KR102443804B1 - 측정 시료 희석액, 키트 및 측정 방법 - Google Patents

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Abstract

[과제] 고감도·고정밀도·HPLC법과의 고상관성이며, 또한 측정 시료와 측정 시료 희석액을 혼합하고 나서 HbA1c 측정용 면역 크로마토그래피 시험편에 적하할 때까지의 시간의 영향을 받지 않고, 측정 시료 중의 HbA1c양의 Hb양에 대한 비율: HbA1c(％)를 측정할 수 있는 측정 시료 희석액, 및 측정 시료 희석액을 포함하는 키트를 제공한다. [해결수단] 본 발명은 측정 시료 중의 헤모글로빈 A1c양의 헤모글로빈양에 대한 비율인 헤모글로빈 A1c(％)를 정량하기 위한 면역 크로마토그래피용 측정 시료 희석액이며, 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제 및 완충제를 포함하는 수용액인 측정 시료 희석액이다.

Description

측정 시료 희석액, 키트 및 측정 방법
본 발명은 면역 크로마토그래피법에 의한 측정 시료 중의 헤모글로빈 A1c양의 헤모글로빈양에 대한 비율: 헤모글로빈 A1c(％)의 측정 방법, 상기 측정 방법에 사용하는 측정 시료 희석액 및 측정 시료 희석액을 포함하는 키트에 관한 것이다.
세계 당뇨병 연합(International Diabetes Federation)에 의하면, 세계의 당뇨병 환자수는 미국, 유럽 등의 선진국에 추가로, 중국, 인도, 브라질 등의 신흥국을 포함하여 급증하고 있어, 2015년에 약 4.2억명 존재하고, 2040년에는 약 6.4억명에 달할 것으로 예측되어 당뇨병 진단의 중요성은 증가하고 있다.
당뇨병 진단 항목의 하나인 헤모글로빈 A1c(이하, HbA1c로 약칭하는 경우가 있다)란, 혈액 중의 산소를 운반하는 역할을 담당하는 헤모글로빈(이하, Hb로 약칭하는 경우가 있다)에 당(글루코오스)이 결합한 당화 Hb 중, Hb의 β쇄의 N 말단측에 위치하는 발린 잔기가 당화된 물질을 가리키고, 총 Hb양에 대한 HbA1c양의 비율인 HbA1c(％)가 과거 1 내지 2개월 간의 평균 혈당값을 반영하는 것으로부터, 당뇨병의 장기적인 경과를 관찰하는 데 이용되고 있다.
종래, HbA1c(％)의 측정에는 HPLC법, 모세관 전기 영동법, 효소 비색법, 면역 비탁법 등의 측정 기술이 이용되고 있었는데, 이들 측정 방법은 전문 지식을 갖는 점이나 분석 장치가 대형이며 또한 고액이라는 등의 이유로부터, 주로 대규모 병원이나 다수의 검사를 행하는 검사 센터에서 이용되고 있고, 소규모 병원에서는 HbA1c(％)를 간단히 측정할 수 없는 점이 문제가 되어 있었다.
근년, 의료 현장에서는 POCT라고 하는 단어가 주목을 모으고 있다. POCT란 현장현시검사(Point Of Care Testing)의 약칭이며, 의료 종사자가 피험자의 옆에서 행하는 임상 검사를 말한다. POCT는 대규모 병원의 중앙 검사실 등에서 행하는 임상 검사와는 달리, 그 자리에서 순시에 검사 결과가 얻어지는 것으로부터 당뇨병 진단에 있어서도 POCT가 널리 퍼지고 있다.
HbA1c(％)의 측정을 목적으로 한 POCT 중에 면역 크로마토그래피법을 이용한 기술이 제안되어 있다. 면역 크로마토그래피법이란 모세관 현상을 이용한 면역 측정법이며, 임신 검사나 인플루엔자 검사 등에 있어서 세계적으로 보급되어 있다. 종래의 면역 크로마토그래피법은 시각적 판정(정성 평가)이 일반적이었지만, 근년 면역 크로마토그래피 리더 등의 분석 장치를 이용하여 측정 시료 중에 포함되는 분석 대상 물질의 양을 정량화하는 기술이 개발되고 있다.
면역 크로마토그래피법을 사용하여 분석 대상 물질의 양을 정량하는 방법의 하나로서는, 항원 항체 반응을 이용한 샌드위치법을 들 수 있다. 샌드위치법에서는 분석 대상 물질에 대하여 에피토프가 다른 2종류의 항체를 이용한다. 한쪽 항체는 금 콜로이드, 착색 라텍스 입자, 형광 입자 등의 검출 입자와 감작한 검출 항체로서 사용한다. 다른 쪽 항체는 다공질 지지체의 표면에 선상으로 고정한 포착 항체로서 테스트 라인을 형성한다. 추가로, 상기 검출 항체를 특이적으로 포착하는 항체를 다공질 지지체의 표면의, 상기 테스트 라인과는 다른 위치에 선상으로 고정하여 컨트롤 라인을 형성한다. 측정 시료 중에 포함되는 분석 대상 물질은 다공질 지지체의 일단부(상류측)로부터 전개하고, 검출 항체와 면역 복합체를 형성하면서 이동하고, 테스트 라인 상에서 포착 항체와 접촉하여 포착되어 발색한다. 분석 대상 물질과 면역 복합체를 형성하지 않은 유리된 검출 시약은 테스트 라인 상을 통과하고, 컨트롤 라인의 항체에 포착되어 발색한다. 이들의 발색 강도로부터 면역 크로마토그래피 리더 등의 장치를 이용함으로써 분석 대상 물질의 양을 정량할 수 있다.
전술한 바와 같이, 면역 크로마토그래피법에 의해 HbA1c(％)를 측정하기 위해서는 HbA1c의 당화되어 있는 부위(Hb의 β쇄의 N 말단측에 위치하는 발린 잔기)에 특이적인 항체를 사용하는데, 상기 당화 부위는 Hb의 표면에 존재하는 것이 아니라 Hb의 내부에 매립되어 있어, 생리적인 조건 하에서는 항체가 결합하기 어려운 장소에 존재하는 것이 판명되어 있다. 이러한 성상으로부터, 상기 당화 부위를 에피토프로서 인식하는 항체를 효율적으로 반응시켜서 측정을 행하기 위해서, 상기 에피토프를 Hb의 표면에 노출시키는(이하, 변성이라고 칭하는 경우가 있다) 기술이 보고되어 있다.
특허문헌 1, 2에는 측정 시료 희석액에 계면 활성제를 포함하고, 면역 크로마토그래피 시험편에 환상 다당류를 담지한 구성이 개시되어 있다. 상기 발명은 하류의 항원 항체 반응을 저해하지 않으며 에피토프를 노출시킨다는 점, 즉 측정 감도의 향상에 대해서는 일정한 효과가 기대된다. 그러나, 상기 발명은 하류로의 전개 불균일이 발생하기 때문에 측정 정밀도가 충분하지 않았다. 또한, 실제의 면역 크로마토그래피 키트에 있어서의 측정 시료의 희석 조작은 수동으로 행하는 것이 상정되기 때문에, 측정 시료와 측정 시료 희석액을 혼합하고 나서 면역 크로마토그래피 시험편에 적하할 때까지의 시간(이하, 혼합 시간이라고 약칭하는 경우가 있다)에 명확한 개인차가 발생한다. 그러나, 상기 발명은 측정 시료 희석액 중에서의 에피토프 노출 반응의 속도, 즉 상기 혼합 시간에 따른 측정 결과의 변동을 고려한 계면 활성제종의 선정이 이루어져 있지 않기 때문에, 작업자에 의해 측정 정밀도가 더욱 악화된다. 또한, 상기 발명에서는 검출 입자로서 금 콜로이드 또는 라텍스 입자를 사용하고 있기 때문에, 감도·정밀도·HPLC법과의 상관성의 관점에서 충분하지 않았다. 또한, 상기 발명에는 측정 시료 희석액의 최적의 조성은 사용하는 검출 입자에 따라 다른 것이 기재되어 있지만, 셀룰로오스 입자에 대해서는 언급되어 있지 않다.
특허문헌 3, 4에는 측정 시료 희석액에 비이온성 계면 활성제를 포함하고, 면역 크로마토그래피 시험편에 음이온성 계면 활성제를 담지한 구성이 개시되어 있다. 상기 발명은 전개 불균일의 향상에 대해서는 일정한 효과가 기대된다. 그러나, 상기 발명은 면역 크로마토그래피 시험편에 담지한 계면 활성제가 희석 측정 시료가 전개하는 약간의 시간에서 에피토프를 Hb의 표면에 노출시킬 수 없기 때문에, 측정 감도가 충분하지 않으며 상기 혼합 시간의 영향을 크게 받는다. 또한, 상기 발명은 검출 입자로서 금 콜로이드를 사용하고 있기 때문에, 감도·정밀도·HPLC법과의 상관성의 관점에서 충분하지 않았다.
일본 특허 공개 제2012-251789호 공보 일본 특허 공개 제2015-158515호 공보 일본 특허 공개 제2015-200517호 공보 일본 특허 공개 제2016-161329호 공보
본 발명은 상기 문제점을 감안하여 종래 기술보다도 감도·정밀도·HPLC법과의 상관성이 높은, 면역 크로마토그래피법에 의한 측정 시료 중의 HbA1c양의 Hb양에 대한 비율: HbA1c(％)의 측정 방법, 상기 측정 방법에 사용하는 측정 시료 희석액, 측정 시료 희석액을 포함하는 키트를 제공하는 것을 과제로 하는 것이다. 보다 상세하게는, 종래보다도 측정 시료와 측정 시료 희석액을 혼합하고 나서 HbA1c 측정용 면역 크로마토그래피 시험편에 적하할 때까지의 시간의 영향을 받기 어려운, 측정 시료 중의 HbA1c양의 Hb양에 대한 비율: HbA1c(％)의 측정 방법, 상기 측정 방법에 사용하는 측정 시료 희석액, 및 측정 시료 희석액을 포함하는 키트를 제공하는 것을 과제로 하는 것이다.
본 발명자는 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 연구한 결과, 측정 시료 희석액으로서 적어도 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제 및 완충제를 포함하는 수용액을 사용함으로써, 종래 기술보다도 감도·정밀도·HPLC법과의 상관성이 대폭으로 향상되고, 또한 측정 시료와 측정 시료 희석액을 혼합하고 나서 면역 크로마토그래피 시험편에 적하할 때까지의 시간의 영향을 받지 않는 것을 알아냈다. 또한, 상기 측정 시료 희석액에 산화제 및/또는 아지드화제를 포함하는 수용액을 사용함으로써, 감도·정밀도·HPLC법과의 상관성이 더욱 향상되는 것을 알아내고 본 발명을 완성시켰다. 또한, 본 발명의 측정 시료 희석액은 검출 입자가 셀룰로오스 입자인 경우에 특히 유효하다.
즉, 대표적인 본 발명은 이하와 같다.
1. 측정 시료 중의 헤모글로빈 A1c양의 헤모글로빈양에 대한 비율인 헤모글로빈 A1c(％)를 정량하기 위한 면역 크로마토그래피용 측정 시료 희석액이며, 음이온성 계면 활성제, 비이온성 계면 활성제 및 완충제를 포함하는 수용액인, 측정 시료 희석액.
