JP2022517161A - マイクロバイオータ関連代謝物の検出および定量のための質量分析検定法 - Google Patents
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Abstract
質量分析により、サンプル中の、下記からなる群から選択される１つまたは複数の分析物の量を決定する方法が記載されている：Ｎ－パルミトイルセリノール、インドールプロピオネート、インドール、トリプトファン、５－アミノバレレート、ピペコレート、Ｎ－アセチル－カダベリン、カダベリン、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、セロトニン、イミダゾールプロピオネート、イミダゾールラクテート、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、ファモチジン、クレゾール、３－インドキシルサルフェート、４－ヒドロキシフェニルアセテート、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート、ベンゾエート、フェニル酢酸、フェニルラクテート、ヒプラート、ラクテート、フェニルプロピオニルグリシン、フェニルアセチルグリシン、エチルフェニルサルフェート、フェノールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、ｐ－クレゾールグルクロニド、エンテロジオール、エンテロラクトン、エクオール、ダイゼイン、アピゲニン、ナリンゲニン、ゲニスタイン、デオキシコレート、リトコレート、タウロデオキシコレート、キシロース、ラフィノース、スタキオース、ジアミノピメレート、トリメチルアミン（ＴＭＡ）、３－フェニルプロピオネート、４－エチルフェノール、４－ヒドロキシフェニルラクテート、シンナメート、シンナモイルグリシン、フェノールグルクロニド、ウロリチンＡ、Ｎ－アセチルムラミネート、Ｎ－アセチルノイラミネート（シアル酸）、カテコールサルフェート、３－インドールラクテート、およびそれらの組み合わせ。この方法は、１つまたは複数の分析物のそれぞれから質量分析によって検出可能な１つまたは複数のイオンを生成するのに適した条件下で、サンプルをイオン化源に導入すること；質量分析によって、１つまたは複数の分析物のそれぞれからの１つまたは複数のイオンの量を測定すること；及び１つまたは複数のイオンの測定された量を使用して、サンプル中の１つまたは複数の分析物のそれぞれの量を決定すること、を含む。また、１つまたは複数の分析物のそれぞれの内部標準として１つまたは複数の同位体標識された類似体を含むキットについても記述する。
Description
背景
本発明の背景を説明するための以下の情報は、本発明の理解を支援するために提供され、本発明の先行技術を構成または説明することは認められていない。
本発明の背景を説明するための以下の情報は、本発明の理解を支援するために提供され、本発明の先行技術を構成または説明することは認められていない。
ミクロフローラの変化（すなわち、ミクロバイオーム組成の変化を含む腸内毒素症、または体内または体内の微生物の不均衡）およびその活動は、アレルギー、関節炎、喘息、自閉症、結腸癌、クロストリジウム・ディフィシル感染症、糖尿病、ＩＢＳ、肥満などの多くの慢性および退行性の病気に関連しており、現在、その要因であると考えられている。
ＤＮＡベースの技術における最近の進歩は、ヒトマイクロバイオームにおける多様性および豊富さの調査を可能にした。これらの技術を使用して、人体のさまざまな部位に恒久的に生息するすべての微生物に存在する遺伝子を特徴づける取り組みが進行中である。この仕事は、細菌の遺伝子機能と人間の健康におけるそれらの役割を解明することを目的としている。
微生物群集は、動物種（宿主）を含む種内および種間のコミュニケーションのために小分子に依存している。宿主と微生物の間のこれらのコミュニケーションが人間の健康に影響を与えるという証拠が増えており、健康への影響は有益または有害である可能性がある。ただし、これらの効果の根底にある微生物と宿主の相互作用はよく理解されていない。微生物および微生物関連分析物のレベルの変化を測定する能力は、宿主におけるマイクロバイオータ誘発性の変化および結果として生じる健康への影響の機構的詳細の指標を提供する可能性がある。さらに、マイクロバイオーム自体の健康状態についての洞察が得られる場合がある。したがって、微生物および微生物関連分析物のレベルを検出および測定する方法は、健康なマイクロバイオームを構成し、重要な満たされていない医療ニーズを表すものへの洞察を提供し得る。
本明細書に記載されているのは、対象におけるマイクロバイオータおよび宿主微生物相互作用の評価に有用な分析物の１つまたは複数、複数、またはパネルの検出および定量化のための方法である。これらの方法の結果により、少量のサンプル中のさまざまな構造的に多様な微生物およびマイクロバイオーム関連の分析物の定量測定が可能になる。代謝物検定は、質量分析法を使用して実行でき、検定またはパネルごとに１回のサンプル注入のみを必要とし、誘導体化を必要としない。
概要
本発明の第１の態様では、方法は、質量分析によるサンプル中の下記からなる群から選択される１つまたは複数の分析物からなる分析物のパネルの量を検出および決定することを含む：
Ｎ－パルミトイルセリノール、インドールプロピオネート、インドール、トリプトファン、５－アミノ吉草酸（バレレート）、ピペコレート、Ｎ－アセチル－カダベリン、カダベリン、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、セロトニン、イミダゾールプロピオネート（３－（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロピオン酸、デアミノ－ヒスチジン）、イミダゾールラクテート、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、ファモチジン、クレゾール、３－インドキシルサルフェート、４－ヒドロキシフェニルアセテート、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート、ベンゾエート、フェニル酢酸、フェニルラクテート、ヒプラート、ラクテート、フェニルプロピオニルグリシン、フェニルアセチルグリシン、エチルフェニルサルフェート、フェノールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、ｐ－クレゾールグルクロニド、エンテロジオール、エンテロラクトン、エクオール、ダイゼイン、アピゲニン、ナリンゲニン、ゲニスタイン、デオキシコレート、リトコレート、タウロデオキシコレート、キシロース、ラフィノース、スタキオース、ジアミノピメレート、トリメチルアミン（ＴＭＡ）、３－フェニルプロピオネート、４－エチルフェノール、４－ヒドロキシフェニルラクテート、シンナメート、シンナモイルグリシン、フェノールグルクロニド、ウロリチンＡ、Ｎ－アセチルムラミネート、Ｎ－アセチルノイラミネート（シアル酸）、カテコールサルフェート、３－インドールラクテート（インドールラクテート）、およびそれらの組み合わせ。一実施形態では、この方法は、１つまたは複数の分析物のそれぞれから質量分析によって検出可能な１つまたは複数のイオンを生成するのに適した条件下でサンプルをイオン化源に供することを含む。別の実施形態では、分析物は、イオン化の前に誘導体化されない。サンプルから分析物を抽出し、質量分析による検出の前に分析物をクロマトグラフィーで分離する方法も提供される。
本発明の第１の態様では、方法は、質量分析によるサンプル中の下記からなる群から選択される１つまたは複数の分析物からなる分析物のパネルの量を検出および決定することを含む：
Ｎ－パルミトイルセリノール、インドールプロピオネート、インドール、トリプトファン、５－アミノ吉草酸（バレレート）、ピペコレート、Ｎ－アセチル－カダベリン、カダベリン、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、セロトニン、イミダゾールプロピオネート（３－（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロピオン酸、デアミノ－ヒスチジン）、イミダゾールラクテート、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、ファモチジン、クレゾール、３－インドキシルサルフェート、４－ヒドロキシフェニルアセテート、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート、ベンゾエート、フェニル酢酸、フェニルラクテート、ヒプラート、ラクテート、フェニルプロピオニルグリシン、フェニルアセチルグリシン、エチルフェニルサルフェート、フェノールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、ｐ－クレゾールグルクロニド、エンテロジオール、エンテロラクトン、エクオール、ダイゼイン、アピゲニン、ナリンゲニン、ゲニスタイン、デオキシコレート、リトコレート、タウロデオキシコレート、キシロース、ラフィノース、スタキオース、ジアミノピメレート、トリメチルアミン（ＴＭＡ）、３－フェニルプロピオネート、４－エチルフェノール、４－ヒドロキシフェニルラクテート、シンナメート、シンナモイルグリシン、フェノールグルクロニド、ウロリチンＡ、Ｎ－アセチルムラミネート、Ｎ－アセチルノイラミネート（シアル酸）、カテコールサルフェート、３－インドールラクテート（インドールラクテート）、およびそれらの組み合わせ。一実施形態では、この方法は、１つまたは複数の分析物のそれぞれから質量分析によって検出可能な１つまたは複数のイオンを生成するのに適した条件下でサンプルをイオン化源に供することを含む。別の実施形態では、分析物は、イオン化の前に誘導体化されない。サンプルから分析物を抽出し、質量分析による検出の前に分析物をクロマトグラフィーで分離する方法も提供される。
本発明の第２の態様では、質量分析によってサンプル中の１つまたは複数の分析物の量を決定するための方法が記載されている。１つまたは複数の分析物は、下記からなる群から選択される：Ｎ－パルミトイルセリノール、インドールプロピオネート、インドール、トリプトファン、５－アミノ吉草酸、ピペコレート、Ｎ－アセチル－カダベリン、カダベリン、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、セロトニン、プロピオン酸イミダゾール（イミダゾールプロピオネート）、乳酸イミダゾール（イミダゾールラクテート）、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、ファモチジン、クレゾール、３－インドキシルサルフェート、４－ヒドロキシフェニルアセテート、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート、ベンゾエート、フェニル酢酸、フェニルラクテート、ヒプラート、ラクテート、フェニルプロピオニルグリシン、フェニルアセチルグリシン、エチルフェニルサルフェート、フェノールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、ｐ－クレゾールグルクロニド、エンテロジオール、エンテロラクトン、エクオール、ダイゼイン、アピゲニン、ナリンゲニン、ゲニスタイン、デオキシコレート、リトコレート、タウロデオキシコレート、キシロース、ラフィノース、スタキオース、ジアミノピメレート、トリメチルアミン（ＴＭＡ）、３－フェニルプロピオネート、４－エチルフェノール、４－ヒドロキシフェニルラクテート、シンナメート、シンナモイルグリシン、フェノールグルクロニド、ウロリチンＡ、Ｎ－アセチルムラミネート、Ｎ－アセチルノイラミネート（シアル酸）、カテコールサルフェート、３－インドールラクテート、およびそれらの組み合わせ。この工程は、１つまたは複数の分析物のそれぞれから質量分析によって検出可能な１つまたは複数のイオンを生成するのに適した条件下でサンプルをイオン化源に導入すること（分析物はイオン化の前に誘導体化されない）；質量分析によって、１つまたは複数の分析物のそれぞれからの１つまたは複数のイオンの量を測定すること；そして、１つまたは複数のイオンの測定された量を使用して、サンプル中の１つまたは複数の分析物のそれぞれの量を決定すること、を含む。この態様の１つの特徴において、質量分析はタンデム質量分析である。態様の別の特徴において、複数の分析物のそれぞれの量を決定するために使用される１つ以上のイオンは、表３、４、および５のイオンから選択される１つ以上のイオンである。態様の別の特徴において、１つまたは複数の分析物のうちの１つが、Ｎ－パルミトイルセリノールを含む時、１つ以上のイオンは、３３０．３±０．５、３１２．１±０．５、２３９．１±０．５、１４９．１±０．５、１３９．１±０．５、９２．１±０．５、および７４．１±０．５の質量対電荷比を有するイオンからなる群から選択される１つ以上のイオンを含む。
第１および第２の態様の特徴において、１つまたは複数の分析物は、Ｎ－パルミトイルセリノール、インドールプロピオネート、インドール、トリプトファン、５－アミノバレレート、ピペコレート、Ｎ－アセチル－カダベリン、カダベリン、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、セロトニン、プロピオン酸イミダゾール、乳酸イミダゾール、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、ファモチジン、ジアミノピメリン酸、およびトリメチルアミン（ＴＭＡ）からなる群から選択され、および１つまたは複数の分析物の量が１回の注入で決定される。この機能に関して、イオン化源は正イオン化モードで動作する。
別の特徴において、１つまたは複数の分析物は、クレゾール、３－インドキシルサルフェート、４－ヒドロキシフェニルアセテート、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート、ベンゾエート、フェニル酢酸、フェニルラクテート、ヒプラート、ラクテート、フェニルプロピオニルグリシン、フェニルアセチルグリシン、エチルフェニルサルフェート、フェノールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、ｐ－クレゾールグルクロニド、エンテロジオール、エンテロラクトン、エクオール、ダイゼイン、アピゲニン、ナリンゲニン、ゲニスタイン、デオキシコレート、リトコレート、タウロデオキシコレート、３－フェニルプロピオネート、４－エチルフェノール、４－ヒドロキシフェニルラクテート、シンナメート、シンナモイルグリシン、フェノールグルクロニド、およびウロリチンＡからなる群から選択され、および１つまたは複数の分析物の量が１回の注入で決定される。この機能に関して、イオン化源は負イオン化モードで動作する。
別の特徴において、１つまたは複数の分析物は、キシロース、ラフィノース、スタキオース、Ｎ－アセチルムラミネート、およびＮ－アセチルノイラミネート（シアル酸）からなる群から選択され、および１つまたは複数の分析物の量は、１回の注入で決定される。この機能に関して、イオン化源は負イオン化モードで動作する。
別の特徴において、１つまたは複数の分析物は、カテコールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、エチルフェニルサルフェート、インドールラクテート、インドールプロピオネート、およびインドキシルサルフェートからなる群から選択され、および１つまたは複数の分析物の量は、１回の注入で決定される。この機能に関して、イオン化源は負イオン化モードで動作する。
別の特徴では、分析物はトリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）であり、分析物の量は１回の注入で決定される。この機能に関して、イオン化源は正イオン化モードで動作する。
別の特徴において、サンプルは、イオン化源に導入される前に、液体クロマトグラフィーによって精製されている。この特徴に関して、液体クロマトグラフィーは、高速液体クロマトグラフィー、超高速液体クロマトグラフィー、および乱流液体クロマトグラフィーからなる群から選択される。この特徴に関してさらに、サンプルは、イオン化源に導入される前に、高速液体クロマトグラフィーまたは超高速液体クロマトグラフィーのいずれかによって精製される。
さらなる特徴において、複数の分析物のうちの２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、または７つ以上の量が決定される。
