CN102033102A - 高通量基质辅助激光解析-质谱法筛查奶类制品中β-内酰胺酶类解抗剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种奶类制品中β-内酰胺酶类解抗剂的高通量基质辅助激光解析-质谱法(MALDI-MS)检测与筛查方法，该分析方法基于检测β-内酰胺酶催化含β-内酰胺环的底物的开环反应过程，利用MALDI-MS方法，通过分析开环产物的生成量，来反映奶制品中可能含有的β-内酰胺酶量的高低，此处以活度单位计量。该方法中复杂奶制品样品的前处理步骤采用高速离心方法；通过β-内酰胺酶底物的开环产物量来反映奶制品中含有的β-内酰胺酶浓度；β-内酰胺酶底物的水解开环产物通过MALDI-MS方法进行分析。

Description

高通量基质辅助激光解析-质谱法筛查奶类制品中β-内酰胺酶类解抗剂 

技术领域

本发明涉及一种奶类制品中β-内酰胺酶类解抗剂的高通量基质辅助激光解析-质谱法(MALDI-MS)检测分析方法。 

技术背景

食品添加剂美化了食品外观、丰富了食品的类型和口味，同时也紧密影响着人们的生活。随着人类生活质量的提高，人们对食品安全的关注程度越来越高，食品添加剂的残留的检测也成为了一项国家法律所规定必须经过的流程，中华人民共和国食品安全法第二十八条规定“禁止生产经营下列食品：用非食品原料生产的食品或者添加食品添加剂以外的化学物质和其他可能危害人体健康物质的食品，或者用回收食品作为原料生产的食品(参见《中华人民共和国食品安全法》第二十八条)。三聚氰胺事件以后，人们谈“添”色变，开始质疑每一种食品添加剂的安全问题，国内各地相关部门也开始严厉打击各类违禁超标的食品添加。 

含有抗生素的牛奶对身体有害，一些奶农、奶站，为了达到原料奶的收购标准而使用“解抗剂”，“解抗剂”的主要活性成分为β-内酰胺酶，可以用来分解并掩蔽奶中残留的β-内酰胺抗生素。在乳制品生产加工之前，在含有抗生素的牛奶中只要添加解抗剂，就可以将不合格的有抗奶伪装成无抗奶。2009年3月9日，卫生部公布了《全国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项整治近期工作重点及要求》(卫监督发〔2009〕21号)，其中明确规定：乳及乳制品生产检查的重点是添加皮革水解物、三聚氰胺、β-内酰胺酶(解抗剂)、硫氰酸钠等非食品用物质及滥用增稠剂、香精、着色剂等违法行为，以及添加未经批准的进口食品原料或添加剂。正因为如此，GB6914-86《生鲜牛乳收购标准》修订版增加了11项检测指标，其中明确规定β-内酰胺类抗生素“不得”检出，并对检测方法和指标做出新规定(参见GB6914-86《生鲜牛乳收购标准》)。 

卫生部于2009年2月正式公布《食品中可能违法添加的非食用物质名单(第二批)》(参见卫生部、食品整治办〔2009〕5号《食品中可能违法添加的非食用 物质名单(第二批)》)，其中明确认定β-内酰胺酶是属于违法添加的非食用物质，其作用就是掩蔽抗生素。综上所述，β-内酰胺酶作为生鲜乳中的一种违法添加物已经引起了学术界及政府主管部门的重视并制定了初步的管理方案。2007年中国药品生物制品检定所崔生辉等学者2006年5～8月间分3次从北京零售市场上随机采集了5个厂家生产的38份牛奶样品中有63.12％(24/38)检出了β-内酰胺酶(参见中国食品卫生杂志.2007，19，113-116)。由此引发了政府部门、检测机构对于β-内酰胺酶残留问题的关注，同时崔生辉等学者建立起了“杯碟法”β-内酰胺酶残留检测体系。根据抑菌圈的出现与否可以定性判定β-内酰胺酶的残留情况，并根据该方法的敏感度设定其检出限为4U/mL。以此为依据，2009年3月卫生部下达了“关于印发全国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项整治抽检工作指导原则和方案的通知”，并以“杯碟法”为标准建立了β-内酰胺酶的残留定性检测方案。虽然国家明文规定β-内酰胺酶属于不安全食品添加剂，但是，由于细菌耐药产生的内源性β-内酰胺酶有300多种，内源性、外源性β-内酰胺酶的区别鉴定检测技术尚未见报道。目前β-内酰胺酶的活力测定可采用《中国药典》(2005版二部附录XIB)收载的“青霉素酶活力测定法”，各检测机构正在研究的乳制品中β-内酰胺酶的检测方法一般是采用化学仪器分析高效液相色谱法或微生物法(参见国外医药.抗生素分册，1995，16，409-414)。马洁，李孝君，薛颖.利用酸度计检测奶制品中残留的β-内酰胺酶.该方法在磷酸缓冲溶液(PBS)和牛奶中，对β-内酰胺酶的检出限分别为10U/mL和15U/mL，同时得到米氏常数为0.0351mmol/L(参见化学通报.2009，72，370-373)。目前的研究结果表明市售的成品鲜牛奶依然可以检测到残留的β-内酰胺酶，这也说明巴氏消毒法不能有效对β-内酰胺酶灭活，食用这些奶制品依然具有风险。 