2. 상기 음이온성 계면 활성제는 알킬황산염인, 1에 기재된 측정 시료 희석액.
3. 상기 비이온성 계면 활성제는 폴리옥시에틸렌소르비탄지방산에스테르인, 1 또는 2에 기재된 측정 시료 희석액.
4. 상기 비이온성 계면 활성제는 폴리옥시에틸렌소르비탄지방산에스테르 및 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르의 혼합물인, 1 또는 2에 기재된 측정 시료 희석액.
5. 상기 음이온성 계면 활성제를 0.05 내지 2.0wt％, 또한 상기 비이온성 계면 활성제를 0.05 내지 3.0wt％ 포함하는, 1 내지 4 중 어느 것에 기재된 측정 시료 희석액.
6. 추가로 산화제를 포함하는, 1 내지 5 중 어느 것에 기재된 측정 시료 희석액.
7. 상기 산화제는 아질산염인, 6에 기재된 측정 시료 희석액.
8. 추가로 아지드화제를 포함하는, 1 내지 7 중 어느 것에 기재된 측정 시료 희석액.
9. 상기 아지드화제는 아지드화나트륨인, 8에 기재된 측정 시료 희석액.
10. 1 내지 9 중 어느 것에 기재된 측정 시료 희석액, 면역 크로마토그래피 시험편, 및 면역 크로마토그래피 리더를 포함하는, 헤모글로빈 A1c양의 헤모글로빈양에 대한 비율을 정량하기 위한 측정 키트.
11. 상기 면역 크로마토그래피 시험편은
(1) 샘플 패드와,
(2) 상기 측정 시료 중의 헤모글로빈 또는 헤모글로빈 A1c를 포착하기 위한 항체와 셀룰로오스 입자의 복합체를 담지한 컨주게이션 패드와,
(3) 측정 시료 중의 헤모글로빈 또는 헤모글로빈 A1c를 특이적으로 포착하기 위한 항체를 선상으로 고정한 멤브레인과,
(4) 흡수 패드
로 구성되는, 10에 기재된 측정 키트.
12. 1 내지 11 중 어느 하나에 기재된 측정 시료 희석액 또는 측정 키트를 사용하여, 적어도 하기 공정 (i) 내지 (iii)을 이 순으로 거쳐서 측정 시료 중의 헤모글로빈 A1c양의 헤모글로빈양에 대한 비율을 정량하는 방법.
공정 (i): 측정 시료와 측정 시료 희석액을 체적비 1:49 내지 1:999로 혼합하여 희석하는 공정
공정 (ii): 공정 (i)의 혼합액을 면역 크로마토그래피 시험편의 샘플 패드에 적하하는 공정
공정 (iii): 면역 크로마토그래피 시험편의 테스트 라인의 반사 흡광도와 컨트롤 라인의 반사 흡광도로부터 헤모글로빈 A1c양의 헤모글로빈양에 대한 비율을 비색 정량하는 공정
13. 측정 시료와 측정 시료 희석액을 체적비 1:99 내지 1:499로 혼합하여 희석하는, 12에 기재된 방법.
본 발명의 측정 시료 희석액은 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제 및 완충제를 포함하는 수용액이기 때문에, 고감도·고정밀도·HPLC법과의 고상관성이며 또한 측정 시료와 측정 시료 희석액을 혼합하고 나서 면역 크로마토그래피 시험편에 적하할 때까지의 시간의 영향을 받지 않고, 측정 시료 중의 HbA1c양의 Hb양에 대한 비율: HbA1c(％)를 측정할 수 있다.
도 1은 본 발명에 사용하는 면역 크로마토그래피 시험편의 일례를 도시하는 (상면)도이다.
도 2는 본 발명에 사용하는 면역 크로마토그래피 시험편의 일례를 도시하는 (측면)도이다.
본 발명에 있어서 측정 시료는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 혈액, 림프액, 수액, 땀, 소변, 눈물, 타액, 피부, 점막, 모발 등의 생체 시료를 들 수 있다. 혈액에 있어서는 전혈 이외에도 혈액을 원심 분리하여 얻어진 혈청, 혈구 또는 혈장을 시료로 할 수 있다. 또한, 측정 시료는 인간 유래에 한정되지 않고, 개, 고양이, 소 등의 포유 동물 유래의 생체 시료도 대상이다. 또한, 본 발명에 있어서의 측정 항목은 측정 시료 중의 HbA1c양의 Hb양에 대한 비율: HbA1c(％)이다.
본 발명의 측정 시료 희석액은 적어도 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제 및 완충제를 포함하는 수용액이다. 상기 측정 시료 희석액 중에 음이온성 계면 활성제를 포함함으로써, 측정 시료와 측정 시료 희석액을 혼합하고 나서 면역 크로마토그래피 시험편에 적하할 때까지의 시간차에 따른 측정값(예를 들어, 후술하는 테스트 라인의 반사 흡광도)의 변동을 억제하여, 측정 감도 및 측정 정밀도를 높일 수 있다. 또한, 상기 측정 시료 희석액 중에 비이온성 계면 활성제를 포함함으로써, 면역 크로마토그래피 시험편을 이동(유동)하는 측정 시료의 전개 불균일을 억제할 수 있기 때문에 측정 정밀도를 높일 수 있다. 또한 완충제를 포함하고 있지 않으면, 측정 시료의 pH에 따라서는 하류에서의 항원 항체 반응이 저해되어 측정 감도가 저하되는 경우가 있다. 또한, 본 발명에 있어서의 측정 항목은 측정 시료 중의 HbA1c양의 Hb양에 대한 비율(HbA1c(％))이기 때문에, 상기 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제 중 어느 것은 용혈 작용을 나타내는 계면 활성제일 필요가 있다.
상기 음이온성 계면 활성제로서는, 상기 측정 시료 중의 HbA1c를 즉시 변성하고, 또한 하류의 항원 항체 반응을 저해하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 도데실황산나트륨(SDS), 도데실황산리튬(LDS) 등의 알킬황산염, 콜산나트륨, 데옥시콜산나트륨 등의 담즙산염, 폴리옥시에틸렌라우릴에테르황산나트륨 등의 폴리옥시에틸렌알킬에테르황산염, 도데실벤젠술폰산나트륨 등의 알킬벤젠술폰산염, 라우로일메틸알라닌, N-라우로일사르코신나트륨염 등의 아실아미노산염, 디알킬술포숙신산나트륨, β-나프탈렌술폰산포르말린 축합물 나트륨염 및 특수 폴리카르복실산형 고분자 계면 활성제 등을 들 수 있다. 이들 중에서도 알킬황산염이 바람직하고, 도데실황산나트륨(SDS)이 보다 바람직하다. 또한, 상기 알킬황산염은 용혈 작용을 나타내는 계면 활성제이다.
본 발명에 있어서 측정 시료 희석액 중의 상기 음이온성 계면 활성제의 농도는 특별히 한정되지 않지만, 0.05 내지 2.0wt％가 바람직하고, 0.1 내지 1.0wt％가 보다 바람직하다. 농도가 낮으면 HbA1c의 변성에 시간이 걸리기 때문에, 측정 시료와 측정 시료 희석액을 혼합하고 나서 면역 크로마토그래피 시험편에 적하할 때까지의 시간에 따라 측정값(예를 들어, 후술하는 테스트 라인의 반사 흡광도)이 변동하여, 측정 감도 및 측정 정밀도가 저하되는 경우가 있다. 한편, 농도가 높으면 하류의 항원 항체 반응을 저해하기 때문에, 측정 감도가 저하되는 경우가 있다.
본 발명에 있어서 상기 비이온성 계면 활성제로서는, 상기 측정 시료의 전개 균일성을 향상시키고, 또한 하류의 항원 항체 반응을 촉진하는 작용을 갖는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르(Triton(등록 상표) 등), 폴리옥시에틸렌알킬에테르(Brij(등록 상표) 등), 폴리옥시에틸렌소르비탄지방산에스테르(Tween(등록 상표) 등), 폴리옥시에틸렌지방산에스테르(에마논(등록 상표) 등), 폴리옥시에틸렌알킬아민(아미트(등록 상표) 등), 폴리옥시에틸렌소르비톨 지방산에스테르(레오돌(등록 상표) 등), 소르비탄지방산에스테르(레오돌(등록 상표) 등), 글리세린 지방산에스테르(레오돌(등록 상표) 등), 알킬알칸올아미드(아미논(등록 상표) 등), 알킬이미다졸린(호모게놀(등록 상표) 등), 자당지방산에스테르를 들 수 있다. 이들 중에서도, 측정 시료의 전개 균일성의 관점에서 폴리옥시에틸렌소르비탄지방산에스테르(Tween(등록 상표) 등)가, 하류의 항원 항체 반응 촉진의 관점에서 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르(Triton(등록 상표) 등)가 각각 바람직하고, 폴리옥시에틸렌소르비탄지방산에스테르(Tween(등록 상표) 등)와, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르(Triton(등록 상표) 등)의 양쪽을 포함하는 것이 보다 바람직하다. 또한, 폴리옥시에틸렌소르비탄지방산에스테르(Tween(등록 상표) 등)의 시판품으로서는, Tween(등록 상표) 20, Tween(등록 상표) 40, Tween(등록 상표) 60, 또는 Tween(등록 상표) 80(모두, 와코 쥰야꾸 고교사제) 등이 적합하게 사용되고, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르(Triton(등록 상표) 등)의 시판품으로서는, TritonX(등록 상표) 100, TritonX(등록 상표) 114, Nonidet(등록 상표) P-40(모두, 와코 쥰야꾸 고교사제) 등이 적합하게 사용된다. 또한, 상기 폴리옥시에틸렌소르비탄지방산에스테르(Tween(등록 상표) 등)에 용혈 작용은 부족하지만, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르(Triton(등록 상표) 등)는 용혈 작용을 나타내는 계면 활성제이다.
본 발명에 있어서, 측정 시료 희석액 중의 비이온성 계면 활성제의 농도는 0.05 내지 3.0wt％인 것이 바람직하다. 또한 비이온성 계면 활성제로서, 폴리옥시에틸렌소르비탄지방산에스테르(Tween(등록 상표) 등) 및 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르(Triton(등록 상표) 등)의 혼합물을 사용하는 경우, 전자의 농도는 0.05 내지 3.0wt％가 바람직하고, 0.1 내지 2.0wt％가 보다 바람직하다. 농도가 낮으면 하류로의 전개가 곤란해지거나, 전개하더라도 불균일해져 측정 정밀도가 대폭으로 저하되는 경우가 있다. 한편 농도가 높으면, 물리적으로 흡착하고 있는 검출 입자와 검출 항체 및/또는 멤브레인과 포착 항체가 괴리하여 측정값이 얻어지지 않거나, 얻어졌다고 해도 측정 감도가 대폭으로 저하되는 경우가 있다. 또한, 후자의 농도는 0.1 내지 2.0wt％가 바람직하고, 0.1 내지 1.0wt％가 보다 바람직하다. 농도가 낮으면 하류의 항원 항체 반응의 촉진 효과가 얻어지지 않아, 측정 감도가 저하되는 경우가 있다. 한편 농도가 높으면, 물리적으로 흡착하고 있는 검출 입자와 검출 항체 및/또는 멤브레인과 포착 항체가 괴리하여 측정값이 전혀 얻어지지 않거나, 얻어졌다고 해도 측정 감도가 대폭으로 저하되는 경우가 있다.