別の特徴において、Ｎ－パルミトイルセリノールおよび下記からなる群から選択される１つ以上の分析物の量が測定される：インドールプロピオネート、インドール、トリプトファン、５－アミノ吉草酸、ピペコレート、Ｎ－アセチル－カダベリン、カダベリン、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）、ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、セロトニン、プロピオン酸イミダゾール、乳酸イミダゾール、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、ファモチジン、クレゾール、３－インドキシルサルフェート、４－ヒドロキシフェニルアセテート、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート、ベンゾエート、フェニル酢酸、フェニルラクテート、ヒプラート、ラクテート、フェニルプロピオニルグリシン、フェニルアセチルグリシン、エチルフェニルサルフェート、フェノールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、ｐ－クレゾールグルクロニド、エンテロジオール、エンテロラクトン、エクオール、ダイゼイン、アピゲニン、ナリンゲニン、ゲニスタイン、デオキシコレート、リトコレート、タウロデオキシコレート、キシロース、ラフィノース、スタキオース、ジアミノピメレート、トリメチルアミン（ＴＭＡ）、３－フェニルプロピオネート、４－エチルフェノール、４－ヒドロキシフェニルラクテート、シンナメート、シンナモイルグリシン、フェノールグルクロニド、ウロリチンＡ、Ｎ－アセチルムラミネート、Ｎ－アセチルノイラミネート（シアル酸）、カテコールサルフェート、および３－インドールラクテート。
さらに別の特徴において、複数の分析物の第１の１つ以上の分析物は、下記からなる群から選択され：Ｎ－パルミトイルセリノール、インドールプロピオネート、インドール、トリプトファン、５－アミノ吉草酸、ピペコレート、Ｎ－アセチル－カダベリン、カダベリン、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、セロトニン、プロピオン酸イミダゾール、乳酸イミダゾール、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、ファモチジン、ジアミノピメレート、およびトリメチルアミン（ＴＭＡ）、および複数の分析物の第１の１つまたは複数の分析物が１回の注入で測定される。複数の分析物のうちの第２の１つ以上の分析物は、下記からなる群から選択され：クレゾール、３－インドキシルサルフェート、４－ヒドロキシフェニルアセテート、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート、ベンゾエート、フェニル酢酸、フェニルラクテート、ヒプラート、ラクテート、フェニルプロピオニルグリシン、フェニルアセチルグリシン、エチルフェニルサルフェート、フェノールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、ｐ－クレゾールグルクロニド、エンテロジオール、エンテロラクトン、エクオール、ダイゼイン、アピゲニン、ナリンゲニン、ゲニスタイン、デオキシコレート、リトコレート、タウロデオキシコレート、３－フェニルプロピオネート、４－エチルフェノール、４－ヒドロキシフェニルラクテート、シンナメート、シンナモイルグリシン、フェノールグルクロニド、およびウロリチンＡ、および複数の分析物の第２の１つまたは複数の分析物が１回の注入で測定される。この特徴に関して、複数の分析物のうちの第３の１つまたは複数の分析物は、キシロース、ラフィノース、スタキオース、Ｎ－アセチルムラミネート、およびＮ－アセチルノイラミネート（シアル酸）からなる群から選択され、複数の分析物のうちの第３の１つまたは複数の分析物が、単一の注入で決定される。
別の特徴では、１つまたは複数の内部標準を使用して、サンプル中の１つまたは複数の分析物のそれぞれの量を決定する。この特徴に関して、１つまたは複数の内部標準のうちの少なくとも１つは、測定される１つまたは複数の分析物のうちの少なくとも１つの同位体標識された類似体を含む。この特徴に関してさらに、１つまたは複数の内部標準のうちの少なくとも１つは、下記からなる群から選択される：Ｎ－パルミトイルセリノール－ｄ３、トリメチルアミンＮ－オキシド－１３Ｃ３、３－インドールプロピオネート－ｄ２、インドール－ｄ７、Ｎ－アセチルカダベリン－ｄ３、５－アミノ吉草酸－ｄ４、カダベリン－ｄ４、ファモチジン－１３Ｃ３、ガンマ－アミノ酪酸－ｄ６、セロトニン－ｄ４、ピペコール酸－ｄ９、イミダゾールプロピオン酸－ｄ３、イミダゾール乳酸－ｄ３、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）－ｄ３、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）－ｄ３、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）－ｄ４、トリプトファン－ｄ５、ｐ－クレゾール－ｄ７、安息香酸－ｄ５、ヒプラート－ｄ５、４－ヒドロキシフェニル酢酸－ｄ６、３－フェニルラクテート－ｄ５、（４－ヒドロキシフェニル）－２－プロピオン酸－ｄ６、ナリンゲニン－ｄ３、（３－フェニルプロピオニル）グリシン－１３Ｃ２，１５Ｎ１、フェニルアセチルグリシン－ｄ５、ｐ－クレゾールサルフェート－ｄ７、エンテロジオール－ｄ６、エンテロラクトン－ｄ６、フェノールサルフェート－ｄ３、ダイゼイン－ｄ４、アピゲニン－ｄ５、ｐ－クレゾールグルクロニド－ｄ７、ゲニスタイン－ｄ４、エチルフェニルサルフェート－ｄ４、エクオール－ｄ４、３－インドキシルサルフェート－１３Ｃ６、フェニル酢酸－ｄ７、デオキシコール酸－ｄ４、リトコール酸－ｄ４、タウロデオキシコール酸－ｄ５、乳酸－ｄ４、キシロース－１３Ｃ５、ラフィノース－ｄ９、スタキオース－ｄ７、ジアミノピメリン酸－１３Ｃ７，１５Ｎ２、トリメチルアミン－１３Ｃ３、ヒドロ桂皮－ｄ５酸、４－エチルフェノール－２，３，５，６－ｄ４，ＯＤ、４ －ヒドロキシフェニルラクテート－ｄ２、桂皮－ｄ５酸、シンナモイルグリシン－２，２－ｄ２、フェノールグルクロニド－ｄ５、ウロリチンＢ－１３Ｃ６、Ｎ－アセチルムラミン酸－ｄ３、Ｎ－アセチル－Ｄ－ノイラミン酸－１，２，３－１３Ｃ３、カテコールサルフェート－１３Ｃ６、およびインドールラクテート－ｄ５。
本発明の第３の態様では、キットは、下記からなる群から選択される１つまたは複数の分析物のそれぞれの内部標準として、１つまたは複数の同位体標識類似体、およびパッケージ材料とキットの使用説明書を含む：Ｎ－パルミトイルセリノール、インドールプロピオネート、インドール、トリプトファン、５－アミノ吉草酸、ピペコレート、Ｎ－アセチル－カダベリン、カダベリン、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、セロトニン、プロピオン酸イミダゾール、乳酸イミダゾール、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、ファモチジン、クレゾール、３－インドキシルサルフェート、４－ヒドロキシフェニルアセテート、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート、ベンゾエート、フェニル酢酸、フェニルラクテート、ヒプラート、ラクテート、フェニルプロピオニルグリシン、フェニルアセチルグリシン、エチルフェニルサルフェート、フェノールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、ｐ－クレゾールグルクロニド、エンテロジオール、エンテロラクトン、エクオール、ダイゼイン、アピゲニン、ナリンゲニン、ゲニスタイン、デオキシコレート、リトコレート、タウロデオキシコレート、キシロース、ラフィノース、スタキオース、ジアミノピメレート、トリメチルアミン（ＴＭＡ）、３－フェニルプロピオネート、４－エチルフェノール、４－ヒドロキシフェニルラクテート、シンナメート、シンナモイルグリシン、フェノールグルクロニド、ウロリチンＡ、Ｎ－アセチルムラミネート、Ｎ－アセチルノイラミネート（シアル酸）、カテコールサルフェート、および３－インドールラクテートとそれらの組み合わせ。この特徴に関して、内部標準は、下記からなる群から選択される１つまたは複数の内部標準を含む：Ｎ－パルミトイルセリノール－ｄ３、トリメチルアミンＮ－オキシド－１３Ｃ３、３－インドールプロピオネート－ｄ２、インドール－ｄ７、Ｎ－アセチルカダベリン－ｄ３、５－アミノ吉草酸－ｄ４、カダベリン－ｄ４、ファモチジン－１３Ｃ３、ガンマ－アミノ酪酸－ｄ６、セロトニン－ｄ４、ピペコール酸－ｄ９、イミダゾールプロピオン酸－ｄ３、イミダゾール乳酸－ｄ３、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）－ｄ３、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）－ｄ３、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）－ｄ４、トリプトファン－ｄ５、ｐ－クレゾール－ｄ７、安息香酸－ｄ５、ヒプラート－ｄ５、４－ヒドロキシフェニル酢酸－ｄ６、３－フェニルラクテート－ｄ５、（４－ヒドロキシフェニル）－２－プロピオン酸－ｄ６、ナリンゲニン－ｄ３、（３－フェニルプロピオニル）グリシン－１３Ｃ２，１５Ｎ１、フェニルアセチルグリシン－ｄ５、ｐ－クレゾールサルフェート－ｄ７、エンテロジオール－ｄ６、エンテロラクトン－ｄ６、フェノールサルフェート－ｄ３、ダイゼイン－ｄ４、アピゲニン－ｄ５、ｐ－クレゾールグルクロニド－ｄ７、ゲニスタイン－ｄ４、エチルフェニルサルフェート－ｄ４、エクオール－ｄ４、３－インドキシルサルフェート－１３Ｃ６、フェニル酢酸－ｄ７、デオキシコール酸－ｄ４、リトコール酸－ｄ４、タウロデオキシコール酸－ｄ５、乳酸－ｄ４、キシロース－１３Ｃ５、ラフィノース－ｄ９、スタキオース－ｄ７、ジアミノピメリン酸－１３Ｃ７，１５Ｎ２、トリメチルアミン－１３Ｃ３、ヒドロ桂皮－ｄ５酸、４－エチルフェノール－２，３，５，６－ｄ４，ＯＤ、４－ヒドロキシフェニルラクテート－ｄ２、桂皮－ｄ５酸、シンナモイルグリシン－２，２－ｄ２、フェノールグルクロニド－ｄ５、ウロリチンＢ－１３Ｃ６、Ｎ－アセチルムラミン酸－ｄ３、Ｎ－アセチル－Ｄ－ノイラミン酸－１，２，３－１３Ｃ３、およびそれらの組み合わせ。
第３の態様の特徴において、１つまたは複数の分析物は、下記からなる群から選択される：Ｎ－パルミトイルセリノール、インドールプロピオネート、インドール、トリプトファン、５－アミノバレレート、ピペコレート、Ｎ－アセチル－カダベリン、カダベリン、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、セロトニン、プロピオン酸イミダゾール、乳酸イミダゾール、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、ファモチジン、ジアミノピメレート、トリメチルアミン（ＴＭＡ）、およびそれらの組み合わせ。この特徴に関して、内部標準は、下記からなる群から選択される１つまたは複数の内部標準を含む：Ｎ－パルミトイルセリノール－ｄ３、３－インドールプロピオネート－ｄ２、インドール－ｄ７、トリプトファン－ｄ５、５－アミノ吉草酸－ｄ４、ピペコール酸－ｄ９、Ｎ－アセチルカダベリン－ｄ３、カダベリン－ｄ４、トリメチルアミンＮ－オキシド－１３Ｃ３、ガンマアミノ酪酸－ｄ６、セロトニン－ｄ４、イミダゾールプロピオン酸－ｄ３、イミダゾール乳酸－ｄ３、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）－ｄ３、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）－ｄ３、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）－ｄ４、ファモチジン－１３Ｃ３、ジアミノピメリン酸－１３Ｃ７，１５Ｎ２、トリメチルアミン－１３Ｃ３、カテコールサルフェート－１３Ｃ６、インドールラクテート－ｄ５、およびそれらの組み合わせ。
別の特徴において、１つまたは複数の分析物は、下記からなる群から選択される：クレゾール、３－インドキシルサルフェート、４－ヒドロキシフェニルアセテート、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート、ベンゾエート、フェニル酢酸、フェニルラクテート、ヒプラート、ラクテート、フェニルプロピオニルグリシン、フェニルアセチルグリシン、エチルフェニルサルフェート、フェノールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、ｐ－クレゾールグルクロニド、エンテロジオール、エンテロラクトン、エクオール、ダイゼイン、アピゲニン、ナリンゲニン、ゲニスタイン、デオキシコレート、リトコレート、タウロデオキシコレート、３－フェニルプロピオネート、４－エチルフェノール、４ －ヒドロキシフェニルラクテート、シンナメート、シンナモイルグリシン、フェノールグルクロニド、およびウロリチンＡ、およびそれらの組み合わせ。この特徴に関して、内部標準は、下記からなる群から選択される１つまたは複数の内部標準を含む：ｐ－クレゾール－ｄ７、３－インドキシルサルフェート－１３Ｃ６、４－ヒドロキシフェニル酢酸－ｄ６、（４－ヒドロキシフェニル）－２－プロピオン酸－ｄ６、安息香酸－ｄ５、フェニル酢酸－ｄ７、３－フェニルラクテート－ｄ５、ヒプラートｄ５、乳酸－ｄ４、（３－フェニルプロピオニル）グリシン－１３Ｃ２，１５Ｎ１、フェニルアセチルグリシン－ｄ５、エチルフェニルサルフェート－ｄ４、フェノールサルフェート－ｄ３、ｐ－クレゾールサルフェート－ｄ７、ｐ－クレゾールグルクロニド－ｄ７、エンテロジオール－ｄ６、エンテロラクトン－ｄ６、エクオール－ｄ４、ダイゼイン－ｄ４、アピゲニン－ｄ５、ナリンゲニン－ｄ３、ゲニスタイン－ｄ４、デオキシコール酸－ｄ４、リトコール酸－ｄ４、タウロデオキシコール酸－ｄ５、ヒドロ桂皮－ｄ５酸、４－エチルフェノール－２，３，５，６－ｄ４，ＯＤ、４－ヒドロキシフェニルラクテート－ｄ２、桂皮－ｄ５酸、シンナモイルグリシン－２，２－ｄ２、フェノールグルクロニド－ｄ５、ウロリチンＢ－１３Ｃ６、およびそれらの組み合わせ。
さらに別の特徴において、１つまたは複数の分析物は、下記からなる群から選択される：キシロース、ラフィノース、スタキオース、Ｎ－アセチルムラミネート、およびＮ－アセチルノイラミネート（シアル酸）、ならびにそれらの組み合わせ。この特徴に関して、内部標準は、下記からなる群から選択される１つまたは複数の内部標準を含む：キシロース－１３Ｃ５、ラフィノース－ｄ９、スタキオース－ｄ７、Ｎ－アセチルムラミン酸－ｄ３、Ｎ－アセチル－Ｄ－ノイラミン酸－１，２，３－１３Ｃ３、およびそれらの組み合わせ。
さらに別の特徴において、１つまたは複数の分析物は、カテコールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、エチルフェニルサルフェート、インドールラクテート、インドールプロピオネート、インドキシルサルフェート、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。この特徴に関して、内部標準は、カテコールサルフェート－１３Ｃ６、ｐ－クレゾールサルフェート－ｄ７、エチルフェニルサルフェート－ｄ４、インドールラクテート－ｄ５、インドールプロピオネート－ｄ２、３－インドキシルサルフェート－１３Ｃ６、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の内部標準を含む。
さらに別の特徴において、分析物はトリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）である。この機能に関して、内部標準はトリメチルアミンＮ－オキシド－１３Ｃ３を含む。