因此，发展建立简便、快速、准确和灵敏度高的检测方法，检测牛奶中非法添加的β-内酰胺酶类解抗剂，将对保障饮用牛奶的卫生和安全具有重要意义。 

发明内容

本发明要解决的问题是：提供一种奶类制品中β-内酰胺酶类解抗剂的高通量基质辅助激光解析-质谱法(MALDI-MS)检测分析方法。 

本发明是这样实现的：基于β-内酰胺酶使青霉素(Penicillin G，PEN G) 等抗生素中的β-内酰胺环发生开环反应，应用基质辅助激光解析-质谱平台对底物青霉素水解产物的定性和相对定量研究，高通量筛查和定量分析牛奶中的β-内酰胺酶类解抗剂。 

一、底物 

本发明的检测分析方法是基于β-内酰胺酶以及β-内酰胺酶类解抗剂可以催化青霉素类抗生素，如以青霉素(Penicillin G，PEN G)为例，青霉素中的β-内酰胺环发生水解开环反应生成青霉噻唑酸(Penicilloic acid，PA)，水解开环反应式如下所示： 

在本发明的检测分析方法中，β-内酰胺酶类解抗剂的底物为结构中含有β-内酰胺环的化合物，如(-)-文斯内酯 

及各种β-内酰胺类抗生素：如青霉 

素类抗生素 

头孢菌素类抗生素 

头霉素类抗生素 

头孢菌素类抗生素 

单环β-内酰胺酶类类抗生素 

等。 

二、β-内酰胺类底物的酶催化的水解开环反应 

首先进行β-内酰胺类底物及其开环产物的质谱行为研究，在β-内酰胺酶的催化作用下，底物逐步转化为其相应的水解开环产物(分子量相对底物增加18)，在质谱图中表现为底物的质谱信号强度逐渐降低而开环产物质谱信号强度逐渐增强。同时可以利用傅立叶变换质谱的高分辨率和高质量准确性，对酶反应体系谱图中的离子进行进一步鉴定和结构确认，在此基础上确定可以代表底物及其开环产物的质谱信号。 

本发明的β-内酰胺类底物的酶催化的水解开环反应在如下条件进行：将β-内酰胺酶标准品溶液用10mmol·L^-1三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(pH 7.0)(Tris-HCl pH 7.0)逐级稀释至目标浓度。将β-内酰胺类抗生素原液用10mmol·L^-1Tris-HCl(pH 7.0)稀释成1.0mmol·L^-1的底物溶液。用于β-内酰胺酶催化的酶反应。将β-内酰胺类抗生素溶液与β-内酰胺酶溶液10μL混合，15℃-35℃下反应2-6h。将反应溶液直接进行MALDI-MS分析。 

MALDI-MS检测，激光能量控制在幅值的20～30％，过大谱图中出现较多碎片离子，过低样品难于离子化。质量扫描范围100～500Da。使用聚乙二醇PEG-200与PEG-400做质量校正。做质量校正时，PEG-200和PEG-400用甲醇/水(v/v＝1/1)溶液配成10μg·μL^-1溶液使用。点样采用常规的dried-droplet方法，以二羟基苯甲酸(DHB)溶于等体积比混合的水/甲醇溶液，配成150mg·mL^-1的溶液作为基质溶液，吸取1μL基质溶液点于样品靶上，自然风干后点1μL样品溶液，自然风干，将样品靶放入离子源进行高通量基质辅助激光解析-质谱法检测。 

