão de micropartículas apenas de monômeros e dímeros em concentrações de cerca de 5mM (0,007% p/v) a cerca de 500mM (0,67% p/v). Pluronic® F127 resultou em monômeros, dímeros e trímeros de micropartículas de cerca de 6,67mM (0,009% p/v) a cerca de 33,33mM (0,043% p/v), e monômeros, dímeros e agregados grandes de cerca de 50mM (0,064% p/v) a cerca de 667mM (0,850% p/v). Contudo, Tetronic® 908 rendeu agregados na maioria das concentrações testadas. Pluronic® F108 funcionou como um agente bloqueador de PMP de biotina-BSA em concentrações de cerca de 0,4% p/v a cerca de 0,6% p/v. Em outras modalidades da presente invenção, Pluronic® F108 é adicionado em uma concentração de cerca de 0,1% p/v a cerca de 1,0% p/v, ou cerca de 0,5% p/v a cerca de 0,75% p/v. O uso de copolímeros em bloco como agentes de dispersão para micropartículas revestidas com moléculas biotiniladas antes de se adicionar moléculas de ligação de biotina tendo dois ou mais domínios de ligação de biotina é ilustrado na Figura 6 para uma modalidade específica usando-se Pluronic® F108 como agente de dispersão antes da adição de SA a uma mi-cropartícula revestida com biotina. Na ilustração mostrada, o Pluronic®+ F108 é usado tanto para promover a monodispersão como para bloquear a ligação não-específica à superfície. Adição de uma pelo menos molécula de ligação de biotina bivalente é mostrada em presença ou ausência de Pluronic® F108. Na ausência de Pluronic® F108, as micropartículas podem se agregar durante a adição da molécula de ligação de biotina. Na presença de Pluronic® F108, as micropartículas são monodispersas durante e depois da adição da molécula de ligação de biotina.

Uma etapa de dispersão é preferida sob certas circunstâncias para resultados ótimos porque, por exemplo, as micropartículas biotiniladas exibindo biotina-BSA que são combinadas com porções de ligação de biotina tendo dois ou mais domínios de ligação de biotina (por exemplo, avidina, SA, ou neutravidina) são propensas a se agregarem ou formarem grumos devido à reticulação das micropartículas biotiniladas através dos dois ou mais domínios de cada porção de ligação de biotina.

Micropartículas biotiniladas, por exemplo, revestidas com fixadores de ligante sintéticos ou biológicos (porções de ligação de biotina) compreendendo dois ou mais domínios de ligação de biotina por porção de ligação de biotina têm propensão a se agregarem ou formarem grumos devido à ligação de um domínio acessível, não-ocupado, de uma porção de ligação de biotina em uma micropartícula biotinilada com uma biotina (ligante) acessível não-ligada sobre uma outra partícula biotinilada. A agregação de micropartículas pode ser reduzida por titulação lenta (por exemplo, adição gota a gota) das micropartículas biotiniladas em uma solução continuamente misturada contendo uma concentração ou excesso molar de porções de ligação de biotina (por exemplo, avidina, SA, neutravidina, um fragmento de SA, um fragmento de avidina ou um fragmento de neutravidina). Essa abordagem por diminuir a agregação das micropartículas por saturação das biotinas da superfície da micropartícula com as moléculas de ligação de biotina antes que a reticulação possa ocorrer. Contudo, a abordagem de titulação não é de custo muito compensador ou robusto, já que há múltiplos parâmetros pa- ra controlar, e ela pode ser bastante cara devido ao custo de certas porções de ligação de biotina, mas que pode resultar em monodispersão de micro-partículas depois do revestimento com a porção de ligação de biotina escolhida. O uso de um copolímero em bloco, tal como Pluronic® pode ser uma melhor alternativa para a abordagem de titulação lenta mencionada a-cima. Pluronic® F108 (um copolímero em tribloco fabricado pela BASF) tem um grupo cabeça de polipropileno (PPO) hidrofóbico simples de cerca de 56 unidades monoméricas de comprimento, e duas cabeças de polietileno (PE-O) hidrofílicos de cerca de 129 unidades de comprimento. Os grupos cabeça de PPO de Pluronic® F108 agem como sondas hidrofóbicas e se ligam fortemente aos locais ou sítios hidrofóbicos sobre proteínas ou sobre superfícies de suporte de fase sólida tais como superfícies de suporte de micropar-tícula. Como resultado, Pluronic® F108 pode ser usado para romper a agregação de micropartículas devido às interações de proteína superficial (isto é, interações de proteínas hidrofóbicas ou iônicas). As caudas de EPO proporcionam microambientes hidrofílicos e podem agir como barreiras estéricas para impedir a reassociação da proteína devido à interação hidrofóbica ou iônica. Como resultado, uma vez que as micropartículas são tratadas com Pluronic® F108, elas são bastante hidrofílicas e são monodispersas em solução.

Uma modalidade da presente invenção proporciona ensaios de afinidade aperfeiçoados envolvendo micropartículas. Nessa modalidade, uma população de micropartículas dispersadas, tal como uma população monodispersa de micropartículas, é preparada usando-se um copolímero em bloco tal como Pluronic® F108 ou F127. As micropartículas dispersadas são então incorporadas a um ensaio de afinidade convencional. Porque as micropartículas estão dispersas, o ensaio de afinidade terá uma sensitividade aumentada (razão de sinal para ruído), acuidade aumentada dos ensaios, precisão aumentada dos ensaios (ensaios quantitativos), e reprodutibilidade aumentada dos ensaios (ensaios qualitativos).

Uma ilustração usando um copolímero em bloco em uma etapa de dispersão para o caso específico de Pluronic® F108 e uma micropartícula revestida com SA é mostrada na Figura 6 e na Figura 7. A Figura 7 mostra micropartículas com BSA biotinilada com razão de entrada baixa e bloqueada com Pluronic® F108 que são dispersas ou ressuspensas em 0,4% a 0,6% (p/v) de Pluronic® F108. Uma vez que as micropartículas biotiniladas estão monodispersas, SA é adicionada para revestir as micropartículas biotiniladas. Já que SA (p.m. de cerca de 56 kDa) é levemente menor que BSA (p.m. de cerca de 66 kDa), é provável que uma molécula de SA possa se ligar estericamente com uma molécula de biotina-BSA (mesmo que a BSA tenha múltiplas biotinas acessíveis). Além disso, nem toda molécula de BSA tem uma biotina disponível (vide discussão da distribuição de Poisson, acima). Portanto, o número total de moléculas de SA capturadas sobre a superfície de ligação será menor que o número total de moléculas de BSA acopladas à superfície de suporte, e SA será não-saturada (haverá menos que uma quantidade máxima de moléculas de SA por área de superfície unitária) sobre a superfície de ligação (vide Exemplo 11).

Depois de a superfície de suporte ser revestida com moléculas sintéticas biotiniladas ou biológicas (complexos de ligante::acoplador de suporte), ela pode ser usada para capturar ou capturar e orientar uma quantidade menos saturante de um fixador de ligante sintético ou biológico (porção de ligante de biotina) contendo dois ou mais domínios de ligação de ligante. Assumindo que os domínios de ligação de biotina estão localizados em extremidades ou lados opostos, ou aproximadamente opostos de cada porção de ligação de biotina, pelo menos um de seus domínios de ligação de biotina se ligará com uma biotina da fase sólida, ao passo que seu domínio de ligação de biotina remanescente que é oposto, ou aproximadamente oposto, estará disponível para se ligar com uma porção de captura biotinilada (por exemplo, anticorpo ou antígeno biotinilado).

Conforme discutido acima, as micropartículas biotiniladas podem ser revestidas com um fixador de ligante sintético ou biológico (porção de ligação de biotina) contendo dois ou mais domínios de ligação de biotina sem agregação de micropartículas por dispersão das micropartículas biotini-ladas em cerca de 0,4% a cerca de 0,6% de Pluronic® F108 (copolímero em tribloco) antes da adição da porção de ligação de biotina ou por titulação lenta (por exemplo, gota a gota) das micropartículas biotiniladas em um solução continuamente misturada contendo uma concentração muito alta ou um excesso molar das porções de ligação de biotina.

Na prática, micropartículas dispersas de Pluronic® F108 revestidas com BSA biotinilada de razão de entrada baixa em concentrações de cerca de 0,1% a cerca de 1,0% (p/v), ou alternativamente de cerca de 0,4% a cerca de 0,6% (p/v). Uma vez que as micropartículas biotiniladas tenham sido tratadas e dispersas em uma solução de cerca de 0,4% a cerca de 0,6% (p/v) de Pluronic® F108, os níveis ou quantidades baixas de SA podem ser adicionados às micropartículas sem a formação de agregados ou grumos de micropartículas. Esse processo resultou em monodispersão de micropartículas depois do revestimento da porção de ligação de biotina específica (por exemplo, SA). O processo apresenta uma relação de custo-benefício bem melhor que o método de titulação de micropartículas descrito acima, e é um método bastante robusto e reproduzível para revestir as micropartículas biotiniladas com fixadores sintéticos ou biológicos (porções de ligação de biotina) contendo dois ou mais domínios de ligação de biotina.

Assim, em pelo menos uma modalidade, o copolímero em bloco pode ser empregado em concentrações de cerca de 0,1% p/v a cerca de 1,0% p/v, ou de cerca de 0,4% a cerca de 0,6% (p/v) tanto para reduzir ligação não-específica como para auxiliar na promoção de uma monodispersão de micropartículas.

Um objetivo para criar uma superfície não-saturada e orientada é proporcionar uma fundação, ou base, para construir componentes para um ensaio de afinidade. Já que o complexo básico de ligante::acoplador de suporte construído de acordo com a invenção é não-saturado e orientado, quaisquer componentes construídos sobre este complexo de ligan-te::acoplador de suporte refletirá sua natureza não-saturada e orientação. Um exemplo de tal estrutura é mostrado na Figura 8. A Figura 8 mostra o revestimento das porções de captura biotini-ladas sobre uma superfície de ligação de micropartícula específica de biotina que foi preparada por (1) revestimento da superfície com BSA biotinilada de razão de entrada baixa; (2) bloqueio da superfície com copolímero em triblo-co, Pluronic® F108, (3) dispersão das micropartículas de Pluronic® F108 antes da adição da porção de ligação de biotina sintética ou biológica (por e-xemplo, SA) contendo dois ou mais domínios de ligação de biotina, e (4) adição de SA à superfície. A micropartícula revestida com SA resultante pode ser usada para orientar e capturar uma quantidade não saturante de qualquer porção de captura biotinilada de interesse. A Figura 8 ilustra como a micropartícula revestida com SA é u-sada para orientar e capturar uma quantidade não saturante de certas porções de captura biotiniladas de interesse, incluindo (A) fragmentos Fab de anticorpos (a ausência da região Fc do Ig pode reduzir ou mitigar os problemas de ligação não-específica); (B) imunoglobulinas (anticorpos policlonais e/ou monoclonais); e (C, D, e E) moléculas pequenas, médias, e/ou grandes, respectivamente, se elas são sintéticas ou biológicas. Qualquer uma das porções de captura biotiniladas de interesse pode compreender um espaça-dor, por exemplo, entre a molécula e a porção de biotina.

Espaçadores podem ser particularmente úteis no caso de moléculas biotiniladas que são relativamente pequenas. Já que os domínios de ligação de biotina na molécula de SA estão encobertos 9 angstrons abaixo da superfície, as moléculas pequenas biotiniladas (por exemplo, aquelas tendo um peso molecular de menos que cerca de 1.000 Da) podem não ser detectáveis por traçadores de imunoensaios maiores (fixadores detectáveis) devido ao impedimento estérico. Uma capacidade de ligação maior e sensiti-vidade de ligação maior podem ser percebidas usando-se derivados de biotina que têm braços espaçadores ligados a eles, ou por conjugação da molécula pequena com uma molécula biotinilada maior (isto é, uma molécula carreadora).

Até onde elas são úteis, as diretrizes para distinguir moléculas pequenas de moléculas médias ou grandes podem ser expressas da seguin- te forma: as moléculas pequenas são geralmente consideradas como sendo de peso molecular menor que cerca de 5.000 Da; moléculas médias são geralmente consideradas como sendo de peso molecular de cerca de 5.000 ou mais a cerca de 150.000 Da; moléculas grandes são consideradas com sendo aquelas acima de cerca de 150.000 Da de peso molecular.

Certos aspectos da invenção na preparação das micropartículas com superfície de ligação de acordo com a invenção são ilustrados nas Figuras 9A e 9B.

As Figuras 9A e 9B ilustram a orientação e o revestimento de uma quantidade menos saturante de anticorpos biotinilados, ou Fragmentos Fab, sobre as micropartículas de ligação de biotina (por exemplo, micropartículas revestidas com SA) preparadas de acordo com a invenção. PMPs revestidas com SA preparadas de acordo com a invenção podem aperfeiçoar a sensitividade de um imunoensaio (aumentar a razão de sinal para ruído), já que a fase sólida de ligação de biotina pode ser usada para orientar e capturar menos que uma quantidade saturante de uma porção de captura biotinilada tais como, por exemplo, anticorpos biotinilados específicos de analitos ou fragmentos Fab. A sensitividade do ensaio é aperfeiçoada porque um decréscimo no número total de moléculas de SA por área de superfície suporte de cada micropartícula revestida com SA resulta em capacidade de ligação de anticorpo de captura biotinilado reduzida, mas em aperfeiçoado desempenho de anticorpo de captura biotinilado devido à liberdade estérica. Ou seja, o propósito de proporcionar uma quantidade de moléculas de SA menor que a máxima sobre uma superfície é aperfeiçoar a liberdade estérica de cada molécula de SA para ligação às porções de captura biotiniladas grandes (por exemplo, anticorpos biotinilados), e para aperfeiçoar a eficácia de ligação de cada molécula de SA. A Figura 9A ilustra uma superfície de micropartícula revestida com SA convencional ou padrão, em que a SA é revestida diretamente sobre a superfície por amina primária ou por outra química de acoplamento; e a superfície é bloqueada usando-se BSA. Sobre tal superfície convencional ou padrão, a molécula de SA não está especificamente não-saturada ou orien- tada sobre a superfície; ou seja, a ligação é aleatória. Adição de um anticorpo biotinilado ou fragmento Fab resulta em uma superfície de ligação que não seja predominantemente não-saturada ou orientada, já que SA sobre a superfície é aleatoriamente orientada. Concentração de anticorpos ou de Fab pode criar barreiras estéricas (acessibilidade baixa) e diminuem a eficácia de captura de antígeno, particularmente se o antígeno é uma molécula grande. A Figura 9B ilustra uma superfície de ligação de micropartícula revestida com SA feita de acordo com a invenção. Sobre essa superfície de ligação, as moléculas de SA são não-saturadas (um decréscimo das moléculas totais de SAA por área de superfície de ligação unitária de uma micropartícula) e orientadas sobre a superfície. A superfície de suporte de micropartícula é covalentemente revestida com a BSA biotinilada de razão de entrada baixa, e bloqueada com Pluronic® F108. As micropartículas biotiniladas são então dispersas em Pluronic® F108 antes da adição de SA. A ligação de SA é específica e não-aleatória. A ligação do anticorpo biotinilado ou do fragmento Fab biotinilado à superfície de ligação de micropartícula de SA feita de acordo com a invenção é não-saturada e orientada porque a molécula de SA é também não-saturada e orientada sobre a superfície de ligação. A orientação e a natureza menos que saturada do anticorpo biotinilado ou do fragmento Fab biotinilado promove eficácia de captura de antígenos (analito) (sinal é aumentado), particularmente se o antígeno é uma molécula grande. Além disso, a superfície da micropartícula é hidrofílica devido ao bloqueador de Pluronic® F108, e a ligação não-específica à superfície é minimizada ou eliminada (ruído é reduzido).

Uma outra característica da invenção é ilustrada na Figura 10, que mostra a área de superfície disponível aumentada associada a uma mo-nodispersão de micropartículas. A Figura 10, painel A, ilustra que agregado ou aglutinado de micropartículas devido às interações na superfície de micropartícula com micropartícula. Essa agregação reduzirá tanto (1) a área de superfície de mi- cropartícula total, já que qualquer área dentro do agregado não está esteri-camente disponível (acessível), e (2) a capacidade de ligação e eficácia da porção de ligação de biotina (por exemplo, SA) sobre a superfície de ligação, resultando em sinal de ensaio reduzido. A Figura 10 painel B mostra que as micropartículas de acordo com a invenção têm área de superfície de ligação aumentada, o que resulta em capacidade de ligação aperfeiçoada e eficácia de ligação aperfeiçoada da porção de ligação de biotina (por exemplo, SA) sobre a superfície de ligação, resultando em sinal de ensaio aumentado. As micropartículas monodis-persas têm área de superfície total maior que as micropartículas agregadas ou grumos de micropartículas, e proporcionarão cinética de ensaio aperfeiçoada devido às taxas de colisão aumentadas e distância de difusão de ensaio diminuída.

As micropartículas de acordo com a invenção são desenhadas de modo que a superfície de ligação da BSA biotinilada de razão de entrada baixa seja bloqueada com um copolímero em bloco tal como um copolímero em tribloco Pluronic® F108 antes da adição das moléculas de SA conforme discussão acima. Naturalmente, o Pluronic® F108 é somente um exemplo da mesma modalidade. É para ser entendido que qualquer copolímero em bloco da mesma invenção pode ser usado desse modo.