第３の態様の別の特徴において、１つまたは複数の分析物は、下記からなる群から選択される：Ｎ－アセチル－カダベリン、５－アミノ吉草酸、プロピオン酸イミダゾール、β－イミダゾール乳酸、Ｎ－パルミトイルセリノール、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート、ナリンゲニン、フェノールサルフェート、エチルフェニルサルフェート、ラフィノース、スタキオース、４－ヒドロキシフェニルラクテート、フェノールグルクロニド、Ｎ－アセチルムラミネート、カテコールサルフェート、およびそれらの組み合わせ。この特徴に関して、１つまたは複数の内部標準は、下記からなる群から選択される：Ｎ－アセチル－カダベリン－ｄ３、５－アミノ吉草酸－ｄ４、プロピオン酸イミダゾール－ｄ３、β－イミダゾール乳酸－ｄ３、Ｎ－パルミトイルセリノール－ｄ３、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）－ｄ３、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）－ｄ３、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）－ｄ４、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート－ｄ６、ナリンゲニン－ｄ３ナトリウム塩、フェノールサルフェート－ｄ３、エチルフェニルサルフェート－ｄ４、ラフィノース－ｄ９、スタキオース－ｄ７、４－ヒドロキシフェニルラクテート－ｄ２、フェノールグルクロニド－ｄ５、Ｎ－アセチルムラミン酸－ｄ３、カテコールサルフェート－１３Ｃ６、およびそれらの組み合わせ。
図面の簡単な説明
図１Ａ－図１Ｂは、クロマトグラフィー法１を使用して１回の注入で精製および分離された、Ｎ－アセチル－カダベリン、プロピオン酸イミダゾール、ピペコレート、インドール、５－アミノ吉草酸、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、カダベリン、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）、ファモチジン、Ｎ－パルミトイルセリノール、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、トリプトファン、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、インドールプロピオネート、セロトニン、および乳酸イミダゾールのクロマトグラムの例を示す。
図１Ｂの説明は、図１Ａの上記説明と同じ。
詳細な記述
下記からなる代謝物の群から選択される１つ以上の分析物または複数の分析物の量を測定するための方法が記載される：Ｎ－パルミトイルセリノール、インドールプロピオネート、インドール、トリプトファン、５－アミノ吉草酸、ピペコレート、Ｎ－アセチル－カダベリン、カダベリン、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、セロトニン、プロピオン酸イミダゾール、乳酸イミダゾール、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、ファモチジン、クレゾール、３－インドキシルサルフェート、４－ヒドロキシフェニルアセテート、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート、ベンゾエート、フェニル酢酸、フェニルラクテート、ヒプラート、ラクテート、フェニルプロピオニルグリシン、フェニルアセチルグリシン、エチルフェニルサルフェート、フェノールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、ｐ－クレゾールグルクロニド、エンテロジオール、エンテロラクトン、エクオール、ダイゼイン、アピゲニン、ナリンゲニン、ゲニスタイン、デオキシコレート、リトコレート、タウロデオキシコレート、キシロース、ラフィノース、スタキオース、ジアミノピメレート、トリメチルアミン（ＴＭＡ）、３－フェニルプロピオネート、４－エチルフェノール、４－ヒドロキシフェニルラクテート、シナメート、シナモイルグリシン、フェノールグルクロニド、ウロリチンＡ、Ｎ－アセチルムラミネート、Ｎ－アセチルノイラミネート（シアル酸）、カテコールサルフェート、３－インドールラクテート、およびそれらの組み合わせ。質量分析法は、単一（１回）の注入法を使用して、サンプル中の単一および多数（複数）の分析物を定量化するために説明されている。複数の分析物が定量化される例では、分析物は「パネル」または「分析物のパネル」と呼ばれ得る。一例では、パネルは、下記からなる群から選択される複数の分析物を含み得る：Ｎ－パルミトイルセリノール、インドールプロピオネート、インドール、トリプトファン、５－アミノバレレート、ピペコレート、Ｎ－アセチル－カダベリン、カダベリン、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、セロトニン、プロピオン酸イミダゾール、乳酸イミダゾール、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、ファモチジン、クレゾール、３－インドキシルサルフェート、４－ヒドロキシフェニルアセテート、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート、ベンゾエート、フェニル酢酸、フェニルラクテート、ヒプラート、ラクテート、フェニルプロピオニルグリシン、フェニルアセチルグリシン、エチルフェニルサルフェート、フェノールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、ｐ－クレゾールグルクロニド、エンテロジオール、エンテロラクトン、エクオール、ダイゼイン、アピゲニン、ナリンゲニン、ゲニスタイン、デオキシコレート、リトコレート、タウロデオキシコレート、キシロース、ラフィノース、スタキオース、ジアミノピメレート、トリメチルアミン（ＴＭＡ）、３－フェニルプロピオネート、４－エチルフェノール、４－ヒドロキシフェニルラクテート、シンナメート、シンナモイルグリシン、フェノールグルクロニド、ウロリチンＡ、Ｎ－アセチルムラミネート、Ｎ－アセチルノイラミネート（シアル酸）、カテコールサルフェート、３－インドールラクテート、およびそれらの組み合わせ。別の例では、パネルは、下記からなる群から選択される複数の分析物を含み得る：Ｎ－パルミトイルセリノール、インドールプロピオネート、インドール、トリプトファン、５－アミノバレレート、ピペコレート、Ｎ－アセチル－カダベリン、カダベリン、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）、ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、セロトニン、プロピオン酸イミダゾール、乳酸イミダゾール、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、ファモチジン、ジアミノピメリン酸、トリメチルアミン（ＴＭＡ）、およびそれらの組み合わせ。さらに別の例では、パネルは、下記からなる群から選択される複数の分析物を含み得る：クレゾール、３－インドキシルサルフェート、４－ヒドロキシフェニルアセテート、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート、ベンゾエート、フェニル酢酸、フェニルラクテート、ヒプラート、ラクテート、フェニルプロピオニルグリシン、フェニルアセチルグリシン、エチルフェニルサルフェート、フェノールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、ｐ－クレゾールグルクロニド、エンテロジオール、エンテロラクトン、エクオール、ダイゼイン、アピゲニン、ナリンゲニン、ゲニスタイン、デオキシコレート、リトコレート、タウロデオキシコレート、３－フェニルプロピオネート、４－エチルフェノール、４－－ヒドロキシフェニルラクテート、シンナメート、シンナモイルグリシン、フェノールグルクロニド、ウロリチンＡ、およびそれらの組み合わせ。さらに別の例では、パネルは、キシロース、ラフィノース、スタキオース、Ｎ－アセチルムラミネート、Ｎ－アセチルノイラミネート（シアル酸）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される複数の分析物を含み得る。別の例では、パネルは、カテコールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、エチルフェニルサルフェート、インドールラクテート、インドールプロピオネート、インドキシルサルフェート、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される複数の分析物を含み得る。この方法は、例えば、質量分析の方法と組み合わせた選択された分析物の分離（精製、濃縮）を実行するために、ＬＣ（液体クロマトグラフィー）、ＵＰＬＣ（超高速液体クロマトグラフィー）またはＨＩＬＩＣ（親水性相互作用クロマトグラフィー）などの液体クロマトグラフィー工程を使用する精製または濃縮工程を含み得る。本明細書に記載の方法の利点は、サンプル中の複数の分析物を定量化するための自動化に適したハイスループット検定システムの提供である。
下記からなる代謝物の群から選択される１つ以上の分析物または複数の分析物の量を測定するための方法が記載される：Ｎ－パルミトイルセリノール、インドールプロピオネート、インドール、トリプトファン、５－アミノ吉草酸、ピペコレート、Ｎ－アセチル－カダベリン、カダベリン、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、セロトニン、プロピオン酸イミダゾール、乳酸イミダゾール、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、ファモチジン、クレゾール、３－インドキシルサルフェート、４－ヒドロキシフェニルアセテート、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート、ベンゾエート、フェニル酢酸、フェニルラクテート、ヒプラート、ラクテート、フェニルプロピオニルグリシン、フェニルアセチルグリシン、エチルフェニルサルフェート、フェノールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、ｐ－クレゾールグルクロニド、エンテロジオール、エンテロラクトン、エクオール、ダイゼイン、アピゲニン、ナリンゲニン、ゲニスタイン、デオキシコレート、リトコレート、タウロデオキシコレート、キシロース、ラフィノース、スタキオース、ジアミノピメレート、トリメチルアミン（ＴＭＡ）、３－フェニルプロピオネート、４－エチルフェノール、４－ヒドロキシフェニルラクテート、シナメート、シナモイルグリシン、フェノールグルクロニド、ウロリチンＡ、Ｎ－アセチルムラミネート、Ｎ－アセチルノイラミネート（シアル酸）、カテコールサルフェート、３－インドールラクテート、およびそれらの組み合わせ。質量分析法は、単一（１回）の注入法を使用して、サンプル中の単一および多数（複数）の分析物を定量化するために説明されている。複数の分析物が定量化される例では、分析物は「パネル」または「分析物のパネル」と呼ばれ得る。一例では、パネルは、下記からなる群から選択される複数の分析物を含み得る：Ｎ－パルミトイルセリノール、インドールプロピオネート、インドール、トリプトファン、５－アミノバレレート、ピペコレート、Ｎ－アセチル－カダベリン、カダベリン、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、セロトニン、プロピオン酸イミダゾール、乳酸イミダゾール、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、ファモチジン、クレゾール、３－インドキシルサルフェート、４－ヒドロキシフェニルアセテート、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート、ベンゾエート、フェニル酢酸、フェニルラクテート、ヒプラート、ラクテート、フェニルプロピオニルグリシン、フェニルアセチルグリシン、エチルフェニルサルフェート、フェノールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、ｐ－クレゾールグルクロニド、エンテロジオール、エンテロラクトン、エクオール、ダイゼイン、アピゲニン、ナリンゲニン、ゲニスタイン、デオキシコレート、リトコレート、タウロデオキシコレート、キシロース、ラフィノース、スタキオース、ジアミノピメレート、トリメチルアミン（ＴＭＡ）、３－フェニルプロピオネート、４－エチルフェノール、４－ヒドロキシフェニルラクテート、シンナメート、シンナモイルグリシン、フェノールグルクロニド、ウロリチンＡ、Ｎ－アセチルムラミネート、Ｎ－アセチルノイラミネート（シアル酸）、カテコールサルフェート、３－インドールラクテート、およびそれらの組み合わせ。別の例では、パネルは、下記からなる群から選択される複数の分析物を含み得る：Ｎ－パルミトイルセリノール、インドールプロピオネート、インドール、トリプトファン、５－アミノバレレート、ピペコレート、Ｎ－アセチル－カダベリン、カダベリン、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）、ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、セロトニン、プロピオン酸イミダゾール、乳酸イミダゾール、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、ファモチジン、ジアミノピメリン酸、トリメチルアミン（ＴＭＡ）、およびそれらの組み合わせ。さらに別の例では、パネルは、下記からなる群から選択される複数の分析物を含み得る：クレゾール、３－インドキシルサルフェート、４－ヒドロキシフェニルアセテート、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート、ベンゾエート、フェニル酢酸、フェニルラクテート、ヒプラート、ラクテート、フェニルプロピオニルグリシン、フェニルアセチルグリシン、エチルフェニルサルフェート、フェノールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、ｐ－クレゾールグルクロニド、エンテロジオール、エンテロラクトン、エクオール、ダイゼイン、アピゲニン、ナリンゲニン、ゲニスタイン、デオキシコレート、リトコレート、タウロデオキシコレート、３－フェニルプロピオネート、４－エチルフェノール、４－－ヒドロキシフェニルラクテート、シンナメート、シンナモイルグリシン、フェノールグルクロニド、ウロリチンＡ、およびそれらの組み合わせ。さらに別の例では、パネルは、キシロース、ラフィノース、スタキオース、Ｎ－アセチルムラミネート、Ｎ－アセチルノイラミネート（シアル酸）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される複数の分析物を含み得る。別の例では、パネルは、カテコールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、エチルフェニルサルフェート、インドールラクテート、インドールプロピオネート、インドキシルサルフェート、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される複数の分析物を含み得る。この方法は、例えば、質量分析の方法と組み合わせた選択された分析物の分離（精製、濃縮）を実行するために、ＬＣ（液体クロマトグラフィー）、ＵＰＬＣ（超高速液体クロマトグラフィー）またはＨＩＬＩＣ（親水性相互作用クロマトグラフィー）などの液体クロマトグラフィー工程を使用する精製または濃縮工程を含み得る。本明細書に記載の方法の利点は、サンプル中の複数の分析物を定量化するための自動化に適したハイスループット検定システムの提供である。
本明細書に提示される方法は、これらの分析物を測定するための現在の方法に対する改善および利点を提供する。分析物の複数のパネルを測定するための方法が提供される。パネルに含まれる分析物は構造的に多様であり、この方法は、誘導体化せずに１回の注入で分析物を一緒に測定することにより、技術的な改善と利点を提供する。さらに、この方法では、分析物の安定同位体標識類似体が、内部標準として個々の分析物ごとに使用される。各分析物に標識類似体を使用すると、１つの内部標準を使用して複数（たとえば３つ以上）の分析物を定量したり、構造的に類似した標識された化合物（類似体ではない）を使用して定量したりする方法よりも正確な定量が可能になる。１回の注入で、さまざまな組み合わせで複数の分析物を定量的に測定する機能は、分析結果の取得に必要な時間を短縮し、ラボの使い捨て（チューブ、ピペットチップ、試薬など）、ラボの機器、および人的資源に関する少ない資源を使用する。これらの改善は、検定のコストを削減し、サンプル分析のための機器と実験室の容量を増やすことによって節約につながる。
本発明をさらに詳細に説明する前に、以下の用語が定義される。
定義：