본 발명에 있어서 상기 완충제로서는, 목적으로 하는 pH 범위에 있어서 충분한 완충 능력을 갖고 있으면 어떠한 종류의 완충제를 사용해도 되고, 예를 들어 트리스, 인산, 프탈산, 시트르산, 말레산, 숙신산, 옥살산, 붕산, 타르타르산, 아세트산, 탄산, 구드 버퍼(MES, ADA, PIPES, ACES, 콜라민염산, BES, TES, HEPES, 아세트아미드글리신, 트리신, 글리신아미드, 비신)를 들 수 있다. 이들 중에서도, 본 발명에 사용하는 항체의 최적 pH 범위인 7.0 부근에 있어서 충분한 완충 능력을 갖는다는 등의 이유로부터, 트리스, 인산, MES, PIPES, TES, HEPES가 바람직하고, 트리스, 인산, PIPES가 보다 바람직하다. 상기 완충제의 농도는 목적으로 하는 pH 범위에 있어서 충분한 완충 능력을 갖고 있으면 특별히 한정되지 않지만, 10 내지 100mM 정도가 바람직하다.
본 발명에 있어서, 측정 시료 희석액은 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제 및 완충제에 더하여 산화제를 포함하고 있어도 된다. 상기 산화제로서는 Hb를 산화하고, 또한 하류의 항원 항체 반응을 저해하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 할로겐옥소산염, 전이 금속 착체의 염, 과산화물, 과망간산염, 크롬산염, 아질산염, 및 초산화물을 들 수 있다. 할로겐옥소산염으로서, 예를 들어 차아염소산, 아염소산, 염소산, 과염소산, 차아브롬산, 아브롬산, 브롬산, 과브롬산, 차아요오드산, 아요오드산, 요오드산, 및 과요오드산의 알칼리 금속염, 알칼리 토류 금속염, 및 암모늄염을 들 수 있다. 전이 금속 착체의 염으로서, 예를 들어 알칼리 금속염, 알칼리 토류 금속염, 및 암모늄염의 페리시안화염을 들 수 있다. 과산화물로서 예를 들어 유기 과산화물을 들 수 있다. 과망간산염으로서 예를 들어 알칼리 금속 또는 알칼리 토류 금속의 과망간산염을 들 수 있다. 이들 중에서도 아질산염이 바람직하고, 아질산나트륨이 보다 바람직하다. 산화제를 포함함으로써, 측정 시료 중의 Hb의 산화 불균일에서 기인하는 항원 항체 반응 불균일을 억제할 수 있고, 측정 정밀도의 향상을 기대할 수 있다. 또한, 측정 시료 중의 비특이 반응의 원인이 되는 물질도 산화함으로써 비특이 반응의 진행을 억제할 수 있고, 측정 정밀도의 향상을 기대할 수 있다.
본 발명에 있어서, 측정 시료 희석액 중의 상기 산화제의 농도는 특별히 한정되지 않지만 0.01 내지 1.0wt％가 바람직하다. 농도가 낮으면 Hb의 산화가 불충분해지고, 측정값(예를 들어, 후술하는 테스트 라인의 반사 흡광도)이 변동하고, 측정 정밀도가 저하되는 경우가 있다. 한편, 농도가 높으면 하류의 항원 항체 반응을 저해하기 때문에 측정 감도가 저하되는 경우가 있다.
본 발명의 측정 시료 희석액은 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제 및 완충제에 더하여 아지드화제를 포함하고 있어도 된다. 상기 아지드화제로서는 Hb를 아지드화하고, 또한 하류의 항원 항체 반응을 저해하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 아지드화나트륨이 바람직하다. 또한, 상기 아지드화제는 보존 시에는 방부제로서도 작용한다. 아지드화제를 포함함으로써, 측정 시료 중의 Hb의 아지드화 불균일에서 기인하는 항원 항체 반응 불균일을 억제할 수 있어 측정 정밀도의 향상을 기대할 수 있다. 또한, 측정 시료 중의 비특이 반응의 원인이 되는 물질도 아지드화함으로써 비특이 반응의 진행을 억제할 수 있고, 측정 정밀도의 향상을 기대할 수 있다.
상기 아지드화제의 농도는 특별히 한정되지 않지만 0.01 내지 0.1wt％가 바람직하다. 농도가 낮으면 Hb의 아지드화가 불충분해져서 측정값(예를 들어, 후술하는 테스트 라인의 반사 흡광도)이 변동하여, 측정 정밀도가 저하되는 경우가 있다. 한편 농도가 높으면 하류의 항원 항체 반응을 저해하기 때문에, 측정 감도가 저하되는 경우가 있다. 또한, 0.1wt％ 이상의 아지드화나트륨은 독물이기 때문에 바람직하지 않다.
본 발명의 측정 시료 희석액은 필요에 따라 블로킹용 단백질(블로킹 펩티드 프래그먼트; Blocking Peptide Fragment(BPF), 소혈청 알부민(BSA), 카제인 등), 염류(염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 염화알루미늄 등) 및/또는 항체 안정화제(단당류, 올리고당류, 다당류, 당알코올, 글리세롤, 글루콘산염, 아미노산류, 알부민류, 글로불린류, 섬유성 단백질 등)를 첨가해도 된다.
상기 측정 시료 희석액에 의한 측정 시료의 희석 배율은 특별히 한정되지 않지만, 50 내지 1000배 희석이 바람직하고, 100 내지 500배 희석이 보다 바람직하다. 측정 시료의 희석 배율이 작으면 하류로의 전개가 곤란해진다. 또한, 측정 시료 중의 협잡 물질의 영향도 받기 쉬워져 측정 정밀도가 저하되는 경우가 있다. 한편 측정 시료의 희석 배율이 크면, 측정 시료 중의 Hb 및 HbA1c의 농도가 저하되어 측정 감도가 저하되는 경우가 있다.
본 발명에 있어서 면역 크로마토그래피 측정 키트는 측정 시료 희석액에 더하여 면역 크로마토그래피 시험편 및 면역 크로마토그래피 리더를 포함한다.
본 발명에 있어서 면역 크로마토그래피 시험편의 구성은 특별히 한정되지 않지만, 면역 크로마토그래피 시험편의 측정 시료 용액의 첨가부(적하부)를 상류측으로 하고, 상기 첨가부를 갖는 샘플 패드, 컨주게이션 패드, 멤브레인, 흡수 패드의 순으로 연접 배치되어 있는 구성이 바람직하다. 이어서, 본 발명의 면역 크로마토그래피 시험편의 일례를 도면을 참조하여 설명하지만, 본 발명을 전혀 한정하지 않는다. 도 1 및 2에 있어서, 1은 샘플 패드, 2는 컨주게이션 패드, 3은 멤브레인, 4는 흡수 패드, 5는 배킹 시트(backing sheet), 6은 테스트 라인, 7은 컨트롤 라인, 8은 점착 시트를 각각 나타낸다.
도 1 및 2의 예에서 면역 크로마토그래피 시험편은 폭 3 내지 5㎜(바람직하게는 4㎜ 정도), 길이 40 내지 100㎜(바람직하게는 60㎜ 정도)의 가늘고 긴 직사각형의 형태를 하고 있다. 또한, 면역 크로마토그래피 시험편의 멤브레인(3)의 상류측의 단부로부터 약 15㎜의 위치에 포착 항체를 선상으로 고정한 테스트 라인(6)이 형성된다. 또한, 상기 단부로부터 약 20㎜의 위치에 다른 포착 항체를 선상으로 고정한 컨트롤 라인(7)이 형성된다. 또한, 면역 크로마토그래피 시험편의 컨주게이션 패드(2)에는 검출 항체와 검출 입자의 복합체인 테스트 라인 검출 시약, 및 표지한 블로킹용 단백질과 검출 입자의 복합체인 컨트롤 라인 검출 시약이 담지되어 있다.
샘플 패드(1)의 재질은 측정 시료를 빠르게 흡수한 후, 하류의 컨주게이션 패드, 멤브레인, 흡수 패드로 전개할 수 있는 재질의 것이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 셀룰로오스제의 여과지 또는 부직포, 유리제의 여과지 또는 부직포, 폴리에스테르제의 여과지 또는 부직포, 폴리에틸렌제의 여과지 또는 부직포를 들 수 있다. 이들 중에서도 셀룰로오스제의 여과지가 바람직하다. 또한, 상기 샘플 패드(1)의 두께는 0.1 내지 2.0㎜가 바람직하고, 0.2 내지 1.0㎜가 보다 바람직하다. 두께가 얇으면 하류에서의 측정 시료의 흐름이 불균일해져 측정 정밀도가 저하되는 경우가 있다. 한편, 두께가 두꺼우면 하류로의 전개가 느려져 측정 시간이 길어지는 경우가 있다. 또한, 하류로의 전개에 필요해지는 측정 시료량이 많이 필요하게 된다.
컨주게이션 패드(2)의 재질은 테스트 라인 검출 시약 및 컨트롤 라인 검출 시약을 건조 상태에서 유지할 수 있고, 또한 측정 시료의 하류로의 전개와 함께 상기 양쪽 검출 시약을 빠르게 방출할 수 있는 재질의 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 셀룰로오스제의 여과지 또는 부직포, 유리제의 여과지 또는 부직포, 폴리에스테르제의 여과지 또는 부직포, 폴리에틸렌제의 여과지 또는 부직포를 들 수 있다. 이들 중에서도 유리제의 여과지가 바람직하다. 또한, 상기 컨주게이션 패드(2)의 두께는 0.1 내지 2.0㎜가 바람직하고, 0.2 내지 1.0㎜가 보다 바람직하다. 두께가 얇으면 목적량의 테스트 라인 검출 시약 및 컨트롤 라인 검출 시약을 건조 상태에서 유지할 수 없는 경우가 있다. 한편 두께가 두꺼우면, 하류로의 전개가 느려져 측정 시간이 길어지는 경우가 있다. 또한, 하류로의 전개에 필요해지는 측정 시료량이 많아진다.
멤브레인(3)의 재질은 측정 시료를 고정밀도로 균일하게 전개할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 셀룰로오스, 셀룰로오스 유도체, 니트로셀룰로오스, 아세트산셀룰로오스, 폴리우레탄, 폴리에스테르, 폴리에틸렌, 폴리염화비닐, 폴리불화비닐리덴, 또는 나일론제의 멤브레인을 들 수 있다. 이들 중에서도 니트로셀룰로오스제의 멤브레인이 바람직하다.
흡수 패드(4)의 재질은 상류로부터 전개해 온 측정 시료를 빠르게 흡수한 후, 역류하지 않도록 유지할 수 있는 재질의 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 셀룰로오스제의 여과지 또는 부직포, 유리제의 여과지 또는 부직포, 폴리에스테르제의 여과지 또는 부직포, 폴리에틸렌제의 여과지 또는 부직포를 들 수 있다. 이들 중에서도 셀룰로오스제의 여과지가 바람직하다. 또한, 상기 흡수 패드(4)의 두께는 0.2 내지 5.0㎜가 바람직하고, 0.5 내지 2.0㎜가 보다 바람직하다. 두께가 얇으면, 측정 시료의 적하량에 따라서는 한번 흡수 패드에 흡수된 측정 시료가 멤브레인측으로 역류하는 경우가 있다. 한편 두께가 두꺼우면, 면역 크로마토그래피 시험편 및 면역 크로마토그래피 시험편을 덮는 하우징 케이스의 크기도 커져서 POCT의 관점에서 바람직하지 않다.