三、样品前处理 

牛奶的成分非常复杂，是由水分、脂肪、蛋白质、乳糖、无机盐类、磷脂、维生素、酶、免疫相关因子、色素以及其它微量成分组成的悬浮液。牛乳中的大分子，如乳脂肪球、乳蛋白等都会干扰牛奶中β-内酰胺酶的检出。如何降低基质效应，提高牛奶中小分子化合物的检出灵敏度，是样品前处理步骤中需要重点考虑的问题。 

由于底物及其开环产物在水中都有着较好的溶解性，因此它们在牛奶中都会处于水相中。而牛奶中干扰这些小分子检出的，主要是那些不溶于水的物质，如牛奶中的大分子，如脂肪球，乳蛋白等。基于以上考虑，实验选择高速离心的方法来处理牛奶样品，尝试用这种简单的处理方法来提高待检测小分子的质谱检测灵敏度。当对稀释的牛奶样品进行10-25min的高速离心(室温下转速10000rpm)之后，样品分成3层，其中中间层为澄清的水相，上下两层为白色浑浊状态。上层为破碎的脂肪球中含有的甘油三酯，也就是奶油，因为较之水的密度小，浮于上层；下层则是密度较大的未破碎的脂肪球等。因此，直接对中间水相进行MALDI-MS分析。 

经所建立方法确定不含有β-内酰胺酶的牛奶样本作为空白对照。为了检测 牛奶中的β-内酰胺酶，将牛奶样本中加入β-内酰胺酶后，将牛奶与青霉素溶液(0.1-10mmol·L^-1)以体积比8∶1-2∶1混合，反应2-6小时后，对溶液进行处理后直接进行MALDI-MS分析。具体步骤是：移取400μL牛奶于0.6mL离心管中，分别加入6×10^-5，6×10^-4，6×10^-3，6×10^-2，6×10^-1U·mL^-1的β-内酰胺酶标准溶液100μL，得到系列浓度的强化β-内酰胺酶牛奶溶液。100μLPEN G(1mmol·L^-1)与上述6种牛奶溶液涡轮混旋20-40s后，25℃反应4h。将反应后的溶液室温下10000rpm转速离心10-25min。取中间的澄清溶液点样，进行MALDI-MS分析，MALDI-MS检测方法同前。 

四、牛奶中β-内酰胺酶类解抗剂的检测方法的建立与应用 

由于牛奶是一种非常复杂的基质，因此需要排除牛奶中含有能催化底物形成开环产物的物质存在的可能性。首先进行对照实验，排除这些可能的干扰。 

利用MALDI-MS方法，检测反应体系中的产物与底物，通过得到的相对丰度的比值，定量监测β-内酰胺酶催化的反应，从而用于研究反应的表观动力学以及对样品中是否含有β-内酰胺酶进行筛选。随着酶反应的进行，底物的信号逐渐降低，而其开环产物的信号逐渐增强。在不同时刻使用有机溶剂淬灭酶反应，通过质谱获得的体系中底物及其产物相对丰度比值的变化，便得到各个时刻底物的转化率，从而可以从表观上监测β-内酰胺酶的活性。 

用商品化的β-内酰胺标准酶评估后，在反应体系中加入新鲜生奶的稀释液，通过检测体系中底物的转化率高通量筛查出含有β-内酰胺酶的生奶样本，从而完成筛查方法的建立与应用。 

具体方法如下：将牛奶与青霉素溶液(0.1-10mmol·L^-1)以体积比8∶1-2∶1混合，混合反应2-6小时后，对溶液进行适当处理直接进行MALDI-MS分析。具体步骤是：移取400μL牛奶于0.6mL离心管中，加入100μL青霉素溶液(1mmol·L^-1)涡轮混旋20-40s后，25℃反应2-6h。将反应后的溶液室温下10000rpm转速离心10-25min。取中间的澄清溶液点样，进行MALDI-MS分析，MALDI-MS分析方法同前。 