「量」という用語は、本明細書に記載の方法を使用して測定される分析物の量を意味する。量は濃度として表すことができる。たとえば、質量濃度、モル濃度、数濃度、または体積濃度。本明細書で使用される量は、相対量または相対量ではなく、絶対量または絶対量を指す。
「量」という用語は、本明細書に記載の方法を使用して測定される分析物の量を意味する。量は濃度として表すことができる。たとえば、質量濃度、モル濃度、数濃度、または体積濃度。本明細書で使用される量は、相対量または相対量ではなく、絶対量または絶対量を指す。
「固相抽出」という用語は、複合混合物（すなわち、移動相）の成分が、固体粒子クロマトグラフィー充填材料（すなわち、固相または固定相）を使用してそれらの物理的および化学的特性に従って分離されるサンプル調製プロセスを指す。固体粒子充填材料は、カートリッジタイプの装置（例えば、カラム）中に含まれ得る。
「分離」という用語は、複合混合物をその成分分子または代謝産物に分離するプロセスを指す。一般的な例示的な実験室分離技術には、電気泳動およびクロマトグラフィーが含まれる。
「クロマトグラフィー」という用語は、分離される成分（すなわち、化学成分）が２つの相の間に分配され、一方が静止（固定相）であり、他方（移動相）が明確な方向に移動する、物理的分離方法を指す。移動相は、気体（「ガスクロマトグラフィー」、「ＧＣ」）または液体（「液体クロマトグラフィー」、「ＬＣ」）であり得る。クロマトグラフィー出力データは、本明細書に記載の方法の実施形態で使用することができる。
「液体クロマトグラフィー」または「ＬＣ」という用語は、細かく分割された物質のカラムを通ってまたは毛細管通路を通って、流体が均一に移動するときに、流体溶液の１つまたは複数の成分を選択的に阻害するプロセスを指す。阻害は、移動相が固定相に対して移動するときに、１つまたは複数の固定相と移動相との間の混合物の成分の分布に起因する。「液体クロマトグラフィー」の例には、「逆相液体クロマトグラフィー」または「ＲＰＬＣ」、「高速液体クロマトグラフィー」または「ＨＰＬＣ」、「超高速液体クロマトグラフィー」または「ＵＰＬＣ」または「ＵＨＰＬＣ」、または親水性相互作用クロマトグラフィーまたは「ＨＩＬＩＣ」が含まれる。
「保持時間」という用語は、サンプルが分離装置中に導入されてからのクロマトグラフィープロセスにおける経過時間を指す。サンプルの成分の保持時間は、サンプルを分離装置中に注入する時間と、サンプルの成分が、固定相を含む分離装置の部分から溶出する（例えば、出る）時間と、の間のクロマトグラフィープロセスにおける経過時間を指す。
サンプル成分の「保持指数」という用語は、既知の標準の分離特性を使用して系統的エラーを除去するメカニズムである、サンプル成分の保持時間または保持係数を、サンプル成分のピークの前後に溶出された標準の保持時間に関連付ける、補間（通常は対数）によって得られる数を指す。
「分離指数」という用語は、分離技術によって分離された化学成分に関連する測定基準を指す。クロマトグラフィー分離技術の場合、分離指数は保持時間または保持指数であることができる。非クロマトグラフィー分離技術の場合、分離指数は化学成分が移動した物理的距離であることができる。
本明細書で使用される場合、「分離情報」および「分離データ」という用語は、分離指数に関して化学成分の存在または不存在を示すデータを指す。例えば、分離データは、特定の時間に溶出する特定の質量を有する化学成分の存在を示し得る。分離データは、時間の経過とともに溶出する化学成分の量が増加し、ピークに達し、その後減少することを示し得る。分離指数（時間など）にわたってプロットされた化学成分の存在のグラフは、グラフィカルなピークを表示し得る。したがって、分離データの内容では、「ピーク情報」および「ピークデータ」という用語は、「分離情報」および「分離データ」という用語と同義である。
「質量分析」（ＭＳ）という用語は、標的分子をイオン化またはイオン化および断片化し、次にそれらの質量／電荷比に基づいてイオンを分析して、「分子指紋」として機能する質量スペクトルを生成することを含む分子を測定および分析するための技術を指す。物体の質量／電荷比の決定は、電磁エネルギーがその物体によって吸収される波長を決定することによって行うことができる。イオンの質量電荷比を決定するために一般的に使用される方法はいくつかあり、イオン軌道と電磁波の相互作用を測定する方法、イオンが特定の距離を移動するのにかかる時間を測定する方法、またはその両方の組み合わせがある。これらの断片質量測定からのデータをデータベースに対して検索して、ターゲット分子の識別を取得できる。
「負モードで動作する」または「負多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードで動作する」または「負イオン化モードで動作する」という用語は、負イオンが生成および検出される質量分析法を指す。「正モードで動作する」または「正多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードで動作する」または「正イオン化モードで動作する」という用語は、正イオンが生成および検出される質量分析法を指す。
「質量分析器」という用語は、イオンの混合物をそれらの質量電荷比（「ｍ／ｚ」）比によって分離する質量分析計内のデバイスを指す。
「ｍ／ｚ」という用語は、イオンの質量数をその電荷数で割ることによって形成される無次元量を指す。これは長い間「質量電荷比」と呼ばれてきた。
本明細書で使用される場合、「ソース」または「イオン化源」という用語は、分析されるサンプルをイオン化する質量分析計内のデバイスを指す。イオン化源の例には、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、加熱エレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ）、大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）等が含まれる。
本明細書で使用される場合、「検出器」という用語は、イオンを検出する質量分析計内のデバイスを指す。
「イオン」という用語は、電荷を含む任意の物体を指し、これは、例えば、物体に電子を追加するか、または物体から電子を除去することによって形成することができる。
「質量スペクトル」という用語は、質量分析計によって生成されたデータのプロットを指し、典型的には、ｘ軸上にｍ／ｚ値およびｙ軸上に強度値を含む。
「スキャン」という用語は、特定の分離指数に関連する質量スペクトルを指す。たとえば、クロマトグラフィー分離技術を使用するシステムは、複数のスキャンを生成する場合があり、各スキャンは異なる保持時間で行われます。
「実行時間」という用語は、サンプル注入から機器データの生成までの時間を指す。
「タンデムＭＳ」という用語は、「一次ＭＳ」と呼ばれる第１のＭＳ工程が実行され、その後、一般に「二次ＭＳ」と呼ばれる後続のＭＳ工程の１つまたは複数が実行される操作を指す。一次ＭＳでは、一次質量スペクトルの作成中に、１つ（場合によっては複数）の化学成分を表すイオンが検出および記録される。イオンによって表される物質は、二次ＭＳにかけられ、このＭＳでは、対象の物質がサブコンポーネントに分解されるためにフラグメンテーションが行われ、二次質量スペクトルとして検出および記録される。真のタンデムＭＳでは、一次ＭＳの対象イオンと、二次ＭＳ中に生成されるピークとの間に明確な関係がある。一次ＭＳの対象イオンは「親」または前駆体イオンに対応し、二次ＭＳ中に生成されるイオンは親イオンのサブコンポーネントに対応し、本明細書では「娘」または「生成物」イオンと呼ばれる。
したがって、タンデムＭＳは、複合混合物中の化学成分の親娘関係を表すデータ構造の作成を可能にする。この関係は、親イオンと娘イオンの相互関係を示す木のような構造で表すことができ、娘イオンは親イオンのサブコンポーネントを表す。タンデムＭＳは、たとえば「孫娘」イオンを決定するために娘イオンで繰り返される場合がある。したがって、タンデムＭＳは、２レベルのフラグメンテーション（断片化）に限定されず、「ＭＳｎ」とも呼ばれるマルチレベルＭＳを指すために一般的に使用される。「ＭＳ／ＭＳ」という用語は「ＭＳ２」の同義語である。簡単にするために、以下の「娘イオン」という用語は、二次または高次（すなわち、一次ではない）ＭＳによって生成される任意のイオンを指す。
「分析物」、「小分子」、「生化学的」、または「代謝産物」は、互換的に使用することができる。本明細書で使用される場合、分析物の例には、下記のものが含まれる：Ｎ－パルミトイルセリノール、インドールプロピオネート、インドール、トリプトファン、５－アミノ吉草酸、ピペコレート、Ｎ－アセチル－カダベリン、カダベリン、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、セロトニン、プロピオン酸イミダゾール、乳酸イミダゾール、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、ファモチジン、クレゾール、３－インドキシルサルフェート、４－ヒドロキシフェニルアセテート、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、ベンゾエート、フェニル酢酸、フェニルラクテート、ヒプレート、ラクテート、フェニルプロピオニルグリシン、フェニルアセチルグリシン、エチルフェニルサルフェート、フェノールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、ｐ－クレゾールグルクロニド、エンテロジオール、エンテロラクトン、エクオール、ダイゼイン、アピゲニン、ナリンゲニン、ゲニスタイン、デオキシコレート、リトコレート、タウロデオキシコレート、キシロース、ラフィノース、スタキオース、ジアミノピメレート、トリメチルアミン（ＴＭＡ）、３－フェニルプロピオネート、４－エチルフェノール、４－ヒドロキシフェニルラクテート、シンナメート、シンナモイルグリシン、フェノールグルクロニド、ウロリチンＡ、Ｎ－アセチルムラミネート、およびＮ－アセチルノイラミネート（シアル酸）。この用語は、大きなタンパク質（例えば、分子量が２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、または１０，０００を超えるタンパク質）、大きな核酸（例えば、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、または１０，０００を超える分子量を有する核酸）、または大きな多糖類（たとえば、分子量が２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、または１０，０００を超える多糖類）などの大きな高分子を含まない。
「サンプル」は、記載された方法によって分析される材料を指す。サンプルは、固体サンプル、液体サンプル、または揮発性サンプルの場合がある。サンプルは、任意のタイプのサンプルを指し、非生物学的サンプル（非限定的な例には、土壌サンプル、水サンプル、固体製剤（例えば、食品サンプルを含むがこれに限定されない）、液体製剤（例えば、飲料サンプルを含むがこれに限定されない）が含まれ得る）、及び生物学的サンプルを含む。「生物学的サンプル」という用語は、対象から単離された生物学的材料を指し得る。生物学的サンプルは、所望の分析物を検出するのに適した任意の生物学的材料を含み得るのであり、対象からの細胞性および／または非細胞性物質を含み得る。生物学的サンプルの非限定的な例には、下記のものが含まれる：血液、血漿（血漿）、血清（血清）、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、糞便、組織、皮膚、細胞含有量、乳汁、唾液、植物サンプル、細胞または細胞培養物、細胞培養培地、およびバイオフィルム。
「対象」は、任意の動物を意味するが、好ましくは、例えば、ヒト、サル、マウス、イヌ、ウサギまたはラットなどの哺乳動物である。
Ｉ．サンプル調製と品質管理（ＱＣ）
分析物を含むサンプル抽出物は、サンプル中に存在し得る高分子（例えば、タンパク質、核酸、脂質）からサンプル中の分析物を単離することによって調製される。「サンプル抽出物」、「抽出されたサンプル」または「分析物抽出物」という用語は、本明細書では「分析サンプル」と呼ばれることもあり、これらの用語は交換可能に使用され得る。サンプル中の一部またはすべての分析物がタンパク質に結合している可能性がある。ＭＳ分析の前に、さまざまな方法を使用して、分析物とタンパク質間の相互作用を破壊することができる。例えば、分析物をサンプルから抽出して液体抽出物を生成する一方で、存在し得るタンパク質を沈殿させて除去することができる。タンパク質は、例えば、酢酸エチルまたはメタノールの溶液を使用して沈殿させることができる。サンプル中のタンパク質を沈殿させるには、酢酸エチルまたはメタノール溶液をサンプルに加え、混合物を遠心分離機で回転させて、抽出された分析物を含む液体上清を、沈殿したタンパク質から分離する。
分析物を含むサンプル抽出物は、サンプル中に存在し得る高分子（例えば、タンパク質、核酸、脂質）からサンプル中の分析物を単離することによって調製される。「サンプル抽出物」、「抽出されたサンプル」または「分析物抽出物」という用語は、本明細書では「分析サンプル」と呼ばれることもあり、これらの用語は交換可能に使用され得る。サンプル中の一部またはすべての分析物がタンパク質に結合している可能性がある。ＭＳ分析の前に、さまざまな方法を使用して、分析物とタンパク質間の相互作用を破壊することができる。例えば、分析物をサンプルから抽出して液体抽出物を生成する一方で、存在し得るタンパク質を沈殿させて除去することができる。タンパク質は、例えば、酢酸エチルまたはメタノールの溶液を使用して沈殿させることができる。サンプル中のタンパク質を沈殿させるには、酢酸エチルまたはメタノール溶液をサンプルに加え、混合物を遠心分離機で回転させて、抽出された分析物を含む液体上清を、沈殿したタンパク質から分離する。
他の実施形態では、分析物は、タンパク質を沈殿させることなくタンパク質から放出され得る。たとえば、ギ酸溶液をサンプルに添加して、タンパク質と分析物の間の相互作用を破壊することができる。あるいは、硫酸アンモニウム、エタノール中のギ酸の溶液、またはメタノール中のギ酸の溶液をサンプルに添加して、タンパク質を沈殿させることなくタンパク質と分析物との間のイオン相互作用を破壊することができる。一例では、アセトニトリル、メタノール、水、およびギ酸の溶液を使用して、サンプルから分析物を抽出することができる。
いくつかの実施形態において、抽出物は、本明細書に記載の液体クロマトグラフィー、電気泳動、濾過、遠心分離、および親和性分離を含む様々な方法に供されて、サンプル中の１つ以上の他の成分と比較して選択された分析物の量を精製または濃縮し得る。
分析物を検出および定量化する方法の精度、確度、較正範囲、または分析感度を評価するために、品質管理（ＱＣ）サンプルを使用することができる。ＱＣサンプルで使用される特定の分析物の濃度は、サンプルで検出された特定の分析物の定量下限（ＬＬＯＱ）または定量上限（ＵＬＯＱ）に基づいて決定できる。一例では、ＬＬＯＱは、標準（例えば、標準Ａ）の濃度によって表され得、ＵＬＯＱは、第２の標準（例えば、標準Ｈ）の濃度によって表され得る。低ＱＣ値は約３Ｘ ＬＬＯＱの濃度に設定でき、中ＱＣ値は高ＱＣの約２５～５０％の濃度に設定でき、高ＱＣ値はＵＬＯＱの約８０％の濃度に設定できる。ＱＣターゲット濃度レベルは、分析測定範囲（ＡＭＲ）と、一連の代表的なサンプルで測定されたサンプル結果の頻度の組み合わせに基づいて選択できる。
ＩＩ．クロマトグラフィー
質量分析の前に、分析物抽出物は、電気泳動、濾過、遠心分離、親和性分離、またはクロマトグラフィーなどの１つまたは複数の分離方法に供され得る。一実施形態では、分離方法は、例えば、超高速ＬＣ（ＵＨＰＬＣ）を含む液体クロマトグラフィー（ＬＣ）を含み得る。
質量分析の前に、分析物抽出物は、電気泳動、濾過、遠心分離、親和性分離、またはクロマトグラフィーなどの１つまたは複数の分離方法に供され得る。一実施形態では、分離方法は、例えば、超高速ＬＣ（ＵＨＰＬＣ）を含む液体クロマトグラフィー（ＬＣ）を含み得る。
いくつかの実施形態において、ＵＨＰＬＣは、逆相カラムクロマトグラフィーシステム、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）、または混合相カラムクロマトグラフィーシステムを使用して実施され得る。
ＬＣ用のカラムヒーター（またはカラムマネージャー）は、約２５℃から約８０℃の温度に設定することができる。例えば、カラムヒーターは、約３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃などに設定することができる。
