CN109613269A - 一种用于牛奶中兽药残留检测的蛋白芯片及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于测定牛奶六种兽药残留浓度的蛋白芯片,所述蛋白芯片的制备方法包括如下步骤:(1)黑玻片预处理;(2)抗原溶液点样;(3)封闭工艺;制得所述蛋白芯片。本发明蛋白芯片用于检测牛奶中兽药残留,应用本公司独创的蛋白芯片技术实现联合检测可以有效地提高检测效率,降低检测成本;本发明人开发了同时包含有MA、CAP、PCN、SAS、GM和TC六个指标的蛋白芯片诊断试剂盒,具有快速,高效,低成本等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其是涉及一种用于检测兽药残留的蛋白芯片及其制备方法。
背景技术
兽药残留是指用药后蓄积或存留于畜禽体内或产品中原型药物或其代谢产物。兽药的正确、合理的使用给养殖业带来了高效益,但总有部分人一味追求经济利益,在畜禽产业各个环节中非法使用、滥用、违规添加、注入兽药或有害物质。兽药的残留及有害物质严重影响动物性食品安全、畜牧业的可持续发展,更严重的是直接危害人体健康和生命安全,对人类健康危害极大。因此,必须对动物性食品进行兽药残留含量和违禁药物及有害物质的检测,防止问题畜产品流入市场各环节,保证人们的“餐桌安全”。
六个兽药残留检测的指标分别为:MA、CAP、PCN、SAS、GM、TC。
MA(三聚氰胺)又被人称为“蛋白精”属于化工原料,在牛奶和奶粉添加三聚氰胺,可以冒充蛋白质,提高牛奶中蛋白质的含量指标。三聚氰胺的遗传毒性、亚慢性毒性、慢性毒性是致命的,长期摄入会造成生殖、泌尿系统的损害,膀胱、肾部结石,并可进一步诱发膀胱癌。2017年10月27日,世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考,三聚氰胺在2B类致癌物清单中。
CAP(氯霉素)可用于细菌核糖核蛋白体的50s亚基,阻扰蛋白质的合成,对革兰氏阳性、阴性菌均有抑制作用,特别对伤寒杆菌、流感杆菌、副流感杆菌和百日咳杆菌的作用强于其他抗生素。氯霉素会抑制骨髓造血机能,造成有粒细胞及血小板减少、再生障碍性贫血,久用还可致视神经炎、共济失调及二重感染。
PCN(青霉素)是抗菌素的一种,能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素。青霉素毒性低,但较容易发生过敏反应,如:皮疹、哮喘、药物热、严重的可致过敏性性休克而引起死亡。长期使用含青霉素的牛奶,还可出现神经症状,如:反射亢进、知觉障碍、抽搐、昏睡等。
SAS(磺胺药)是一类具有抑菌活性的化学合成药,为对氨基苯磺酰胺的衍生物。本专利中提及的SAS检测主要针对是磺胺十七项的检测。一旦长时间摄入磺胺类的牛奶,造成体内细菌对磺胺药较易产生抗药性,同时当人体内蓄积到一定程度时,会有严重的毒副作用,会破坏人的正常免疫机能、造血系统和泌尿系统,甚至还可抑制骨髓的造血功能,影响中枢神经系统。
GM(庆大霉素)是一种氨基糖苷类药,主要作用于细菌体内的核糖体,抑制细菌蛋白质的合成,并破坏细菌细胞膜的完整性。庆大霉素在奶牛上主要是用于治疗乳房炎、子宫内膜炎等。会引起眩晕,耳蜗神经损害表现为听力减退,耳聋;出现蛋白尿、血尿,严重可致肾衰竭;引起骨骼肌收缩、呼吸困难;引起皮疹、药热,还可以引起过敏性休克。
TC(四环素)在奶牛上主要用于治疗乳房炎、子宫内膜,由支原体、衣原体等所致的感染。长期使用含四环素的牛奶会造成消化道反应、肝损害、肾损害、对牙齿和骨骼的发育造成影响、对局部具有一定的刺激作用、过敏反应、导致肠道菌群失调等。