컨주게이션 패드(2)에 담지하는 테스트 라인 검출 시약은 특별히 한정되지 않지만, 검출 항체와 검출 입자의 복합체가 바람직하다.
상기 검출 항체는 특별히 한정되지 않지만, 항Hb 항체 또는 항HbA1c 항체가 바람직하고, 항HbA1c 항체가 보다 바람직하다. 항Hb 항체 또는 항HbA1c 항체는 시판품을 사용해도 되고, 별도 공지된 방법으로 제조해도 된다. 또한 모노클로날 항체여도 되고 폴리클로날 항체여도 되며, 분자 크기도 특별히 한정되지 않는다.
상기 검출 입자는 특별히 제한되지 않지만, 착색 입자나 형광 입자를 사용할 수 있다. 착색 입자로서는 금속 입자, 라텍스 입자, 셀룰로오스 입자 등을 예시할 수 있다. 금속 입자로서는 금 콜로이드, 은 콜로이드, 백금 콜로이드, 팔라듐 콜로이드, 금 나노 로드, 금 나노 플레이트, 은 나노 플레이트 등을 예시할 수 있고, 평균 입경은 1 내지 100㎚가 바람직하다. 라텍스 입자로서는 폴리스티렌, 폴리메타크릴산메틸, 아크릴산 중합체 등의 재질을 포함하는 것을 예시할 수 있고, 평균 입경은 25 내지 500㎚가 바람직하다. 형광 입자로서는 폴리스티렌, 폴리메타크릴산메틸, 폴리비닐톨루엔, 실리카 등의 재질을 포함하는 것을 예시할 수 있고, 형광 색소로서는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 시아닌 및 그의 유도체 등을 예시할 수 있다. 이들 중에서도 분산성이 높고, 시인성이 우수한 셀룰로오스 입자가 바람직하다. 이하, 셀룰로오스 입자에 대하여 상세하게 설명한다.
상기 셀룰로오스 입자는 대량의 수산기를 갖기 때문에, 많은 반응성 염료를 공유 결합에 의해 유지할 수 있을 뿐 아니라 농염화한 후에도 물 등에 대한 안정한 분산성을 유지할 수 있다. 셀룰로오스 입자로서 재생 셀룰로오스, 정제 셀룰로오스, 천연 셀룰로오스 등을 사용할 수 있고, 일부 유도체화된 셀룰로오스를 사용해도 된다. 상기 셀룰로오스 입자 중량의 20 내지 90wt％는 셀룰로오스 유래인 것이 바람직하고, 20 내지 80wt％가 보다 바람직하고, 20 내지 70wt％가 더욱 바람직하다.
상기 셀룰로오스 입자의 평균 입경은 특별히 한정되지 않지만, 100 내지 1000㎚가 바람직하고, 200 내지 800㎚가 보다 바람직하다. 평균 입경이 1000㎚보다 크면, 하류로의 전개가 느려져서 측정 시간이 길어진다. 또한, 멤브레인 상에 포착되기 쉬워져 백그라운드 자체가 발색됨으로써 테스트 라인 및 컨트롤 라인에서의 발색이 불명료하게 되는 경우가 있다. 한편, 평균 입경이 100㎚보다 작으면 물리 흡착 또는 화학 결합할 수 있는 항체량이 저하되어, 측정 감도가 저하되는 경우가 있다.
상기 셀룰로오스 입자의 색은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 적색, 청색, 황색, 녹색, 흑색, 백색, 형광색을 들 수 있다. 이들 중에서도 백그라운드의 Hb 유래의 적색의 영향을 받기 어려운 청색, 흑색이 바람직하고, 청색이 보다 바람직하다. 이러한 셀룰로오스 입자로서는 아사히 가세이사제의 착색 셀룰로오스 나노비즈(NanoAct(등록 상표))를 들 수 있는데, 이 중에서도 Navy(BL1), Dark Navy(BL2), Black(KR1)이 바람직하고, Navy(BL1), Dark Navy(BL2)가 보다 바람직하다.
상기 테스트 라인 검출 시약은 블로킹용 단백질에 의해 블로킹하는 것이 바람직하다. 상기 블로킹용 단백질은 특별히 한정되지 않지만, 미생물 유래 단백질의 블로킹 펩티드 프래그먼트(이하, BPF라고 약칭하는 경우가 있다), 동물 유래 단백질의 소혈청 알부민(이하, BSA라고 약칭하는 경우가 있다), 카제인이 바람직하고, 미생물 유래 단백질의 BPF가 보다 바람직하다. BPF(약 22kDa)는 BSA(약 66kDa)보다도 분자량이 작기 때문에, 보다 고정밀도의 측정이 가능하다. 또한, BSA는 소 유래이기 때문에 외래성 물질에서 기인하는 오염의 리스크가 있지만, BPF는 미생물 유래이기 때문에 상기 리스크는 없다. 한편, 카제인의 용해에는 알칼리 조건(pH=8.5 내지 10)의 붕산 완충액을 사용할 필요가 있기 때문에, 항체가 실활되어 감도가 저하되는 경우가 있다. 또한, 붕산 완충액은 환경 리스크도 높다. 한편, BPF의 용해에는 중성 조건의 트리스, 인산, PIPES 등을 사용할 수 있기 때문에 바람직하다. 블로킹용 단백질은 시판품을 사용해도 되고, 별도 공지된 방법으로 제조해도 된다. 또한, 분자 크기도 특별히 한정되지 않지만, 평균 분자량으로 100kDa 이하가 바람직하다. 일반적으로 블로킹용 단백질의 분자 크기가 작을수록 검출 입자 1입자에 대한 블로킹용 단백질의 결합량은 증가하므로 측정 정밀도의 향상에 기여한다.
상기 검출 항체와 상기 셀룰로오스 입자의 결합 방법은 특별히 한정되지 않지만, 소수 결합에 의한 물리 흡착 또는 공유 결합에 의한 화학 결합으로 감작하는 것이 바람직하고, 조작이 간편하고 또한 비용도 싼 물리 흡착이 보다 바람직하다. 또한, 감작 효율을 향상시키기 위해서 셀룰로오스 입자에 반응성 활성기를 도입해도 된다. 반응성 활성기로서는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 카르복실기, 아미노기, 알데히드기, 티올기, 에폭시기, 수산기를 들 수 있다. 이들 중에서도, 카르복실기, 아미노기가 바람직하다. 카르복실기의 경우에는, 카르보디이미드를 사용하여 리간드의 아미노기와 공유 결합을 형성할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 컨주게이션 패드(2)에 담지하는 컨트롤 라인 검출 시약은 특별히 한정되지 않지만, 표지한 블로킹용 단백질과 검출 입자의 복합체가 바람직하다.
상기 테스트 라인 검출 시약의 검출 입자의 평균 입경과, 상기 컨트롤 라인 검출 시약의 검출 입자의 평균 입경은 실질적으로 동일한 것이 바람직하다. 여기서 실질적으로 동일하다란, 평균 입경이 ±50㎚ 이내인 것을 의미한다. 양자의 평균 입경이 다르면 하류로의 전개 속도나 발색 강도에 차이가 발생하여, 컨트롤 라인에 의한 테스트 라인의 보정이 잘 기능하지 않아 측정 정밀도가 저하되는 경우가 있다.
상기 테스트 라인 검출 시약의 검출 입자의 색과, 상기 컨트롤 라인 검출 시약의 검출 입자의 색은 실질적으로 동일한 것이 바람직하다. 여기서 실질적으로 동일하다란, 최대 흡광 파장이 ±20㎚ 이내인 것을 의미한다. 양자의 색이 다르면, 예를 들어 일반적인 발광 다이오드(이하, LED라고 약칭하는 경우가 있다)-포토다이오드(이하, PD라고 약칭하는 경우가 있다)의 측정 장치로 측정하는 경우에, 테스트 라인과 컨트롤 라인의 각 색에 대응하는 복수의 LED-PD의 조합이 필요해져서 장치가 대형화된다.
상기 표지한 블로킹용 단백질에 있어서의 표지 물질은 특별히 한정되지 않지만, 비교적 저렴하며 입수하기 쉬운 것이나 단백질 표지 분야 등에서 실적이 있는 것으로부터, 비오틴 또는 디곡시게닌이 바람직하고, 비오틴이 보다 바람직하다.
상기 표지한 블로킹용 단백질의 표지 방법은 특별히 한정되지 않지만, 화학 반응에 의해 공유 결합을 형성하는 것이 바람직하고, N-히드록시숙신이미드법을 예시할 수 있다. N-히드록시숙신이미드법을 사용함으로써 예를 들어 비오틴의 카르복실기를 N-히드록시아민계 화합물과 탈수 축합제의 존재 하에서 축합 반응하고, 선택적으로 활성화하고, 블로킹용 단백질의 아미노기와 아미드 결합을 통하여 표지할 수 있다. 상기 축합 반응에 사용하는 N-히드록시아민계 화합물은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 N-히드록시숙신이미드, N-히드록시노르보르넨-2,3-디카르복실산이미드, 2-히드록시이미노-2-시아노아세트산에틸에스테르, 2-히드록시이미노-2-시아노아세트산아미드, N-히드록시피페리딘, N-히드록시프탈이미드, N-히드록시이미다졸, N-히드록시말레이미드를 들 수 있다. 이들 화합물을 2종 이상 사용해도 된다. 이들 중에서도 N-히드록시숙신이미드(이하, NHS라고 약칭하는 경우가 있다)가 비교적 저렴하며, 입수하기 쉬운 것이나 펩티드 합성 분야 등에서 실적이 있는 것으로부터 바람직하다. 또한, 상기 축합 반응에 사용하는 탈수 축합제로서는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 1-에틸-3-디메틸아미노프로필카르보디이미드염산염, 1-시클로헥실-(2-모르포닐-4-에틸)-카르보디이미드 메소p-톨루엔술포네이트를 들 수 있다. 이들 중에서도 1-에틸-3-디메틸아미노프로필카르보디이미드염산염(이하, EDC라고 약칭하는 경우가 있다)이 펩티드 합성 분야 등에서 범용적인 수용성 축합제로서 실적이 있는 것으로부터 바람직하다. 또한, 반응 온도는 특별히 한정되지 않지만 10 내지 50℃가 바람직하고, 20 내지 40℃가 보다 바람직하다. 반응 시간은 반응 온도에 따라 다르지만, 통상은 5분 내지 24시간이다. 또한, 반응액 중에 포함되는 미반응된 N-히드록시아민계 화합물이나 탈수 축합제는 여과나 원심 분리 등에 의해 수용매로부터 용이하게 분리할 수 있다.