一例では、ＵＨＰＬＣは、ＨＩＬＩＣシステムを使用して実施することができる。別の例では、ＵＨＰＬＣは、逆相カラムクロマトグラフィーシステムを使用して実施することができる。システムは、２つ以上の移動相を含み得る。移動相は、例えば、移動相Ａ、移動相Ｂ、移動相Ａ’、および移動相Ｂ’と呼ばれることがある。
２つの移動相ＡおよびＢを使用する例示的な実施形態では、移動相Ａは、パーフルオロペンタン酸（ＰＦＰＡ）および水を含み得、移動相Ｂは、ＰＦＰＡおよびアセトニトリルを含み得る。ＰＦＰＡの濃度は、約０．０１から約０．５００％であり得る。アセトニトリルの濃度は０％から１００％の範囲であり得る。いくつかの例では、移動相Ａ中のパーフルオロペンタン酸（ＰＦＰＡ）の濃度は、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、または０．３％であり得る。他の例では、移動相Ｂ中のＰＦＰＡの濃度は、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、または０．３％であり得、そしてアセトニトリルの濃度は、９９．９７、９９．９６、９９．９５、９９．９４、９９．９３、９９．９２、９９．９１、９９．９、９９．８、または９９．７％でありうる。
一例では、線形勾配溶出をクロマトグラフィーに使用することができる。線形勾配溶出の開始条件は、移動相の濃度（例えば、移動相Ｂ）および／またはカラムを通る移動相の流速（例えば、移動相Ｂ）を含み得る。開始条件は、１つまたは複数の分析物の分離および／または保持のために最適化することができる。勾配条件は、分析物の分離および／または保持のために最適化することもでき、選択した流量に応じて変化させることができる。たとえば、初期条件は、移動相Ｂが０．５％、流量が６００μＬ／分である場合がある。移動相Ｂは、約４分で５～１０％に増加し、約５．５～６．０分で約４０～９０％に増加し、約６．５分で約９０～９８％に増加し得る。移動相Ｂは６．７分で０．５％に戻る可能性があり、次のサンプル注入のための平衡化のために１分未満維持され得る。合計実行時間は７．０分以下の場合がある。
別の例では、移動相Ａはギ酸および水を含み得、移動相Ｂはギ酸およびアセトニトリルを含み得る。移動相Ａまたは移動相Ｂ中のギ酸の濃度は、０．００１％から５％の範囲であり得る。アセトニトリルの濃度は０％から１００％の範囲である可能性がある。例えば、移動相Ａは、水中の０．００５、０．０１、０．０５、０．１、または０．５％のギ酸を含み得、移動相Ｂは、アセトニトリル中の０．００５、０．０１、０．０５、０．１、または０．５％のギ酸を含み得る。線形勾配溶出はクロマトグラフィーに使用でき、６００μＬ／分の流速と０％移動相Ｂの初期条件で実行できる。次に、移動相Ｂは３．５～４分で２０～２５％に増加し、６．５～６．９分で２５～３０％に増加し、６．９～８．０分で７０～９０％に増加し、８～８．５分で９０～９５％に増加する。次に、移動相Ｂを０．５分未満の間９５％に維持することができる。移動相Ｂは、次のサンプル注入前の平衡化のために１分未満で０％に戻る場合がある。合計実行時間は９．０分以下の場合がある。
さらに別の例では、移動相Ａはトリエチルアミンおよび水を含み得、移動相Ｂはトリエチルアミンおよびアセトニトリルを含み得る。トリエチルアミンの濃度は、約０．０１から約０．５００％の範囲であり得るし、アセトニトリルの濃度は、０％から１００％の範囲であり得る。いくつかの例において、移動相Ａまたは移動相Ｂ中のトリエチルアミンの濃度は、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、または０．５％であり得る。クロマトグラフィーには線形勾配溶出を使用できる。たとえば、初期条件は２％の移動相Ａと６００μＬ／分の流量である。移動相Ａは、１．５～２．０分で約１０～２０％に増加し、約５分で２５～３０％に増加し、約５分で４０～５０％に増加し、０．５分未満維持され得る。移動相Ａは約５．５分で２％に戻ることができ、次のサンプル注入のための平衡化のために約０．５分間維持されることができる。合計実行時間は６．０分以下の場合がある。
さらなる例では、移動相Ａはギ酸および水を含み得、移動相Ｂはギ酸およびアセトニトリルを含み得る。移動相Ａまたは移動相Ｂ中のギ酸の濃度は、０．００１％から５％の範囲であり得る。アセトニトリルの濃度は０％から１００％の範囲であり得る。例えば、移動相Ａは、水中の０．００５、０．０１、０．０５、０．１、または０．５％のギ酸を含み得、移動相Ｂは、アセトニトリル中の０．００５、０．０１、０．０５、０．１、または０．５％のギ酸を含み得る。線形勾配溶出はクロマトグラフィーに使用でき、０～１５％の移動相Ｂと５５０μＬ／分の流速の初期条件で実行できる。次に、移動相Ｂは、約３分で１５～３０％に増加し、４．０～４．３分で３０～４５％に増加し、そして４．３～５．０分で７０～９９％に増加し得る。移動相Ｂは、次のサンプル注入前の平衡化のために１分未満で１０％に戻る場合がある。合計実行時間は５．５０分以下の場合がある。
さらに別の例では、移動相Ａはギ酸アンモニウムおよび水を含み得、移動相Ｂはギ酸アンモニウム、アセトニトリル、および水を含み得る。移動相Ａのギ酸アンモニウムの濃度は０．１ｍＭから１００ｍＭの範囲であり、アセトニトリルの濃度は０％から１００％の範囲である可能性がある。いくつかの例において、移動相Ａ中のギ酸アンモニウムの濃度は、１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、または５０ｍＭであり得、そしてアセトニトリルの濃度は、６０、７０、８０、または９０％であり得る。線形勾配溶出はクロマトグラフィーに使用でき、０～１５％の移動相Ａと５５０μＬ／分の流速の初期条件で実行できる。次に、移動相Ａは、約２．５分で１５～３５％に増加し、そして２．６～３．５分で３０～６０％に増加し得る。次に、移動相Ａは、次のサンプル注入前の平衡化のために１分未満で５％に戻る場合がある。合計実行時間は４．３０分以下の場合がある。
クロマトグラフィーカラムからの溶離液は、質量分析計のエレクトロスプレー源に直接かつ自動的に導入することができる。
ＩＩＩ．質量分析と定量
１つまたは複数の分析物は、例えば、質量分析によってイオン化され得る。質量分析は、分画（断片化）されたサンプルをイオン化し、さらに分析するための荷電分子を作成するためのイオン化源を含む質量分析計を使用して実行される。サンプルのイオン化は、例えば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）によって実施することができる。他のイオン化源には、例えば、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、加熱エレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ）、大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）、またはマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）が含まれる。イオン化方法の選択は、いくつかの考慮事項に基づいて決定することができる。例示的な考慮事項には、測定される分析物、サンプルのタイプ、検出器のタイプ、および正モードまたは負モードの選択が含まれる。いくつかの例では、質量分析法は、感度を高めるために２つ以上の期間に分割され得る。
１つまたは複数の分析物は、例えば、質量分析によってイオン化され得る。質量分析は、分画（断片化）されたサンプルをイオン化し、さらに分析するための荷電分子を作成するためのイオン化源を含む質量分析計を使用して実行される。サンプルのイオン化は、例えば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）によって実施することができる。他のイオン化源には、例えば、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、加熱エレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ）、大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）、またはマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）が含まれる。イオン化方法の選択は、いくつかの考慮事項に基づいて決定することができる。例示的な考慮事項には、測定される分析物、サンプルのタイプ、検出器のタイプ、および正モードまたは負モードの選択が含まれる。いくつかの例では、質量分析法は、感度を高めるために２つ以上の期間に分割され得る。
１つまたは複数の分析物は、正または負のモードでイオン化されて、１つまたは複数のイオンを生成し得る。たとえば、下記の分析物は、正モードでイオン化できる：Ｎ－パルミトイルセリノール、インドールプロピオネート、インドール、トリプトファン、５－アミノ吉草酸、ピペコレート、Ｎ－アセチル－カダベリン、カダベリン、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）、ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、セロトニン、イミダゾールプロピオン酸、乳酸イミダゾール、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、ファモチジン、ジアミノピメレート、およびトリメチルアミン（ＴＭＡ）。さらに別の例では、下記の分析物は、負モードでイオン化できる：クレゾール、３－インドキシルサルフェート、４－ヒドロキシフェニルアセテート、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート、ベンゾエート、フェニル酢酸、フェニルラクテート、ヒプラート、ラクテート、フェニルプロピオニルグリシン、フェニルアセチルグリシン、エチルフェニルサルフェート、フェノールサルフェート、ｐ－硫酸クレゾール、ｐ－クレゾールグルクロニド、エンテロジオール、エンテロラクトン、エクオール、ダイゼイン、アピゲニン、ナリンゲニン、ゲニスタイン、デオキシコレート、リトコレート、タウロデオキシコレート、３－フェニルプロピオネート、４－エチルフェノール、４－ヒドロキシフェニルラクテート、シンナメート、シンナモイルグリシン、フェノールグルクロニド、ウロリチンＡ、キシロース、ラフィノース、スタキオース、Ｎ－アセチルムラミネート、Ｎ－アセチルノイラミネート（シアル酸）、カテコールサルフェート、および３－インドールラクテート。いくつかの例では、分析物は、単一の注入で正モードおよび負モードでイオン化され得る。
一例では、分析物Ｎ－パルミトイルセリノール、インドールプロピオネート、インドール、トリプトファン、５－アミノ吉草酸、ピペコレート、Ｎ－アセチル－カダベリン、カダベリン、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）、γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、セロトニン、プロピオン酸イミダゾール、乳酸イミダゾール、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、ファモチジン、ジアミノピメレート、およびトリメチルアミン（ＴＭＡ）は、正モードでイオン化でき、１回の注入で測定できる。別の例では、分析物クレゾール、３－インドキシルサルフェート、４－ヒドロキシフェニルアセテート、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート、ベンゾエート、フェニル酢酸、フェニルラクテート、ヒプラート、ラクテート、フェニルプロピオニルグリシン、フェニルアセチルグリシン、エチルフェニルサルフェート、フェノールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、ｐ－クレゾールグルクロニド、エンテロジオール、エンテロラクトン、エクオール、ダイゼイン、アピゲニン、ナリンゲニン、ゲニスタイン、デオキシコレート、リトコレート、タウロデオキシコレート、３－フェニルプロピオネート、４－エチルフェノール、４－ヒドロキシフェニルラクテート、シンナメート、シンナモイルグリシン、フェノールグルクロン、及びウロリチンＡは、負モードでイオン化することができ、１回の注入で測定することができる。さらに別の例では、分析物のキシロース、ラフィノース、スタキオース、Ｎ－アセチルムラミネート、およびＮ－アセチルノイラミネート（シアル酸）は、負モードでイオン化され得、そして単一の注入で測定され得る。さらに別の例では、分析物であるカテコールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、エチルフェニルサルフェート、インドールラクテート、インドールプロピオネート、およびインドキシルサルフェートは、負モードでイオン化され得、一回の注入で測定され得る。
質量分析計機器の設定は、所与の分析方法および／または使用される特定の質量分析計に対して最適化され得る。機器は、さまざまなガス、たとえば、窒素、ヘリウム、アルゴン、またはゼロエアを使用できる。一実施形態では、質量分析は、ＡＢ Ｓｃｉｅｘ ＱＴｒａｐ ６５００質量分析計を使用して実施することができる。一例では、質量分析計は、正多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードで操作することができる。イオンスプレー電圧設定は、約０．５ｋＶから約６．０ｋＶの範囲である可能性がある。一実施形態では、電圧は５．５ｋＶに設定することができる。ソース温度は約３５０℃から約６００℃の範囲である可能性がある。一実施形態では、ソース温度は５００℃に設定することができる。カーテンガスは、約１０から約５５ｐｓｉの範囲であり得る。一実施形態では、カーテンガスは３５ｐｓｉに設定される。ネブライザおよび脱溶媒和ガスの流量は、約０～約９０ｐｓｉの範囲である可能性がある。一実施形態では、流量は７０に設定することができる。ＣＡＤガス設定は、高から低の範囲であり得る。一実施形態では、衝突活性化解離（ＣＡＤ）ガスは中程度に設定される。デクラスタリング電位は、約２０Ｖから約１９０Ｖの範囲である可能性がある。衝突エネルギー（ＣＥ）は、約１０Ｖから約７０Ｖの範囲であり得る。入口電位（ＥＰ）は、約１０Ｖであり得る。コリジョンセル出口電位（ＣＸＰ）設定は、約２Ｖから約３０Ｖの範囲であり得る。
別の例では、ＭＳ機器は、負のＭＲＭモードで動作され得る。イオンスプレー電圧の設定は、－０．５ｋＶから－５．５ｋＶの範囲である。一実施形態では、電圧は、－４．５ｋＶに設定することができる。別の実施形態では、電圧を－３．５ｋＶに設定することができる。ソース温度は約３５０℃から６００℃の範囲である。一実施形態では、ソース温度は５００℃に設定することができる。カーテンガスの範囲は１０～４０である。一実施形態では、カーテンガスを３５に設定することができる。別の実施形態では、カーテンガスを２０に設定することができる。ネブライザおよび脱溶媒和ガスの流量は、４０から９０の範囲であり得る。一実施形態では、流量を７０に設定することができる。別の実施形態では、流量は６０に設定することができる。ＣＡＤガスは、低から高の範囲であり得る。一例では、ＣＡＤは、例えば、中程度に設定され得る。デクラスタリング電位は、約－１０Ｖから約－２９０Ｖの範囲である可能性がある。衝突エネルギー（ＣＥ）は、約－１０Ｖから約－１３０Ｖの範囲であり得る。入口電位（ＥＰ）は、約－１０Ｖであり得る。衝突セル出口電位（ＣＸＰ）設定は、約－５Ｖから約－３５Ｖの範囲であり得る。
イオン化に続いて、荷電イオンを分析して、質量対電荷比を決定することができる。質量電荷比を決定するための例示的な適切な分析器には、四重極分析器、イオントラップ分析器、および飛行時間分析器が含まれる。イオンは、例えば、選択モードまたは走査モードを使用して検出することができる。例示的な走査モードには、ＭＲＭおよび選択された反応モニタリング（ＳＲＭ）が含まれる。
分析結果は、タンデムＭＳによって生成されたデータを含み得る。例示的な実施形態では、タンデムＭＳは、正確な質量タンデムＭＳであり得る。たとえば、正確な質量のタンデム質量分析では、四重極飛行時間型（Ｑ－ＴＯＦ）分析装置を使用できる。タンデムＭＳを使用すると、複合混合物中の化学成分の親娘関係を表すデータ構造を作成できる。この関係は、親イオンと娘イオンの相互関係を示す木のような構造で表すことができ、娘イオンは親イオンのサブコンポーネントを表す。