As micropartículas de acordo com a invenção são feitas usando-se biotina como um ligante, e outro BSA ou ovalbumina como um acoplador de suporte. As micropartículas revestidas com SA foram feitas também, bem como as micropartículas com porções de captura específicas. Os resultados desses estudos são discutidos abaixo e nos Exemplos. O efeito de variar razões de entrada molares da biotina em reações de biotinilação foi estudado, e é apresentado no Exemplo 1. A biotinila-ção de BSA em várias razões de entrada molares da biotina para BSA, variando de 3,4:1 para 30:1 foi conduzida, o grau de biotinilação determinado, e a estabilidade a 4°C e 37°C foi determinada (vide Tabela 1). Decréscimos de estabilidade refletem pelo menos em parte a retirada ou dissociação da biotina ou do reagente de biotina dos conjugados de biotina-BSA (vide Figura 11). Os resultados indicaram que a biotina-BSA preparada em razões de entrada molares de biotina (por exemplo, 8:1, 15:1, e 30:1) exibe fraca estabilidade, mas conforme a razão de entrada molar do reagente de biotina para BSA decresce de 30:1 para 4:1, há um aperfeiçoamento da estabilidade de 4% a 100%. Assim, a seleção de um razão de entrada relativamente baixa de ligante para acoplador de suporte, e associar o complexo de ligan-te::acoplador de suporte a uma fase sólida, resulta em uma superfície de ligação mais estável que as superfícies de ligação preparadas convencionalmente tendo a biotina como um ligante. A preparação de uma superfície de ligação não-saturada por revestimento de um suporte com um complexo de ligante::acoplador de suporte preparado em qualquer razão de entrada (e particularmente com complexos de ligante::acoplador de suporte preparados em uma razão de entrada alta para acoplador de suporte) pode ser facilitada por adição de um dis-persante adequado ao complexo de ligante: :acoplador depois de sua preparação, mas antes dele ser revestido sobre a superfície de suporte. Disper-santes adequados para este método são discutidos aqui. Uma ilustração é fornecida aqui para o uso de um agente de dispersão adequado com biotina-SA preparada em uma razão de entrada baixa de biotina para BSA para preparar uma superfície não-saturada, embora o método que emprega um agente de dispersão não esteja limitado a revestimentos biotinilados. É proporcionado um método para fazer uma superfície de ligação não-saturada usando um agente de dispersão adequado para impedir a agregação dos suportes de fase sólida, tais como, por exemplo, micropartí-culas. O método é baseado pelo menos em parte na observação que uma preparação relativamente dispersa (por exemplo, aproximadamente mono-dispersa) das micropartículas é desejável. O método pode ser empregado no qual a agregação das micropartículas pode ocorrer, por exemplo, em que o ligante é biotina e a biotina é revestida com SA. O método de dispersão é particularmente útil quando o fixador de ligante é pelo menos bivalente, ou seja, quando uma porção de ligação de biotina, simples, pelo menos bivalente, tal como SA pode reticular uma biotina de uma molécula de biotina-BSA sobre uma outra partícula. Uma ilustração do método de dispersão é proporcionada aqui para uma modalidade em que o complexo de ligante::acoplador de suporte é biotina-BSA, e o fixador de ligante (porção de ligação de biotina) é SA, abaixo e no E-xemplo 2. Contudo, conforme previamente examinado, o método não está limitado às superfícies de ligação de biotina/SA.

Agentes de dispersão tais como, por exemplo, copolímeros em bloco podem ser usados em um método para fazer uma superfície de ligação não-saturada. Na ilustração aqui fornecida, os copolímeros em bloco são usados como agentes de dispersão para micropartículas revestidas como complexos de ligação de biotina sintéticos ou biológicos (fixadores de ligante) compreendendo dois ou mais domínios de ligação de biotina. Na ilustração fornecida aqui, o copolímero em bloco Pluronic® F108 é empregado; contudo, o método não está limitado ao copolímero em bloco particular da ilustração.

Geralmente, a Figura 7 ilustra o revestimento de uma superfície biotinilada, sintética ou biológica, com porções de ligação de biotina sintéticas ou biológicas (fixadores de ligante) contendo dois ou mais domínios de ligação de ligante de biotina. Mais especificamente, a Figura 7 ilustra o revestimento contendo SA sobre uma superfície de ligação de micropartícula de BSA biotinilada de razão de entrada baixa bloqueada com Pluronic® F108 e dispersa em Pluronic® F108 antes da adição de SA.

Os métodos e composições fornecidos aqui podem ser usados na preparação de um revestimento não-saturado para uma superfície de suporte de fase sólida, em que o revestimento compreende um complexo de ligante::acoplador de suporte acoplado a uma superfície de suporte, um fixador de ligante (porção de ligação de biotina) associado ao ligante do complexo de ligante::acoplador de suporte e uma porção de captura (por exemplo, uma porção de captura biotinilada) associada ao fixador de ligante. A porção de captura pode ser selecionada de modo a facilitar a captura de qualquer molécula de interesse, tal como um analito. É fornecida uma ilustração abaixo e na Figura 8 de um sistema de botina/SA, mas a invenção não está limitada a um sistema de biotina/SA.

Superfícies de ligação não-saturadas podem ser desenhadas por orientação e associação menor que uma quantidade saturante de fixadores de ligante sintéticos ou biológicos (porções de ligação de biotina) contendo dois ou mais domínios de ligação de biotina sobre uma superfície de suporte. As superfícies podem ser ilustradas por um exemplo que oriente e forneça uma quantidade menor que saturante de SA sobre a superfície de micropartículas, por exemplo, PMPs. A Figura 8 ilustra uma superfície de ligação não-saturada e orientada feita de porções de captura sobre uma ligação de micropartícula de ligação de biotina que foi preparada por (1) revestir a superfície com BSA biotinilada de razão de entrada baixa; (2) bloquear a superfície com o copolímero em tribloco Pluronic® F108; (3) dispersar as micropartículas em Pluronic® F108 (antes de adicionar as porções de ligação de biotina sintéticas ou biológicas contendo dois ou mais domínios de ligação de biotina); e (4) adicionar SA como porção de ligação de biotina. Como mostrado na Figura 8, as micropartículas revestidas com SA podem ser usadas para orientar e/ou capturar uma quantidade menor que saturante de porções de captura biotiniladas, por exemplo: (A) fragmentos Fab de anticorpos (a ausência da região Fc pode diminuir ou mitigar os problemas de ligação não-específica); (B) imunoglobulinas (anticorpos policlonais e/ou monoclonais); e (C, D, e E) moléculas pequenas, médias, e/ou grandes, respectivamente, se fossem sintéticas ou biológicas. A Figura 8 ilustra porções de captura biotiniladas sobre uma superfície de ligação não-saturada empregando um sistema de biotina/SA. BSA biotinilada de razão de entrada baixa covalentemente ligada à superfície de uma micropartícula é bloqueada com o copolímero em tribloco Pluronic® F108, as micropartículas são dispersadas em Pluronic® F108 antes de adicionar SA, SA é adicionada, e então uma porção de captura biotinilada desejada é exposta à superfície revestida com SA não-saturada. Os exemplos de porções de captura biotiniladas mostradas incluem (da esquerda para a direita na Figura 8: fragmento Fab biotinilado (p.m. de cerca de 30.000 Da), anticorpo biotinilado (IgG, p.m. de cerca de 150.000 Da); molécula pe- quena biotinilada, ou molécula pequena biotinilada com um braço espaçador (por exemplo, p.m. menor que cerca de 5.000 Da); molécula média biotinilada, ou molécula média biotinilada como um carreador para uma molécula pequena (por exemplo, p.m. de cerca de 5.000 Da a cerca de 150.000 Da); e molécula grande biotinilada (por exemplo, p.m. mais que cerca de 150.000 Da). Como pode ser visto da Figura 8, a natureza orientada e não-saturada da biotina-BSA na superfície do suporte de fase sólida é refletida em uma superfície revestida com SA não-saturada, e também em um revestimento de porção de captura não-saturada. Grupos de cabeça hidrofóbica de Pluro-nic® F108 são mostrados associados à superfície de suporte, e grupos de cauda hidrofílica de Pluronic® F108 são mostrados se estendendo para longe da superfície de suporte.

Superfícies de ligação não-saturadas de acordo com a invenção têm tipicamente capacidade de ligação menor que as superfícies de ligação comercialmente disponíveis. Um exemplo é proporcionado empregando um sistema de biotina/SA (vide Tabela 2, Exemplo 2). Um suporte revestido com menos moléculas de SA por área de superfície unitária terá inerentemente uma capacidade reduzida de ligação à biotina, já que a superfície terá menos sítios de ligação de biotina. A finalidade de proporcionar uma quantidade de moléculas de SA menor que a máxima sobre uma superfície é de aperfeiçoar a liberdade estérica de cada molécula de SA de se ligar a porções de captura biotiniladas grandes (por exemplo, anticorpos biotinilados), e para aperfeiçoar a eficácia de ligação de cada molécula de SA. O Exemplo 2 ilustra que ter uma quantidade orientada e menor que saturante de uma molécula sobre uma superfície ligante reduziu a capacidade de ligação, mas aumentou o sinal de ensaio, resultando em uma superfície de ligação melhor e mais eficaz para um ensaio de afinidade. As mi-cropartículas de acordo com a invenção exibem capacidade de ligação diminuída em comparação com os produtos análogos, convencionais ou padrão, comercialmente disponíveis (vide, por exemplo, a Tabela 2), mas desempenho de ensaio intensificado (vide, por exemplo, a Tabela 3 e a Tabela 4). As razões de sinal para ruído aumentadas devido ao resíduo menor e reposta ao sinal aumentada refletem desempenho de ensaio intensificado. No total, os resultados suportam que a invenção possibilita a produção de micropartí-culas revestidas com SA com capacidade de ligação menor que as micropar-tículas revestidas com SA comercialmente disponíveis, mas desempenho de ensaio aumentado devido à orientação de estretavidina e acessibilidade es-térica sobre a superfície da micropartícula, e novo bloqueio de superfície de ligação. O Exemplo 3 mostra que as micropartículas de acordo com a etapa de dispersão da invenção resultam em uma população monodispersa de micropartículas substancialmente isentas de agregados ou grumos. O Exemplo 4 mostra que as micropartículas de acordo com a invenção, em uma modalidade específica de uma micropartículas revestida com SA, em contraste com as micropartículas convencionais ou padrão, exibem características de razão de sinal para ruído mais favoráveis, bloqueio de superfície aumentado, e eficácia de ligação aperfeiçoada. O Exemplo 5 ilustra a redução da ligação não-específica quando são empregadas as micropartículas de acordo com a invenção. A ligação não-específica nas micropartículas de acordo com a invenção é reduzida de acordo com a invenção mesmo em ensaios nos quais os analitos têm uma preferência associada a um revestimento sobre a fase sólida, tal como a preferência de hormônios da tireóide tais como T3 (triiodotironina) e T4 (tiroxina) para BSA. O Exemplo 6 estabelece através de estudos de validação que o processo inventivo para revestir um suporte é reproduzível e confiável, uma característica desejável para ensaios de afinidade para diagnóstico. O Exemplo 7 mostra que as micropartículas de acordo com a invenção exibem estabilidade intensificada em lotes de validação múltipla, para a modalidade particular de micropartículas revestidas com SA. O E-xemplo 8 estabelece que a retirada do ligante nas micropartículas inventivas não é um problema, e o Exemplo 9 mostra superfícies de ligação de acordo com a invenção feitas com ovalbumina em vez de BSA.

Embora muito da discussão e muitos dos Exemplos descrevam a preparação de superfícies não-saturadas por revestimento de uma superfície de suporte com um acoplador de suporte tendo um ligante complexado a ele, em que o acoplador de suporte compreende uma proteína, superfícies de ligação não-saturadas ou não-saturadas e orientadas podem ser obtidas usando a invenção em uma variedade de modos. Por exemplo, o acoplador de suporte pode ser uma não-proteína tal como, por exemplo, um polímero. O polímero pode ser funcionalizado para reagir e se complexar com o ligante, ou pares de polímero/ligante podem ser selecionados de modo que grupos funcionais naturalmente presentes no polímero ligar-se-ão com uma funcionalidade sob um conjunto específico de condições. O número de grupos reativos, ou funcionais no polímero pode ser controlado por inativação de alguns dos grupos reativos, permitindo, assim, que menos ligante fique ligado por molécula de polímero.

Os complexos de polímero/ligante podem ser também diluídos com ligante carecendo de polímero, e a mistura diluída pode ser usada para revestir uma superfície de suporte para fazer uma superfície de ligação não-saturada ou não-saturada e orientada. Um tipo de polímero, ou uma mistura de polímeros, pode ser usado.

Por conseguinte, em várias modalidades, a invenção compreende um suporte que contém uma superfície de ligação para um ensaio de afinidade, compreendendo ligantes ligados a polímeros, em que os ligantes não são saturados ou não são saturados e orientados sobre a superfície. O suporte compreendendo o ligante pode ser então tratado de acordo com qualquer método adequado descrito aqui. Em várias modalidades, a superfície compreende uma mistura de polímero sem qualquer ligante anexado, e polímeros com ligante anexado. Em várias modalidades, o suporte é uma micropartícula, a superfície de ligação é bloqueada com um copolímero em bloco, o ensaio é um imunoensaio, e o ligante se liga um pelo fixador de ligante bivalente que ele próprio pode se ligar com uma porção de captura, tal como uma imunoglobulina modificada ou não modificada ou fragmento da mesma.

Em certas modalidades, um ligante pode ser acoplado direta- mente sobre uma superfície de suporte sem o uso de um acoplador de suporte. Nessas modalidades, uma superfície de suporte tendo grupos funcionais capazes de reagirem com um ligante é exposta ao ligante sob condições suficientes para o ligante se ligar ao suporte. Em várias modalidades, a ligação é uma ligação covalente entre um ligante ativado e a superfície de suporte, que pode ser também ativada. A não-saturação do ligante pode ser obtida por controle do número de ligantes que se ligam à superfície de suporte. Em várias modalidades, a superfície de suporte compreende uma pluralidade de grupos funcionais capazes de reagirem com o ligante sob um dado conjunto de condições. A superfície de suporte pode ser tratada de modo a reduzir o número de grupos funcionais que são capazes de reagirem com o ligante, ou por manipulação das condições reacionais ou por adição de um agente que reduz o número de grupos funcionais sobre a superfície de suporte. A superfície de suporte que compreende o ligante pode ser então tratada de acordo com qualquer método adequado descrito aqui.

Por conseguinte, a presente invenção também proporciona uma superfície de suporte revestida com um ligante, em que o ligante está não-saturado sobre a superfície de suporte. Em várias modalidades, a superfície de ligação é bloqueada com um copolímero em bloco, o ensaio é um imuno-ensaio, e o ligante liga um pelo menos fixador de ligante bivalente que por si próprio pode se ligar com uma porção de captura, tal como uma imunoglobu-lina modificada ou não modificada ou fragmento da mesma. Em várias modalidades, a densidade de ligante sobre a superfície de suporte está dentro das faixas descritas aqui para as modalidades que descrevem o ligante ligado aos acopladores de suporte. Qualquer ligante adequado pode ser usado para se ligar diretamente a uma superfície de suporte, tais como, por exemplo, imunoglobulinas ou fragmentos das mesmas, oligonucleotídeos, e lecti-nas. Como em outras modalidades, o ligante pode compreender um fixador, e o fixador pode ser anexado à superfície de suporte. A presente invenção proporciona orientação e associação de uma quantidade menor que saturação tal como SA sobre a superfície de uma micropartícula (por exemplo, uma PMP). Superfícies de ligação de bio- tina comercialmente disponíveis (por exemplo, Dynal® DYNABEADS® MyOne Estreptavidina T1, e DYNABEADS M-280 Estreptavidina) são desenhadas para terem capacidade de ligação de biotina máxima. Superfícies de ligação de biotina comercialmente disponíveis são tipicamente produzidas por revestimento direto da SA ou de outras moléculas de ligação de biotina sobre uma superfície de micropartícula. Em contraste, a presente invenção proporciona micropartículas de revestimento com BSA biotinilada de razão de entrada baixa, bloqueio das micropartículas de biotina-BSA com Pluronic® F108, dispersão das micropartículas de biotina-BSA bloqueada em Pluronic® F108, e finalmente revestimento das micropartículas de biotina-BSA com SA.

As micropartículas de acordo com a invenção exibem características de razão de sinal para ruído mais favorável devido à não-saturação e orientação, bloqueio da superfície intensificada, e eficácia de ligação aperfeiçoada. Isso é demonstrado para micropartículas de BSA biotinilada de razão de entrada baixa revestidas com SA, conforme mostrado nos Exemplos.

Os métodos e composições da invenção podem ser usados em combinação com qualquer ensaio adequado conhecido da técnica, por e-xemplo, qualquer ensaio de afinidade adequado ou imunoensaio conhecido da técnica, em que a superfície não-saturada ou não-saturada e orientada pode ser usada vantajosamente, incluindo, mas sem-limitação, ensaios de afinidade de proteína-proteína, ensaios de afinidade de proteína-ligante, ensaios de afinidade de ácido nucleico, ensaios de anticorpos fluorescentes indiretos (IFAs), ensaios imunoabsorventes ligados a enzimas (ELISAs), ensaios diretos ou indiretos, ensaios competitivos, ensaios intercalados etc. Formatos de ensaios adequados incluem, mas sem-limitação, ensaios ou formatos empregados nos Exemplos aqui.

Os métodos e composições da invenção podem ser usados em conexão com qualquer suporte, por exemplo, um suporte sólido adequado, conhecido da técnica. Exemplos de tais suportes de fase sólida são discutidos, mas a invenção não é limitada aos suportes explicitamente discutidos. Por exemplo, os suportes de fase sólida não estão limitados aos suportes particulados, às micropartículas, às micropartículas de poliestireno, às placas de microtítulo, aos tubos revestidos etc. Outros suportes de fase sólida podem ser usados com a invenção, incluindo, mas sem-limitação, quaisquer suportes sólidos conhecidos da técnica que são usados em conexão com ensaios de afinidade. Por exemplo, suportes de fase sólida que compreendem nitrocelulose forrada com Mylar e/ou náilon podem ser usados. Suportes de fase sólida que compreendem filtros ou membranas, por exemplo, podem ser usados. Suportes de fase sólida que compreendem microtúbulos, nanopartículas, ou nanotubos, por exemplo, nanotubos de carbono, podem ser usados. Os suportes de fase sólida podem compreender partículas de qualquer tamanho e suportes de fase sólida que têm uma área de superfície planar grande podem ser usados.