상기 표지한 블로킹용 단백질에 있어서의 블로킹용 단백질은 특별히 한정되지 않지만, 미생물 유래 단백질의 블로킹 펩티드 프래그먼트(이하, BPF라고 약칭하는 경우가 있다), 동물 유래 단백질의 소혈청 알부민(이하, BSA라고 약칭하는 경우가 있다), 카제인이 바람직하고, 미생물 유래 단백질의 BPF가 보다 바람직하다. BPF(약 22kDa)는 BSA(약 66kDa)보다도 분자량이 작기 때문에, 보다 고감도의 측정이 가능하다. 또한, BSA는 소 유래이기 때문에 외래성 물질에서 기인하는 오염의 리스크가 있지만, BPF는 미생물 유래이기 때문에 상기 리스크는 없다. 한편, 카제인의 용해에는 알칼리 조건(pH=8.5 내지 10)의 붕산 완충액을 사용할 필요가 있는데, 붕산 완충액은 환경 리스크가 높다. 한편, BPF의 용해에는 중성 조건의 트리스, 인산, PIPES 등을 사용할 수 있기 때문에 바람직하다. 블로킹용 단백질은 시판품을 사용해도 되고, 별도 공지된 방법으로 제조해도 된다. 또한, 분자 크기도 특별히 한정되지 않지만, 평균 분자량으로 100kDa 이하가 바람직하다. 일반적으로 블로킹용 단백질의 분자 크기가 작을수록 검출 입자 1입자에 대한 블로킹용 단백질의 결합량은 증가하므로, 측정 감도의 향상에 기여한다.
컨주게이션 패드(2)에 상기 테스트 라인 검출 시약과 상기 컨트롤 라인 검출 시약을 담지시키는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 상기 테스트 라인 검출 시약과 상기 컨트롤 라인 검출 시약을 일정 비율로 혼합한 후, 상기 혼합액을 컨주게이션 패드에 균일하게 도포, 분무 또는 함침한 후, 항온조 내에서 적당한 온도에서 일정 시간 건조시킴으로써 제작할 수 있다. 상기 혼합액의 도포량은 특별히 한정되지 않지만, 라인 길이 1㎝당 5 내지 50μL가 바람직하다. 또한, 상기 혼합액의 검출 입자 농도는 특별히 한정되지 않지만, 0.01 내지 0.5wt％가 바람직하고, 0.02 내지 0.2wt％가 보다 바람직하고, 0.02 내지 0.1wt％가 더욱 바람직하다. 농도가 0.01wt％보다 낮으면 Hb 및 HbA1c를 충분히 포착·검출할 수 없어, 측정 감도가 저하되는 경우가 있다. 한편, 농도가 0.5wt％보다 높아도 측정 감도의 향상은 보이지 않고, 비용만 높아진다. 이어서, 상기 도포 후에 건조하는 것이 바람직하다. 건조 온도는 특별히 한정되지 않지만 20℃ 내지 80℃가 바람직하고, 20℃ 내지 60℃가 보다 바람직하다. 건조 시간은 건조 온도에 따라 다르지만, 통상은 5 내지 120분간이다.
본 발명에서 사용하는 멤브레인(3) 상의 테스트 라인(6)을 형성하는 선상으로 고정한 포착 항체는 특별히 한정되지 않지만, 항Hb 항체 또는 항HbA1c 항체가 바람직하고, 항Hb 항체가 보다 바람직하다. 항Hb 항체 또는 항HbA1c 항체는 시판품을 사용해도 되고, 별도 공지된 방법으로 제조해도 된다. 또한, 모노클로날 항체여도 되고 폴리클로날 항체여도 되며, 분자 크기도 특별히 한정되지 않는다.
본 발명에서 사용하는 멤브레인(3) 상의 컨트롤 라인(7)을 형성하는 선상으로 고정한 포착 항체는 특별히 한정되지 않지만, 컨트롤 라인 검출 시약의 표지 물질을 특이적으로 포착하기 위한 항체가 바람직하고, 구체적으로는 표지 물질이 비오틴인 경우에는 항비오틴 항체이며, 표지 물질이 디곡시게닌인 경우에는 항디곡시게닌 항체이다. 또한, 항비오틴 항체 또는 항디곡시게닌 항체는 시판품을 사용해도 되고, 별도 공지된 방법으로 제조해도 된다. 또한, 모노클로날 항체여도 되고 폴리클로날 항체여도 되며, 분자 크기도 특별히 한정되지 않는다.
멤브레인(3)에 상기 테스트 라인을 형성하는 포착 항체와 상기 컨트롤 라인을 형성하는 포착 항체를 선상으로 고정하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 상기 테스트 라인을 형성하는 포착 항체와 상기 컨트롤 라인을 형성하는 포착 항체를 각각 선 상에 일정량을 다른 위치에 도포한 후, 항온조 내에서 적당한 온도에서 일정 시간 건조시킴으로써 제작할 수 있다. 상기 양쪽 포착 항체의 도포량은 특별히 한정되지 않지만, 라인 길이 1㎝당 0.1 내지 2μL가 바람직하다. 또한, 상기 양쪽 포착 항체의 도포 농도는 특별히 한정되지 않지만, 0.1 내지 10mg/mL가 바람직하고, 0.2 내지 5mg/mL가 보다 바람직하고, 0.5 내지 2mg/mL가 더욱 바람직하다. 농도가 낮으면 Hb 및 HbA1c를 충분히 포착·검출할 수 없어, 측정 감도가 저하되는 경우가 있다. 한편, 농도를 높게 해도 측정 감도의 향상은 보이지 않고, 비용만 높아진다. 이어서, 상기 도포 후에 건조하는 것이 바람직하다. 건조 온도는 특별히 한정되지 않지만 20℃ 내지 80℃가 바람직하고, 20℃ 내지 60℃가 보다 바람직하다. 건조 시간은 건조 온도에 따라 다르지만, 통상은 5 내지 120분간이다.
본 발명에 있어서 면역 크로마토그래피 시험편은 상기 제작한 멤브레인(3)을 점착 시트(8)의 중앙 부근에 첩부하고, 이어서 컨주게이션 패드(2)를 멤브레인(3)의 한쪽 말단 상에 일부 중첩하여 첩부하고, 이어서 샘플 패드(1)를 컨주게이션 패드(2)의 멤브레인(3)과의 겹침부와는 역의 말단 상에 일부 중첩하여 첩부하고, 이어서 흡수 패드(4)를 멤브레인(3)의 다른 쪽 말단 상에 일부 중첩하여 첩부한 후, 일정 폭의 직사각형으로 절단함으로써 제작할 수 있다. 또한, 테스트 라인(6) 및 컨트롤 라인(7)은 시험편을 제작한 후에 조제해도 되고, 시험편을 제작하기 전에 조제해도 된다.
상기 면역 크로마토그래피 시험편은 적어도 샘플 패드(1) 상에 측정 시료를 적하하기 위한 제1 개구부, 멤브레인(3) 상에 테스트 라인(6)과 컨트롤 라인(7)을 측정하기 위한 제2 개구부를 갖는 적당한 플라스틱제의 하우징 케이스에 수용된 것이어도 된다.
본 발명의 측정 시료 희석액, 및 면역 크로마토그래피 시험편을 사용하여 멤브레인 상에서 HbA1c(％)의 측정을 행하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 이하의 방법을 예시할 수 있다. 처음에, 측정 시료와 측정 시료 희석액을 소정의 희석 배율로 혼합함으로써 전개 가능한 희석 측정 시료를 얻는다. 이어서, 상기 희석 측정 시료를 샘플 패드(1)에 적하함으로써, 희석 측정 시료는 모세관 현상에 의해 샘플 패드(1)를 통과하여 컨주게이션 패드(2)로 전개한다. 그 때, 희석 측정 시료는 컨주게이션 패드(2)에 담지된 테스트 라인 검출 시약 및 컨트롤 라인 검출 시약을 용해하면서, 희석 측정 시료 중의 HbA1c와 테스트 라인 검출 시약 중의 항HbA1c 항체로 감작한 셀룰로오스 입자가 면역 복합체를 형성한다. 또한, 희석 측정 시료 중의 HbA1c 이외의 Hb(예를 들어, HbA0 등)는 테스트 라인 검출 시약과는 면역 복합체를 형성하지 않는다. 이어서, 상기 희석 측정 시료는 멤브레인(3)으로 전개한다. 희석 측정 시료가 테스트 라인(6)에 도달하면, 상기 면역 복합체는 테스트 라인을 형성하는 포착 항체(항Hb 항체)로 포착되어서 집적하고, 테스트 라인(6)이 발색한다. 또한, 희석 측정 시료 중의 HbA1c 이외의 Hb(예를 들어, HbA0 등)도 테스트 라인을 형성하는 포착 항체(항Hb 항체)로 포착되어서 집적하기 때문에, 테스트 라인 상에서는 면역 복합체와 HbA1c 이외의 Hb(예를 들어, HbA0 등)의 경합적인 포착이 발생하고, 포착될 확률은 측정 시료 중의 HbA1c양의 Hb양에 대한 비율: HbA1c(％)에 의존한다. 즉, 테스트 라인의 발색 강도로부터 HbA1c(％)를 직접 측정하는 것이 가능하게 된다. 그 후, 상기 희석 측정 시료가 컨트롤 라인(7)에 도달하면, 컨트롤 라인 검출 시약 중의 표지 물질(비오틴)로 표지한 블로킹용 단백질로 감작한 셀룰로오스 입자는 컨트롤 라인을 형성하는 포착 항체(항비오틴 항체)로 포착되어서 집적하고, 컨트롤 라인(7)이 발색한다. 마지막으로, 상기 희석 측정 시료는 흡수 패드(4)로 흡수된다.
상기 HbA1c(％)는 테스트 라인의 발색 강도로부터 직접 측정해도 되고, 희석 측정 시료의 유동 불균일을 고려하여, 테스트 라인의 발색 강도를 컨트롤 라인의 발색 강도로 나눈 보정값으로부터 측정해도 된다.
본 발명에 있어서 면역 크로마토그래피 시험편의 테스트 라인 및 컨트롤 라인의 측정 방법은 특별히 한정되지 않고, 시판하고 있는 면역 크로마토그래피 리더를 사용해도 되고, 별도 공지된 방법으로 면역 크로마토그래피 리더를 제조해도 된다. 검출계로서는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 LED-FD, LED-CMOS, LED-CCD를 사용할 수 있다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 상세하게 설명한다. 본 발명은 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다. 또한, 실시예에서 기재하는 HbA1c(％)는 모두 NGSP값이다.