例えば、一次質量スペクトルは、５つの別個のイオンを含み得、これは、５つのグラフィカルなピークとして表され得る。一次ＭＳの各イオンは親イオンである可能性がある。各親イオンは、その特定の親イオンの娘イオンを示す質量スペクトルを生成する二次ＭＳにさらされる場合がある。
親／娘関係は、分離された成分（例えば、クロマトグラフィー状態から溶出する成分）と一次ＭＳで検出されたイオンとの間の関係、および分析されるサンプルと分離された成分との間の関係、を記述するために拡張され得る。
質量分析計は、通常、ユーザーにイオンスキャン（すなわち、所与の範囲にわたる特定の質量／電荷を有する各イオンの相対的な存在量）を提供する。質量分析データは、いくつかの方法によって元のサンプル中の分析物の量に関連付けることができる。一例では、較正標準を使用して標準曲線（検量線）を生成し、特定のイオンの相対存在量を元の分析物の絶対量に変換できるようにする。別の例では、較正標準は外部標準であり得、標準曲線は、それらの標準から生成されたイオンに基づいて生成されて、もう１つの分析物の量を計算し得る。さらなる例において、外部標準は、標識されていない分析物であり得る。
内部標準は、較正標準および／または試験サンプルに追加され得る。サンプル中の測定された分析物のより正確な値を得るために、サンプル処理中の分析物の損失を説明するために内部標準を使用することができる。較正標準のレベルにおける分析物のピーク面積と内部標準のピーク面積の比率を使用して、検量線を生成し、サンプルを定量することができる。分析物の１つまたは複数の同位体標識類似体を内部標準として使用することができる。いくつかの実施形態では、内部標準として使用するための分析物の類似体は、重水素、炭素１３（１３Ｃ）、酸素１７（１７Ｏ）、酸素１８（１８Ｏ）、硫黄３３（３３Ｓ）、硫黄３４（３４Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、炭素１４（１４Ｃ）、またはそれらの組み合わせで標識され得る。内部標準として使用できる標識類似体の非限定的な例には、下記のものが含まれる：トリメチルアミンＮ－オキシド－１３Ｃ３、３－インドールプロピオン酸－ｄ２、インドール－ｄ７、Ｎ－アセチルカダベリン－ｄ３、５－アミノ吉草酸－ｄ４、カダベリン－ｄ４、ファモチジン－１３Ｃ３、ガンマ－アミノ酪酸－ｄ６、セロトニン－ｄ４、ピペコール酸－ｄ９、イミダゾールプロピオン酸－ｄ３、イミダゾール乳酸－ｄ３、Ｎ－パルミトイルセリノール－ｄ３、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）－ｄ３、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）－ｄ３、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）－ｄ４、トリプトファン－ｄ５、ｐ－クレゾール－ｄ７、安息香酸－ｄ５、ヒプラートｄ５、４－ヒドロキシフェニル酢酸－ｄ６、３－フェニル乳酸－ｄ５、（４－ヒドロキシフェニル）－２－プロピオン酸－ｄ６、ナリンゲニン－ｄ３、（３－フェニルプロピオニル）グリシン－１３Ｃ２，１５Ｎ１、フェニルアセチルグリシン－ｄ５、ｐ－クレゾールサルフェート－ｄ７、エンテロジオール－ｄ６、エンテロラクトン－ｄ６、フェノールサルフェート－ｄ３、ダイゼイン－ｄ４、アピゲニン－ｄ５、ｐ－クレゾールグルクロニド－ｄ７、ゲニスタイン－ｄ４、エチルフェニルサルフェート－ｄ４、エクオール－ｄ４、３－インドキシルサルフェート－１３Ｃ６、フェニル酢酸－ｄ７、デオキシコール酸－ｄ４、リトコール酸－ｄ４、タウロデオキシコール酸－ｄ５、乳酸－ｄ４、キシロース－１３Ｃ５、ラフィノース－ｄ９、スタキオース－ｄ７、ジアミノピメリン酸－１３Ｃ７，１５Ｎ２、トリメチルアミン－１３Ｃ３、ヒドロ桂皮－ｄ５酸、４－エチルフェノール－２，３，５，６－ｄ４，ＯＤ、４－ヒドロキシフェニルラクテート－ｄ２、桂皮－ｄ５酸、シンナモイルグリシン－２，２－ｄ２、フェノールグルクロニド－ｄ５、ウロリチンＢ－１３Ｃ６、Ｎ－アセチルムラミン酸－ｄ３、Ｎ－アセチル－Ｄ－ノイラミン酸－１，２，３－１３Ｃ３、カテコールサルフェート－１３Ｃ６、またはインドールラクテート－ｄ５。内部標準として使用される分析物の類似体に、１つまたは複数の同位体標識を追加することができる。いくつかの実施形態では、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０つ以上の同位体標識を類似体に加えることができる。分析物の標識類似体が市販されていないか、または合成できない場合など、いくつかの実施形態では、構造的に類似した標識化合物を定量に使用することができる。たとえば、内部標準のＮ－アセチル－Ｄ－ノイラミン酸－１，２，３－１３Ｃ３は、分析物のＮ－アセチルムラミン酸の定量に使用できる。
ＭＳ機器からの分析データは、コンピュータに送信され、コンピュータソフトウェアを使用して処理され得る。一例では、分析物と内部標準のピーク面積比は、定量のための統計的回帰法を使用して、キャリブレーション標準の濃度に対して適合される。別の例では、統計的回帰は加重線形最小二乗回帰である。検量線を使用して計算された傾きと切片を使用して、実験サンプル中の分析物の未知の濃度を計算できる。
ＩＶ．キット
本明細書では、下記のものからなる群から選択される１つ以上のマイクロバイオームパネル分析物または複数の分析物を検定するためのキットが記載される：Ｎ－パルミトイルセリノール、インドールプロピオネート、インドール、トリプトファン、５－アミノバレレート、ピペコレート、Ｎ－アセチル－カダベリン、カダベリン、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、セロトニン、プロピオン酸イミダゾール、乳酸イミダゾール、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、ファモチジン、クレゾール、３－インドキシルサルフェート、４－ヒドロキシフェニルアセテート、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート、ベンゾエート、フェニル酢酸、フェニルラクテート、ヒプラート、ラクテート、フェニルプロピオニルグリシン、フェニルアセチルグリシン、エチルフェニルサルフェート、フェノールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、ｐ－クレゾールグルクロニド、エンテロジオール、エンテロラクトン、エクオール、ダイゼイン、アピゲニン、ナリンゲニン、ゲニスタイン、デオキシコレート、リトコレート、タウロデオキシコレート、キシロース、ラフィノース、スタキオース、ジアミノピメレート、トリメチルアミン（ＴＭＡ）、３－フェニルプロピオネート、４－エチルフェノール、４－ヒドロキシフェニルラクテート、シンナメート、シンナモイルグリシン、フェノールグルクロニド、ウロリチンＡ、Ｎ－アセチルムラミネート、Ｎ－アセチルノイラミネート（シアル酸）、カテコールサルフェート、３－インドールラクテート、およびそれらの組み合わせ。例えば、キットは、１つまたは複数の検定に十分な量の包装材料および１つまたは複数の較正標準、分析物標準、内部標準、または品質管理サンプルの測定量を含み得る。例示的な実施形態では、内部標準は標識されることができ（同位体標識または放射性標識など）、キットは、予め作製された較正標準溶液、内部標準溶液、移動相溶液、品質管理サンプル、品質管理サンプル再構成溶液を含むことができ、及び／又は、キットは、キャリブレーション標準試薬、内部標準試薬、移動相試薬、および移動相溶液を調製するための説明書を含むことができる。キットはまた、試薬を使用して１つまたは複数の分析物を測定するための有形の形態で（例えば、説明書または電子媒体などの紙に）記録された説明書を含み得る。
本明細書では、下記のものからなる群から選択される１つ以上のマイクロバイオームパネル分析物または複数の分析物を検定するためのキットが記載される：Ｎ－パルミトイルセリノール、インドールプロピオネート、インドール、トリプトファン、５－アミノバレレート、ピペコレート、Ｎ－アセチル－カダベリン、カダベリン、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、セロトニン、プロピオン酸イミダゾール、乳酸イミダゾール、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、ファモチジン、クレゾール、３－インドキシルサルフェート、４－ヒドロキシフェニルアセテート、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート、ベンゾエート、フェニル酢酸、フェニルラクテート、ヒプラート、ラクテート、フェニルプロピオニルグリシン、フェニルアセチルグリシン、エチルフェニルサルフェート、フェノールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、ｐ－クレゾールグルクロニド、エンテロジオール、エンテロラクトン、エクオール、ダイゼイン、アピゲニン、ナリンゲニン、ゲニスタイン、デオキシコレート、リトコレート、タウロデオキシコレート、キシロース、ラフィノース、スタキオース、ジアミノピメレート、トリメチルアミン（ＴＭＡ）、３－フェニルプロピオネート、４－エチルフェノール、４－ヒドロキシフェニルラクテート、シンナメート、シンナモイルグリシン、フェノールグルクロニド、ウロリチンＡ、Ｎ－アセチルムラミネート、Ｎ－アセチルノイラミネート（シアル酸）、カテコールサルフェート、３－インドールラクテート、およびそれらの組み合わせ。例えば、キットは、１つまたは複数の検定に十分な量の包装材料および１つまたは複数の較正標準、分析物標準、内部標準、または品質管理サンプルの測定量を含み得る。例示的な実施形態では、内部標準は標識されることができ（同位体標識または放射性標識など）、キットは、予め作製された較正標準溶液、内部標準溶液、移動相溶液、品質管理サンプル、品質管理サンプル再構成溶液を含むことができ、及び／又は、キットは、キャリブレーション標準試薬、内部標準試薬、移動相試薬、および移動相溶液を調製するための説明書を含むことができる。キットはまた、試薬を使用して１つまたは複数の分析物を測定するための有形の形態で（例えば、説明書または電子媒体などの紙に）記録された説明書を含み得る。
例示的な実施形態では、キットと共に使用するための１つまたは複数の内部標準または複数の内部標準は、下記のものからなる群から選択される１つまたは複数の内部標準を含み得る：Ｎ－パルミトイルセリノール－ｄ３、トリメチルアミンＮ－オキシド－１３Ｃ３、３－インドールプロピオン酸－ｄ２、インドール－ｄ７、Ｎ－アセチルカダベリン－ｄ３、５－アミノ吉草酸－ｄ４、カダベリン－ｄ４、ファモチジン－１３Ｃ３、ガンマ－アミノ酪酸－ｄ６、セロトニン－ｄ４、ピペコール酸－ｄ９、イミダゾールプロピオン酸－ｄ３、イミダゾール乳酸－ｄ３、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）－ｄ３、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）－ｄ３、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）－ｄ４、トリプトファン－ｄ５、ｐ－クレゾール－ｄ７、安息香酸－ｄ５、ヒプラート－ｄ５、４－ヒドロキシフェニル酢酸－ｄ６、３－フェニル乳酸－ｄ５、（４－ヒドロキシフェニル）－２－プロピオン酸－ｄ６、ナリンゲニン－ｄ３、（３－フェニルプロピオニル）グリシン－１３Ｃ２，１５Ｎ１、フェニルアセチルグリシン－ｄ５、ｐ－クレゾールサルフェート－ｄ７、エンテロジオール－ｄ６、エンテロラクトン－ｄ６、フェノールサルフェート－ｄ３、ダイゼイン－ｄ４、アピゲニン－ｄ５、ｐ－クレゾールグルクロニド－ｄ７、ゲニスタイン－ｄ４、エチルフェニルサルフェート－ｄ４、エクオール－ｄ４、３－インドキシルサルフェート－１３Ｃ６、フェニル酢酸－ｄ７、デオキシコール酸－ｄ４、リトコール酸－ｄ４、タウロデオキシコール酸－ｄ５、乳酸－ｄ４、キシロース－１３Ｃ５、ラフィノース－ｄ９、スタキオース－ｄ７、ジアミノピメリン酸－１３Ｃ７，１５Ｎ２、トリメチルアミン－１３Ｃ３、ヒドロ桂皮－ｄ５酸、４－エチルフェノール－２，３，５，６－ｄ４，ＯＤ、４－ヒドロキシフェニルラクテート－ｄ２、桂皮－ｄ５酸、シンナモイルグリシン－２，２－ｄ２、フェノールグルクロニド－ｄ５、ウロリチンＢ－１３Ｃ６、Ｎ－アセチルムラミン酸－ｄ３、Ｎ－アセチル－Ｄ－ノイラミン酸－１，２，３－１３Ｃ３、カテコールサルフェート－１３Ｃ６、およびインドールラクテート－ｄ５、およびそれらの組み合わせ。
他の例示的な実施形態において、キットと共に使用するための１つ以上の内部標準は、下記からなる群から選択される１つまたは複数の内部標準を含み得る：Ｎ－アセチル－カダベリン－ｄ３、５－アミノ吉草酸－ｄ４、プロピオン酸イミダゾール－ｄ３、β－イミダゾール乳酸－ｄ３、Ｎ－パルミトイルセリノール－ｄ３、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）－ｄ３、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）－ｄ３、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）－ｄ４、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート－ｄ６、ナリンゲニン－ｄ３ナトリウム塩、フェノールサルフェート－ｄ３、エチルフェニルサルフェート－ｄ４、ラフィノース－ｄ９、スタキオース－ｄ７、４－ヒドロキシフェニルラクテート－ｄ２、フェノールグルクロニド－ｄ５、Ｎ－アセチルムラミン酸－ｄ３、カテコールサルフェート－１３Ｃ６、およびそれらの組み合わせ。
一実施形態では、下記からなる群から選択される１つ以上または複数の分析物を検定するためのキットが、本明細書に記載されている：Ｎ－パルミトイルセリノール、インドールプロピオネート、インドール、トリプトファン、５－アミノバレレート、ピペコレート、Ｎ－アセチル－カダベリン、カダベリン、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、セロトニン、プロピオン酸イミダゾール、乳酸イミダゾール、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、ファモチジン、ジアミノピメレート、トリメチルアミン（ＴＭＡ）、およびそれらの組み合わせ。キットで使用するための内部標準は、下記からなるグループから選択できる：Ｎ－パルミトイルセリノール－ｄ３、３－インドールプロピオン酸－ｄ２、インドール－ｄ７、トリプトファン－ｄ５、５－アミノ吉草酸－ｄ４、ピペコール酸－ｄ９、Ｎ－アセチルカダベリン－ｄ３、カダベリン－ｄ４、トリメチルアミンＮ－オキシド－１３Ｃ３、ガンマアミノ酪酸－ｄ６、セロトニン－ｄ４、イミダゾールプロピオン酸－ｄ３、イミダゾール乳酸－ｄ３、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）－ｄ３、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）－ｄ３、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）－ｄ４、ファモチジン－１３Ｃ３、ジアミノピメリン酸－１３Ｃ７，１５Ｎ２、およびトリメチルアミン－１３Ｃ３。
別の実施形態では、下記からなる群から選択される１つ以上または複数の分析物を検定するためのキットが本明細書に記載されている：クレゾール、３－インドキシルサルフェート、４－ヒドロキシフェニルアセテート、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート、ベンゾエート、フェニル酢酸、フェニルラクテート、ヒプレート、ラクテート、フェニルプロピオニルグリシン、フェニルアセチルグリシン、エチルフェニルサルフェート、フェノールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、ｐ－クレゾールグルクロニド、エンテロジオール、エンテロラクトン、エクオール、ダイゼイン、アピゲニン、ナリンゲニン、ゲニスタイン、デオキシコレート、リトコレート、タウロデオキシコレート、３－フェニルプロピオネート、４－エチルフェノール、４－ヒドロキシフェニルラクテート、シンナメート、シンナモイルグリシン、フェノールグルクロニド、ウロリチンＡ、およびそれらの組み合わせ。キットで使用する内部標準は、下記からなるグループから選択できる：ｐ－クレゾール－ｄ７、３－インドキシルサルフェート－１３Ｃ６、４－ヒドロキシフェニル酢酸－ｄ６、（４－ヒドロキシフェニル）－２－プロピオン酸－ｄ６、安息香酸－ｄ５、フェニル酢酸－ｄ７、３－フェニル乳酸－ｄ５、ヒプラート－ｄ５、乳酸－ｄ４、（３－フェニルプロピオニル）グリシン－１３Ｃ２，１５Ｎ１、フェニルアセチルグリシン－ｄ５、エチルフェニルサルフェート－ｄ４、フェノールサルフェート－ｄ３、ｐ－クレゾールサルフェート－ｄ７、ｐ－クレゾールグルクロニド－ｄ７、エンテロジオール－ｄ６、エンテロラクトン－ｄ６、エクオール－ｄ４、ダイゼイン－ｄ４、アピゲニン－ｄ５、ナリンゲニン－ｄ３、ゲニスタイン－ｄ４、デオキシコール酸－ｄ４、リトコール酸－ｄ４、およびタウロデオキシコール酸－ｄ５、ヒドロ桂皮－ｄ５酸、４－エチルフェノール－２，３，５，６－ｄ４，ＯＤ、４－ヒドロキシフェニルラクテート－ｄ２、桂皮－ｄ５酸、シンナモイルグリシン－２，２－ｄ２、フェノールグルクロニド－ｄ５、およびウロリチンＢ－１３Ｃ６。