Os métodos e composições da invenção podem ser usados em conexão com qualquer ensaio em que uma razão de sinal para ruído, aperfeiçoada, seja desejada. Por exemplo, uma superfície de ligação de acordo com a invenção que é não-saturada e tratada com um copolímero em bloco adequado, tal como, por exemplo, um Pluronic®, pode ser preparada sobre um suporte de fase sólida planar ou substancialmente planar para uso em ensaio de fluxo lateral e/ou ensaio de difusão. Um exemplo de um ensaio de fluxo lateral é aquele em que uma amostra é colocada sobre uma superfície de ligação (imobilizada ou não) e um ou mais reagentes analíticos em uma fase líquida são passados sobre a amostra (em um ensaio de difusão, por difusão sobre a superfície), e o analito é detectado e/ou quantificado por um sinal adequado quando contatado com um reagente na fase líquida. Um outro exemplo de um ensaio de fluxo lateral é aquele em que um ou mais reagentes analíticos são colocados sobre uma superfície de ligação (imobilizada ou não), e uma amostra em uma fase líquida é passada sobre o um ou mais reagentes analíticos (em um ensaio de difusão, por difusão sobre a superfície), e um analito na amostra é detectado e/ou quantificado sobre a superfície de ligação. Um outro exemplo de um ensaio de fluxo lateral é um bastão de imersão compreendendo uma superfície de ligação não-saturada de a-cordo com a invenção. Os ensaios de fluxo lateral e/ou de difusão não estão limitados ao movimento do líquido através de uma superfície de ligação de um suporte planar; tais ensaios incluem mover o líquido através de uma membrana ou filtro, em que a membrana ou filtro compreende uma superfície de ligação não-saturada. Por conseguinte, em várias modalidades, uma superfície de ligação para um ensaio de fluxo lateral e/ou para um ensaio de difusão é proporcionada, bem como métodos e composições para fazer uma superfície de ligação para um ensaio de fluxo lateral e/ou um ensaio de difusão, de acordo com qualquer uma das modalidades descritas aqui.

Em um outro aspecto, é proporcionado o uso de qualquer um dos métodos e composições aqui em um imunoensaio. Em várias modalidades, é proporcionado o uso de um suporte tendo uma superfície de ligação não-saturada compreendendo uma pluralidade de acopladores de suporte disposta sobre o suporte e ligantes acoplados com os acopladores de suporte, em que os ligantes são não-saturados e são orientados sobre a superfície de um modo que proporciona ligantes estericamente acessíveis, em um i-munoensaio. Em uma modalidade específica, uma micropartícula tendo uma superfície de ligação compreendendo uma proteína biotinilada (complexo de ligante::acoplador de suporte), uma pelo menos porção de ligação de biotina bivalente selecionada de avidina, SA, neutravidina, um fragmento de SAA, um fragmento de avidina, um fragmento de neutravidina, ou misturas dos mesmos em associação com a porção de biotina (porção de captura biotinilada) em associação com a pelo menos porção de ligação de biotina (fixador de ligante) é usado em um imunoensaio para um analito de interesse, por exemplo, um antígeno, em uma amostra. Em uma outra modalidade, a pelo menos porção de ligação de biotina bivalente que é associada à porção de biotina da proteína biotinilada é associada a um antígeno biotinilado ou fragmento do mesmo (porção de captura biotinilada) e a micropartícula é usada em um imunoensaio para um analito de interesse, por exemplo, um anticorpo na amostra. As características das composições, e métodos para fazer as composições, usadas nos imunoensaio, incluem quaisquer das características (incluindo, por exemplo, modalidades específicas que revelam a densidade dos componentes da superfície) descritas aqui.

Os métodos, as composições, e os kits da invenção podem ser aplicados para uso com qualquer sistema de imunoensaio adequado. Exemplos de sistemas de imunoensaio adequados incluem, mas sem-limitação, o Sistema de Imunoensaio Access®, o Sistema de Imunoensaio Unicel® Dxl 800 Access®, o Sistema de Imunoensaio Access® 2, Sistema Clínico Sync-hron LXi®, o Sistema de Imunoensaio UniCel® Dxl 800, o Sistema de Imuno-química IMMAGE® (todos da Beckman Coulter, Inc.), e o sistema Triage® (Biosite, Inc.). Um sistema em série de imunoensaios é o sistema de Micro-ensaio A2® (Beckman Coulter, Inc.).

Relacionada abaixo está uma lista não-limitativa de substâncias que podem funcionar como uma ou alternativamente como o outro membro de um par de ligações consistindo em ligante de analito (porção de captura) e analito, dependendo da aplicação para a qual um ensaio de afinidade é para ser desenhado. Tais substâncias podem ser usadas, por exemplo, como porções de captura (fixadores de analito) ou podem ser usadas para gerar porções de captura (por exemplo, por emprego das mesmas como hap-tenos/antígenos para gerar anticorpos específicos) que podem ser usadas com a invenção. Ensaios de afinidade, inclusive imunoensaios, podem ser desenhados de acordo com a invenção para detectar a presença e/ou nível de tais substâncias em que elas são os analitos em uma amostra. Em uma modalidade específica, as porções de captura de ligação de analito da invenção podem ser usadas para detectar essas substâncias como analitos em uma amostra do seguinte modo: as porções de captura podem ser bioti-niladas e associadas a uma superfície de suporte de fase sólida revestida com SA de acordo com a invenção (por exemplo, com um revestimento de BSA biotinilada de razão de entrada baixa, com SA sobre ele) e usadas para capturar tais substâncias. Alternativamente, as substâncias listadas abaixo podem ser biotiniladas e associadas a uma superfície de suporte de fase sólida revestida com SA de acordo com a invenção, e usadas para capturar moléculas que interagem com elas (tais como, por exemplo, anticorpos ou fragmentos específicos para as substâncias listadas, proteínas de ligação, ou enzimas).

Uma lista não-limitativa de substâncias que podem funcionar como um, ou alternativamente como o outro, membro de um par de ligações consistindo em fixador de analito (porção de captura) e analito inclui: óxido nítrico sintase induzível (iNOS), CA19-9, IL-1a, IL-1 β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-t, IL-5, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, slL-2R, slL-4R, slL-6R, antígeno do núcleo de SIV, IL-1RA, TNF-α, IFN-gama, GM-CSF; isoformas de PSA (antígeno específico da próstata) tais como PSA, pPSA, BPSA, inPSA, PSA complexado com não-a-i-antiquimotripsina, PSA complexado com a-i-antiquimotripsina, calicreínas da próstata tais como hK2, hK4, e Hk15, ek-rhK2, Ala-rhK2, TWT-rhK2, TWT-rhK2, Xa-rhK2, Xa-rhK2, HWT-rhK2, e outras calicreínas; HIV-1 p24; ferritina. L ferritina, troponina I, BNP, leptina, digoxina, mioglobi-na, peptídeo natriurético do tipo B ou peptídeo natriurético do cérebro (BNP), peptídeo natriurético atrial (ANP); hormônio do crescimento humano, fosfa-tase alcalina óssea, hormônio estimulador do folículo humano, hormônio lu-teinizante humano, prolactina; gonadotropina coriônica humana (por exemplo, CGa, CGp); tiroglobulina; antitiroglobulina; IgE, IgG, lgG1, lgG2, lgG4, antígeno da B. anthracis, fator letal da B. anthracis, antígeno do esporo da B. anthracis, LPS, enterotoxina B de S. aureas, antígeno F1 capsular da Y. pes-tis, insulina, alfa fetoproteína (por exemplo, AFP 300), antígeno carcinoem-briônico (CEA), antígeno CA 15.3, antígeno CA 19.9, antígeno CA 125, HAV Ab, HAV Igm, HBc Ab, HBc Igm, HIV1/2, HBsAg, HBsAb, HCV Ab, anti-p53, histamina; neopterina; s-VCAM-1, serotonina, sFas, ligante de sFas, sGM-CSFR, slCAM-1, timidina quinase, IgE, EPO, fator intrínseco Ab, haptoglo-bulina, anticardiolipina, anti-dsDNA, anti-Ro, Ro, anti-La, anti-SM, SM, anti-nRNP, anti-histona, anti-Scl-70, Scl-70, anticorpos antinucleares, anticorpos anticentrômeros, SS-A, SS-B, Sm, U1-RNP, Jo-1, CK, CK-MB, CRP, albumi-na modificada por isquemia, HDL, oxLDL, VLDL, troponina T, troponina I, microalbumina, amilase, ALP, ALT, AST, GGT, IgA, IgG, prealbumina, anti-estreptolisina, clamídia, IgG de CMV, toxo IgG, toxo IgM, apolipoproteína A, apolipoproteína B, C3, C4, fator B de properdina, albumina, arácido glico-proteína, ai-antitripsina, αι-microglobulina, a2-macroglobulina, antiestreptoli-sina O, antitrombina-lll, apoliproteína A1, apoliproteína B, p2-microglobulina, ceruloplasmina, complemento C3, complemento C4, proteína reativa C, DNase B, ferritina, cadeia leve capa livre, cadeia leve lambda, haptoglobina, imunoglobulina A, imunoglobulina A (CSF), imunoglobulina E, imunoglobuli-na G, imunoglobulina G (CSF), imunoglobulina G (urina), subclasses da i-munoglobulina G, imunoglobulina M, imunoglobulina M (CSF), cadeia leve capa, cadeia leve lambda, lipoproteína (a), microalbumina, prealbumina, fator B de properdina, fator reumatóide, ferritina, transferrina, transferrina (urina), IgG de rubéola, anticorpo de tiroglobulina, IgM do IgG, proteína de ligação do IGF (IGFBP)-3, hepsina, pim-1-quinase, E-caderina, EZH2, e uma a-metilacil-CoA racemase, TGF-beta, IL6SR, GAD, IA-2, CD-64, neutrófilos CD-64, CD-20, CD-33, CD-52, isoformas de citocromo P450, s-VCAM-1, sFas, sICAM, antígeno de superfície da hepatite B, tromboplastina, HIV p24, HIV gp41/129, HCV C22, HCV C33, hemoglobina A1c, e GAD65, IA2.

Substâncias adequadas que podem funcionar como um, ou alternativamente, como o outro, membro de um par de ligação que consiste em fixador de analito (porção de captura) e analito, dependendo da a-plicação para a qual um ensaio de afinidade é para ser desenhado, e que podem ser usadas com a presente invenção incluem também porções, tais como, por exemplo, anticorpos ou fragmentos dos mesmos, específicos para qualquer uma das WHO International Biological Reference Pre-parations mantidas e caracterizadas, e/ou distribuídas por WHO Interatio-national Laboratories for Biological Standards (disponíveis em http:/www.who.int/bloodproducts/re_materials, atualizado a partir de 30 de junho de 2005, que lista substâncias que são bem conhecidas da técnica; a lista está aqui incorporada a título de referência).

Uma lista parcial de padrões de referência internacionais adequados, identificados pelo código WHO, em parênteses, seguinte à substância, inclui: tromboplastina recombinante humana (rTF/95), tromboplastina de coelho (RBT/90), anticorpo estimulador de tireóide (90/672), ativador de plasminogênio de tecidual humano recombinante (98/714), uroquinase de alto peso molecular (87/594), antígeno específico da próstata (96/668), antígeno específico da próstata 90:10 (96/700); proteína C plasmática humana (86/622), proteína S plasmática humana (93/590), soro de artrite reumatóide (W1066), proteína amilóide A sérica (92/680), estreptoquinase (00/464), trombina humana (01/580), tromboplastina combinada bovina (OBT/79), i-munoglobulina intravenosa de controle positivo anti-D (02/228), anticorpos de células da ilhota (97/550), lipoproteína a (IFCC SEM 2B), DNA do parvo-vírus humano B19 (99/800), plasmina humana (97/536), inibidor 1 de ativa-dor de plasminogênio humano (92/654), fator de plaquetário 1 (92/654), fator plaquetário 4 (83/505), ativador de precalicreína (82/530), controle de CJD do cérebro humano preparação 1 do CJD esporádico do cérebro humano e preparação 2 de CJD esporádico do cérebro humano e CJD variante de cérebro humano (nenhum; cada um citado em WHO TRS ECBS Relatório N° 926, 53° Relatório, homogeneizado do cérebro), componentes de complemento do soro humano C1q, C4, C5, fator B, e complemento funcional integral CH50 (W1032), imunoglobulina E sérica humana (75/502) imunoglobuli-nas séricas humanas G, A, e M (67/86), proteínas séricas humanas albumi-na, alfa-1 -antitripsina, alfa-2-macroglobulina, ceruloplasmina, complemento C3, transferrina (W1031), imunoglobulina intravenosa de controle negativo anti-D (02/226), RNA de hepatite A (00/560), genótipo A subtipo adw2 de antígeno de superfície da hepatite B (03/262 e 00/588), DNA viral da hepatite B (97/746), RNA viral da hepatite C (96/798), antígeno p24 do HIV-1 (90/636), RNA do HIV-1 (97/656), genótipos de RNA do HIV-1 (conjunto de 10 101/466), concentrado de fibrinogênio humano (8/614), fibrinogênio plas-mático humano (98/612), hemoglobina A2 produzida (89/666), hemoglobina F produzida (85/616), cianeto de hemoglobina (98/708), heparina de baixo peso molecular (85/600 e 90/686), heparina não fracionada (95/578), fator de coagulação sanguínea VIII e fator de von Willebrand (02/150), concentrado de fator de coagulação sanguíneo humano VIII (99/678), plasma do fator de coagulação sanguínea humana (02/206), fatores de coagulação sanguínea humana II, VII, IX, X (99/826), concentrado de fatores de coagulação sanguínea humana II e X (98/590), antígeno carcinoembriônico humano (73/601), proteína reativa C humana (85/506), ferritina humana recombinante (94/572), apoliproteína B (SP3-07), beta-2-microglobulina (B2M), beta- tromboglobulina humana (83/501), concentrado do fator de coagulação sanguínea humana IX (96/854), concentrado de fator de coagulação sanguínea humana IX (96/854), concentrado de fator de coagulação sanguínea humana IXa (97/562), fator de coagulação sanguínea humana V Leiden, amostras de gDNA humano tipo selvagem FV, homozigoto FVL, heterozigoto FVL (03/254, 03/260, 03/248), concentrado de fator de coagulação sanguínea humano VII (97/592), concentrado de fator de coagulação sanguínea humano Vila (89/688), soro antissifílico humano (HS), imunoglobulina antitétano humano (TE-3), concentrado de antitrombina humana (96/520), antitrombina plasmática humana (93/768), soro antitiroglobulínico humano (65/93), soro antitoxoplasmático (TOXM), soro antitoxoplasmático (IgG) (01/600), imunoglobulina antivaricela zoster humana (W1044), apolipoproteína A-1 (SP1-01), soro anti-interferon beta humano (G038-501-572), soro antissarampo humano (66/202), soro de ribonucleoproteína antinuclear (W1063), soro de fator antinuclear (homogêneo) (66/233), soro antiparvovírus B19 (IgG) (91/602), soro antipoliovírus Tipos 1, 2, 3 (66/202), imunoglobulina antirrábica humana (RAI), imunoglobulina antirrubéola humana (RUBI-1-94), soro da antimuscu-latura lisa (W1062), soro anti-DNA de fita dupla humano (Wo/80), soro de tipagem de sangue completo anti-E humano (W1005), soro antiequinococus humano (ECHS), imunoglobulina anti-hepatite A humana (97/646), imunoglobulina anti-hepatite B humana (W1042), soro anti-hepatite E humano (95/584), antígeno-1a plaquetário anti-humano (93/710), antígeno-5b plaque-tário anti-humano (99/666), soro anti-interferon alfa humano (B037-501-572), alfafetoproteína humana (AFP), ancrod (74/581), soro de tipagem de sangue anti-A (W1001), soro de tipagem sangue anti-B humano (W1002), soro de tipagem de sangue completo anti-C humano (W1004), reagente de tipagem sangue completo anti-D (anti-RhO) (99/836), soro de tipagem de sangue incompleto anti-D (anti-RhO) (W1006), e imunoglobulina anti-D humana (01/572).

Outros exemplos de substâncias adequadas que podem funcionar como um, ou alternativamente como o outro, membro de um par de ligações consistindo em fixador de analito (porção de captura) e analito, dependendo da aplicação para qual um ensaio de afinidade é para ser desenhado de modo a incluir compostos que podem ser usados como hapte-nos para gerar anticorpos capazes de reconhecerem os compostos, e incluem, mas sem-limitação, quaisquer sais, ésteres, ou éteres, dos seguintes: hormônios, incluindo mas sem-limitação, progesterona, estrogênio, e testosterona, progestinas, corticosteróides, e desidroepiandrosterona e quaisquer antígenos não-proteína/não polipeptídeo que são listados como padrões de referência internacional WHO. Uma lista parcial de tais padrões de referência internacional adequados, identificados pelo código WHO, em parênteses, seguintes à substância, inclui vitamina B12 (WHO 81.563), fo-lato (WHO 95/528), homocisteína, transcobalaminas, T4/T3, e outras substâncias descritas no catálogo WHO da International Biological Reference Preparations (disponível no website do WHO, por exemplo, na página http://wwww.who.int/bloodproducts/ref materiais/, atualizado em 30 de janeiro de 2005), que é aqui incorporado a título de referência. Os métodos e composições descritos aqui podem compreender um ou mais dos padrões de referência de WHO mencionados acima ou uma mistura contendo um padrão de referência.

Em pelo menos uma modalidade, a presente invenção proporciona uma superfície de ligação com duas ou mais porções de captura diferentes.