五、巴氏消毒过程对β-内酰胺酶活性的影响 

生鲜牛奶(raw milk)极易遭到各种微生物污染而传染疾病，一旦处理不当，就会使人致病、致死。因此，生鲜奶需要经过“巴氏消毒”处理才能饮用。巴氏消毒法是将牛奶加热到一定温度并保持一定时间的破坏牛奶中微生物的一种方 法。通常，不法商贩是在巴氏消毒之前添加解抗剂，因此添加的β-内酰胺酶会经过巴氏消毒的一系列过程。为了将所建立的方法用于对市场上销售的巴氏消毒奶的直接检测，需要进一步考察巴氏消毒过程对β-内酰胺酶活性的影响。实验中分别采用两种消毒工艺对添加β-内酰胺酶的牛奶进行处理，并对其中β-内酰胺酶的活性进行测定。考察的巴氏消毒工艺有两种：低温长时间巴氏杀菌法(LTLT)与高温短时间杀菌法(HTST)。低温长时间(LTLT)巴氏杀菌法的具体的做法是将牛奶加热到62.8℃，保温30min，随即冷却到4℃。高温短时间杀菌法(HTST)是将牛奶于71.7℃，加热15-16s，随后再冷却到4℃。实验过程中选用较低的β-内酰胺酶添加浓度(6×10^-3U·mL^-1)进行测定。该酶浓度接近本方法检测限，因此，若β-内酰胺酶的活性稍有降低，则不能观察到生成的PA的质谱信号，如此可方便地得到β-内酰胺酶活性降低的数据。可以看出，尽管经过了加热冷却的一系列步骤，牛奶中的β-内酰胺酶活性没有明显降低，谱图中仍可得到生成的PA的质谱信号。该结果表明，本方法可以作为质量控制与食品安全控制的一种方法，直接对市售牛奶进行抽样检测，以维护消费者的合法权益。 

本发明包含一种简单快速的牛奶中β-内酰胺酶的MALDI-FTMS检测方法。复杂牛奶样品的前处理步骤采用高速离心方法，可以有效减少牛奶中干扰小分子检出的物质，如牛奶蛋白、脂肪球等。而且高速离心方法可以短时间内处理批量样品，可以满足该方法应用于实际检测的高通量要求。质谱的高分辨率和高质量准确性对于复杂样品中离子的检测与鉴定体现了其优越性，可排除复杂样品基质的干扰，使该方法可以扩展用于更为复杂的体系，如酸奶、奶酪等基质中β-内酰胺酶的检测。质谱仪器的高选择性，可以在检测β-内酰胺酶的同时，对牛奶样本中存在的其它残留进行检测，如抗生素等，无需额外的实验步骤。所建立的MALDI-FTMS方法实用性强，操作简单，试剂消耗少，可以作为一种可能的高通量筛选牛奶样本的方法。该方法在食品质量控制与监察中有着很好的应用前景。 

说明书附图 

图1：青霉素G标准品的MALDI-FTMS谱图； 

图2：青霉素G经β-内酰胺酶催化后反应产物PA的MALDI-FTMS质谱 图； 

图3：几种反应体系中进行的青霉素G的开环反应对比研究。 

其中，图3a：Tris-HCl缓冲液；图3b：添加β-内酰胺酶的缓冲液体系；图3c：牛奶样品；图3d：添加β-内酰胺酶的牛奶样品； 

图4：[PEN G+H]⁺与[PA+H-CO2]⁺的相对信号强度； 

其中，空白：体系；阴影：牛奶样本； 

图5：添加β-内酰胺酶浓度为6×10^-3U·mL^-1的牛奶催化青霉素反应体系的质谱图； 

图6：含β-内酰胺酶的牛奶催化的青霉素反应混合物的质谱图； 

其中，图6a牛奶样品未经处理；图6b：牛奶经低温长时间巴氏消毒处理；图6c：牛奶经高温短时间巴氏消毒处理。 

具体实施方法 

通过下述的具体实施方法将有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容。以青霉素G作为底物，建立牛奶中β-内酰胺酶的检测体系。 

β-内酰胺酶使青霉素(Penicillin G，PEN G)中的β-内酰胺环发生开环反应。青霉素G标准品的MALDI-FTMS谱图见图1，在图中可以观察到PEN G的质子加合峰(m/z 335.1)以及加钾离子的信号(m/z 373.1)，其中质子加合峰的强度最高。 

由于没有青霉噻唑酸的标准品，因此需要通过β-内酰胺酶的催化作用，将PEN G转化成PA再考察其质谱行为。PEN G向PA的转化，在质谱图中表现为质荷比m/z 335.1信号强度的降低而m/z 353.1信号强度的增强。图2中可以清楚地观察到质子化的青霉噻唑酸的信号m/z 353.1。此外，谱图中m/z 309的信号强度也较强。经过分析认为该质谱信号应该是青霉噻唑酸质子加合离子进一步丢失一分子二氧化碳(44Da)的加质子信号。 