目前这六个指标已经被企业、检测机构、政府执法部门等广泛应用检测。但是目前采取的主流方法是免疫单指标的测定方法(例如ELISA和胶体金等)。虽然能够测定这六个指标,但是存在检测速度慢,检测成本高等缺点。而且六个指标分别检测存在着操作不便,出错概率大等现实问题。而作为微量成分检测最权威的HPLC(液相色谱)法虽然结果准确可靠,但成本极高,设备昂贵,无法大规模采用。牛奶中是否含有抗生素、能否安全食用是大众急切想知道的问题,为了加快检测的速度,不少企业、检测机构、政府执法部门不得不花费更多的人力、物力、时间,分别用于检测MA、CAP、PCN、SAS、GM、TC,造成了较大的浪费。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题,本发明申请人提供了一种用于兽药残留检测的蛋白芯片及其制备方法。本发明蛋白芯片用于检测牛奶六个兽药残留指标,应用本公司独创的蛋白芯片技术实现联合检测可以有效地提高检测效率,降低检测成本;本发明人开发了同时包含有MA、CAP、PCN、SAS、GM、TC六个指标的蛋白芯片诊断试剂盒,具有快速,高效,低成本等优点。
本发明的技术方案如下:
一种用于兽药残留检测的蛋白芯片,所述蛋白芯片的制备方法包括如下步骤:
(1)黑玻片预处理;
(2)抗原溶液点样;
(3)封闭工艺,制得所述蛋白芯片。
步骤(1)中所述黑玻片预处理的方法为:
①将黑玻片置于含有NaOH的玻片预处理液中浸泡16~24h,之后采用纯化水清洗2~8次;
②将黑玻片置于质量浓度为0.05~1%的硅烷溶液中浸泡20~60min;
③将浸泡好的黑玻片氮气吹扫后放入烘箱中,于100~180℃条件下烘烤0.2~0.6h。
步骤(2)中所述抗原溶液包括MA抗原溶液、CAP抗原溶液、PCN抗原溶液、SAS抗原溶液、GM抗原溶液、TC抗原溶液。
步骤(2)中所述点样的方法为机器自动化点样。
步骤(3)中所述封闭过程为:将点样好的黑玻片没入封闭液中1~24h,之后取出黑玻片,并离心去除残余封闭液,制得所述蛋白芯片。
所述封闭液为含有封闭蛋白的缓冲溶液;所述封闭蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白;所述缓冲液为PBS缓冲液、Tris缓冲液、HEPS缓冲液、MOPS缓冲液中的一种或多种。
一种所述蛋白芯片的应用,将所述蛋白芯片制成试剂盒。
所述试剂盒还包括标记有HRP酶或碱磷酶的第二抗体溶液、兽药相对应的抗体溶液、对标记物敏感的化学发光底物。
本发明有益的技术效果在于:
本发明蛋白芯片用于检测六个重要的兽药指标,应用蛋白芯片技术实现联合检测可以有效地提高检测效率,降低检测成本;同时包含有MA、CAP、PCN、SAS、GM、TC六个指标的蛋白芯片诊断试剂盒,具有快速,高效,低成本等优点。配合本公司的自动化蛋白芯片阅读仪,可以实现自动化检测。由于有效地将六个指标集成在一张芯片中进行检测,只需要一份牛奶就可以实现六个指标的同时快速检测。本产品和技术作为一种新颖的检测方法,目前世界上还没有同类产品面市。
本发明采用经典的免疫学间接竞争法。在玻璃为载体的芯片基质上固定捕获抗原,这些包被抗原可以与样本中抗原竞争加入的特异性抗体溶液,被捕获的抗原抗体复合物与标记有HRP酶的第二抗体相结合,形成夹心式结合产物。加入对标记物(HRP酶或碱磷酶)敏感的化学发光底物进行化学发光,其光信号通过CCD摄像头采集,通过光信号的强弱可以判断被测样本中特定标志物抗原的浓度。