Outros exemplos de substâncias que podem funcionar como um, ou alternativamente como o outro, membro de um par de ligações consistindo em fixador de analito (porção de captura) e analito, dependendo da aplicação para a qual um ensaio de afinidade é desenhado para incluir fármacos de abuso incluem, por exemplo, a seguinte lista de fármacos e seus metabó-litos (por exemplo, metabólitos presentes no sangue, na urina, e outros materiais biológicos), bem como quaisquer sais, ésteres, ou éteres, dos mesmos: heroína, morfina, hidromorfona, codeína, oxicodona, hidrocodona, fen-tanila, demerol, metadona, darvon, estadol, talwin, paregórico, buprenex; estimulantes tais como, por exemplo, anfetaminas, metanfetamina; metilan-fetamina, etilanfetamina, fenidato de metila, efedrina, pseudoefedrina, efe- dra, ma huang, metilenodioxianfetamina (MDS), fentermina, fenilpropanola-mina; amifenazol, bemigrida, benzfetamina, bromatano, clorfentermina, cro-propamida, crotetamida, dietilpropiona, dimetlanfetamina, doxapram, etami-vana, fencanfamina, meclofenoxato, metilfenidato, niquetamida, pemolina, pentetrazol, fendimetrazina, fenmetrazina, fentermina, fenilpropanolamina, picrotoxina, pipradol, prolintano, estriquinina, sinefrina, fenciclidina e análogos, tais como poeira de anjo, PCP, cetamina; depressivos tais como, por exemplo, barbituratos, glutetimida, metaqualona, e meprobamato, metoexi-tal, tiamila, tiopental, amobarbital, pentobarbital, secobarbital, butalbital, bu-tabarbital, talbutal, e aproparbital, fenobarbital, mefobarbital; benzodiazepe-nos, tais como, por exemplo, estazolam, flurazepam, temazepam, triazolam, midazolam, alprazolam, clordiazepóxido, clorazepato, diazepam, halazepam, lorazepam, oxazepam, prazepam, quazepam, clonazepam, flunitrazepam; drogas de GBH tais como ácido gama hidroxil butírico e gama butirolactona; glutetimida, metaqualona, meprobamato, carisoprodol, zolpidem, zaleplon; drogas canabinóides tais como tetraidracanabinol e análogos; cocaína, 3-4 metilenodiometanfetamina (MDMA); alucinógenos, tal como, por exemplo, mescalina e LSD.

Outros exemplos de substâncias que podem funcionar como um, ou alternativamente como o outro, membro de um par de ligações consistindo em fixador de analito (porção de captura) e analito, dependendo da aplicação para a qual um ensaio de afinidade é para ser desenhado, incluem esteróides e outras drogas associadas com a melhoria do desempenho, inclusive aqueles comumente encontrados em mercados ilícitos, ou empregados como auxiliares ergogênicos, tais como, por exemplo, os seguintes compostos e quaisquer sais, ésteres, ou éteres dos mesmos: testosterona (incluindo seus ésteres com porções, tais como, por exemplo, enantato, cipi-onato, e propionato), diidrotestosterona (DHT), tetraidrogestrinona, nandro-lona, nortestosterona, metenolona, estanozolol, metandrostenolona, metan-dienona, androstenodiona (por exemplo, 5a-androstan-3,17-diona), andros-tenodiol tais como 1-androstenodiool (3p,17p-diidróxi-5a-androst-1-eno), 4-androstenodiol (3b, 17b-diidróxi-androst-4-eno), 5-androstenodiol (3b, 17b- diidróxi-androst-5-eno), androstendionas, tais como 1-androstenodiona ({5a]-androst-1-en-3,17-diona), 4-androstenodiona (androst-4-en-3,17-diona), 5-androstenodiona (androst-5-em-3,17-diona), norandrostenodiona, 19-noran-drostenodiol, 19-norandrostenodiona, norandrostenodiol, desidropiandroste-rona (DHEA), boldenona, fluoximesterona, metandriol, metiltestosterona, oxandrolona, oximetolona, trembolona, clostebol, desidroclorometiltestoste-rona, dromostanolona, epitrembolona, gestrinona, mesterolona, metanodie-nona, metanodienona, metenolona, noretandrolona, oxandrolona, oximetolona, tetraidrogestrinona (THG), trembolona, clembutorol, e esteróides incluídos na Ato de Controle de Esteróides Anabólicos de 2004 (aqui incorporado a título de referência, incluindo 3b,17b-diidróxi-5a-androstano; 3a,17b-diidró-xi-5a-androstano; androstanodiona, bolasterona (7a,17a-dimetil-17b-hidroxi-androst-4-en-3-ona), boldenona (17b-hidroxiandrost-1,4-dieno-3-ona), calus-terona (7b,17a-dimetil-17b-hidroxiandrost-4-en-3-ona), clostebol (4-cloro-17b-hidroxiandrost-4-en-3-ona), desidroclormetiltestosterona (4-cloro-17b-hidróxi-17a-metil-androst-1,4-dien-3-ona), 4-diidrotestosterona (17b-hidróxi-androstan-3-ona), drostanolona (17b-hidróxi-2a-metil-5a-androstan-3-ona), etilestrenol (17a-etil-17b-hidroxiestr-4-eno), fluoximesterona (9-flúor-17a-metil-11b,17b-diidroxiandrost-4-en-3-ona), formebolona (2-formil-17a-metil-11 a,17b-diidroxiandrost-1,4-dien-3-ona), furazabol (17a-metil-17b-hidroxian-drostano[2,3-c]-furazan), 18a-homo-17b-hidroxiestr-4-en-3-ona (13b-etil-17b-hidroxigon-4-en-3-ona), 4-hidroxitestosterona (4,17b-diidróxi-androst-4-en-3-ona), 4-hidróxi-19-nortestosterona (4,1b-diidróxi-estr-4-en-3-ona), estanolona (17a-metil-17b-hidróxi-5a-androstan-3-ona), mesterolona (1 a-metil-17b-hidróxi-[5a]-androstan-3-ona), metandienona (17a-metil-17b-hidroxiandrost-1,4-dien-3-ona), metandriol (17a-metil-3b,17b-diidroxiandrost-5-eno), metenolona (1 -metil-17b-hidróxi-5a-androst-1 -en-3-ona), etiltestosterona (17a-metil-17b-hidroxiandrost-4-en-3-ona), mibolerona (7a,17a-dimetil-17b-hidro-xestr-4-en-3-ona), nandrolona (17b-hidroxiestr-4-en-3-ona), norandrostenodiol, 19-nor-4-androstenodiol (3b,17b-diidroestr-4-eno), 19-nor-4-androsteno-diol (3a,17b-diidroestr-4-eno), 19-nor-5-androstenodiol (3b,17b-diidroxiestr-5-eno), 19-nor-5-androstenodiol (3a,17b-diidriestr-5-eno), norandrostenodiona, 19-nor-4-androstenodiona (estr-4-en-3,17-diona), 19-nor-5-androstenodiona (estr-5-em-3,17-diona), norboletona (18a-homo-17b-hidroxipregna-4-em-3-ona), norclostebol (4-cloro-17b-hidroxiestr-4-en-3-ona), noretandrolona (17a-etil-17b-hidroxiestr-4-em-3-ona), oxandrolona (17a-metil-17b-hidróxi-2-oxa-[5a]-androstan-3-ona), oximesterona (17a-metil-4,17b-diidroxiandrost-4-en-3-ona), oximetolona (17a-metil-2-hidroximetileno-17b-hidróxi-[5a]-androstan-3-ona), estanozolol (17a-metil-17b-hidróxi-[5a]-androst-2-eno[3,2-c]-pirazol), estembolona (17b-hidróxi-2-metil-[5a-androst-1-en-3-ona), testolactona (lac-tona do ácido 13-hidróxi-3-oxo-13,17-secoandrosta-1,4-dien-17-óico), 1-tes-tosterona (17b-hidróxi-5a-androst-1-en-3-ona), testosterona (17b-hidroxian-drost-4-en-3-ona), tetraidrogestrinona (13b,17a-dietil-17b-hidroxigon-4,9,11-trien-3-ona), trembolona (17b-hidroxiestr-4,9,11-trien-3-ona).

Outros exemplos de substâncias que podem funcionar como um, ou alternativamente como o outro, membro de um par de ligação consiste em fixador de analito (porção de captura) e analito, dependendo da aplicação para a qual um ensaio de afinidade é para ser projetado, incluem antibióticos ou outros fármacos administrados a animais (inclusive seres humanos) e cuja detecção é útil na prática clínica, e cuja detecção em uma preparação biológica pode ser obtida, usando-se, por exemplo, um imunoensaio. Exemplos de tais fármacos incluem antibióticos tais como aqueles listados nas preparações de WHO International Biological Reference (disponível em http://www.who.int/bloodproducts/ref materials/Ant-Sept05-pdf, atualizado a partir de 21 de setembro de 2005, aqui incorporado a título de referência. Exemplos incluem gentamicina (92/670), estreptomicina (76/539), tobramici-na (82/510), e vancomicina (50/020).

Em pelo menos uma modalidade, a presente invenção proporciona uma superfície de ligação com pelo menos duas ou mais porções de captura.

Quaisquer das características das várias modalidades descritas aqui podem ser usadas em conjunto com as características descritas em conexão com quaisquer outras modalidades descritas. Por exemplo, as características descritas em conexão com as composições da invenção podem ser empregadas em quaisquer métodos descritos aqui etc. As características descritas em conexão com as várias ou específicas modalidades não devem ser interpretadas como não adequadas em conexão com outras modalidades descritas aqui, a menos que tal exclusividade esteja explicitamente estabelecida ou implícita no contexto.

Certas modalidades da invenção são ilustradas nas Figuras e Exemplos acompanhantes, que são fornecidos para ilustrar certas modalidades da invenção, e não têm por objetivo impor limites à invenção.

EXEMPLOS EXEMPLO f BIOTINILACÃO COM RAZÃO DE ENTRADA BAIXA DE ALBUMINA SÉRI-CA BOVINA BSA foi biotinilada com sulfo-NHS-LC-biotina (sulfossuccinimidil-6-[biotinamido]hexanoato; Pierce Biotechnology Inc./Thermo Scientific) em várias razões de entrada molares de biotina para BSA (vide Tabela 1). Em resumo, sulfo-NHS-LC-biotina (556,59 g/mol) foi dissolvida em DMF (dimetil-formamida) em uma concentração de 30 miligramas por mililitro (mg/mL), e BSA liofilizada (albumina sérica, isenta de protease; Celliance Corporation, uma Serologicals Company; 66.000 g/mol) foi dissolvida em tampão de bora-to 0,05M, pH 8,2 em uma concentração de 15 a 20 mg/mL. A solução de sulfo-NHS-LC-biotina foi adicionada à solução de BSA de modo que a razão de entrada molar final de sulfo-NHS-LC-biotina para BSA foi de 3,4 a 30 (mol de sulfo-NHS-LC-bitoina: mol de BSA). A reação foi incubada por 2 horas a 4°C, e então dialisada imediatamente (isto é, diafiltração ou diálise) com tampão de borato 0,05M, pH 8,2, para remover excesso de sulfo-NHS-LC-bitoina (isto é, reagente de biotina, e reagente de biotina hidrolisada, isento de biotina). Esse procedimento geral foi usado durante a preparação da BSA biotinilada de razão de entrada baixa. O grau de biotinilação pode ser estimado usando-se qualquer método conhecido da técnica para quantificação da biotina. Um método a-dequado é o ensaio colorimétrico HABA, que emprega o ácido 4'-hidroxiben-zeno-2-carboxílico (HABA), que é seletivo para biotina. Os rnols de biotina ligada por mol de BSA foram estimados por análise com HABA. Os resultados são mostrados na Tabela 1.

Análise de estabilidade de 17 lotes de biotinilação independentes de BSA biotinilada foi completada por revestimento de 25 mg/mL de PMPs ativadas com tosila (Dynal® DYNABEADS MyOne Tosyactivated, diâmetro de 1 mícron, Innvitrogen Corporation) com biotina-BSA , por 18-24 horas, a 37-42°C, em tampão de borato 0,1 M pH 9,0-9,5 (0,030-0,050 mg de biotina-BSA por mg de PMP), lavar as micropartículas três vezes com TBS (Tris 0,02M, cloreto de sódio 0,15M) pH 7,4, bloquear a superfície da micro-partícula revestida com biotina-BSA com 0,4%-0,6% (p/p) de copolímero em tribloco Pluronic® (Pluronic F-108 NF Prill; BASF) em TBS pH 7,4, por 4-4,5 horas a 37-42°C, lavar as micropartículas três vezes com TBS pH 7,4, dispersar as micropartículas de biotina-BSA em 0,4%-0,6% (p/v) de Pluronic® F108 em TBS pH 7,4, revestir as micropartículas de biotina-BSA com SA, (congelado, nunca liofilizado, SA21 SD-plus, Prozyme, Inc.) em TBS pH 7,4 por 30-50 minutos, à temperatura ambiente (0,025-0,050 miligrama de SA por miligrama de PMP de biotina-BSA), lavar as micropartículas três vezes com TBS pH 7,4 com azida sódica (0,1% p/v), lavar as micropartículas três vezes com tampão de micropartícula específico para ensaio Access® T4 Livre, diluir as micropartículas de 25 mg/mL a 0,35 mg/mL com tampão de micropartícula específico para ensaio Access® T4 Livre, incubar as micropartículas revestidas com BSA, revestidas com SA a 4°C ou 37°C, por 3 dias, e testar a capacidade das micropartículas revestidas com biotina-BSA, revestidas com SA de se ligarem a anticorpo específico para T4 biotinilado livre no Ensaio Access® T4 Livre (Beckman Coulter, Inc.)· A estabilidade foi determinada por cálculo da média de recuperações de calibrador de RLU (unidades de luz relativa, sinal, ou resposta) de T4 livre, individuais. Para o ensaio Access® T4 Livre usa seis calibradores diferentes (S0, S1, S2, S3, S4, e S5) com níveis de antígenos de 0 ng/mL a 6 ng/mL (vide Tabela 4). A recuperação foi calculada dividindo-se a resposta de RLU do calibrador a 37°C pela resposta de RLU do calibrador a 4°C, e multiplicando-se o resultado por 100%. A estabilidade foi calculada determinando-se a média da recuperação para todos os seis calibradores. Os resultados são mostrados na Tabela 1. A estabilidade foi indicativa da alteração na capacidade de ligação de SA depois da incubação da fase sólida a 4°C ou a 37°C, por 3 dias. Um decréscimo da estabilidade é devida à retirada ou à dissociação da bio-tina ligada passivamente ou reagente de biotina de conjugados da biotina-BSA (vide Figura 11; linha tracejada: 37°C; linha cheia: 4°C), e a captura subsequente da biotina livre ou reagente de biotina por SA com o tempo. Os resultados indicaram que a biotina-BSA preparada em razões de entrada molares altas (isto é, 8:1, 15:1,30:2) exibe estabilidade muito fraca. Conforme a razão de entrada molar do reagente de biotina para BSA é decrescida de 30:1 a 4:1, a estabilidade aperfeiçoou de 4% a 100%.

BSA foi biotinilada em uma razão de entrada molar de 30 mois de sulfo-NHS-LC-biotina por mol de BSA. A BSA biotinilada 30:1 foi ligada a PMPs ativadas por tosila Dynal(R) MyOne por revestimento de 25 mg/mL de PMPs ativadas por tosila com biotina-BSA por 18 a 24 horas a 37-42°C em tampão de borato 0,1 M pH 9,0-9,5 (0,030-0,050 miligrama de biotina-BSA por miligrama de PMP), lavar, três vezes, as micropartículas com TBS pH

7.4, bloquear a superfície da micropartícula revestida com biotina-BSA com 0,4% a 0,6% (p/v) de Pluronic® F108 em TBS pH 7,4 por 4-4,5 horas, a 37-42°C, lavar, três vezes, as micropartículas com TBS pH 7,4, dispersar as micropartículas de biotina-BSA em 0,4%-0,6% (p/v) de Pluronic® F108 em TBS pH 7,4, revestir as micropartículas de biotina-BSA com SA em TBS pH 7.4, por 30-50 minutos, à temperatura ambiente (0,025-0,050 miligramas de SA por mg de PMP), e lavar, três vezes, as micropartículas com TBS pH 7,4. Os 25 mg/mL de PMP revestidas com biotina-BSA, revestidas com SA foram colocadas a 4°C ou 37°C, por três dias, e colocadas em um ímã por 10 minutos para separar as PMPs (remover as micropartículas dos tampões a 4°C ou a 37°C). Os fluidos sobrenadantes isentos de micropartículas a 4°C e a 37°C foram coletados, e os fluidos sobrenadantes foram analisados usando-se cromatografia líquida de alto desempenho, por exclusão de tamanho (SEC-HPLC; Beckman Coulter System Gold HPLC System, software 32 KA-RAT™ 5,0, coluna Phenomenex 300 x 7,80 BioSep-SEC-S 3000, fase móvel de PBS pH 7,2, 1,0 mL/min de vazão, volume de amostra de 0,050 mL, tempo de corrida de 17 minutos, detecção com série de fotodiodos de 200 a 400 nm). A análise de SEC-HPLC em 210 nm do fluido sobrenadante a 37°C revelou um nível significantemente maior de analitos de baixo peso molecular em ambos o tempo de retenção (TR) de 10,8 minutos e o RT de 12,4 minutos em comparação com o fluido sobrenadante a 4°C. Acreditou-se que estes picos fossem a biotina e/ou o reagente de biotina que haviam absorvido passivamente para as moléculas de BSA durante o processo de bio-tinilação em uma razão de entrada de 30:1 (reagente de biotina:BSA), e não foram removidos por diálise ou dessalgação. Os resultados indicam também que não há BSA ou SA detectável (abaixo do limite de detecção do método) no fluido sobrenadante (RT de 7,8 a 8,2 minutos), e o conjugado de biotina-BSA e/ou SA não está descascando da fase sólida.