将所建立的方法用于牛奶中β-内酰胺酶的检测。由于牛奶是一种非常复杂的基质，因此需要排除牛奶中含有能催化青霉素G形成青霉噻唑酸的物质存在的可能性。首先进行对照实验，排除这些可能的干扰，见图3，在所选实验条件下，青霉素G钠盐在Tris-HCl缓冲液中不会发生自身分解而得到青霉噻唑酸(图3a)。同样，青霉素G钠盐在空白牛奶中也不会发生自身分解而得到青霉噻唑酸 (图3c)，这也说明所购买的该牛奶样品中不含有β-内酰胺酶，可以作为空白对照。由图3b的比对可以看出，虽然溶液中所含的β-内酰胺酶的浓度一致，但是牛奶这样的复杂基质，会部分降低酶的活性，因此谱图中仍有未反应完全的青霉素G的信号。比较图3a和3c，直接检测牛奶中的青霉素，会由于牛奶体系的复杂性而降低待测物的检测灵敏度(图3c)。基于以上考察，确信实验中所使用的介质(包括牛奶及缓冲液)都不会导致青霉素G的转化，因此不会干扰测定。随之通过质谱检测与β-内酰胺酶催化的化学反应相关的小分子来确定该酶是否在牛奶中有残留。随着化学反应的进行，底物青霉素G逐渐消耗，而青霉噻唑酸逐渐生成。反映在质谱图中，即是随着反应的进行，青霉素G(m/z335.1)的质谱信号逐渐降低，而青霉噻唑酸(m/z 353.1)的信号强度逐渐增强。由此可通过简单的底物/产物的质谱信号强度比例来跟踪反应的进行情况。实验中分别考察了Tris-HCl缓冲溶液中以及牛奶中β-内酰胺酶的催化反应，并进行对比。从图4中可以看出，牛奶体系中PEN G/PA的质谱信号强度比值比缓冲溶液中的数值稍低，但是牛奶基质不会显著降低β-内酰胺酶的活性，这与前述的结论相同。随着反应时间的延长，孵育时间从2h到6h的反应过程中，PEN G/PA比值逐渐降低，显示出青霉素G向产物转化的反应趋势。该结果表明，可以通过质谱图中底物/产物的相对信号强度来对反应程度进行监测。如果底物与产物的结构类似，则可以认为两者的离子化效率相似，不通过加入内标，直接以两者比例来进行定量研究。 

由于不是直接检测β-内酰胺酶，因此这个量的确定取决于一定时间内生成的PA的量。只要牛奶中所含有的β-内酰胺酶在一定时间内催化生成足够多PA，并被MALDI-FTMS检测到，则可以检测该浓度的β-内酰胺酶。实验中配制一系列β-内酰胺酶添加浓度(6×10^-5，6×10^-4，6×10^-3，6×10^-2，6×10^-1U·mL^-1)的牛奶样品，用于催化青霉素G的反应。当牛奶中β-内酰胺酶的浓度为6×10^-3U·mL^-1时，仍可在质谱图中观察到PA的质谱信号(m/z 309.1和m/z 353.1)。其中将所用同种牛奶样品作为空白对照，未在其中发现PA的生成，表明该方法的结果可靠。文献报道使用酸度计方法[Huaxue Tongbao 2009，72(4)，370-373.]检测牛奶中β-内酰胺酶的检出限为15U·mL^-1，应用“杯碟法”[中国食品卫生杂志2007(02)，113-116]检测牛奶中β-内酰胺酶的检出限为4U·mL^-1，本方法较文献报道的检测灵敏度大大提高，可以检测出牛奶中更低浓度的B-内酰胺酶。若使用 更高浓度的青霉素，在不抑制PA信号的前提下，可以检测出更低浓度的β-内酰胺酶。市售解抗剂的主要成分β-内酰胺酶，一般的加入量为18mL·t^-1。按照解抗剂的推荐用量，实验中对牛奶样本添加市售解抗剂，以验证本方法对实际样本检测的可能性。结果发现，本方法的灵敏度可以达到检测实际样本中酶的检测要求。进一步将建立的方法用于实际样本的考察，筛选结果显示，从市场上随机购买的8个批次牛奶样品，其中一例为β-内酰胺酶阳性。 