さらに別の実施形態では、キシロース、ラフィノース、スタキオース、Ｎ－アセチルムラミネート、Ｎ－アセチルノイラミネート（シアル酸）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の分析物を検定するためのキットがここに記載される。キットで使用する内部標準は、キシロース－１３Ｃ５、ラフィノース－ｄ９、スタキオース－ｄ７、Ｎ－アセチルムラミン酸－ｄ３、およびＮ－アセチル－Ｄ－ノイラミン酸－１，２，３－１３Ｃ３からなるグループから選択できる。
さらなる実施形態において、カテコールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、エチルフェニルサルフェート、インドールラクテート、インドールプロピオネート、インドキシルサルフェート、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上または複数の分析物を検定するためのキットが、本明細書に記載されている。キットで使用する内部標準は、カテコールサルフェート－１３Ｃ６、ｐ－クレゾールサルフェート－ｄ７、エチルフェニルサルフェート－ｄ４、インドールラクテート－ｄ５、インドールプロピオネート－ｄ２、および３－インドキシルサルフェート－１３Ｃ６からなるグループから選択できる。
例
Ｉ．試薬および機器
ＨＰＬＣグレードのメタノール、エタノール、水およびアセトニトリルは、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手した。混合には、ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃのマルチチューブボルテックスを使用した。プレートの遠心分離は、Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＳｏｒｖａｌｌ ＳＴ４０Ｒ遠心分離機で３６１７バケットローターを使用して実行した。試薬は商業供給源から入手した。内部標準は、商業供給源から入手したか、社内で合成したものである。
Ｉ．試薬および機器
ＨＰＬＣグレードのメタノール、エタノール、水およびアセトニトリルは、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手した。混合には、ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃのマルチチューブボルテックスを使用した。プレートの遠心分離は、Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＳｏｒｖａｌｌ ＳＴ４０Ｒ遠心分離機で３６１７バケットローターを使用して実行した。試薬は商業供給源から入手した。内部標準は、商業供給源から入手したか、社内で合成したものである。
ＩＩ．内部標準合成
本明細書に記載の方法で使用される以下の内部標準は、商業的供給源から入手できず、社内で合成された：Ｎ－アセチル－カダベリン－ｄ３、５－アミノ吉草酸－ｄ４、プロピオン酸イミダゾール－ｄ３、β－イミダゾール乳酸－ｄ３、Ｎ－パルミトイルセリノール－ｄ３、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）－ｄ３、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）－ｄ３、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）－ｄ４、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート－ｄ６、ナリンゲニン－ｄ３ナトリウム塩、フェノールサルフェート－ｄ３、エチルフェニルサルフェート－ｄ４、ラフィノース－ｄ９、スタキオース－ｄ７、４－ヒドロキシフェニルラクテート－ｄ２、フェノールグルクロニド－ｄ５、Ｎ－アセチルムラミン酸－ｄ３、およびカテコールサルフェート－１３Ｃ６。
本明細書に記載の方法で使用される以下の内部標準は、商業的供給源から入手できず、社内で合成された：Ｎ－アセチル－カダベリン－ｄ３、５－アミノ吉草酸－ｄ４、プロピオン酸イミダゾール－ｄ３、β－イミダゾール乳酸－ｄ３、Ｎ－パルミトイルセリノール－ｄ３、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）－ｄ３、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）－ｄ３、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）－ｄ４、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート－ｄ６、ナリンゲニン－ｄ３ナトリウム塩、フェノールサルフェート－ｄ３、エチルフェニルサルフェート－ｄ４、ラフィノース－ｄ９、スタキオース－ｄ７、４－ヒドロキシフェニルラクテート－ｄ２、フェノールグルクロニド－ｄ５、Ｎ－アセチルムラミン酸－ｄ３、およびカテコールサルフェート－１３Ｃ６。
当業者は、重水素化化合物に使用される命名法が、通常、重水素化の最も高い取り込みを伴う異性体を反映することを理解するであろう。ただし、水素－重水素（Ｈ－Ｄ）交換化学では、重水素の取り込みは通常完全ではなく、異性体の混合物になる。異性体の分布は、合成された各化合物について記載されている。以下の化合物の名前に示されている重水素化レベルは、本明細書に記載の方法の内部標準として使用された異性体を反映している。この異性体は、混合物に重水素化が最も多く組み込まれている異性体を常に反映しているわけではない。
Ｎ－アセチル－カダベリン－ｄ ３
Ｄ２Ｏ（０．５０ｍＬ）中のＮ－アセチルカダベリン（２７ｍｇ、０．１８７ｍｍｏｌ、１．０当量）の撹拌懸濁液に、Ｄ２Ｏ中のＮａＯＤ（４０重量％、０．１００ｍＬ）を加えた。この混合物を４５℃で一晩撹拌したが、不完全なＨ－Ｄ交換を示した。Ｄ２Ｏ中のＮａＯＤの追加のアリコートを加え（～０．１００ｍＬ）、撹拌を一晩続けた。Ｈ－Ｄ交換がＨＲＭＳ（ｄ０＝＜０．５％）によって完了したと判断された場合、反応混合物をＨＣｌでｐＨ＝７に中和し、凍結乾燥して２５ｍｇ（９３％、粗製）のＮ－アセチル－カダベリン－ｄ３を提供した。それは、それ以上の精製なしで使用された。高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）の質量電荷比（ｍ／ｚ）は、Ｃ７Ｈ１３Ｄ３Ｎ２Ｏ＋Ｈ］＋に対して１４６．１３７８と計算された。合成されたＮ－アセチル－カダベリン－ｄ３で観察されたｍ／ｚは１４６．１３８５であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）で分析した同位体分布は、ｄ０＝０％、ｄ１＝１％、ｄ２＝１１％、ｄ３＝７１％、ｄ４＝６％、ｄ５＝０％であった。
Ｄ２Ｏ（０．５０ｍＬ）中のＮ－アセチルカダベリン（２７ｍｇ、０．１８７ｍｍｏｌ、１．０当量）の撹拌懸濁液に、Ｄ２Ｏ中のＮａＯＤ（４０重量％、０．１００ｍＬ）を加えた。この混合物を４５℃で一晩撹拌したが、不完全なＨ－Ｄ交換を示した。Ｄ２Ｏ中のＮａＯＤの追加のアリコートを加え（～０．１００ｍＬ）、撹拌を一晩続けた。Ｈ－Ｄ交換がＨＲＭＳ（ｄ０＝＜０．５％）によって完了したと判断された場合、反応混合物をＨＣｌでｐＨ＝７に中和し、凍結乾燥して２５ｍｇ（９３％、粗製）のＮ－アセチル－カダベリン－ｄ３を提供した。それは、それ以上の精製なしで使用された。高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）の質量電荷比（ｍ／ｚ）は、Ｃ７Ｈ１３Ｄ３Ｎ２Ｏ＋Ｈ］＋に対して１４６．１３７８と計算された。合成されたＮ－アセチル－カダベリン－ｄ３で観察されたｍ／ｚは１４６．１３８５であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）で分析した同位体分布は、ｄ０＝０％、ｄ１＝１％、ｄ２＝１１％、ｄ３＝７１％、ｄ４＝６％、ｄ５＝０％であった。
５－アミノ吉草酸－ｄ ４
ＡＣＮ（０．２００ｍＬ）中のブロモペンタン酸－ｄ４（７５．０ｍｇ、０．４０５ｍｍｏｌ、１．０当量）の撹拌懸濁液に、ジベンジルアミン（７５．０、０．３８０ｍｍｏｌ、０．９４当量）を加えた。反応混合物を４０℃で数時間撹拌し、溶媒を除去した。残留物を１．５ｍＬのＥｔＯＨに取り、Ｈ２の雰囲気下で１０％Ｐｄ／Ｃ（２０．０ｍｇ）と共に一晩撹拌した。濾過後、溶媒を除去し、残留物を水に溶解し、凍結乾燥して、３８ｍｇ（７８％、粗製）の５－アミノ吉草酸－ｄ４を得て、これをさらに精製することなく使用した。高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）の質量電荷比（ｍ／ｚ）は、Ｃ５Ｈ７Ｄ４ＮＯ２－Ｈ］－について１２０．０９６８と計算された。合成された５－アミノ吉草酸－ｄ４で観察されたｍ／ｚは１２０．０９７３であった。
ＡＣＮ（０．２００ｍＬ）中のブロモペンタン酸－ｄ４（７５．０ｍｇ、０．４０５ｍｍｏｌ、１．０当量）の撹拌懸濁液に、ジベンジルアミン（７５．０、０．３８０ｍｍｏｌ、０．９４当量）を加えた。反応混合物を４０℃で数時間撹拌し、溶媒を除去した。残留物を１．５ｍＬのＥｔＯＨに取り、Ｈ２の雰囲気下で１０％Ｐｄ／Ｃ（２０．０ｍｇ）と共に一晩撹拌した。濾過後、溶媒を除去し、残留物を水に溶解し、凍結乾燥して、３８ｍｇ（７８％、粗製）の５－アミノ吉草酸－ｄ４を得て、これをさらに精製することなく使用した。高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）の質量電荷比（ｍ／ｚ）は、Ｃ５Ｈ７Ｄ４ＮＯ２－Ｈ］－について１２０．０９６８と計算された。合成された５－アミノ吉草酸－ｄ４で観察されたｍ／ｚは１２０．０９７３であった。
プロピオン酸イミダゾール－ｄ ３
Ｄ２Ｏ（１．０ｍＬ）中の４－イミダゾールアクリル酸（２０．０ｍｇ）の撹拌懸濁液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（２．５ｍｇ）および１０％Ｐｔ／Ｃ（２．５ｍｇ）を加えた。反応混合物をＨ２雰囲気下、６０℃で一晩撹拌した。Ｈ－Ｄ交換がＨＲＭＳ（ｄ０＝＜０．５％）によって完了したと判断された場合、反応混合物をろ過および濃縮して、５ｍｇ（２５％、粗製）のプロピオン酸イミダゾール－ｄ３を提供し、これをさらに精製することなく使用した。高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）の質量電荷比（ｍ／ｚ）は、Ｃ６Ｈ４Ｄ４Ｎ２Ｏ２－Ｈ］－について１４６．０７６４と計算された。合成されたプロピオン酸イミダゾール－ｄ３で観察されたｍ／ｚは１４３．０７７３であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）で分析した同位体分布は、ｄ０＝０％、ｄ１＝１％、ｄ２＝１２％、ｄ３＝２６％、ｄ４＝４５％、ｄ５＝１７％であった。
Ｄ２Ｏ（１．０ｍＬ）中の４－イミダゾールアクリル酸（２０．０ｍｇ）の撹拌懸濁液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（２．５ｍｇ）および１０％Ｐｔ／Ｃ（２．５ｍｇ）を加えた。反応混合物をＨ２雰囲気下、６０℃で一晩撹拌した。Ｈ－Ｄ交換がＨＲＭＳ（ｄ０＝＜０．５％）によって完了したと判断された場合、反応混合物をろ過および濃縮して、５ｍｇ（２５％、粗製）のプロピオン酸イミダゾール－ｄ３を提供し、これをさらに精製することなく使用した。高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）の質量電荷比（ｍ／ｚ）は、Ｃ６Ｈ４Ｄ４Ｎ２Ｏ２－Ｈ］－について１４６．０７６４と計算された。合成されたプロピオン酸イミダゾール－ｄ３で観察されたｍ／ｚは１４３．０７７３であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）で分析した同位体分布は、ｄ０＝０％、ｄ１＝１％、ｄ２＝１２％、ｄ３＝２６％、ｄ４＝４５％、ｄ５＝１７％であった。
β－イミダゾール乳酸－ｄ ３
Ｄ２Ｏ（２．５ｍＬ）中のヒスチジン一塩酸塩一水和物（７５．０ｍｇ、０．３５８ｍｍｏｌ）の撹拌懸濁液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（２．５ｍｇ）および５％Ｐｔ／Ｃ（２．５ｍｇ）を加えた。反応混合物をＨ２雰囲気下、６０℃で一晩撹拌した。Ｈ－Ｄ交換がＨＲＭＳによって完了したと判断された場合（ｄ０＝＜０．５％）、反応混合物をろ過し、オイルに濃縮した。これは、さらに精製することなく次の工程で使用した。この残留物を８：２水／ＨＯＡｃ（１ｍＬ）に溶解し、２Ｍ ＮａＮＯ２（０．３５ｍＬ水に溶解した４９．０ｍｇ（２．０ｅｑ））で処理した。一晩撹拌した後、溶媒を蒸発させ、残留物をＭｅＯＨで粉砕した。上澄みを濾過し、乾燥させて、４５．０ｍｇ（６０％、粗製）のβ－イミダゾール乳酸－ｄ３を得て、これをさらに精製することなく使用した。高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）の質量電荷比（ｍ／ｚ）は、Ｃ６Ｈ５Ｄ３Ｎ２Ｏ３－Ｈ］－について１５８．０６５０と計算された。合成されたβ－イミダゾール乳酸－ｄ３で観察されたｍ／ｚは１５８．０６４８であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）で分析した同位体分布は、ｄ０＝０％、ｄ１＝５％、ｄ２＝５１％、ｄ３＝３６％、ｄ４＝８％、ｄ５＝１％であった。
Ｄ２Ｏ（２．５ｍＬ）中のヒスチジン一塩酸塩一水和物（７５．０ｍｇ、０．３５８ｍｍｏｌ）の撹拌懸濁液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（２．５ｍｇ）および５％Ｐｔ／Ｃ（２．５ｍｇ）を加えた。反応混合物をＨ２雰囲気下、６０℃で一晩撹拌した。Ｈ－Ｄ交換がＨＲＭＳによって完了したと判断された場合（ｄ０＝＜０．５％）、反応混合物をろ過し、オイルに濃縮した。これは、さらに精製することなく次の工程で使用した。この残留物を８：２水／ＨＯＡｃ（１ｍＬ）に溶解し、２Ｍ ＮａＮＯ２（０．３５ｍＬ水に溶解した４９．０ｍｇ（２．０ｅｑ））で処理した。一晩撹拌した後、溶媒を蒸発させ、残留物をＭｅＯＨで粉砕した。上澄みを濾過し、乾燥させて、４５．０ｍｇ（６０％、粗製）のβ－イミダゾール乳酸－ｄ３を得て、これをさらに精製することなく使用した。高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）の質量電荷比（ｍ／ｚ）は、Ｃ６Ｈ５Ｄ３Ｎ２Ｏ３－Ｈ］－について１５８．０６５０と計算された。合成されたβ－イミダゾール乳酸－ｄ３で観察されたｍ／ｚは１５８．０６４８であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）で分析した同位体分布は、ｄ０＝０％、ｄ１＝５％、ｄ２＝５１％、ｄ３＝３６％、ｄ４＝８％、ｄ５＝１％であった。
Ｎ－パルミトイルセリノール－ｄ ３
ヘキサデセン酸－３（２５．０ｍｇ、０．０９６６ｍｍｏｌ、１．０当量）、セリノール（８．８０ｍｇ、０．９６６ｍｍｏｌ、１．０当量）、およびＨＢＴＵ（３１．０ｍｇ、０．１１６ｍｍｏｌ、１．２当量）のＤＭＦ（１．０ｍＬ）中の撹拌懸濁液に、ＤＩＰＥＡ（６７．０μＬ、０．３８６ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）を加えた。すぐに沈殿物が形成された。室温で一晩撹拌した後、反応混合物を水で希釈し、固体を吸引濾過によって収集して、１７．９ｍｇのＮ－パルミトイルセリノール－ｄ３（５６％）を得て、これをさらに精製することなく使用した。高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）の質量電荷比（ｍ／ｚ）は、Ｃ１９Ｈ３６Ｄ３ＮＯ３－Ｈ］－について３３１．３０４５と計算された。合成されたＮ－パルミトイルセリノール－ｄ３で観察されたｍ／ｚは３３１．３０４５であった。