Os resultados de SEC-HPLC fundamentam os resultados de estabilidade (vide Tabela 1), em que a amostra de reagente de biotina 30: BSA 1 exibiu o decréscimo mais significante de estabilidade a 37°C (95,9% de decréscimo de estabilidade, ou 4,1% de estabilidade) em comparação aos 4°C, e também mostrou a presença de uma quantidade significante de anali-to(s) de baixo peso molecular no fluido de sobrenadante a 37°C em comparação com o fluido de sobrenadante a 4°C. Um decréscimo de estabilidade se deve à retirada ou à dissociação da biotina passivamente ligada ou o reagente de biotina dos conjugados de biotina-BSA, e a captura subsequente da biotina livre ou do reagente de biotina pela SA com o tempo.

O processo de revestimento de biotina-BSA foi otimizado por biotinilação da BSA usando 4 mois de sulfo-NHS-LC-biotina por mol de BSA, oferecendo 30, 40, 50, ou 60 microgramas de biotina-BSA por mg de partículas (Dynal® DYNABEADS MyOne, ativadas com tosila, 1,0 mícron de diâmetro, Invitrogen Corporation), incubar a biotina-BSA com as micropartículas por 2, 4, ou 18 horas a 37°C ou 40°C em Borato 0,1 M pH 9,5, lavar as micropartículas, três vezes, com TBS contendo 0,4% (p/v) de Pluronic® F108 pH 7,4 por 4 horas a 37°C, lavar, três vezes, as micropartículas com TBS pH 7,4, dispersar as micropartículas de biotina-BSA em TBS contendo 0,4% (p/v) de Pluronic® F108, acoplar a SA por adição de 35 microgramas de SA por miligrama de micropartículas e incubar por 30 minutos à temperatura ambiente, e lavar as micropartículas revestidas com biotina-BSA, revestidas com SA, três vezes, com TBS pH 7,4.

Os resultados de teste de desempenho de ensaio (ensaios Access® T4 Livre Access® AccuTnl; Beckman Coulter, Inc.) e teste de capacidade de ligação de IgG biotinilado indicaram que o processo de revestimento de biotina-BSA é robusto quando 30 a 50 pg de biotina-BSA são adicionados por miligrama de micropartículas, em uma concentração de micropartículas de 25 mg/mL, em um tampão de borato 0,1 M pH 9,5, e incubadas por 18 a 24 horas a 37°C a 42°C. Em resumo, o método de IgG biotinilado marcado com 125l é usado para avaliar a capacidade de ligação por marcação do IgG biotinilado a IgG não biotiniladado com 125l usando um procedimento de io-dação (anticorpo e anticorpo biotinilado são, cada um, incubados com Na125l e triidrato de cloramina T, à temperatura ambiente, em que cada reação é interrompida com metabissulfito de sódio, e o anticorpo não biotinilado marcado com 125l e anticorpo biotinilado marcado com 125l são, cada um, purificados usando-se colunas de SEPHADEX G-500 pré-condicionadas com 0,5% de BSA/PBS/0,1% de azida sódica), CPM totais (contagens por minuto )/mg de 125l-lgG biotinilado e de não biotinilado são calculados usando um contador gama, às micropartículas revestidas com SA são oferecidas um excesso molar ou de 125l-biotina-lgG (absorção ativa via domínios de ligação de biotina) ou 125l-lgG (absorção passiva ou ligação não-específica), as micropartículas são lavadas, 5 vezes, com tampão de lavagem, as micropartículas lavadas são colocadas em um contador gama para determinar CPM totais, e a quantidade de biotina-lgG especificamente capturada é determinada por subtração das COM das micropartículas de SA revestidas com 125l-IgG (controle de ligação não-específica) das CPM das micropartículas de 125l-biotina-IG SA. EXEMPLO 2 NÃO SATURAÇÃO DECRESCE A CAPACIDADE DE LIGAÇÃO. MAS AUMENTA O SINAL DO ENSAIO

Uma superfície de ligação não-saturada e orientada usando um sistema de biotina/AS foi preparada com biotina-BSA preparada em uma razão de entrada molar baixa de biotina para BSA (4:1) usando PMPs. Em resumo, uma batelada de micropartículas tendo um superfície de ligação não-saturada e orientada foi preparada por revestimento de PMPs ativadas com tosila Dynal® AKT-100 com BSA biotinilada de razão de entrada baixa, bloquear as micropartículas de biotina-BSA com Pluronic® F108, dispersar as micropartículas de biotina-BSA em Pluronic® F108, e finalmente revestir as micropartículas de biotina-BSA com SA. Vide Tabela 2, "Amostra BCL". A título de comparação, uma micropartícula de ligação de biotina comercial- mente disponível (Dynal® DYNABEADS MyOne Estreptavidina T1, Invitrogen Corporation) foi testada. Vide Tabela 2, "Controle Dynal®". A superfície não-saturada e a superfície de ligação de biotina comercialmente disponível foram, cada uma, preparadas usando a mesma micropartícula bruta (PMP de 1,0 mícron, ativada com tosila, Dynal® MyOne da Invitrogen Corporation).

As superfícies de ligação de biotina não-saturadas e comercialmente disponíveis (isto é, revestidas com SA) foram testadas quanto a sua capacidade de ligação de biotina usando um teste de capacidade de ligação da biotina-14C (Invitrogen Corporation). Os resultados são mostrados na Tabela 2. O nível do calibrador está presente em nanograma por mililitro. A capacidade de ligação da biotina das micropartículas comercialmente disponíveis foi de 1.400 pmols de biotina/mg, ao passo que a capacidade de ligação da biotina das micropartículas tendo uma superfície de ligação não-saturada preparada de acordo com a invenção foi de somente 214 pmols de biotina/mg. Assim, as micropartículas de ligação de biotina comercialmente disponíveis exibiram uma capacidade de ligação para biotina de seis vezes mais que as micropartículas de mesmo diâmetro, preparadas de acordo com a invenção.

As micropartículas foram também testadas quanto a sua capacidade de se ligar ao IgG biotinilado. As micropartículas comercialmente disponíveis exibiram uma capacidade de ligação de IgG biotinilada de 20,0 mi-crogramas de IgG biotinilada por miligrama de micropartículas, ao passo que as micropartículas de acordo com a invenção exibiram uma capacidade de ligação de 6,7 microgramas de IgG biotinilado por miligrama de micropartículas. Assim, as micropartículas de ligação de biotina comercialmente disponíveis exibiram uma capacidade de ligação de IgG de cerca de três vezes maior que as micropartículas de acordo com a invenção. Contudo, a capacidade de ligação de biotina das micropartículas comercialmente disponíveis foi de seis vezes acima daquela das micropartículas da invenção. O desempenho funcional das micropartículas de ligação de bio-tina comercialmente disponíveis de micropartículas não-saturadas preparadas de acordo com a invenção em um ensaio para uma proteína, a troponina I. Em resumo, micropartículas de ligação de biotina de um mícron de diâmetro comercialmente disponíveis (DYNABEADS MyOne Estreptavidina T1, Invitrogen Corporation) revestidas com SA de acordo com a invenção, foram usadas para o ensaio de troponina I usando o Ensaio Access® AccuTnl (Beckman Coulter, Inc.), um ensaio intercalado, por tratamento das micropartículas revestidas com SA com antitroponina I biotinilada e medir a resposta de ensaio ao calibrador de troponina I (Beckman Coulter, Inc.). Os resultados são mostrados na Tabela 3. A Tabela 3 ilustra que, em uma faixa de níveis do calibrador (S1 a S5), as micropartículas não-saturadas de acordo com a invenção exibem leituras de RLU maiores que as das micropartículas comercialmente disponíveis, e leituras de RLU residuais menores (SO) que as micropartículas comercialmente disponíveis. Esse resultado é surpreendente e inesperado porque as micropartículas não-saturadas de acordo com a invenção exibem uma capacidade de ligação de biotina menor que a das micropartículas de ligação de biotina comercialmente disponíveis (vide Tabela 2). A resposta do calibrador foi mais alta para as micropartículas não-saturadas em quase a faixa toda. A precisão de ensaio, medida como % do CV da Resposta do Calibrador da SO (CV = coeficiente de variação), foi duas vezes maior para as micropartículas não-saturadas. Contudo, as micropartículas não-satura-das apresentaram um resposta de RLU de SO em comparação com as micropartículas comercialmente disponíveis (8,116 versus 13.023), e uma pequena diferença nas RLUs entre repetições pode resultar em % de CV maior conforme o sinal de RLU decresce. A imprecisão do ensaio expressa como % de CV da Dose do Calibrador, foi, em média, significantemente menor com respeito às micropartículas não-saturadas. Com respeito à faixa dinâmica, as razões de S1/S0 e S5/S0 foram cerca de duas vezes maior para as micropartículas não-saturadas. Assim, embora as micropartículas de acordo com a invenção se liguem menos à biotina (e, por conseguinte, menos IgG biotinilado), elas apresentam um desempenho inesperadamente melhor em um ensaio de afinidade funcional, e têm ruído diminuído ou ligação não-específica reduzida em comparação com as micropartículas comercialmente disponíveis. O desempenho das micropartículas revestidas com SA de 2,8 micra de diâmetro, comercialmente disponíveis (Dynal® DYNABEADS M-280 Estreptavidina, capacidade de ligação de biotina de 650 a 900 picomols de biotina por miligrama, Invitrogen Corporation) foi comparado com o desempenho de micropartículas revestidas com SA preparadas de acordo com a invenção (capacidade de ligação de biotina de cerca de 214 picomols de biotina por miligrama; vide Tabela 2 no ensaio Access® T4 Livre (Beckman Coulter, Inc.). T4 Livre foi ensaiado usando o ensaio Access® T4 Livre, um ensaio competitivo, por tratamento das micropartículas revestidas com SA (PMPs de 2,8 micra de diâmetro revestidas com SA, comercialmente disponíveis para o "Método Dynal®"; PMPs revestidas com SA de 1,0 mícron de diâmetro preparadas de acordo com a invenção para o "Método BCI") com anti-T4 biotinilado de acordo com a invenção e por medição da resposta de ensaio a um calibrador T4 (Beckman Coulter, Inc.). Os ensaios foram realizados em um Sistema de Imunoensaio Access® 2 (Beckman Coluter, Inc.), e os resultados obtidos em RLUs obtidos no sistema estão mostrados na Tabela 7.

Como mostrado na Tabela 4, as micropartículas revestidas com SA de 1,0 mícron preparadas de acordo com a invenção renderam cerca do mesmo sinal para o analito (T4 Livre) que as micropartículas revestidas com SA, de 2,8 micra de diâmetro, comercialmente disponíveis. Esse resultado é surpreendente e inesperado porque as micropartículas não-saturadas de acordo com a invenção exibem capacidade de ligação de biotina menor que as micropartículas de antibiotina comercialmente disponíveis (Dynal® DY-NABEADS M-280 Streptavidina, capacidade de ligação de biotina de 650 a 900 picolmols de biotina por miligrama, Invitrogen Corporation). A preparação das micropartículas de acordo com a invenção, conforme ilustradas nas tabelas acima (vide Tabelas 2, 3, e 4), resulta em não saturação da superfície de ligação, de modo que o número de ligantes (biotinas) é reduzido. As micropartículas de acordo com a invenção se ligam menos (214 picomols por miligrama para micropartículas de acordo com a invenção, em comparação com 650 a 900 picomols por miligrama para micropartículas DYNABE-ADS M-280 comercialmente disponíveis, e acima de 1.000 picomols por mg para micropartículas T1 de SA DYNABEADS MyOne), mas elas funcionam melhor (vide Tabela 3 e Tabela 4). As micropartículas de 1,0 mícron de a-cordo com a invenção se ligam ligeiramente menor que uma partícula de 2,8 micra, mas as micropartículas inventivas geram mais sinal.

No total, os resultados estabelecem que as micropartículas não-saturadas de acordo com a invenção, embora tenham capacidade de ligação menor que as micropartículas comercialmente disponíveis elas rendem sinais de ensaio que são tão bons quanto, ou melhores que, as micropartículas comercialmente disponíveis. Isso é verdadeiro mesmo para as superfícies de ligação inventivas com capacidades de ligação significantemente menores que as das micropartículas comercialmente disponíveis. EXEMPLO 3 FAZENDO COM QUE UMA SUPERFÍCIE NÃO-SATURADA EMPREGUE UMA ETAPA DE DISPERSÃO

Biotina-BSA preparada usando uma razão de entrada molar baixa de reagente de biotinilação para BSA (4:1) foi usado em um método de dispersão para fazer uma superfície de ligação não-saturada. Em resumo, a biotina-BSA (preparada conforme descrição acima) foi covalentemente ligada às micropartículas Dynal®, conforme descrição acima, para produzir uma superfície que era não-saturada com respeito ao número de biotinas por á-rea de superfície de suporte unitária. As micropartículas revestidas foram então empregadas em uma etapa de dispersão antes da adição de SA.

Estudos iniciais usaram um hemacitômetro (análise microscópica) para avaliar o estado de agregação de micropartículas revestidas com biotina-BSA, preparadas conforme descrição acima, (1) antes da adição de SA, (2) depois da adição, gota a gota de uma solução de 10 mg/mL de mi- cropartículas revestidas com biotina-BSA a uma solução, sob misturamento contínuo, de SA (0, 125, 250, 375, 500, 750, OU 1.000 microgramas de SA por ml_), e (3) depois da adição de diferentes quantidades de uma solução de 18 mg/mL de SA (25, 50, 75, 100, 150 ou 200 microgramas de SA por mg de micropartícuas) a uma solução sob misturamento contínuo de 10 mg/mL de micropartículas revestidas com biotina-BSA. Os resultados do hemacitô-metro foram reportados como monômeros (micropartículas simples), díme-ros (agregados de duas partículas), trímeros (agregados de três micropartículas), agregado pequeno (agregados com 4 a 10 micropartículas), e agregado grande (agregados com >10 micropartículas). Os agregados são definidos como a associação de duas ou mais micropartículas de biotina-BSA via reticulação de SA (isto é, SA é multivalente com quatro unidades, e cada subunidade tem um domínio de ligação de biotina). Os resultados do hema-citômetro indicaram que as micropartículas de biotina-BSA eram monodiper-sas (somente monômeros e dímeros) antes da adição de SA, a maioria a-gregada (agregados grandes) quando as micropartículas de biotina-BSA foram tituladas (gota a gota) em soluções de SA até 750 microgramas de SA por mililitro, monodispersas (trímeros, dímeros, e monômeros) quando as micropartículas de biotina-BSA foram tituladas (gota a gota) em uma solução de SA de 1.000 microgramas de SA por mililitro, e altamente agregadas (a-gregados grandes) quando SA foi adicionada a micropartículas de biotina-SA em todas as concentrações testadas. Conforme usado aqui, o termo "substancialmente monodisperso" significa uma população de micropartículas que existem substancialmente somente como monômeros e dímeros.

As micropartículas revestidas com biotina-BSA, revestidas com SA preparadas pela adição, gota a gota, de micropartículas revestidas com biotina-BSA a uma solução misturadora de SA, ou pela adição de uma solução de SA a uma solução misturadora de micropartículas de biotina-BSA, podem ser levadas a um estado monodisperso temporário (maior parte trímeros, com dímeros e monômeros) submetendo-se as micropartículas revestidas com SA à energia de sonicação (2 x 300 Watts por 60 segundos) com misturamento, mas as micropartículas não permaneceram monodisper- sas ao longo do tempo, e se tornaram de novo altamente agregadas. A e-nergia de sonicação não resultou em micropartículas revestidas com SA, revestidas com biotina-BSA permanentemente dispersas, e não puderam reduzir a propensão das micropartículas de biotina-BSA de se agregarem devido à reticulação.

Estudos com o hemacitômetro foram completados para determinar a quantidade de Pluronic F108 (17 níveis de diluição a partir de 0 μΜ a 1.000 μΜ de Pluronic® F108 em água) requerida para monodispersão de micropartículas hidrofóbicas (PMP de poliestireno de 1,03 mícron, Cat. N° M1-070/40, EMD Biosciences, Inc.). Os resultados dos mesmos estudos indicaram que micropartículas M1-070/40 estavam substancialmente mono-dispersas (isto é, somente monômeros e dímeros) em concentrações de Pluronic® F108 de 27,04 μΜ de Pluronic® F108/mg de micropartículas (nível de diluição 6) para 2.027,7 μg de Pluronic®/mg de micropartículas (nível de diluição 15). As micropartículas foram agregadas em concentrações de Pluronic® F108 menores que 27,04 μg de Pluronic® F108/mg de micropartículas, e em concentrações maiores que 2.027,7 pg de Pluronic® F108/mg de micropartículas (mais provavelmente devido à retirada em multicamadas dos copolímeros em tribloco). Os cálculos de área de superfície prognosticaram que uma monocamada teórica de Pluronic® F108 requerería pelo menos 4,1 pg de Pluronic® F108, assumindo-se uma área de superfície interfacial de 20 nm2 por molécula de Pluronic® F108, e uma área de superfície de micropar-tícula de 38,38 cm2/mg (com base em uma esfera perfeitamente redonda, de superfície lisa, de 1,03 pm). Deve ser observado que as micropartículas M1-070/40 não eram de tamanho uniforme (distribuição de tamanho heteróge-no), e continham uma população grande de finos menores que 1,03 mícron de diâmetro (com base em análise de tamanho de micropartícula usando um medidor de partícula de difração laser Beckman Coulter LS13 320). Ambas as micropartículas finas e uma superfície de micropartícula áspera indicariam que as micropartículas M1-070/40 têm uma área de superfície maior que a calculada acima. Os resultados do hemacitômetro confirmam esta suposição já que mais que 27 pg de Pluronic® F108/mg de micropartículas para monodispersão de micropartículas. Os resultados desse estudo indicaram que Pluronic® F108 podem resultar em monodispersão de micropartículas em concentrações de 27,04 a 2.027,7 pg de Pluronic® F108/mg de micropartículas (níveis de diluição de 6 a 15).