本试剂盒使用了兽药残留芯片技术平台,而国内其他厂家的单项检测方法使用的是ELISA检测体系,每次只能检测一个指标。与之相比,本产品的优势在于:①由于抗原或抗体与本产品抗体或抗原结合的特异性高、亲和力强,并且受到其他杂质影响较低,因此,对生物样品的要求非常低,可简化样品的前处理过程;而经典的HPLC(液相色谱)法对样品处理要求很高。②能够快速高通量、平行化定量分析大量的牛奶样品;③操作简单,结果正确率高;④所需试剂和样品少,价格低廉。
附图说明
图1为本发明抗原点样示意图;
图中,列1:阳性质控列;列2:空白;列3:MA测定列;列4:CAP测定列;列5:PCN测定列;列6:空白;列7:SAS测定列;列8:GM测定列;列9:TC测定列;列10:空白;列11:阴性对照列。
具体实施方式
下面结合附图和实施例,对本发明进行具体描述。
实施例1
一种用于兽药残留检测的蛋白芯片,所述蛋白芯片的制备方法包括如下步骤:
(1)黑玻片预处理;
①将黑玻片置于含有2%NaOH的玻片预处理液中浸泡16h,之后采用纯化水清洗2~8次;
②将黑玻片置于质量浓度为0.05%的硅烷溶液(介质为25%乙醇)中浸泡60min;
③将浸泡好的黑玻片氮气吹扫后放入烘箱中,于180℃条件下烘烤0.2h。
(2)抗原溶液点样;
参考图1,采用机器自动化点样MA抗原溶液、CAP抗原溶液、PCN抗原溶液、SAS抗原溶液、GM抗原溶,TC抗原溶液浓度为0.05mg/mL,每点点样20nL,各抗体点样分布如图1所示。
(3)封闭工艺;
将点样好的黑玻片没入封闭液(内含1%牛血清白蛋白的PBS缓冲液)中10h,之后取出黑玻片,并离心去除残余封闭液,制得所述蛋白芯片。
(4)试剂盒
将所述蛋白芯片、残留兽药的相应抗体溶液与标记有HRP酶的第二抗体溶液(浓度为1ug/ml,其中介质为外购的赛默飞公司的酶标二抗稀释液,pH=6.0)、样本稀释液(0.01MPBS PH-7.4)、检测液A(含1%鲁米诺和2%Tris)和检测液B(含1%过氧化氢)共同包装成试剂盒。
实施例2
一种用于兽药残留检测的蛋白芯片,所述蛋白芯片的制备方法包括如下步骤:
(1)黑玻片预处理;
①将黑玻片置于含有2%NaOH的玻片预处理液中浸泡24h,之后采用纯化水清洗2~8次;
②将黑玻片置于质量浓度为0.5%的硅烷溶液(介质为25%乙醇)中浸泡30min;
③将浸泡好的黑玻片氮气吹扫后放入烘箱中,于140℃条件下烘烤0.5h。
(2)抗原溶液点样;
参考图1,采用机器自动化点样MA抗原溶液、CAP抗原溶液、PCN抗原溶液、SAS抗原溶液、GM抗原溶,抗原溶液浓度为0.05mg/mL,每点点样20nL,各抗体点样分布如图1所示。
(3)封闭工艺;
将点样好的黑玻片没入封闭液(内含2%卵清蛋白的PBS缓冲液)中24h,之后取出黑玻片,并离心去除残余封闭液,制得所述蛋白芯片。
(4)试剂盒
将所述蛋白芯片、残留兽药的相应抗体溶液与标记有HRP酶的第二抗体溶液(浓度为1ug/ml,其中介质为外购的赛默飞公司的酶标二抗稀释液,pH=6.0)、样本稀释液(0.01MPBS PH-7.4)、检测液A(含1%鲁米诺和2%Tris)和检测液B(含1%过氧化氢)共同包装成试剂盒。
实施例3
一种用于兽药残留检测的蛋白芯片,所述蛋白芯片的制备方法包括如下步骤:
(1)黑玻片预处理;
①将黑玻片置于含有2%NaOH的玻片预处理液中浸泡20h,之后采用纯化水清洗2~8次;
②将黑玻片置于质量浓度为1%的硅烷溶液(介质为25%乙醇)中浸泡20min;
③将浸泡好的黑玻片氮气吹扫后放入烘箱中,于100℃条件下烘烤0.6h。
(2)抗原溶液点样;
参考图1,采用机器自动化点样MA抗原溶液、CAP抗原溶液、PCN抗原溶液、SAS抗原溶液、GM抗原溶,抗原溶液浓度为0.05mg/mL,每点点样20nL,各抗体点样分布如图1所示。
(3)封闭工艺;