(실시예 1)
(1) HbA1c 측정용 테스트 라인 검출 시약의 조제
8.57mg/mL의 항HbA1c 모노클로날 항체(HbA1c Antibody, OAMA02329, AVIVA SYSTEM BIOLOGY사제)를 증류수(오츠카 증류수, 오츠카 세이야쿠사제)로 1.0mg/mL로 조제하였다. 이어서, 1.0wt％의 셀룰로오스 입자(NanoAct(등록 상표), BL2: Dark Navy, 평균 입경 365㎚, 아사히 가세이사제) 100μL, 10mM의 트리스 완충액(204-07885, 와코 쥰야꾸 고교사제)(pH 7.0) 900μL, 및 상기 1.0mg/mL(0.1wt％)의 항HbA1c 모노클로날 항체 100μL를 15mL의 원침관(遠沈管)에 첨가하고, 볼텍스로 교반하였다. 이어서, 37℃로 조정한 저온 인큐베이터(IN604, 야마토 가가쿠사제)에 넣고 120분간 정치하였다. 이어서, 1.0wt％의 카제인(030-01505, 와코 쥰야꾸 고교사제), 100mM의 붕산 완충액(021-02195, 와코 쥰야꾸 고교사제)을 포함하는 블로킹액(pH 8.0) 12mL를 첨가하고, 추가로 37℃로 조정한 저온 인큐베이터(IN604, 야마토 가가쿠사제)에서 60분간 정치하였다. 이어서, 원심 분리기(MX-307, 토미 세이코사제)와 랙-인-로터(TMA-300, 토미 세이코사제)와 랙(AR510-04, 토미 세이코사제)을 사용하여, 10,000G의 원심을 25℃에서 15분간 행하여 항체 감작 셀룰로오스 입자를 침강시킨 후에 상청을 제거하였다. 이어서, 50mM의 붕산 완충액(021-02195, 와코 쥰야꾸 고교사제)을 포함하는 세정액(pH 10.0) 12mL를 첨가하고, 초음파 분산기(UH-50, 에스엠티사제)로 10초간 처리하였다. 이어서, 원심 분리기(MX-307, 토미 세이코사제)와 랙-인-로터(TMA-300, 토미 세이코사제)와 랙(AR510-04, 토미 세이코사제)을 사용하여, 10,000G의 원심을 25℃에서 15분간 행하여 항체 감작 셀룰로오스 입자를 침강시킨 후에 상청을 제거하였다. 이어서, 15wt％의 수크로오스(196-00015, 와코 쥰야꾸 고교사제), 0.2wt％의 카제인(030-01505, 와코 쥰야꾸 고교사제), 62mM의 붕산 완충액(021-02195, 와코 쥰야꾸 고교사제)을 포함하는 도포액(pH 9.2) 2.0mL를 첨가하고, 초음파 분산기(UH-50, 에스엠티사제)로 10초간 처리하여 HbA1c 측정용 테스트 라인 검출 시약을 얻었다. 또한, 상기 HbA1c 측정용 테스트 라인 검출 시약 중의 검출 입자 농도는 0.5mg/mL(0.05wt％), 항체 농도는 0.05mg/mL(0.005wt％)였다.
(2) HbA1c 측정용 컨트롤 라인 검출 시약의 조제
D비오틴(04822-91, 나카라이테스크사제) 16mg, 및 디메틸술폭시드: DMSO(08904-14, 나카라이테스크사제) 1000μL를 1.5mL 마이크로튜브에 첨가하고, 볼텍스로 교반하여 D비오틴 용액을 얻었다. 이어서, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염: EDC(15022-86, 나카라이테스크사제) 20mg, N-히드록시숙신이미드: NHS(18948-02, 나카라이테스크사제) 20mg, 및 증류수(오츠카 증류수, 오츠카 세이야쿠사제) 100μL를 1.5mL 마이크로튜브에 첨가하고, 볼텍스로 교반하여 EDC/NHS 용액을 얻었다. 이어서, 상기 D비오틴 용액 100μL 및 상기 EDC/NHS 용액 100μL를 혼합한 후, 25℃로 조정한 저온 인큐베이터(IN604, 야마토 가가쿠사제)에 넣고 15분간 정치하여 D비오틴/EDC/NHS 용액을 얻었다. 이어서, 블로킹 펩티드 프래그먼트: BPF(BPF-301, 도요보사제) 10mg, 및 증류수(오츠카 증류수, 오츠카 세이야쿠사제) 100μL를 1.5mL 마이크로튜브에 첨가하고, 볼텍스로 교반하여 BPF 용액을 얻었다. 이어서, 상기 D비오틴/EDC/NHS 용액 100μL와 상기 BPF 용액 100μL를 혼합한 후, 25℃로 조정한 저온 인큐베이터(IN604, 야마토 가가쿠사제)에 넣고 30분간 정치하여 D비오틴-BPF 용액을 얻었다. 이어서, 1.0wt％의 셀룰로오스 입자(NanoAct(등록 상표), BL2: Dark Navy, 평균 입경 365㎚, 아사히 가세이사제) 100μL, 10mM의 트리스 완충액(204-07885, 와코 쥰야꾸 고교사제)(pH 7.0) 900μL, 및 상기 D비오틴-BPF 용액 100μL를 15mL의 원침관에 첨가하고 볼텍스로 교반하였다. 이어서, 37℃로 조정한 저온 인큐베이터(IN604, 야마토 가가쿠사제)에 넣고 120분간 정치하였다. 이어서, 1.0wt％의 카제인(030-01505, 와코 쥰야꾸 고교사제), 100mM의 붕산 완충액(021-02195, 와코 쥰야꾸 고교사제)을 포함하는 블로킹액(pH 8.0) 12mL를 첨가하고, 추가로 37℃로 조정한 저온 인큐베이터(IN604, 야마토 가가쿠사제)에서 60분간 정치하였다. 이어서, 원심 분리기(MX-307, 토미 세이코사제)와 랙-인-로터(TMA-300, 토미 세이코사제)와 랙(AR510-04, 토미 세이코사제)을 사용하여, 10,000G의 원심을 25℃에서 15분간 행하여, D비오틴 감작 셀룰로오스 입자를 침강시킨 후에 상청을 제거하였다. 이어서, 50mM의 붕산 완충액(021-02195, 와코 쥰야꾸 고교사제)을 포함하는 세정액(pH 10.0) 12mL를 첨가하고, 초음파 분산기(UH-50, 에스엠티사제)로 10초간 처리하였다. 이어서, 원심 분리기(MX-307, 토미 세이코사제)와 랙-인-로터(TMA-300, 토미 세이코사제)와 랙(AR510-04, 토미 세이코사제)을 사용하여, 10,000G의 원심을 25℃에서 15분간 행하여 D비오틴 감작 셀룰로오스 입자를 침강시킨 후에 상청을 제거하였다. 이어서, 15wt％의 수크로오스(196-00015, 와코 쥰야꾸 고교사제), 0.2wt％의 카제인(030-01505, 와코 쥰야꾸 고교사제), 62mM의 붕산 완충액(021-02195, 와코 쥰야꾸 고교사제)을 포함하는 도포액(pH 9.2) 2.0mL를 첨가하고, 초음파 분산기(UH-50, 에스엠티사제)로 10초간 처리하여, HbA1c 측정용 컨트롤 라인 검출 시약을 얻었다. 또한, 상기 HbA1c 측정용 컨트롤 라인 검출 시약 중의 검출 입자 농도는 0.5mg/mL(0.05wt％), 블로킹용 단백질의 표지 도입비는 1:7이었다.
(3) HbA1c 측정용 멤브레인 카드의 제작
3.6mg/mL의 항Hb 모노클로날 항체(HBA1 Antibody, OAMA02326, AVIVA SYSTEM BIOLOGY사제)를 증류수(오츠카 증류수, 오츠카 세이야쿠사제)로 1.0mg/mL로 조제하였다. 이어서, 1.0mg/mL의 항비오틴 폴리클로날 항체(Biotin Antibody, A150-111A, BETHYL사제)를 증류수(오츠카 증류수, 오츠카 세이야쿠사제)로 0.5mg/mL로 조제하였다. 이어서, 상류측에 20㎜×300㎜의 점착 테이프부, 중앙에 25㎜×300㎜의 멤브레인부, 하류측에 15㎜×300㎜의 점착 테이프부로 구성되는 60㎜×300㎜의 멤브레인 카드(Hi-Flow Plus 120 Membrane Cards, HF120, Millipore사제)의 멤브레인부의 상류측으로부터 15㎜의 위치에, 분주(分注) 플랫폼(XYZ3060, BIODOT사제)과 Bio Jet 노즐(BHQHR-XYZ, BIODOT사제)을 사용하여 상기 1.0mg/mL의 항Hb 모노클로날 항체를 1.0μL/㎝의 도포량으로 도포한 후, 45℃로 조정한 건조기(WFO-510, 도쿄 리카 기카이사제)로 30분간 건조시켜서 라인 폭 약 1㎜의 테스트 라인을 형성하였다. 또한, 상기 테스트 라인을 형성한 멤브레인 카드의 멤브레인부의 상류측으로부터 20㎜의 위치에, 분주 플랫폼(XYZ3060, BIODOT사제)과 Bio Jet 노즐(BHQHR-XYZ, BIODOT사제)을 사용하여 상기 0.5mg/mL의 항비오틴 폴리클로날 항체를 1.0μL/㎝의 도포량으로 도포한 후, 45℃로 조정한 건조기(WFO-510, 도쿄 리카 기카이사제)로 30분간 건조시켜, 라인 폭 약 1㎜의 컨트롤 라인을 형성함으로써, HbA1c 측정용 멤브레인 카드를 얻었다.
(4) HbA1c 측정용 컨주게이션 패드의 제작
상기 HbA1c 측정용 테스트 라인 검출 시약 및 상기 HbA1c 측정용 컨트롤 라인 검출 시약을 6:1의 비율(질량비)로 혼합하였다. 또한, HbA1c 측정용 테스트 라인 검출 시약 및 HbA1c 측정용 컨트롤 라인 검출 시약 중의 입자 농도가 동일한 경우에는, 체적비 6:1의 비율로 혼합하면 된다. 이어서, 10㎜×300㎜의 컨주게이션 패드(GLASSFIBER DIAGNOSTIC PAD, GFDX001050, Millipore사제)의 전체면에, 분주 플랫폼(XYZ3060, BIODOT사제)과 Air Jet 노즐(AJQHR-XYZ, BIODOT사제)을 사용하여 상기 혼합액을 15μL/㎝의 도포량으로 균일하게 도포한 후, 45℃로 조정한 건조기(WFO-510, 도쿄 리카 기카이사제)로 30분간 건조시켜서 HbA1c 측정용 컨주게이션 패드를 얻었다.
(5) HbA1c 측정용 면역 크로마토그래피 시험편의 제작
상기 HbA1c 측정용 멤브레인 카드의 상류측의 20㎜×300㎜의 점착 테이프부에, 멤브레인부와 5㎜ 겹치도록 상기 HbA1c 측정용 컨주게이션 패드를 접합하였다. 이어서, 추가로 상류측에 상기 컨주게이션 패드와 5㎜ 겹치도록 20㎜×300㎜의 샘플 패드(CELLULOSE FIBER SAMPLE PADS, CFSP002000, Millipore사제)를 접합하였다. 이어서, 상기 HbA1c 측정용 멤브레인 카드의 하류측의 15㎜×300㎜의 점착 테이프부에, 멤브레인부와 2㎜ 겹치도록 20㎜×300㎜의 흡수 패드(CELLULOSE FIBER SAMPLE PADS, CFSP002000, Millipore사제)를 접합하였다. 이어서, 기요틴식 커팅 모듈(CM5000, BIODOT사제)을 사용하여 폭 4㎜, 길이 63㎜의 직사각형으로 커트함으로써 HbA1c 측정용 면역 크로마토그래피 시험편을 얻었다.
(6) 측정 시료 희석액의 조제
인산 완충 생리 식염 분말(162-19321, 와코 쥰야꾸 고교사제) 1자루, 폴리옥시에틸렌(20)소르비탄모노라우레이트: Tween(등록 상표) 20(166-21213, 와코 쥰야꾸 고교사제) 2.0g, 도데실황산나트륨: SDS(194-13985, 와코 쥰야꾸 고교사제) 1.0g, 아질산나트륨(199-02565, 와코 쥰야꾸 고교사제) 0.2g, 아지드화나트륨(199-11095, 와코 쥰야꾸 고교사제) 0.2g을 증류수(오츠카 증류수, 오츠카 세이야쿠사제) 150mL에 용해하고, 증류수(오츠카 증류수, 오츠카 세이야쿠사제)로 200mL 용액으로 한 후, 500mL 유리병에 옮겨 측정 시료 희석액(50mM PBS, 1.0wt％ Tween20, 0.5wt％ SDS, 0.1wt％ 아질산나트륨, 0.1wt％ 아지드화나트륨)을 조제하였다.