Os lotes específicos de micropartículas (ativadas com tosila Dy-nal® DYNABEADS MyOne, diâmetro de 1,0 mícron, Invitrogen Corporation) revestidas com biotina-BSA tinham áreas de superfície de 74 a 84 cm2/mg (fornecidos no certificado de análise; Invitrogen Corporation). Com base nesses valores, e os estudos no hemacitômetro de Pluronic® F108 acima, foi calculado que uma solução a 0,4% (p/v) de Pluronic® F108 (ou 4 mg/ml_), contendo 25 mg de micropartículas de biotina-BSA por mL, oferecia aproximadamente 160 μg de Pluronic® F108/mg de micropartículas. Já que 1,03 mícron de micropartículas M1-070/40/40(EMD Biosciences, Inc.) usado no estudo do hemacitômetro de Pluronic® F108 tinha uma área de superfície maior que 38,38 cm2/mg, e foram monodispersas em concentrações de 27,04 a 2.027,7 pg de Pluronic® F108/mg de micropartículas, uma solução a 0,4% (p/v) de Pluronic® F108, ou 160 pg de Pluronic® F108/mg de micropartículas, foi usada para estudos iniciais de dispersão para assegurar uma quantidade suficiente de Pluronic® F108 está presente para promover monodispersão de micropartículas biotina-BSA.

As micropartículas revestidas com biotina-BSA, revestidas com SA preparadas por adição de SA (25 a 50 pg de SA/mg de micropartículas) a 25 mg/mL de micropartículas de biotina-BSA dispersas em tampão de PBS (fosfato de sódio 20mM, cloreto de sódio 150mM, pH 7,2) contendo 0,4% (p/v) de Pluronic® F108 (Pluronic® F-108 NF Prill, BASF), ou tampão de TBS (Tris 20mM, cloreto de sódio 150mM, pH 7,2) contendo 0,4% (p/v) de Pluronic® F108, foram monodispersas depois da adição de SA.

As micropartículas permaneceram monodispersas independentemente da ordem de adição de SA (isto é, micropartículas de biotina-BSA adicionadas, gota a gota, a SA, ou a SA adicionada às micropartículas de biotina-BSA), contanto que as micropartículas de biotina-BSA tenham se dispersado em uma solução contendo 0,4% (p/v) de Pluronic® F108 antes de sua combinação com SA. Ao contrário do uso de sonicação como estabelecido acima, as micropartículas revestidas com biotina-BSA, revestidas com SA permaneceram monodispersas se as micropartículas de biotina-BSA foram dispersas em um tampão contendo Pluronic® F108 antes de sua combinação com SA. Portanto, 0,4% (p/v) de Pluronic® F108 funcionaram com sucesso como um agente de dispersão para promover monodispersão de micropartículas de biotina-BSA tanto antes, como depois, da combinação de micropartículas de biotina-BSA com SA por aperfeiçoamento da estabilidade coloidal de micropartículas (hidrofobicidade de superfície de suporte de micropartículas diminuída, carga negativa de superfície de suporte de micro-partícula aumentada devido aos grupos hidroxila pendentes de Pluronic® F108, e repulsão aumentada das micropartículas devido à repulsão de carga negativa de superfície para superfície), e por permitir que as moléculas de SA para se ligarem com todas as biotinas de superfície de micropartículas disponíveis (não ligadas e acessíveis) antes que a reticulação das micropartículas possa ocorrer. A reticulação pode ocorrer somente se as biotinas das micropartículas estão disponíveis, e se pelo menos dois dos quatro domínios de ligação de SA podem ser ligar com biotinas não ligadas e acessíveis sobre duas partículas distintas.

Foi empiricamente determinado que Pluronic® F108 funcionou como um agente de dispersão para micropartículas revestidas com BSA bio-tinilada de razão de entrada baixa em concentrações de 0,4% a 0,6% (p/v). Em resumo, a combinação de razão de entrada de SA (10, 15, 25 e 35 pg de SA/mg de micropartícula de biotina-BSA), períodos de incubação (30 e 60 minutos) e a porcentagem de Pluronic® F108 (0,4 a 0,6% (p/v) foram avaliados para otimizar a etapa de dispersão. Os resultados de testes de desempenho de ensaios (ensaios Access® T4 Livre e Access® AccuTnl; Beckman Coulter, Inc.) e teste de capacidade de ligação de IgG biotinilado indicou que o processo de dispersão é robusto quando 25 a 35 pg de SA são adicionados por mg de micropartículas de biotina-BSA, em uma concentração de micropartículas de 25 mg de micropartículas de biotina-BSA/mL, em um tampão de TBS (Tris 20 mM, cloreto de sódio 150mM, pH 7,2) contendo 0,4% a 0,6% (p/v) Pluronic® F108, e incubadas por 30 a 60 minutos.

Uma vez que as mícropartículas foram tratadas e dispersadas na solução a 0,4%-0,6% (p/v) de Pluronic® F108, níveis baixos ou quantidades de SA puderam ser adicionados às mícropartículas biotiniladas sem a formação de agregados ou grumos de partículas. Esse processo resultou em mo-nodispersão de mícropartículas depois do revestimento de mícropartículas com SA. Uma ilustração do processo é fornecida na Figura 6, que mostra o tratamento com SA de mícropartículas revestida em ausência de Pluronic® F108, e ilustra a monodispersão resultante do tratamento com Pluronic® F108. EXEMPLO 4 RAZÃO DE SINAL PARA RUÍDO AUMENTADA DEVIDO À NÃO-SATURACÃO E ORIENTAÇÃO. BLOQUEIO DE SUPERFÍCIE AUMENTADA. E EFICÁCIA DE LIGAÇÃO APERFEIÇOADA

Foi feita uma comparação em duas plataformas de ensaio entre a razão de sinal para ruído de mícropartículas convencionais e daquela de mícropartículas não-saturadas da invenção que são caracterizadas por não saturação de SA e orientação, bloqueio de superfície aumentado, e eficácia de ligação aperfeiçoada.

Uma superfície de ligação direcionada contra peptídeo natriuréti-co tipo B ou peptídeo natriurético do cérebro (BNP) foi construído em micro-partículas convencionais (mícropartículas M1-070/40, EMD Biosciences) pelo uso de um revestimento primário anticorpo GxBiotina (antibiotina de cabra) na superfície de uma micropartícula, seguido por um revestimento secundário com um fragmento Fab biotinilado OMNICLONAL® (Biosite, Inc.) direcionado contra BNP. Em resumo, o revestimento primário de IgG de GxBiotina foi aplicado aos 10 mg/mL de mícropartículas usando a química de carbodiimida por ativação dos grupos carboxila da superfície de micropartícula (70 a 100 pmols de COOH/g) com aproximadamente 6 a 10 rnols de EDC (cloridrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropi!]carbodiimida; Pierce Biote-chnlogy Inc./Thermo Scientific) e 6 a 10 rnols de sulfo-NHS (n-hidroxissulfos-succinimída; Pierce Biotechnology Inc./Thermo Scientific) por mol de caboxi- Ias de superfície em MES pH 5,5, incubação das micropartículas com agentes de ativação por 30 a 35 minutos, remoção do excesso de agentes de ativação por lavagem das micropartículas, três vezes, com MES pH 5,5, adicionar 40 microgramas de GxBiotina IgG por mg de micropartículas ativadas, incubação das micropartículas ativadas com GxBotina IgGpor 120 a 135 minutos, remoção do excesso de GxBiotina IgG e finalização dos grupos car-boxila ativados residuais com um tampão com base em glicina, separação de GxBotina IgG passivamente absorvido usando tampões de pH baixo (pH 2,5) e alto (pH 8,0) contendo o tensoativo TRITON® X-100 (éter p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenílico de polietileno glicol), e bloqueio da superfície de mi-cropartícula com BSA. O revestimento secundário foi aplicado por lavagem das micropartículas, primárias, revestidas com GxBiotina IgG em diluente específico de ensaio BNP, adição de 10 microgramas de BNP Fab biotinilado por mg de micropartículas de GxBiotina, incubação do BNP Fab biotinilado com as micropartículas por 90 a 135 minutos, à temperatura ambiente, lavagem das micropartículas para remover o excesso de BNP Fab biotinilado, e diluição das micropartículas revestidas com BNP para 1,0 mg/mL com diluente específico de ensaio de BNP.

Micropartículas não-saturadas de acordo com a invenção foram preparadas ligando-se covalentemente BSA biotinilada de razão de entrada baixa para PMPs ativadas com tosila Dynal® AKT-100, onde a BSA foi biotinilada em uma razão de entrada molar de 4 rnols de biotina para 1 mol de BSA, seguido por bloqueio das micropartículas de biotina-BSA com Pluro-nic® F108, dispersão das micropartículas de BSA-biotina bloqueadas em Pluronic® F108, e finalmente revestimento das micropartículas de biotina-BSA com SA. A razão de entrada de anticorpo monoclonal biotinilado foi o mesmo para as micropartículas convencionais e as micropartículas não-saturadas. O Fab OMINCLONAL biotinilado foi direcionado contra BNP. As micropartículas revestidas convencionais e as micropartículas não-saturadas foram avaliadas na mesma concentração de micropartículas (1,0 mg/mL), e foram testados em formatos de ensaio Access® (Beckman Coulter, Inc.) com reagentes idênticos, amostras de controle, e amostras de pacientes. Os resultados são mostrados na Tabela 5.

Razão de sinal para ruído foi medida para as micropartículas convencionais e para as não-saturadas em cada uma das plataformas de ensaio (Beckman Coulter, Inc.): o Sistema de Imunoensaio UniCel) DXI 800 Access® (sistema com rendimento relativamente mais alto) e o Sistema de Imunoensaio Access® 2 (sistema de rendimento relativamente mais baixo). A resposta do calibrador foi medida em uma faixa de níveis de calibrador e para 13 amostras de pacientes separadas. Os resultados são mostrados para as partículas convencionais ("Controle" na Tabela 5) e para as micropartículas não-saturadas ("Dev 3" na Tabela 5) em RLUs. O erro constante na plataforma de ensaio, expresso como "% de erro constante (bias)", foi determinado do mesmo modo para ambas as micropartículas de controle e não-saturadas. O termo "erro constante" refere-se às diferenças nas doses de ensaio que podem ocorrer entre quaisquer sistemas de ensaio, inclusive o Sistema de Imunoensaio Access® 2 e o Sistema de Imunoensaio UniCel® DXI 800 Access®, devido ao equipamento, projeto, e diferenças de rendimentos (isto é, o Sistema de Imunoensaio Access® 2 pode completar 100 testes por hora, e o Sistema de Imunoensaio UniCel® XI 800 Access® pode completar 400 testes por hora), embora ambas as plataformas usem reagentes e suprimentos idênticos. Qualquer erro constante pode ser atribuído a diferenças em como cada plataforma sônica, mistura, lava, e incuba o rea-gente de micropartícula. A dose média foi calculada para as micropartículas convencionais e para as micropartículas não-saturadas.

Conforme ilustrado na Tabela 5, as medições de erro constante para as micropartículas de acordo com a invenção foram melhores no total que para as micropartículas convencionais. A Tabela 5 revela também que, para as micropartículas não-saturadas: (1) ou resíduo foi menor (compare S0 com S1-S5), (2) sinal para resíduo foi mais favorável em todos os níveis do calibrador e todas as amostras dos pacientes, e, (3) a sensitividade foi mais alta para todos os níveis do calibrador e todas as amostras dos pacientes. Assim, as micropartículas não-saturadas produziram um aumento do sinal do ensaio (por exemplo, usando a plataforma DXI, 13 x 106 RLUs em S5 para micropartículas convencionais, em comparação com 23 x 106 RLUs em S5 para micropartículas não-saturadas da invenção), e um decréscimo significante no ruído ou resíduo do ensaio (por exemplo, usando a plataforma Dxl, 10 x 103 RLUs em S0 para micropartículas convencionais, em comparação com 7 x 103 RLUs em S0 para as micropartículas não-saturadas da presente invenção).

Uma outra comparação de micropartículas de acordo com a invenção e uma micropartícula comercialmente disponível foi conduzida (vide Tabela 2 para descrição das micropartículas). Nessa comparação, foi obtida uma micropartícula Dynal® comercialmente disponível (Invitrogen Corportati-on), feita por revestimento primário de PMPs ativadas com tosila Dynal® AKT-100 com SA recombinante. O desempenho da micropartícula revestida com SA comercialmente disponível foi comparada A uma micropartícula de acordo com a invenção produzida por revestimento de PMPs ativadas com tosila Dynal® AKT-100 com BSA biotinilada de razão de entrada baixa, bloqueio das micropartículas de biotina-BSA com Pluronic® F108, dispersão das micropartículas de biotina-BSA bloqueadas em Pluronic® F108, e finalmente revestimento das micropartículas de biotina-BSA com SA. Ambas as micropartículas comercialmente disponíveis e micropartículas não-saturadas foram usadas em um ensaio de troponina I (Ensaio Access® AccuTnl; Beck-man Coulter, Inc.) empregando um anticorpo biotinilado contra Tnl como porção de captura. A micropartícula comercialmente disponível e a micropartícula não-saturada da invenção foram ambas avaliadas na mesma concentração de micropartículas, e foram testadas no formato de ensaio idêntico com reagentes idênticos, amostras de controle, e amostras dos pacientes. Os resultados são mostrados na Tabela 6.

As micropartículas não-saturadas da invenção resultaram em um aumento significante no sinal de ensaio comparado às micropartículas comercialmente disponíveis (por exemplo, S5 aumentada de 0,6 x 106 RLUs a 12,4 x 106 RLUs), e um decréscimo significante do ruído ou resíduo do ensaio (por exemplo, S0 reduziu de 13 x 103 RLUs a 8 x 103 RLUs). Assim, as micropartículas não-saturadas da invenção exibiram uma razão de sinal para ruído aumentado devido à natureza não-saturada e orientada da SA sobre a superfície de ligação da micropartícula e seu efeito cumulativo não saturante e orientador sobre anticorpo biotinilado adicionado subsequentemente. Observe, as comparações acima do Método Dynal® e o Método BCI usaram o Método Dynal® otimizado (produto comercializado, Dynal® YBABEADS MyOne Estreptavidina T1; Invitrogen), mas não o método BCI otimizado. Teste de Tnl subsequente (ensaio Access® AccuTnl) das micropartículas não-saturadas usando o Método BCI otimizado resultou em um aumento ainda mais significante do sinal de ensaio (isto é, S1 = 80.000 RLUs), S5 = 18.300.000 RLUs), ruído ou resíduo de ensaio similar (isto é, S0 = 8,500 RLUs), e razões de curva aumentadas (isto é, S1/S0 = 9,4, S5/S0 = 2.130). EXEMPLO 5 REDUÇÃO DA LIGAÇÃO NÃO-ESPECÍFICA

Foram conduzidos estudos que revelaram reduções da ligação não-específica usando micropartículas feitas de acordo com a invenção, já que a ligação não-específica é um fenômeno indesejado em muitos formatos de ensaio. A ligação não-específica descreve eventos de ligação artefatuais em um imunoensaio envolvendo seus componentes e/ou superfícies de suporte que rendem subprodutos indesejáveis, que podem afetar adversamente os parâmetros de desempenho, como um exemplo não-limitativo, a razão de sinal para ruído. Ligação não-específica pode envolver ligação à própria superfície de suporte de fase sólida, e/ou ao complexo de ligante::acoplador de suporte revestido sobre a superfície de suporte. A modalidade específica de uma micropartícula empregando BSA como um acoplador de suporte foi examinada. BSA é uma albumina (albumina sérica bovina), e albuminas podem se ligar aos hormônios da tireóide. BSA foi identificada como uma proteína de ligação para os hormônios da tireóide T3 e T4. Se uma superfície de suporte de fase sólida é revestida com BSA, a superfície de ligação capturará ou se ligará a tais hormônios da tireóide a menos que ela seja bloqueada com sucesso. Já que micropartículas de SA não-saturadas são produzidas por revestimento das micropartículas com BSA biotinilada, bloqueio de superfície com Pluronic® F108, e revestimento da superfície de biotina-BSA com SA, as micropartículas de SA não-saturadas têm potencial para se ligarem aos hormônios da tireóide tais como T3 e T4 a menos que sua superfície esteja suficientemente bloqueada. Em particular, se as micropartícula de SA não-saturadas são incubadas com conjugado de T3 fosfatase alcalina, as micropartículas podem se ligar ao conjugado de T3 e gerar sinal de ligação não-específica (NSB) em um ensaio a menos que a superfície esteja bloqueada e a ligação não-específica seja reduzida ou eliminada. Além do resíduo aumentado, sinal de calibrador elevado pode resultar da ligação não-específica do conjugado de T3. Foi empiricamente determinado que as micropartículas bloqueadas com Pluronic® F108 revestidas com BSA biotinilada de razão de entrada baixa em concentrações de 0,4% a 0,6% (p/v).

Estudos de bloqueio inicial avaliaram 0,1% (p/v) de BSA em Tris 0,1 M pH 8,0, e 0,4% (p/v) de Pluronic® F108 em Tris 0,1M pH 8,0, como a-gentes de bloqueio para micropartículas paramagnéticas ativadas com tosila revestidas com BSA biotinilada. As micropartículas de biotina-BSA foram incubadas com os tampões de bloqueio de 0,1% (p/v) de BSA ou 0,4% (p/v) de Pluronic® F108 por 18 horas a 37°C, e revestidas com SA por titulação lenta das micropartículas de biotina-BSA em um excesso molar de SA. As micropartículas de BSA-biotina foram lavadas três vezes antes do bloqueio, e também após o bloqueio, usando um dos seguintes tampões: PBS pH 7,4, PBS com 0,1% (p/v) TRITON X-100 pH 7,4, PBS com 0,4% (p/v) de Pluronic® f108. Os resultados do teste de desempenho de ensaio (Ensaio Access® AccuTnl; Beckman Coulter, Inc.) indicaram que o tampão de bloqueio de 0,4% (p/v) de Pluronic® F108, e lavagens com TBS pH 7,4, resultaram no sinal residual mais baixo (RLUs de S0 mais baixo), sinal de calibrador mais alto (RLUs de S1 e S5 mais altos), faixa dinâmica de ensaio maior, e razão mais alta de sinal para ruído.