将点样好的黑玻片没入封闭液(内含3%牛血清白蛋白的Tris缓冲液)中8h,之后取出黑玻片,并离心去除残余封闭液,制得所述蛋白芯片。
(4)试剂盒
将所述蛋白芯片、残留兽药的相应抗体溶液与标记有HRP酶的第二抗体溶液(浓度为1ug/ml,其中介质为外购的赛默飞公司的酶标二抗稀释液,pH=6.0)、样本稀释液(0.01MPBS PH-7.4)、检测液A(含1%鲁米诺和2%Tris)和检测液B(含1%过氧化氢)共同包装成试剂盒。
测试例:
使用本公司生产的SLXP-001型生物芯片阅读仪对兽药残留样本进行检测,SLXP-001型生物芯片阅读仪的工作过程如下:
仪器自动吸取100ul待测牛奶样本(特殊样本需用样本稀释液稀释)至反应杯中,仪器自动吸取100ul抗体溶液至反应杯中,然后仪器将本发明实施例制得的蛋白芯片自动地放入待测牛奶反应杯中,30℃孵育40分钟,随后仪器夹爪将芯片取出,经仪器自动冲洗后投入到标记有HRP酶的第二抗体溶液(200ul,仪器自动提前吸好),再次孵育40分钟后,仪器夹爪将芯片再次取出,经仪器自动冲洗后投入到发光底物溶液中(由100ul的检测液A和100ul的检测液B混合而成,由仪器自动吸取和混合),最后对蛋白芯片进行拍照成像,软件自动分析图片,给出分析结果。检测结果如表1、表2所示,参比值为HPLC的单指标测定。
表1
表2
由上表可见,本发明所提供的试剂盒,同时检测TMA、CAP、PCN、SAS、GM、TC六个指标,可以获得与单指标相似的结果,由于企业、检测机构、政府执法部门有自己判断阴阳性的标准,本发明对阴阳性不做判断。本实验采用HPLC作为参比试剂与芯片结果进行比较。使用本试剂盒可以实现高效率,简操作,低成本,用时短等多个优点,非常有助于及时,准确地通过检测结果发现牛奶是否含有哪种抗生素,及时的进行相应的处理。
Claims (8)
1.一种用于兽药残留检测的蛋白芯片,其特征在于所述蛋白芯片的制备方法包括如下步骤:
(1)黑玻片预处理;
(2)抗原溶液点样;
(3)封闭工艺,制得所述蛋白芯片。
2.根据权利要求1所述的蛋白芯片,其特征在于步骤(1)中所述黑玻片预处理的方法为:
①将黑玻片置于含有NaOH的玻片预处理液中浸泡16~24h,之后采用纯化水清洗2~8次;
②将黑玻片置于质量浓度为0.05~1%的硅烷溶液中浸泡20~60min;
③将浸泡好的黑玻片氮气吹扫后放入烘箱中,于100~180℃条件下烘烤0.2~0.6h。
3.根据权利要求1所述的蛋白芯片,其特征在于步骤(2)中所述抗原溶液包括MA抗原溶液、CAP抗原溶液、PCN抗原溶液、SAS抗原溶液、GM抗原溶液、TC抗原溶液。
4.根据权利要求1所述的蛋白芯片,其特征在于步骤(2)中所述点样的方法为机器自动化点样。
5.根据权利要求1所述的蛋白芯片,其特征在于步骤(3)中所述封闭过程为:将点样好的黑玻片没入封闭液中1~24h,之后取出黑玻片,并离心去除残余封闭液,制得所述蛋白芯片。
6.根据权利要求5所述的蛋白芯片,其特征在于所述封闭液为含有封闭蛋白的缓冲溶液;所述封闭蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白;所述缓冲液为PBS缓冲液、Tris缓冲液、HEPS缓冲液、MOPS缓冲液中的一种或多种。
7.一种权利要求1~6任一项所述蛋白芯片的应用,其特征在于将所述蛋白芯片制成试剂盒。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于所述试剂盒还包括标记有HRP酶或碱磷酶第二抗体溶液、兽药相对应的抗体溶液、对标记物敏感的化学发光底物。
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