CN104215686B - 一种应用于小肽分子定性定量分析检测和高通量筛选增强试剂盒及其制备 - Google Patents

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Abstract

一种应用于小肽分子定性定量分析检测和高通量筛选剂盒的制备，其特征在于，具体步骤如下：任一裂解液进行裂解制备样本，取上清后，加入同等体积的制备试剂QLP；充分混合；取溶液点在靶板上，通风处下静置后进样检测；QLP物质组成及体积比为：70‑90％离子水，10‑30％甲醇，1‑5％甲酸；此试剂盒制备方法简单、成本较低。

Description

一种应用于小肽分子定性定量分析检测和高通量筛选增强试 剂盒及其制备
技术领域
本技术属于分析化学应用领域，具体涉及表面激光解析质谱领域。
背景技术
表面激光解析质谱是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，其中以基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)为最重要的实例，此项发明获得过诺贝尔化学奖。主要由两部分组成：基质辅助激光解吸电离离子源(MALDI)和飞行时间质量分析器(TOF)。MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，在电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。因此它是一种软电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比(M/Z)与离子的飞行时间成正比，检测离子。MALDI-TOF-MS具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，为生命科学等领域提供了一种强有力的分析测试手段。
然而，以基质辅助激光解析电离飞行时间质谱为首的所有基于表面激光解析的质谱都需要将样品制备在特制靶板上面，其操作是将样品分散在基质分子中并形成晶体。当用激光照射晶体时，基质从激光中吸收能量，样品解吸附，基质-样品之间发生电荷转移使得样品分子电离，电离的样品在电场作用下飞过真空的飞行管，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即通过离子的质量电荷之比(M/Z)与离子的飞行时间成正比来分析离子，并测得样品分子的分子量。焦点问题就在于通用的基质分子的分子量在1000-3000da,造成了过量的背景质谱峰。这就决定了所有此类基于表面激光解析的质谱分析只能适用于大分子检测，比如蛋白质，长链多肽，核酸，高分子材料等等，而不能应用于小分子检测(分子量小于1000da)，或者说基于表面激光解析的质谱分析的高灵敏度/高通量等独特的优势无法施展在小分子分析检测上面.而分子量小于1000da的小分子却是对人类最重要的最具应用价值的一类化学产品，例如95％以上的药物小分子，所有的氨基酸，维生素等等和人类生活健康相关的化学物质。
目前现有技术针对小分子检测和筛选还停留在光谱法检测，例如荧光发光检测或者衍生出可以荧光检测的底物，但此类检测要求目标小分子分子结构具有光活性集团，另一弊端就是往往光度法灵敏度较低，检测不到微量的小分子浓度。液相质谱(LC-MS)及气相质谱(GC-MS)的已经开始应用在小分子的检测和高通量筛选。但需要消耗大量的人力和溶剂耗材，而且一个样品从制备到质谱分析再到出结果需要相当长一个过程，根据要求不同，分析一个样品从样品制备到拿到结果需要30-60分钟，远远不能满足现代生物医药发展的高通量筛选要求。
发明内容
发明目的：找到一种制备方法简单、成本较低的增强电离缓冲液制备方法，节省开支与时间。
技术方案：一种应用于小肽分子定性定量分析检测和高通量筛选增强电离缓冲液试剂盒，由将已裂解样本和同等体积的制备试剂QLP组成，QLP物质组成及体积比为：70-90％离子水，10-30％甲醇，1-5％甲酸。
一种应用于小肽分子定性定量分析检测和高通量筛选增强电离缓冲液试剂盒制备，具体步骤如下：任一裂解液进行裂解制备样本，取上清后，加入同等体积的制备试剂QLP；充分混合；取溶液点在靶板上，通风处下静置后进样检测；QLP物质组成及体积比为：70-90％离子水，10-30％甲醇，1-5％甲酸。
优选方案为：QLP物质组成及体积比为：90％离子水，10％甲醇，3％甲酸。
有益效果：1、制备方法简单；2、成本较低。
附图说明
图1利用本发明检测到的小肽分子质谱图
具体实施方式
本技术方法适合小肽分子，因为小肽分子结构上带有多个氨基，天然结合靶板，加上本发明的多肽分子曾强电离缓冲液，使得3000da以下分子量的小肽分子接近100％电离和气化飞向质谱检测器。
首先通过某种裂解方式制备样本，取上清后，加入同等体积的制备试剂QLP(70-90％离子水，10-30％甲醇，1-5％甲酸)。充分混合后，取0.5微升溶液点在靶板上，通风处下静置10分钟后进样即可。
我们做了以下实验来验证此方法：将牛血清白蛋白裂解样品进行分析，可以看到我们的发明技术可以检测到至少10种小肽分子，灵敏度高达纳纳摩尔每升的级别。而基质辅助激光解析电离飞行时间质谱并不能检测到任何小肽分子。如图1所示。

Claims (3)

1.一种基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测小肽分子的高通量筛选试剂盒，其特征在于，由将已裂解样本和同等体积的制备试剂QLP组成，QLP物质组成及体积比为：70-90％离子水，10-30％甲醇，1-5％甲酸。
2.权利要求1所述的一种基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测小肽分子的高通量筛选试剂盒的制备，其特征在于，具体步骤如下：任一裂解液进行裂解制备样本，取上清后，加入同等体积的制备试剂QLP；充分混合；取溶液点在靶板上，通风处下静置后进样检测；QLP物质组成及体积比为：70-90％离子水，10-30％甲醇，1-5％甲酸。
3.根据权利要求1所述的一种基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测小肽分子的高通量筛选试剂盒的制备，其特征在于，QLP物质组成及体积比为：90％离子水，10％甲醇，3％甲酸。
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CN102033102A (zh) * 2010-10-13 2011-04-27 中国科学院上海有机化学研究所 高通量基质辅助激光解析-质谱法筛查奶类制品中β-内酰胺酶类解抗剂

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Peptidomics of CNS-Associated Neurohemal Systems of Adult Drosophila melanogaster: A Mass Spectrometric Survey of Peptides from Individual Flies;REINHARD PREDEL et.al;《THE JOURNAL OF COMPARATIVE NEUROLOGY》;WILEY;20041231;第474卷;第379-392页 *
基质辅助激光解析电离质谱用于多肽和蛋白质亚硝基化修饰研究;曹冬等;《分析化学》;20090131;第37卷(第1期);第1-7页 *
基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱分析寡核苷酸G-四链体;宋玉玲等;《中国科学：化学》;20111231;第41卷(第1期);第75页2.2.1节 *
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱快速鉴定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌;宋宗科等;《卫生研究》;20110531;第40卷(第3期);第375-378页 *
液质联用在多肽及蛋白质定性方面的研究进展;范学海等;《生物技术通报》;20140626(第6期);第63页左栏 *
纳升超高效液相色谱-飞行时间质谱检测斑马鱼胚胎中小分子多肽的初步研究;杨寒朔等;《四川大学学报( 医学版)》;20071231;第38卷(第6期);第1.2.3节，第3节 *
适用小分子化合物MALDI分析的基质研究;张森等;《化学进展》;20131225;第26卷(第1期);159页引言部分 *
食品微生物检测和鉴定中应用的一种质谱新技术;吴多加等;《中华预防医学杂志》;20051231;第39卷(第5期);第361页正文左栏第1-2段 *

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