Os estudos sobre otimização de bloqueio subsequentes avaliaram o desempenho das micropartículas de biotina-BSA preparadas com BSA biotinilada com sulfo-NHS-LC-biotina, sulfo-HHS-LC-LC-biotina, ou PFP biotina, lavadas três vezes com TBS pH 7,4, bloqueadas com tampões de bloqueios 0,1% (p/v) de BSA ou 0,4% (p/v) de Pluronic® F108 por 4 horas a 37°C ou 18 horas a 37°C, lavadas três vezes com TBS pH 7,4, e revestidas com SA ou neutravidina por titulação lenta das micropartículas de biotina-BSA em um excesso molar de SA ou neutravidina. Os resultados do teste de desempenho de ensaio (Ensaio Access® AccuTnl; Beckman Coulter, Inc.) indicaram que as micropartículas de sulfo-NHS-LC-biotina BSA, e micropartículas de PFP-biotina BSA, bloqueadas com 0,4% (p/v) de Pluronic® F108 por 4 horas a 37°C, e revestidas com SA ou neutravidina, resultaram no mais baixo sinal residual (S0), sinal de calibrador mais alto (S1 e S5), maior faixa dinâmica de ensaio, e razão mais alta de sinal para ruído.

Os estudos de otimização de bloqueio final com Pluronic® F108 usaram micropartículas de biotina-BSA preparadas por revestimento com BSA conjugado com sulfo-NHS-LC-biotina de razão de entrada baixa (40 microgramas de biotina-BSA ou miligrama de micropartículas) sobre micropartículas ativadas com tosila Dynal® MyOne (Dynal® DYNABEADS MyOne ativadas com tosila, 1,0 mícron de diâmetro, Invitrogen Corporation) a 40°C, por 18 horas, em Borato 0,1 M pH 9,5. As micropartículas de biotina-BSA foram lavadas três vezes com TBS pH 7,4, bloqueadas com 0,2%, 0,4%, 0,6%, ou 0,8% (p/v) de Pluronic® F108 em TBS pH 7,4 por 2, 4, ou 24 horas a 40°C, lavadas três vezes com TBS pH 7,4, e revestidas com SA por dispersão das micropartículas de biotina-BSA em TBS com 0,4% (p/v) de Pluronic® F108 pH 7,4 e então adição de 35 microgramas de SA por miligrama de micropartículas. Os resultados do teste de desempenho de ensaio (ensaios Access® T4 Livre e Access® AccuTnl; Beckman Coulter, Inc.), e teste de capacidade de ligação de IgG biotinilado, indicaram que as micropartículas bloquearam por 4 horas com 0,4% a 0,6% (p/v) de Pluronic® resultaram no sinal de resíduo mais baixo, sinal de calibrador mais alto, faixa dinâmica de ensaio maior, maior razão de sinal para ruído e capacidade de ligação de IgG biotinilado reprodutível.

Para avaliar a ligação não-específica das micropartículas revestidas com SA não-saturadas, um lote de micropartículas revestidas com SA não-saturada foi incubada a 4°C ou a 37°C, por 3 dias, e testadas em um imunoensaio de T4 livre usando um calibrador Access® T4 Livre e Pacotes de reagente Access® T4 Livre (Beckman Coulter, Inc.). As amostras testadas sem anticorpo específico de T4 livre biotinilado ("Sem AB") avaliariam a ligação não-específica do conjugado T3 à superfície de micropartícula. Os resultados são mostrados na Tabela 7 para micropartículas inventivas tendo BSA biotinilada revestida com SA, em comparação com o sinal gerado a partir de um ensaio de micropartícula comercialmente disponível (Access T4 Livre) empregando-se um anticorpo biotinilado, e as micropartículas Dynal® DYNABEADS M-280 Estreptavidina da Invitrogen Corporation (micropartículas de 2,8 micra).

Os resultados indicam que a ligação não-específica de conjugado não ocorreu já que o sinal de ensaio SO foi <8.500 RLUs em ambas as amostras não-saturadas a 4°C e 37°C quando o anticorpo específico de T4 Livre biotinilado foi removido dos pacotes de reagente (Sem Ab). O sinal de ensaio deveria somente ser gerado se a ligação não-específica ocorresse, ou se o anticorpo específico de T4 Livre biotinilado estivesse presente no ensaio já que a superfície de SA capturará o anticorpo específico de T4 Livre biotinilado, e este anticorpo específico de T4 Livre capturado não se ligou ao conjugado de T3 (isto é, SO > 1,5 x 106 RLUs). As micropartículas comercialmente disponíveis empregaram micropartículas de SA com ovalbumina (sem BSA), de modo a reduzir a ligação não-específica. Embora as micropartículas não-saturadas tenham empregado BSA biotinilada de razão de entrada baixa, elas exibiram melhor desempenho. No global, os resultados indicam que mesmo em temperatura elevada por um período prolongado (37°C por 3 dias), a ligação não-específica não foi observada, sugerindo que Pluronic® F108 não é deslocada das micropartículas não-saturadas sob estas condições. Por conseguinte, uma superfície de ligação revestida com SA, revestida com biotina-BSA bloqueada com Pluronic® F108 resulta em ligação não-específica reduzida ou minimizada de um conjugado de T3 fosfatase alcalina, mesmo durante um tempo em temperatura elevada. EXEMPLO 6 REPRODUTIBILIDADE DO PROCESSO DE REVESTIMENTO A validação do processo para revestimento com SA foi efetuada para micropartículas não-saturadas e orientadas de acordo com a invenção. Os resultados são mostrados na Tabela 8 e na Figura 12 e Figura 13. As micropartículas para a validação do processo foram preparadas de acordo com a invenção. Em resumo, as PMPs ativadas com tosila Dynal® AKT-100 (Invitrogen Corporation) foram revestidas com BSA biotinilada com razão de entrada baixa, as micropartículas de biotina-BSA foram bloqueadas com Pluronic® F108, as micropartículas de biotina-BSA bloqueadas foram dispersas em Pluronic® F108, e as micropartículas de biotina-BSA foram revestidas com SA.

Os ensaios foram conduzidos com várias combinações de revestimentos ("Processo") de SA independentemente preparados, lotes de micropartículas ("Lote de PMPs Ativadas com Tosila"), lotes de BSA biotinilada com razão de entrada baixa ("Lote de BSA biotinilada com Razão de Entrada Baixa"), lotes de Pluronic® F108 ("Lote de Copolímero em Bloco Pluronic® F108"), e lotes de SA ("Lote de SA"). Na Tabela 8, o termo "Processo" refe-re-se ao revestimento de micropartículas com BSA biotinilada de razão de entrada baixa, bloqueio das micropartículas com Pluronic® F108, dispersão das micropartículas em Pluronic® F108, e revestimento de SA sobre as micropartículas de biotina-BSA; "Operador" indica que os revestimentos de SA, ou "Processo", foram realizados por um de quatro operadores humanos diferentes.

Os resultados de outros estudos de validação empregando um ensaio T4 Livre (vide Figura 12) para 11 lotes de validação usando cinco controles separados comercialmente disponíveis ("Bio-Rad Liquid 1", "Bio-Rad Liquid 2". "Bio-Rad 1", "Bio-Rad 2"; Bio-Rad Laboratories, Inc.) e duas amostras soros de pacientes reunidos " Agrupamentos de Paciente 1" e "A-grupamentos de Paciente 2") e três amostras individuais ("Amostra 1", "A-mostra 2", e "Amostra 3") revelaram uma boa concordância, com um CV menor que ou igual a cerca de 5%. Em contraste, as micropartículas preparadas convencionalmente (por exemplo, micropartícula de SA DYNABEADS M-280) têm um CV de pelo menos cerca de 10%.

Outros estudos de validação (vide Figura 13) para 10 lotes de validação empregando um marcador de BPH-A, usando três conjuntos de controles onde o antígeno spiked no soro (Controle A, B, e C), e os três controles de soro de pacientes (QC Paciente 1, 2, e 3) resultaram em constatações similares.

Os resultados da validação do processo de revestimento de SA revelam que todas as especificações de validação foram satisfeitas para todos os lotes. Além disso, os resultados indicam que o processo de fabricação das partículas de acordo com a invenção está associado a um baixo grau de variância, é reprodutível, e é confiável. EXEMPLO 7 ESTABILIDADE AUMENTADA DAS MICROPARTÍCULAS NÃO-SATURADAS O teste de estabilidade acelerada, conforme medido por recuperação do T4 em um calibrador ou amostra, foi conduzido em lotes de validação múltiplos de micropartículas revestidas com SA, não-saturadas, contendo um anticorpo anti-T4 biotinilado usando Calibrador Access® T4 Livre em um ensaio Access T4 Livre (Beckman Coulter, Inc.) a 4°C e a 37°C por um período de quatro dias, e a 4°C e a 37°C por um período de 127 dias. Os resultados são mostrados na Tabela 9 e Figuras 14A e 14B. A Tabela 9 mostra calibrador médio, dose de controle, e recuperações de dose de paciente para lotes de validação de micropartículas revestidas de SA não-saturadas incubadas por 4 dias a 37°C em comparação com 4 dias a 4°C. Conforme pode ser visto da Tabela 9, a recuperação média para todos os lotes estava em ou próximo a 100%.

Nas Figuras 14A e 14B, a recuperação é expressa como porcentagem de RLUs medidas por ensaio para FT4 depois de 127 dias a 37°c em comparação com RLUs medidas por ensaio para FT4 depois de 127 dias a 4°C ("Recuperação"). Os níveis do calibrador foram S0 = 0,0 ng/mL, S1 = 0,54 ng/mL, S2 = 1,01 ng/mL, S3 = 1,98 ng/mL, S4 = 3,00 ng/mL, e S5 = 6,11 ng/mL. À parte do calibrador, outras amostras ensaiadas incluíram Bio-Rad controle 1 = 0,64 ng/mL, Bio-Rad controle 2 =2,18 ng/mL, e Bior-Rad controle 3 = 4,19 ng/mL ("Bio_Rad lypho"), e cinco amostras de paciente separadas ("Paciente #") com doses Paciente 1 = 1,02 ng/mL, Paciente 2 = 1,12 ng/mL, Paciente 3 = 1,83 ng/mL, Paciente 4 = 2,74 ng/mL, e Paciente 5 = 3,80 ng/mL. No total, a recuperação estava em ou próxima de 100%, indicando que o tratamento por um período prolongado de tempo não afeta adversamente o desempenho das micropartículas não-saturadas. Para fins de comparação, as especificações para um ensaio de T4 livre empregando micropartículas revestidas com SA comercialmente disponíveis (ensaio Access® T4 livre; Beckman Coulter, Inc.) estão incluídas nas Figuras 14A e 14B ("Especificações para Ensaio FT4 Correntes"). As micropartículas não-saturadas se enquadram dentro das especificações do ensaio T4 livre comercialmente disponível.

No total, o teste de estabilidade acelerada confirmou que lotes de micropartículas revestidas com SA são bastante estáveis. Nenhuma diferença significante foi observada entre os lotes de validação incubados por 3 dias a 4°C ou por 3 dias a 37°C. O sinal do calibrador foi muito similar (recuperação do calibrador de 99,1% a 113,5%), e as recuperações de dose de Controle e de Paciente foram todas de 97,2% a 10,29%. Não foi observada diferença significante de desempenho quando um único lote foi incubado por 127 dias a 4°C ou a 37°C. O sinal do calibrador foi muito similar (recuperação do calibrador de 95,1% a 109,6%), razões de curva foram bastante similares (% de Recuperação de 91,3% a 105,1%), e as recuperações médias de dose de Controle de Paciente foram todas de 93,7% a 107,6%. EXEMPLO 8 ANÁLISE DE DESCASCAMETEO DE MICROPARTÍCULAS NÃO-SATURADAS

Foi efetuado um estudo da retirada das micropartículas não-saturadas feitas de acordo com a invenção. Existem aproximadamente 8,7-14,0 de biotina-BSA/mg de PMP, e 5,6-7,8 pg de SA/mg de PMP em micropartículas feitas de acordo com a invenção que empregam biotina-BSA e são revestidas com SA (vide Exemplo 11). Se 1% de proteína tivesse que se descascar de 10 mg de PMP total, havería aproximadamente de 0,7-1,0 μg de proteína em solução. Uma análise da retirada foi conduzida para tais mi- cropartículas revestidas com SA. Os resultados da cromatografia por exclusão de tamanho em HPLC (SEC-HPLC) indicam SA ou BSA não detectável em 210 nm, ou menos que 1% de retirada. Se SA e/ou biotina-BSA estão livres em solução, elas estão abaixo do limite de detecção do método de SEC-HPLC (vide Figuras 15A e 15B). Na Figura 15B, os picos padrão SEC de Gama-Globulina e de Ovalbumina (alturas de pico - 1.400 mAU) representam 83,5 pg de proteína total em 210 nm. Uma altura de pico de 5 mAu (unidades de miliabsorção) representariam 0,3 pg de proteína. Análise de HPLC de exclusão de tamanho em 210 nm indicou que não há Biotina-BSA ou moléculas de BSA detectáveis em solução depois de estressar as micro-partículas por 3 dias, a 37°C (por exemplo, não-retirada de proteína da superfície da partícula). Por conseguinte, a retirada não apresenta problema com micropartículas feitas de acordo com a invenção. Os dados de estabilidade apresentados acima confirmam os resultados da análise de retirada de SA por SEC-HPLC, já que o sinal de ensaio e a ligação de IgG presumivelmente biotinilado não foram afetados por estresse das micropartículas até 127 dias a 37°C (Figuras 14A-B). EXEMPLO 9 BIOTINILAÇÃO DE OVALBUMINA DE RACÃO DE ENTRADA BAIXA

As micropartículas de acordo com a invenção foram feitas com ovalbumina acoplada à biotina em vez da BSA acoplada à biotina. A ovalbumina foi biotinilada com NHS-LC-biotina (sulfossuccinimidil-6-[biotinamido] hexanoato, Pierce Biotechnology Inc./Thermo Scientific) em várias razões de entrada molares de biotina para ovalbumina (vide Tabela 10), conforme descrição para BSA no Exemplo 1. Em resumo, quatro lotes de biotinilação separados para biotinilar ovalbumina (20 mg em 1,253 mL) em tampão de bo-rato, pH 8,2 e DMF com sulfo-NHS-LC-biotina em várias razões de entrada foram preparados conforme visto na Tabela 10.

Rendimento em porcentagem na biotinilação foi de 75,6% para razão de entrada de 2; 83,3% para razão de entrada de 4; 85,1% para razão de entrada de 6; e 79,1% para razão de entrada de 8. Análise com HABA (ácido 4'-hidroxiazobenzoato-2-carboxílico) foi efetuada para cada razão de entrada. Os resultados são mostrados na Tabela 11.

Análise de estabilidade de 4 lotes de biotinilação independentes de ovalbumina biotinilada foi completado por revestimento de 25 mg/L de PMPs ativadas com tosila (Dynal® DYNABEADS MyOne Ativadas com tosila, diâmetro de 1,0 mícron, Invitrogen Corporation) com ovalbumina-biotina por 18 a 24 horas a 37°C em tampão de borato de 0,1 M pH 9,5 (0,050 mg de ovalbumina-biotina por mg de PMP), lavagem, três vezes, das micropartícu-las com TBS pH 7,4, bloqueio da superfície da micropartícula revestida com ovalbumina-biotina com 0,4% (p/v) de Pluronic® F108 em TBS pH 7,4 por 4 horas a 37°C, lavagem, três vezes, das micropartículas com TBS pH 7,4, dispersão das micropartículas de ovalbumina-biotina com SA em TBS pH 7,4, por 30 minutos, à temperatura ambiente (0,035 mg de SA por mg de PMP de ovalbumina-biotina), lavagem das micropartículas, três vezes, com TBS pH 7,4 com azida sódica (0,1% p/v), lavagem, três vezes, das micropartículas com tampão de micropartícula específico para ensaio Access® T4 livre, diluição das micropartículas de 25 mg/mL para 0,35 mg/mL com tampão de micropartícula específico de ensaio Access® T4 livre, incubação das micropartículas revestidas com ovalbumina-biotina-SA a 4°C ou a 37°C por 3 dias, e teste da capacidade das micropartículas de ovalbumina-biotina-SA de se ligarem a anticorpo de anti-T4 livre biotinilado no Ensaio Access® T4 livre (Beckman Coulter, Inc.)· A estabilidade foi determinada calculando-se a média das recuperações de RLUs do calibrador de T4 Livre, individuais. O Ensaio Access® T4 livre usa seis calibradores diferentes (S0, S1, S2, S3, S4, e S5) com níveis de antígeno de 0 ng/mL a 6 ng/mL (vide Tabela 4). A recuperação foi calculada por divisão da resposta em RLU do calibrador a 37°C pela resposta em RLU do calibrador a 4°C, e multiplicação do resultado por 100%. A estabilidade foi calculada por medição da média da recuperação para todos os seis calibradores. Os resultados são mostrados na Tabela 11. A estabilidade foi indicativa da mudança de capacidade de ligação à SA depois da incubação da fase sólida a 4°C ou a 37°C por 3 dias. Um decréscimo da estabilidade se deve à retirada ou dissociação da biotina ligada passivamente ou reagente de biotina dos conjugados de ovalbumina-biotina, e a captura subsequente da biotina livre ou reagente de biotina por SA com o tempo. A Tabela 11 estabelece que proteínas que não a BSA, tal como ovalbumina, podem ser preparadas, de modo eficaz, usando-se biotinilação de razão de entrada baixa, conforme descrição aqui. Os resultados do teste de estabilidade da ovalbumina-biotina são muitos similares aos resultados de estabilidade de biotina-BSA descritos acima (vide Tabela 1). Os resultados indicaram que a ovalbumina-biotina preparada em razões de entrada molares altas (isto é, 8:1) exibe estabilidade reduzida. Na medida em que a razão de entrada molar do reagente de biotina para a albumina diminuiu de 8:1 a 2:1, a estabilidade aumentou de 82% a 97% (vide Tabela 11). EXEMPLO 10 DENSIDADE DE BIOTINA. SA. E IMUNOGLOBULINAS SOBRE A SUPERFÍCIE DAS MICROPARTÍCULAS PARA ENSAIOS DE AFINIDADE PMPs de acordo com a invenção foram preparadas usando BSA como um acoplador de suporte e biotina como um ligante. SA foi usada para se ligar a um IgG biotinilado com porção de captura.