(7) 희석 시료의 조제
시판하고 있는 HbA1c 표준 물질인 HbA1c 측정 성능 평가용 시료(QRM HbA1c 2007-1, 겐사 이가쿠 효준 붓시츠 기코사제, L1 내지 L5의 5 수준)를 각각 상기 측정 시료 희석액으로 500배로 희석함으로써, HbA1c(％)가 L1=5.01％, L2=5.65％, L3=7.35％, L4=9.51％, L5=11.26％이며, 또한 Hb 농도가 L1 내지 L5=0.280g/L인 희석 HbA1c 시료(L1 내지 L5)를 얻었다.
(8) HbA1c 측정용 면역 크로마토그래피 시험편의 평가: 감도의 평가
상기 HbA1c 측정용 면역 크로마토그래피 시험편을 수평한 대에 설치하였다. 이어서, 혼합 시간이 10초간인 상기 희석 HbA1c 시료(L1, L4) 100μL를 마이크로 피펫으로 분취하고, 샘플 패드에 천천히 적하하고, 25℃에서 10분간 정치하였다. 이어서, 멤브레인 상의 컨트롤 라인 및 테스트 라인의 반사 흡광도(mAbs)를 면역 크로마토그래피 리더(C10060-10, 측정 모드: Latex, Line, 하마마츠 포토닉스사제)를 사용하여 측정하였다. 상기 실험 조작을 상기 희석 HbA1c 시료(L1, L4)에 대하여 각각 N=10(합계로 상기 HbA1c 측정용 면역 크로마토그래피 시험편을 20개 사용)으로 행하였다. 감도의 지표로서, 상기 희석 HbA1c 시료(L4)의 테스트 라인의 반사 흡광도(mAbs)의 N=10 평균값과, 상기 희석 HbA1c 시료(L1)의 테스트 라인의 반사 흡광도(mAbs)의 N=10 평균값의 차: ΔL4-L1(mAbs)을 산출하고, ΔL4-L1≥180mAbs를 3점(excellent), 150mAbs≤ΔL4-L1<180mAbs를 2점(good), 100mAbs≤ΔL4-L1<150mAbs를 1점(average), ΔL4-L1<100mAbs를 0점(bad)으로 평가하였다. 실시예 1의 HbA1c 측정용 면역 크로마토그래피 시험편의 감도는 ΔL4-L1=170mAbs로 2점으로, 고감도의 측정이 가능하였다.
(9) HbA1c 측정용 면역 크로마토그래피 시험편의 평가: 정밀도의 평가
상기 HbA1c 측정용 면역 크로마토그래피 시험편을 수평한 대에 설치하였다. 이어서, 혼합 시간이 10초간인 상기 희석 HbA1c 시료(L1, L4) 100μL를 마이크로 피펫으로 분취하고, 샘플 패드에 천천히 적하하고, 25℃에서 10분간 정치하였다. 이어서, 멤브레인 상의 컨트롤 라인 및 테스트 라인의 반사 흡광도(mAbs)를 면역 크로마토그래피 리더(C10060-10, 측정 모드: Latex, Line, 하마마츠 포토닉스사제)를 사용하여 측정하였다. 상기 실험 조작을 상기 희석 HbA1c 시료(L1, L4)에 대하여 각각 N=10(합계로 상기 HbA1c 측정용 면역 크로마토그래피 시험편을 20개 사용)으로 행하였다. 정밀도의 지표로서, 상기 희석 HbA1c 시료(L1, L4)의 테스트 라인의 반사 흡광도(mAbs)를 컨트롤 라인의 반사 흡광도(mAbs)로 나눈 보정값(L1, L4)을 각각 산출한 후, 얻어진 보정값(L1, L4)의 N=10에 있어서의 CV(L1, L4)(％)를 각각 산출하고, 또한 CV(L1)(％)와 CV(L4)(％)의 평균값: CV(％)를 산출하고, CV<3％를 3점(excellent), 3％≤CV<5％를 2점(good), 5％≤CV<10％를 1점(average), CV≥10％를 0점(bad)으로 평가하였다. 실시예 1의 HbA1c 측정용 면역 크로마토그래피 시험편의 정밀도는 CV=3.3％로 2점으로, 고정밀도의 측정이 가능하였다.
(10) HbA1c 측정용 면역 크로마토그래피 시험편의 평가: HPLC법과의 상관성의 평가
상기 HbA1c 측정용 면역 크로마토그래피 시험편을 수평한 대에 설치하였다. 이어서, 혼합 시간이 10초간인 상기 희석 HbA1c 시료(L1 내지 L5) 100μL를 마이크로 피펫으로 분취하고, 샘플 패드에 천천히 적하하고, 25℃에서 10분간 정치하였다. 이어서, 멤브레인 상의 컨트롤 라인 및 테스트 라인의 반사 흡광도(mAbs)를 면역 크로마토그래피 리더(C10060-10, 측정 모드: Latex, Line, 하마마츠 포토닉스사제)를 사용하여 측정하였다. 상기 실험 조작을 상기 희석 HbA1c 시료(L1 내지 L5)에 대하여 각각 N=10(합계로 상기 HbA1c 측정용 면역 크로마토그래피 시험편을 50개 사용)으로 행하였다. 상관성의 지표로서, 상기 희석 HbA1c 시료(L1 내지 L5)의 테스트 라인의 반사 흡광도(mAbs)를 컨트롤 라인의 반사 흡광도(mAbs)로 나눈 보정값(L1 내지 L5)을 각각 산출한 후, 얻어진 보정값(L1 내지 L5)과, 상기 희석 HbA1c 시료(L1 내지 L5)의 HbA1c(％), L1=5.01％, L2=5.65％, L3=7.35％, L4=9.51％, L5=11.26％의 피어슨 상관 계수: r을 산출하고, r≥0.95를 3점(excellent), 0.90≤r<0.95를 2점(good), 0.85≤r<0.90을 1점(average), r<0.85를 0점(bad)으로 평가하였다. 실시예 1의 HbA1c 측정용 면역 크로마토그래피 시험편의 상관성은 r=0.96으로 3점으로, HbA1c(％)와의 높은 상관성을 갖고 있었다.
(11) HbA1c 측정용 면역 크로마토그래피 시험편의 평가: 혼합 시간 의존성의 평가
상기 HbA1c 측정용 면역 크로마토그래피 시험편을 수평한 대에 설치하였다. 이어서, 혼합 시간이 10초간 및 15분간인 상기 희석 HbA1c 시료(L4) 100μL를 마이크로 피펫으로 분취하고, 샘플 패드에 천천히 적하하고, 25℃에서 10분간 정치하였다. 이어서, 멤브레인 상의 컨트롤 라인 및 테스트 라인의 반사 흡광도(mAbs)를 면역 크로마토그래피 리더(C10060-10, 측정 모드: Latex, Line, 하마마츠 포토닉스사제)를 사용하여 측정하였다. 상기 실험 조작을 혼합 시간이 10초간인 희석 HbA1c 시료(L4) 및 혼합 시간이 15분간인 희석 HbA1c 시료(L4)에 대하여 각각 N=10(합계로 상기 HbA1c 측정용 면역 크로마토그래피 시험편을 20개 사용)으로 행하였다. 혼합 시간 의존성의 지표로서, 상기 혼합 시간이 15분간인 희석 HbA1c 시료(L4)의 테스트 라인의 반사 흡광도(mAbs)의 N=10 평균값과, 상기 혼합 시간이 10초간인 희석 HbA1c 시료(L4)의 테스트 라인의 반사 흡광도(mAbs)의 N=10 평균값의 차: Δ15-10(mAbs)을 산출하고, Δ15-10≤20mAbs를 3점(excellent), 20mAbs<Δ15-10≤100mAbs를 2점(good), 100mAbs<Δ15-10≤200mAbs를 1점(average), Δ15-10> 200mAbs를 0점(bad)으로 평가하였다. 실시예 1의 HbA1c 측정용 면역 크로마토그래피 시험편의 혼합 시간 의존성은 Δ15-10=-10mAbs로 3점으로, 측정 시료와 측정 시료 희석액을 혼합하고 나서 HbA1c 측정용 면역 크로마토그래피 시험편에 적하할 때까지의 시간: 혼합 시간에 따른 테스트 라인의 반사 흡광도의 변동은 거의 없는 것을 확인하였다.
(실시예 2 내지 27)
측정 시료 희석액의 조성을 변경하는 것 이외에는 실시예 1과 마찬가지로 하여 HbA1c 측정용 면역 크로마토그래피 시험편을 제작하여 평가하였다. 사용한 측정 시료 희석액의 조성 및 얻어진 평가 결과를 표 1에 나타내었다. 또한, 표 1 중의 LDS는 도데실황산리튬(121-02741, 와코 쥰야꾸 고교사제)을, Tween(등록 상표) 80은 폴리옥시에틸렌(20)소르비탄모노올레에이트(163-21625, 와코 쥰야꾸 고교사제)를, TritonX(등록 상표) 100은 폴리옥시에틸렌(10)옥틸페닐에테르(160-24751, 와코 쥰야꾸 고교사제)를, NP-40은 Nonidet(등록 상표) P-40(23640-65, 나카라이테스크사제)을, KNO2는 아질산칼륨(169-27325, 와코 쥰야꾸 고교사제)을, PIPES는 PIPES 완충액(pH 7.5)(28104-16, 나카라이테스크사제)을, Tris는 트리스 완충액(pH 7.5)(204-07885, 와코 쥰야꾸 고교사제)을 각각 나타낸다.
(실시예 28 내지 31)
희석 측정 시료의 조제 공정에 있어서, 시판하고 있는 HbA1c 표준 물질인 HbA1c 측정 성능 평가용 시료(QRM HbA1c 2007-1, 겐사 이가쿠 효준 붓시츠 기코사제, L1 내지 L5의 5 수준)를 각각 측정 시료 희석액으로 500배로 희석하는 대신, 50배(실시예 28), 100배(실시예 29), 1000배(실시예 30), 2000배(실시예 31)로 희석하는 것 이외에는 실시예 1과 마찬가지로 하여 HbA1c 측정용 면역 크로마토그래피 시험편을 제작하여 평가하였다. 얻어진 평가 결과를 표 1에 나타내었다.
Figure 112020081099643-pct00001
(비교예 1 내지 5)
측정 시료 희석액의 조성을 변경하는 것 이외에는 실시예 1과 마찬가지로 하여 HbA1c 측정용 면역 크로마토그래피 시험편을 제작하여 평가하였다. 사용한 측정 시료 희석액의 조성 및 얻어진 평가 결과를 표 2에 나타내었다.