生鲜牛奶(raw milk)极易遭到各种微生物污染而传染疾病，一旦处理不当，就会使人致病、致死。因此，生鲜奶需要经过“巴氏消毒”处理才能饮用。巴氏消毒法是将牛奶加热到一定温度并保持一定时间的破坏牛奶中微生物的一种方法。通常，不法商贩是在巴氏消毒之前添加解抗剂，因此添加的β-内酰胺酶会经过巴氏消毒的一系列过程。为了将所建立的方法用于对市场上销售的巴氏消毒奶的直接检测，需要进一步考察巴氏消毒过程对β-内酰胺酶活性的影响。实验中分别采用两种消毒工艺对添加β-内酰胺酶的牛奶进行处理，并对其中B-内酰胺酶的活性进行测定。实验过程中选用较低的B-内酰胺酶添加浓度(6×10^-3U·mL^-1)进行测定。该酶浓度接近本方法检测限，因此，若B-内酰胺酶的活性稍有降低，则不能观察到生成的PA的质谱信号，如此可方便地得到B-内酰胺酶活性降低的数据。可以看出，尽管经过了加热冷却的一系列步骤，牛奶中的B-内酰胺酶活性没有明显降低，谱图中仍可得到生成的PA的质谱信号。该结果表明，本方法可以作为质量控制与食品安全控制的一种方法，直接对市售牛奶进行抽样检测，以维护消费者的合法权益。 

Claims (5)

1.一种奶类制品中β-内酰胺酶类解抗剂的高通量基质辅助激光解析-质谱法检测分析方法，其特征是对β-内酰胺酶催化奶类制品中含β-内酰胺环底物进行开环反应过程的检测，通过高通量基质辅助激光解析-质谱法检测方法分析开环产物的相对生成量，来反映奶制品中含有的β-内酰胺酶量的高低；所述的β-内酰胺酶底物是文斯内酯、青霉素类抗生素、头孢菌素类抗生素、头霉素类抗生素或头孢菌素类抗生素。

2.根据权利要求1所述的奶类制品中β-内酰胺酶类解抗剂的高通量基质辅助激光解析-质谱法检测检测分析方法，其特征是将奶制品样品采用高速离心方法进行前处理；通过β-内酰胺酶底物的开环产物量来反映奶制品中含有的β-内酰胺酶浓度；β-内酰胺酶底物的开环产物通过高通量基质辅助激光解析-质谱法检测方法进行定性和相对定量分析；所述的β-内酰胺酶底物是文斯内酯、青霉素类抗生素、头孢菌素类抗生素、头霉素类抗生素或头孢菌素类抗生素。

3.如权利要求1或2所述的奶类制品中β-内酰胺酶类解抗剂的高通量基质辅助激光解析-质谱法检测检测分析方法，其特征是所述的β-内酰胺类底物的酶催化的水解开环反应，通过下述步骤实现：(1)将β-内酰胺酶标准品溶液用10mmol·L^-1Tris-HCl pH 7.0稀释至6×10^-5，6×10^-4，6×10^-3，6×10^-2，6×10^-1U·mL^-1；(2)将奶制品样品采用高速离心方法进行前处理，取中间层的含有β-内酰胺酶的底物用10mmol·L^-1Tris-HCl的pH 7.0缓冲液稀释成1.0mmol·L^-1的β-内酰胺酶底物溶液；(3)将上述(2)的含有β-内酰胺类抗生素的底物溶液与(1)的β-内酰胺酶溶液各10μL混合，15℃-35℃下反应2-6h；然后将反应溶液直接进行高通量基质辅助激光解析-质谱法检测检测；所述的Tris是三羟甲基氨基甲烷。

4.如权利要求2所述的奶类制品中β-内酰胺酶类解抗剂的高通量基质辅助激光解析-质谱法检测检测分析方法，其特征是所述的检测牛奶样本中的β-内酰胺酶时，将牛奶与青霉素溶液(0.1-10mmol·L^-1)以体积比8∶1-2∶1混合，25℃反应2-6h；将反应后的溶液室温下10000rpm转速离心10-25min；取转速离心后的中间的澄清溶液点样，直接进行高通量基质辅助激光解析-质谱法检测检测分析。

5.如权利要求1或2所述的高通量基质辅助激光解析-质谱法检测分析，其特征是所述的高通量基质辅助激光解析的激光能量控制在幅值的20～30％，质量扫描范围100～500Da；使用聚乙二醇PEG-200与PEG-400做质量校正，所述的PEG-200和PEG-400用v/v＝1/1的甲醇/水溶液配成10μg·μL^-1溶液使用；以二羟基苯甲酸(DHB)溶于等体积比混合的水/甲醇溶液，配成150mg·mL^-1的溶液作为基质溶液，吸取1μL基质溶液点于样品靶上，自然风干后点1μL样品溶液，自然风干，将样品靶放入离子源进行高通量基质辅助激光解析-质谱法检测。

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