Em resumo, PMPs Dynal® (Invitrogen Corporation) foram preparadas de acordo com o procedimento do Exemplo 1 (isto é, PMPs foram revestidas com biotina-BSA de razão de entrada baixa de acordo com o protocolo do Exemplo 1. As micropartículas foram preparadas de acordo com a invenção e revestidas com biotina-BSA de razão de entrada baixa e então SA de acordo com a invenção. Depois disso, as PMPs revestidas com SA foram tratadas com IgGs biotiniladas. As seguintes IgGs foram usadas: IgG M06 biotinilado, que é o anticorpo monoclonal de Mc x Access® AccuTnl u-sado como o anticorpo de detector (isto é, ele é conjugado à fosfatase alcalina) no ensaio de Access® AccuTnl (Beckman Coulter, Inc.), e 339,4 de IgG biotinilada, que o anticorpo monoclonal Mc x FPSA usado como o anticorpo de captura (isto é, é revestido sobre uma PMP de antibiotina de bode) no Ensaio Access® de PSA Livre (Beckman Coulter, Inc.). Vários lotes das SA PMPs preparadas de acordo com esta invenção, foram revestidos com IgG M06 ou 399,4 IgG para avaliar a capacidade de ligação de IgG biotinilado dos lotes de SA PMP usando o método de IgG biotinilado e marcado com 125l, conforme descrito acima. Uma descrição das partículas e os resultados em termos de densidade de superfície dos componentes da superfície são apresentados na Tabela 12.

Os dados da Tabela 12 podem ser convertidos em valores molares, cuja conversão revela que existem cerca de 2,46 x 10"4 (μιτιοΙ de bioti-na)/(mg de PMP) no exemplo mostrado (vide A). Para uma micropartícula de cerca de um mícron de diâmetro, com área de superfície de 7,7 x 10'3 m2/(mg de PMP), existem cerca de 3,19 x 10'2 (μιτιοΙ de biotina)/(m2 de PMP).

Além dos lotes descritos acima, as PMPs biotiniladas feitas de acordo com a invenção e cuja densidade é de 15,1 (pg de biotina-BSA)/(mg de PMP), para uma PMP de 1,10 mícron tendo uma área de superfície de 7,7 m2/g.

Além dos lotes descritos acima, outros três lotes de validação foram preparados da mesma maneira. Esses outros lotes estão descritos na Tabela 13.

Observando os dados da Tabela 13 em termos molares, supondo que existem cerca de 6,1 (μς de AS)/(mg de PMP), e usando um peso molecular de 56 kDa para SA, existem cerca de 1,41 x 10'2 (pmol de SA)/(m2 de PMP). Assim, em comparação com os dados na Tabela 12, parece haver cerca de tanto quanto a metade de SA sobre a micropartícula como biotina. EXEMPLO 11 Foram efetuados cálculos da densidade superficial para BSA, biotina, SA, e IgG, para lotes preparados nos Exemplos descritos acima. Lotes de biotinilação de entrada baixa da Tabela I que indicaram boa estabilidade (13 lotes) foram usados para gerar densidade superficial para micro-partículas. Os cálculos de densidade superficial real para micropartículas, e para suportes não particulados (com base nos dados das micropartículas) são mostrados nas Figuras 16A e 16B e abaixo na Tabela 14. Os cálculos de densidade superficial para micropartículas, assumindo uma superfície lisa, e para suportes não particulados (com base em dados de micropartículas "lisas") são mostrados nas Figuras 16A, 16C, 16D, e na Tabela 15 abaixo. Cálculos de densidade superficial foram baseados em parâmetros de teste físico. Em resumo, a quantidade de BSA e SA revestida sobre a superfície durante as etapas de revestimento foi medida por análise do fluido do sobrenadante seguinte às etapas de revestimento, usando o método de BCA para determinação de concentração de proteína (Ensaio de Proteína BCA [ácido bicinconínico]; Pierce Biotechnology Inc./Thermo Scientific) e/ou absorbância em 280 nm (para BSA e SA). Análise de HABA foi usada para quantificar a quantidade de biotina na BSA. A ligação de 125l foi usada para avaliar a capacidade de ligação de biotina-lgG. Em resumo, às micropartícu-las em TBS foram oferecidas uma quantidade de BSA, incubadas, e as mi-cropartículas foram separadas do fluido do sobrenadante. A proteína remanescente no fluido do sobrenadante foi medida, e subtraída da quantidade da quantidade de proteína adicionada. As micropartículas foram lavadas e as águas de lavagem analisadas quanto ao teor de proteína. Solução salina tamponada com TRIS, pH 7,4, foi usada para acoplar bem como para ligar o anticorpo às micropartículas. Os cálculos foram feitos com base em (a) a área de superfície medida real provida pelo fabricante da micropartícula e (b) a área de superfície calculada baseada no diâmetro de micropartícula e na suposição de lisura.

Para as medições de densidade superficial mostradas na Tabela 14, a área de superfície da micropartícula (com base no cálculo usando peso sólido seco) variou de um mínimo de 7,4 m2/g a um máximo de 8,4 m2/g, com uma faixa média de 7,7 m2/g.

Como pode ser visto na Tabela 14, que é baseada em medições de uma micropartícula comercialmente disponível (Dynal® DYNABEADS MyOne ativada com tosila, diâmetro de 1 mícron; Invitrogen Corporation), uma vez que os ligantes (por exemplo, biotina) são não-saturados, camadas subsequentes da superfície de ligação serão também não-saturadas. Em uma modalidade específica, uma micropartícula de um mícron tendo uma área de superfície de cerca de 0,0077 m2/mg e revestidas com a quantidade indicada de BSA biotinilada e SA ligada 2,1 x 10'5 μιτιοΙ de biotina-lgG por mg de PMP.

Para as medições de densidade de superfície mostradas na Tabela 15, a área de superfície da micropartícula (com base na presunção de lisura, o diâmetro de micropartícula de 0,90 para 1,10 μηη, e densidade de micropartícula de 1,4 a 1,8 g/cm3) variou de um mínimo de 0,0030 m2/mg a um máximo de 0,0048 m2/mg. A Tabela 15 presume uma superfície lisa. De novo, como pode ser visto na Tabela 15, já que os ligantes (por exemplo, biotina) não estão saturados, camadas subsequentes da superfície de ligação serão também não-saturadas. Contudo, devido à presunção de lisura, os cálculos de densidade de superfície resultam em mais μίτιοίε de ligantes (biotina) por metro quadrado, mais pmols de acopladores de suporte (BSA) por metro quadrado, mais pmols de fixadores de ligante (SA) por metro quadrado, e mais μΠΊοΙβ de porções de captura (biotina-lgG) por metro quadrado, em comparação com os cálculos de densidade superficial sem presunção de lisura (vide Tabela 14). O aumento da densidade superficial é devida ao fato que os pmols/mg de biotina, BSA, SA, ou de biotina-lgG são constantes, mas a área de superfície total da superfície de micropartícula com presunção de lisura é menor que a área de superfície total da superfície de micropartícula sem correção da lisura. Por exemplo, se duas micropartículas tiverem diâmetros e configuração idênticos, mas uma micropartícula é porosa e a ou- tra micropartícula é perfeitamente lisa, a micropartícula porosa terá uma área de superfície disponível maior por massa unitária (m2/mg) que a micropartícula lisa. Se ambas as micropartículas podem se ligar a ligante, e ambas tiverem oferecido a mesma quantidade de ligante, então a micropartícula porosa ligará menos ligante por metro quadrado que a micropartícula lisa.

Claims

1. Suporte de ligação por afinidade não-saturado microparticula-do, caracterizado pelo fato de que compreende: a) um suporte de ensaio de micropartícula de fase sólida tendo uma superfície de ligação não-saturada; b) pelo menos um acoplador de suporte que compreende uma proteína covalentemente imobilizado sobre o suporte de fase sólida, em que menos que uma quantidade saturante do acoplador de suporte é imobilizada no suporte de fase sólida, em que a proteína é selecionada do grupo que consiste em albumina sérica bovina, um fragmento de albumina sérica bovina, ovalbumina, um fragmento de ovalbumina, ou misturas dos mesmos; c) pelo menos um ligante acoplado à proteína, em que o ligante está presente em uma densidade de a partir de 1,0 x 10'2 a 2,0 x 10'1 mi-cromols de ligante por metro quadrado do suporte de ensaio, em que o ligante é biotina, e onde a biotina está presente em uma razão molar de biotina para proteína de menos do que ou igual a 5:1; e d) um copolímero em bloco, em que o copolímero em bloco compreende um grupo de cabeça hidrofóbico flanqueado por pelo menos dois grupos de cauda hidrofílicos, e em que o grupo de cabeça hidrofóbico contata o suporte de ensaio de micropartícula.

2. Suporte de ligação por afinidade não-saturado microparticula-do de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ligante está presente a uma densidade de a partir de 1,9 x 102 a 1,6 x 101 micromols de ligante por metro quadrado do suporte de ensaio; 1.6 x 102 a 6,6 x 102 micromols de ligante por metro quadrado do suporte de ensaio; ou 1.6 x 10'2 a 3,2 x 10'2 micromols de ligante por metro quadrado do suporte de ensaio.

3. Suporte de ligação por afinidade não-saturado microparticula-do de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que ainda compreende pelo menos um fixador de ligante associado com o ligante.

4. Suporte de ligação por afinidade não-saturado microparticula-do de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o fixador de ligante é pelo menos bivalente, o fixador de ligante bivalente compreendendo estreptavidina, avidina, neutravidina, um fragmento de estreptavidina, um fragmento de avidina, um fragmento de neutravidina, ou combinações dos mesmos.

5. Suporte de ligação por afinidade não-saturado microparticula-do de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma porção de captura associada ao fixador de ligante.

6. Suporte de ligação por afinidade não-saturado microparticula-do de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a porção de captura está presente no suporte de ensaio em uma densidade de 1,0 x 10'4 micromols por metro quadrado até 2,0 x 10'2 micromols por metro quadrado do suporte de ensaio.

7. Suporte de ligação por afinidade não-saturado microparticula-do de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o aco-plador de suporte compreende uma proteína selecionada de albumina sérica bovina ou ovalbumina.

8. Suporte de ligação por afinidade não-saturado microparticula-do de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o aco-plador de suporte é biotinilado de modo a render uma razão de incorporação molar de biotina para acoplador de suporte de menos do que ou igual a 3:1.

9. Suporte de ligação por afinidade não-saturado microparticula-do de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o ligante é biotina, em que o fixador de ligante é pelo menor bivalente, o fixador de ligante bivalente compreendendo estreptavidina, avidina, neutravidina, um fragmento de estreptavidina, um fragmento de avidina, um fragmento de neutravidina, ou combinações dos mesmos e em que a porção de captura é biotinilada e é selecionada do grupo que consiste em pelo menos um de um anticorpo, um fragmento de ligação de um anticorpo, um receptor, um ligante de um receptor, um hormônio, um receptor de um hormônio, uma enzima, um substrato de uma enzima, um oligonucleotídeo de fita simples, um oligo- nucleotídeo de fita dupla, um polinucleotídeo de fita simples, um polinucleo-tídeo de fita dupla, um antígeno, um peptídeo, e uma proteína.

10. Suporte de ligação por afinidade não-saturado microparticu-lado de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a porção de captura biotinilada compreende um espaçador.

11. Suporte de ligação por afinidade não-saturado microparticu-lado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o dito suporte de fase sólida compreende um material pa-ramagnético ou superparamagnético.

12. Suporte de ligação por afinidade não-saturado microparticu-lado de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende ainda pelo menos uma segunda porção de captura associada ao fixador de ligante.

13. Suporte de ligação por afinidade não-saturado microparticu-lado de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que os fixadores de ligante estão presentes no suporte de ensaio em uma densidade de 1,0 x 10'2 até 5,0 x 10'2 micromols por metro quadrado do suporte de ensaio.

14. Suporte de ligação por afinidade não-saturado microparticu-lado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um acoplador de suporte está presente no suporte de ensaio em uma densidade de 1,2 x 10'2 micromols por metro quadrado até 7,5 x 10'2 micromols por metro quadrado do suporte de ensaio.

15. Suporte de ligação por afinidade não-saturado microparticu-lado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ligante é biotina, e em que a biotina está presente em uma densidade de 1,6 x 10' 2 até 2,0 x 10'1 micromols por metro quadrado do suporte de ensaio.

16. Suporte de ligação por afinidade não-saturado e orientado microparticulado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o acoplador de suporte é uma proteína biotinilada covalentemente acoplada ao suporte, em que há menos que 5 mois de biotina acoplada por mol de proteína, e compreendendo ainda: a) uma porção de ligação de biotina associada à biotina, em que a porção de ligação de biotina é pelo menos bivalente; b) uma porção de captura biotinilada associada à porção de ligação de biotina; e c) um copolímero em bloco que contata o suporte, em que o co-polímero em bloco compreende um grupo de cabeça de poli(óxido de propi-leno) flanqueado por pelo menos dois grupos cauda de poli(óxido de etileno), em que o grupo de cabeça de poli(óxido de propileno) contata o suporte.

17. Suporte de ligação por afinidade microparticulado de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o comprimento das duas ou mais caudas hidrofílicas no copolímero em bloco pode cada uma ser, independentemente, de 2 a 2,5 vezes o comprimento do grupo de cabeça hidrofóbico e compreende, preferivelmente, uma estrutura de fórmula I, H0(C2H40)x(C3H60)y(C2H40)zH (I), em que x é 100 a 135, y é 40 a 75, e z é 100 a 135, e em que o copolímero em bloco tem um peso molecular médio de 9.000 Da a 18.000 Da.

18. Método para preparar o suporte de ligação por afinidade não-saturado microparticulado como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: a) acoplar, covalentemente, os acopladores de suporte e ligan-tes em uma razão de entrada de menos do que ou igual a 8 rnols de ligante para um mol de acoplador de suporte; e b) ligar covalentemente os complexos de ligante::acoplador de suporte ao suporte de fase sólida de modo a render uma densidade não sa-turante dos complexos de ligante::acoplador de suporte.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que depois de ligar covalentemente os complexos de ligante: :acoplador de suporte com o suporte de ensaio, o suporte de ensaio compreende 1,0 x 10'2 micromols de ligante por metro quadrado do suporte de ensaio a 2,0 x 10'1 micromols de ligante por metro quadrado do suporte de ensaio.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pe- Io fato de que o acoplador de suporte é albumina sérica bovina, um fragmento de albumina sérica bovina, ovalbumina, um fragmento de ovalbumina, ou misturas dos mesmos, e em que o ligante é biotina, e em que a albumina sérica bovina, fragmento de albumina sérica bovina, ovalbumina, fragmento de ovalbumina, ou misturas dos mesmos, são biotinilados de modo a render uma razão de incorporação molar de biotina:acoplador de suporte menor do que ou igual a 5:1.

21. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que compreende ainda preparar um suporte de ligação por afinidade não-saturado e orientado, por a) contatar o suporte sólido com uma pluralidade de moléculas de copolímeros em bloco, em que as moléculas de copolímero em bloco compreendem um grupo de cabeça hidrofóbico flanqueado por pelo menos dois grupos de cauda hidrofílicos, e b) revestir o suporte de ligação por afinidade com fixador de ligante por exposição do suporte de ligação por afinidade a um fixador de ligante que se associa ao ligante dos complexos de ligante::acoplador de suporte.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o suporte de ligação por afinidade compreende uma população de micropartículas revestidas e dispersadas.

23. Método para preparar o suporte de ligação por afinidade não-saturado microparticulado como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: a) preparar uma mistura de porções associadoras de analito, compreendendo complexos de ligante::acoplador de suporte, e porções pre-enchedoras de espaço, que compreendem acoplador de suporte que carece de ligante, em que as porções associadoras de analito se associam ou diretamente ou indiretamente com um analito de interesse, e as porções preen-chedoras de espaço não se associam, nem diretamente nem indiretamente, com um analito de interesse; e b) expor a mistura a um suporte de ensaio de modo que as por- ções associadoras de analito e as porções preenchedoras de espaço se acoplam ao suporte de ensaio e formam uma superfície de ligação de ensaio não-saturada que é não-saturada com respeito à quantidade das porções associadoras de analito acopladas ao suporte de ensaio.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a superfície de ligação de ensaio não-saturada compreende ainda um copolímero em bloco, em que o copolímero em bloco compreende um grupo de cabeça hidrofóbico flanqueado por pelo menos dois grupos de cauda hidrofílicos.

25. Uso do suporte de ligação de ensaio não-saturado como definido na reivindicação 5 em um ensaio de afinidade de um analito, caracterizado pelo fato de que compreende: contatar o suporte de ligação por afinidade não-saturado com o analito, em que a porção de captura se liga especificamente ao analito, e detectar a ligação do analito com a superfície de ligação de ensaio não-saturada.

26. Ensaio de afinidade como definido na reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a porção de captura específica de analito é bio-tinilada.

27. Ensaio de afinidade de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o ensaio de afinidade é um imunoensaio.