표 2에 나타낸 바와 같이, 계면 활성제를 포함하지 않는 측정 시료 희석액을 사용한 비교예 1에서는 측정 대상물인 HbA1c가 변성되지 않고, 컨주게이션 패드에서 HbA1c와 항HbA1c 항체로 감작한 검출 입자가 면역 복합체를 형성할 수 없기 때문에 테스트 라인을 시인할 수 없을 만큼 연하고, 측정 감도가 현저하게 낮은 결과가 되었다. 또한, 비교예 1에서는 테스트 라인의 반사 흡광도가 검출 하한 부근이었기 때문에, 정밀도, 상관성, 혼합 시간 의존성의 평가를 행하지 않았다.
또한, 음이온성 계면 활성제를 포함하지 않는, 즉 비이온성 계면 활성제인 Tween(등록 상표) 20만이 포함되어 있는 측정 시료 희석액을 사용한 비교예 2도 마찬가지로 측정 대상물인 HbA1c가 변성되지 않고, 컨주게이션 패드에서 HbA1c와 항HbA1c 항체로 감작한 검출 입자가 면역 복합체를 형성할 수 없기 때문에 테스트 라인을 시인할 수 없을 만큼 연하고, 측정 감도가 현저하게 낮은 결과가 되었다. 또한, 비교예 2에서는 테스트 라인의 반사 흡광도가 검출 하한 부근이었기 때문에, 그 후의 정밀도, 상관성, 혼합 시간 의존성의 평가를 행하지 않았다.
또한, 2종류의 비이온성 계면 활성제(Tween(등록 상표) 20 및 TritonX(등록 상표) 100)를 포함하는 측정 시료 희석액을 사용한 비교예 3, 4에서는 측정 대상물인 HbA1c가 변성될 때까지 시간이 걸리기 때문에, 측정 시료와 측정 시료 희석액을 혼합하고 나서 HbA1c 측정용 면역 크로마토그래피 시험편에 적하할 때까지의 시간: 혼합 시간에 따라 테스트 라인의 반사 흡광도가 크게 변동하는 결과가 되었다. 또한, 상기 혼합 시간 의존성의 영향에 의해, 특히 통상의 면역 크로마토그래피 시험에서 상정되는, 혼합 직후의 측정 감도, 측정 정밀도가 현저하게 낮은 결과가 되었다.
또한, 음이온성 계면 활성제인 SDS만을 포함하는 측정 시료 희석액을 사용한 비교예 5에서는, 희석한 측정 시료의 하류로의 전개 불균일(경우에 따라서는, 측정 시간 내에 하류로 전개하지 않는다)이 발생하여 측정 정밀도가 현저하게 낮은 결과가 되었다.
(비교예 6)
인산 완충 생리 식염 분말(162-19321, 와코 쥰야꾸 고교사제) 1자루, 도데실황산나트륨: SDS(194-13985, 와코 쥰야꾸 고교사제) 10g을 증류수(오츠카 증류수, 오츠카 세이야쿠사제) 150mL에 용해하고, 증류수(오츠카 증류수, 오츠카 세이야쿠사제)로 200mL 용액으로 한 후, 500mL 유리병에 옮겨 샘플 패드 도포액(50mM PBS, 5wt％ SDS)을 조정하였다. 이어서, 20㎜×300㎜의 샘플 패드(CELLULOSE FIBER SAMPLE PADS, CFSP002000, Millipore사제)의 전체면에, 분주 플랫폼(XYZ3060, BIODOT사제)과 Air Jet 노즐(AJQHR-XYZ, BIODOT사제)을 사용하여 상기 샘플 패드 도포액을 30μL/㎝의 도포량으로 균일하게 도포한 후, 45℃로 조정한 건조기(WFO-510, 도쿄 리카 기카이사제)로 30분간 건조시켜서 계면 활성제를 담지한 샘플 패드를 얻었다. HbA1c 측정용 면역 크로마토그래피 시험편의 제작 공정에 있어서, 20㎜×300㎜의 샘플 패드(CELLULOSE FIBER SAMPLE PADS, CFSP002000, Millipore사제) 대신 상기 계면 활성제를 담지한 샘플 패드를 사용하는 것 이외에는 비교예 2와 마찬가지로 하여 HbA1c 측정용 면역 크로마토그래피 시험편을 제작하여 평가하였다. 사용한 측정 시료 희석액의 조성 및 얻어진 평가 결과를 표 2에 나타내었다.
비이온성 계면 활성제인 Tween(등록 상표) 20만을 포함하는 측정 시료 희석액을 사용하고, 또한 음이온성 계면 활성제인 SDS를 샘플 패드에 담지한 면역 크로마토그래피 시험편을 사용한 비교예 6에서는 테스트 라인이 연하고 측정 감도가 낮은 결과가 되었다. 이것은, 희석 측정 시료가 샘플 패드를 통과하는 약간의 시간에서는 SDS의 용해 및 HbA1c의 변성이 완전히 끝까지는 진행하지 않아, 컨주게이션 패드에서 HbA1c와 항HbA1c 항체로 감작한 검출 입자가 면역 복합체를 형성하기 어렵기 때문으로 생각되었다. 즉, 음이온성 계면 활성제는 샘플 패드가 아니라, 측정 시료 희석액에 포함할 필요가 있는 것을 나타내고 있다.
(비교예 7)
인산 완충 생리 식염 분말(162-19321, 와코 쥰야꾸 고교사제) 1자루, 폴리옥시에틸렌(20)소르비탄모노라우레이트: Tween(등록 상표) 20(166-21213, 와코 쥰야꾸 고교사제) 20g을 증류수(오츠카 증류수, 오츠카 세이야쿠사제) 150mL에 용해하고, 증류수(오츠카 증류수, 오츠카 세이야쿠사제)로 200mL 용액으로 한 후, 500mL 유리병에 옮겨 샘플 패드 도포액(50mM PBS, 10wt％ Tween20)을 조정하였다. 이어서, 20㎜×300㎜의 샘플 패드(CELLULOSE FIBER SAMPLE PADS, CFSP002000, Millipore사제)의 전체면에, 분주 플랫폼(XYZ3060, BIODOT사제)과 Air Jet 노즐(AJQHR-XYZ, BIODOT사제)을 사용하여 상기 샘플 패드 도포액을 30μL/㎝의 도포량으로 균일하게 도포한 후, 45℃로 조정한 건조기(WFO-510, 도쿄 리카 기카이사제)로 30분간 건조시켜서 계면 활성제를 담지한 샘플 패드를 얻었다. HbA1c 측정용 면역 크로마토그래피 시험편의 제작 공정에 있어서, 20㎜×300㎜의 샘플 패드(CELLULOSE FIBER SAMPLE PADS, CFSP002000, Millipore사제) 대신 상기 계면 활성제를 담지한 샘플 패드를 사용하는 것 이외에는 비교예 5와 마찬가지로 하여 HbA1c 측정용 면역 크로마토그래피 시험편을 제작하여 평가하였다. 사용한 측정 시료 희석액의 조성 및 얻어진 평가 결과를 표 2에 나타내었다.
음이온성 계면 활성제인 SDS만이 포함되어 있는 측정 시료 희석액을 사용하고, 또한 비이온성 계면 활성제인 Tween(등록 상표) 20을 샘플 패드에 담지한 면역 크로마토그래피 시험편을 사용한 비교예 7에 있어서도 측정 감도가 낮은 결과가 되었다. 이것은, 희석 측정 시료가 샘플 패드를 통과하는 약간의 시간에서 Tween(등록 상표)의 용해가 완전히 끝까지는 진행하지 않아, 전개 불균일이 완전히는 해소되지 않았기 때문이라고 생각되었다. 즉, 비이온성 계면 활성제는 샘플 패드가 아니라, 측정 시료 희석액에 포함할 필요가 있는 것을 나타내고 있다.
Figure 112020081099643-pct00002
본 발명에 의해, 고감도·고정밀도·HPLC법과의 고상관성이며, 또한 측정 시료와 측정 시료 희석액을 혼합하고 나서 면역 크로마토그래피 시험편에 적하할 때까지의 시간의 영향을 받지 않고, 측정 시료 중의 HbA1c양의 Hb양에 대한 비율인 HbA1c(％)를 측정할 수 있는 면역 크로마토그래피 시험편을 제공할 수 있다.
1: 샘플 패드
2: 컨주게이션 패드
3: 멤브레인
4: 흡수 패드
5: 배킹 시트
6: 테스트 라인
7: 컨트롤 라인
8: 점착 시트

Claims (13)

  1. 측정 시료 중의 헤모글로빈 A1c양의 헤모글로빈양에 대한 비율인 헤모글로빈 A1c(％)를 정량하기 위한 면역 크로마토그래피용 측정 시료 희석액이며, 음이온성 계면 활성제, 비이온성 계면 활성제 및 완충제를 포함하는 수용액이고, 상기 비이온성 계면 활성제는 폴리옥시에틸렌소르비탄지방산에스테르 및 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르의 혼합물이고, 이 때 폴리옥시에틸렌소르비탄지방산에스테르의 농도는 0.1 내지 2.0wt％이고, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르의 농도는 0.1 내지 1.0wt％인, 측정 시료 희석액.
  2. 제1항에 있어서, 상기 음이온성 계면 활성제는 알킬황산염인, 측정 시료 희석액.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 음이온성 계면 활성제를 0.05 내지 2.0wt％ 포함하는, 측정 시료 희석액.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 추가로 산화제를 포함하는, 측정 시료 희석액.
  7. 제6항에 있어서, 상기 산화제는 아질산염인, 측정 시료 희석액.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 추가로 아지드화제를 포함하는, 측정 시료 희석액.
  9. 제8항에 있어서, 상기 아지드화제는 아지드화나트륨인, 측정 시료 희석액.
  10. 제1항에 기재된 측정 시료 희석액, 면역 크로마토그래피 시험편, 및 면역 크로마토그래피 리더를 포함하는, 헤모글로빈 A1c양의 헤모글로빈양에 대한 비율을 정량하기 위한 측정 키트.
  11. 제10항에 있어서, 상기 면역 크로마토그래피 시험편은
    (1) 샘플 패드와,
    (2) 상기 측정 시료 중의 헤모글로빈 또는 헤모글로빈 A1c를 포착하기 위한 항체와 셀룰로오스 입자의 복합체를 담지한 컨주게이션 패드와,
    (3) 측정 시료 중의 헤모글로빈 또는 헤모글로빈 A1c를 특이적으로 포착하기 위한 항체를 선상으로 고정한 멤브레인과,
    (4) 흡수 패드
    로 구성되는 측정 키트.
  12. 제1항 또는 제2항에 기재된 측정 시료 희석액 또는 제10항 또는 제11항에 기재된 측정 키트를 사용하여, 적어도 하기 공정 (i) 내지 (iii)을 이 순으로 거쳐서 측정 시료 중의 헤모글로빈 A1c양의 헤모글로빈양에 대한 비율을 정량하는 방법.
    공정 (i): 측정 시료와 측정 시료 희석액을 체적비 1:49 내지 1:999로 혼합하여 희석하는 공정
    공정 (ii): 공정 (i)의 혼합액을 면역 크로마토그래피 시험편의 샘플 패드에 적하하는 공정
    공정 (iii): 면역 크로마토그래피 시험편의 테스트 라인의 반사 흡광도와 컨트롤 라인의 반사 흡광도로부터 헤모글로빈 A1c양의 헤모글로빈양에 대한 비율을 비색 정량하는 공정
  13. 제12항에 있어서, 측정 시료와 측정 시료 희석액을 체적비 1:99 내지 1:499로 혼합하여 희석하는 방법.
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