ヘキサデセン酸－３（２５．０ｍｇ、０．０９６６ｍｍｏｌ、１．０当量）、セリノール（８．８０ｍｇ、０．９６６ｍｍｏｌ、１．０当量）、およびＨＢＴＵ（３１．０ｍｇ、０．１１６ｍｍｏｌ、１．２当量）のＤＭＦ（１．０ｍＬ）中の撹拌懸濁液に、ＤＩＰＥＡ（６７．０μＬ、０．３８６ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）を加えた。すぐに沈殿物が形成された。室温で一晩撹拌した後、反応混合物を水で希釈し、固体を吸引濾過によって収集して、１７．９ｍｇのＮ－パルミトイルセリノール－ｄ３（５６％）を得て、これをさらに精製することなく使用した。高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）の質量電荷比（ｍ／ｚ）は、Ｃ１９Ｈ３６Ｄ３ＮＯ３－Ｈ］－について３３１．３０４５と計算された。合成されたＮ－パルミトイルセリノール－ｄ３で観察されたｍ／ｚは３３１．３０４５であった。
シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）－ｄ ３
Ｄ２Ｏ（１．０ｍＬ）中のシクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）（２５．０ｍｇ）の撹拌懸濁液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（４．０ｍｇ）および５％Ｐｔ／Ｃ（４．０ｍｇ）を加えた。反応混合物をＨ２雰囲気下、１００℃で４８時間撹拌した。Ｈ－Ｄ交換がＨＲＭＳによって完了したと判断された場合（ｄ０＝＜０．５％）、反応混合物をろ過して凍結乾燥し、１９．０ｍｇ（７６％、粗製）のシクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）－ｄ３を得て、これをさらに精製せずに使用した。高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）の質量電荷比（ｍ／ｚ）は、Ｃ１１Ｈ１１Ｄ３Ｎ４Ｏ２－Ｈ］－について２３６．１２３２と計算された。合成されたシクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）－ｄ３で観察されたｍ／ｚは２３６．１２３７であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）で分析した同位体分布は、ｄ０＝０％、ｄ１＝３％、ｄ２＝２３％、ｄ３＝４７％、ｄ４＝２４％、ｄ５＝３％であった。
Ｄ２Ｏ（１．０ｍＬ）中のシクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）（２５．０ｍｇ）の撹拌懸濁液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（４．０ｍｇ）および５％Ｐｔ／Ｃ（４．０ｍｇ）を加えた。反応混合物をＨ２雰囲気下、１００℃で４８時間撹拌した。Ｈ－Ｄ交換がＨＲＭＳによって完了したと判断された場合（ｄ０＝＜０．５％）、反応混合物をろ過して凍結乾燥し、１９．０ｍｇ（７６％、粗製）のシクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）－ｄ３を得て、これをさらに精製せずに使用した。高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）の質量電荷比（ｍ／ｚ）は、Ｃ１１Ｈ１１Ｄ３Ｎ４Ｏ２－Ｈ］－について２３６．１２３２と計算された。合成されたシクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）－ｄ３で観察されたｍ／ｚは２３６．１２３７であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）で分析した同位体分布は、ｄ０＝０％、ｄ１＝３％、ｄ２＝２３％、ｄ３＝４７％、ｄ４＝２４％、ｄ５＝３％であった。
シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）－ｄ ３
Ｄ２Ｏ（１．０ｍＬ）中のシクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）（２５．０ｍｇ）の撹拌懸濁液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（４．０ｍｇ）および５％Ｐｔ／Ｃ（４．０ｍｇ）を加えた。反応混合物をＨ２雰囲気下、１００℃で４８時間撹拌した。Ｈ－Ｄ交換がＨＲＭＳ（ｄ０＝＜０．５％）によって完了したと判断された場合、反応混合物をろ過して凍結乾燥し、ジアステレオマーとして存在した１９ｍｇ（７６％、粗製）のシクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）－ｄ３を生成した。化合物をさらに精製することなく使用した。高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）の質量電荷比（ｍ／ｚ）は、Ｃ９Ｈ１１Ｄ３Ｎ２Ｏ３－Ｈ］－について２０２．１２６５と計算された。合成されたシクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）－ｄ３で観察されたｍ／ｚは２０２．１２６０であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）で分析した同位体分布は、ｄ０＝０％、ｄ１＝１％、ｄ２＝２４％、ｄ３＝３９％、ｄ４＝１７％、ｄ５＝１０％、ｄ６＝５％、ｄ７＝３％であった。
Ｄ２Ｏ（１．０ｍＬ）中のシクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）（２５．０ｍｇ）の撹拌懸濁液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（４．０ｍｇ）および５％Ｐｔ／Ｃ（４．０ｍｇ）を加えた。反応混合物をＨ２雰囲気下、１００℃で４８時間撹拌した。Ｈ－Ｄ交換がＨＲＭＳ（ｄ０＝＜０．５％）によって完了したと判断された場合、反応混合物をろ過して凍結乾燥し、ジアステレオマーとして存在した１９ｍｇ（７６％、粗製）のシクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）－ｄ３を生成した。化合物をさらに精製することなく使用した。高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）の質量電荷比（ｍ／ｚ）は、Ｃ９Ｈ１１Ｄ３Ｎ２Ｏ３－Ｈ］－について２０２．１２６５と計算された。合成されたシクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）－ｄ３で観察されたｍ／ｚは２０２．１２６０であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）で分析した同位体分布は、ｄ０＝０％、ｄ１＝１％、ｄ２＝２４％、ｄ３＝３９％、ｄ４＝１７％、ｄ５＝１０％、ｄ６＝５％、ｄ７＝３％であった。
シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）－ｄ ４
Ｄ２Ｏ（１．０ｍＬ）中のシクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）（２５．０ｍｇ）の撹拌懸濁液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（４．０ｍｇ）および５％Ｐｔ／Ｃ（４．０ｍｇ）を加えた。反応混合物をＨ２雰囲気下、１００℃で４８時間撹拌した。Ｈ－Ｄ交換がＨＲＭＳ（ｄ０＝＜０．５％）によって完了したと判断された場合、反応混合物をろ過し、凍結乾燥して１８ｍｇ（７２％、粗製）のシクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）－ｄ４を得、これをさらに精製することなく使用した。高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）の質量電荷比（ｍ／ｚ）は、Ｃ８Ｈ６Ｄ４Ｎ４Ｏ２＋Ｈ］＋に対して１９９．１１２８と計算された。合成されたシクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）－ｄ４で観察されたｍ／ｚは１９９．１１１７であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）で分析した同位体分布は、ｄ０＝０％、ｄ１＝１％、ｄ２＝９％、ｄ３＝３４％、ｄ４＝４０％、ｄ５＝１４％、ｄ６＝１％であった。
Ｄ２Ｏ（１．０ｍＬ）中のシクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）（２５．０ｍｇ）の撹拌懸濁液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（４．０ｍｇ）および５％Ｐｔ／Ｃ（４．０ｍｇ）を加えた。反応混合物をＨ２雰囲気下、１００℃で４８時間撹拌した。Ｈ－Ｄ交換がＨＲＭＳ（ｄ０＝＜０．５％）によって完了したと判断された場合、反応混合物をろ過し、凍結乾燥して１８ｍｇ（７２％、粗製）のシクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）－ｄ４を得、これをさらに精製することなく使用した。高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）の質量電荷比（ｍ／ｚ）は、Ｃ８Ｈ６Ｄ４Ｎ４Ｏ２＋Ｈ］＋に対して１９９．１１２８と計算された。合成されたシクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）－ｄ４で観察されたｍ／ｚは１９９．１１１７であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）で分析した同位体分布は、ｄ０＝０％、ｄ１＝１％、ｄ２＝９％、ｄ３＝３４％、ｄ４＝４０％、ｄ５＝１４％、ｄ６＝１％であった。
２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート－ｄ ６
Ｄ２Ｏ（２．０ｍＬ）中の（４－ヒドロキシフェニル）－２－プロピオン酸（３０．０ｍｇ）の撹拌懸濁液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（２．０ｍｇ）および５％Ｐｔ／Ｃ（２．０ｍｇ）を加えた。反応混合物をＨ２雰囲気下、密閉管内で１８０℃で一晩撹拌した。Ｈ－Ｄ交換がＨＲＭＳ（ｄ０＝＜０．５％）によって完了したと判断された場合、反応混合物をろ過および凍結乾燥して、２３ｍｇ（７７％、粗製）の２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート－ｄ６を得て、これをさらに精製せずに使用した。高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）の質量電荷比（ｍ／ｚ）は、Ｃ９Ｈ４Ｄ６Ｏ３－Ｈ］－について１７１．０９３４と計算された。合成された２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート－ｄ６で観察されたｍ／ｚは１７１．０９３９であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）で分析した同位体分布は、ｄ０＝０％、ｄ１＝０％、ｄ２＝１０％、ｄ３＝２４％、ｄ４＝１３％、ｄ５＝１２％、ｄ６＝３２％、ｄ７＝８％であった。
Ｄ２Ｏ（２．０ｍＬ）中の（４－ヒドロキシフェニル）－２－プロピオン酸（３０．０ｍｇ）の撹拌懸濁液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（２．０ｍｇ）および５％Ｐｔ／Ｃ（２．０ｍｇ）を加えた。反応混合物をＨ２雰囲気下、密閉管内で１８０℃で一晩撹拌した。Ｈ－Ｄ交換がＨＲＭＳ（ｄ０＝＜０．５％）によって完了したと判断された場合、反応混合物をろ過および凍結乾燥して、２３ｍｇ（７７％、粗製）の２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート－ｄ６を得て、これをさらに精製せずに使用した。高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）の質量電荷比（ｍ／ｚ）は、Ｃ９Ｈ４Ｄ６Ｏ３－Ｈ］－について１７１．０９３４と計算された。合成された２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート－ｄ６で観察されたｍ／ｚは１７１．０９３９であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）で分析した同位体分布は、ｄ０＝０％、ｄ１＝０％、ｄ２＝１０％、ｄ３＝２４％、ｄ４＝１３％、ｄ５＝１２％、ｄ６＝３２％、ｄ７＝８％であった。
ナリンゲニン－ｄ ３ ナトリウム塩
Ｄ２Ｏ（２．０ｍＬ）中のナリンゲニン（３０．０ｍｇ）の撹拌懸濁液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（３．５ｍｇ）を加えた。反応混合物をＨ２雰囲気下、密閉管内で一晩、１６０℃で撹拌した。ＨＲＭＳによってＨ－Ｄ交換が完了したと判断された場合（ｄ０＝＜０．５％）、反応混合物を冷却し、生成物を沈殿させた。１滴の６Ｍ ＮａＯＨを使用して生成物を可溶性Ｎａ＋塩に変換し、混合物を濾過および凍結乾燥して、３６．０ｍｇ（１１３％、粗製）のナリンゲニン－ｄ３ナトリウム塩を得て、これをさらに精製することなく使用した。高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）の質量電荷比（ｍ／ｚ）は、Ｃ１５Ｈ９Ｄ３Ｏ５－Ｈ］－について２７４．０８００と計算された。合成されたナリンゲニン－ｄ３ナトリウム塩で観察されたｍ／ｚは２７４．０７８３であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）で分析した同位体分布は、ｄ０＝０％、ｄ１＝２％、ｄ２＝１６％、ｄ３＝６７％、ｄ４＝１５％であった。
Ｄ２Ｏ（２．０ｍＬ）中のナリンゲニン（３０．０ｍｇ）の撹拌懸濁液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（３．５ｍｇ）を加えた。反応混合物をＨ２雰囲気下、密閉管内で一晩、１６０℃で撹拌した。ＨＲＭＳによってＨ－Ｄ交換が完了したと判断された場合（ｄ０＝＜０．５％）、反応混合物を冷却し、生成物を沈殿させた。１滴の６Ｍ ＮａＯＨを使用して生成物を可溶性Ｎａ＋塩に変換し、混合物を濾過および凍結乾燥して、３６．０ｍｇ（１１３％、粗製）のナリンゲニン－ｄ３ナトリウム塩を得て、これをさらに精製することなく使用した。高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）の質量電荷比（ｍ／ｚ）は、Ｃ１５Ｈ９Ｄ３Ｏ５－Ｈ］－について２７４．０８００と計算された。合成されたナリンゲニン－ｄ３ナトリウム塩で観察されたｍ／ｚは２７４．０７８３であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）で分析した同位体分布は、ｄ０＝０％、ｄ１＝２％、ｄ２＝１６％、ｄ３＝６７％、ｄ４＝１５％であった。
フェノールサルフェート－ｄ ３
ピリジン（１．０ｍＬ）中のフェン－２，４，６－ｄ３－オール（２０．０ｍｇ、０．２０８ｍｍｏｌ、１．０当量）の撹拌懸濁液に、ＳＯ３－Ｐｙｒ（３８．０ｍｇ、０．２３９ｍｍｏｌ、１．１５当量）を加えた。反応混合物を６０℃で一晩撹拌し、冷却し、そして溶媒を窒素流下で除去して、４１．０ｍｇ（１１１％、粗製）のフェノールサルフェート－ｄ３を得て、これをさらに精製することなく使用した。高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）の質量電荷比（ｍ／ｚ）は、Ｃ６Ｈ３Ｄ３Ｏ４Ｓ－Ｈ］－について１７６．０１０２と計算された。合成されたフェノールサルフェート－ｄ３で観察されたｍ／ｚは１７６．０１０６であった。
ピリジン（１．０ｍＬ）中のフェン－２，４，６－ｄ３－オール（２０．０ｍｇ、０．２０８ｍｍｏｌ、１．０当量）の撹拌懸濁液に、ＳＯ３－Ｐｙｒ（３８．０ｍｇ、０．２３９ｍｍｏｌ、１．１５当量）を加えた。反応混合物を６０℃で一晩撹拌し、冷却し、そして溶媒を窒素流下で除去して、４１．０ｍｇ（１１１％、粗製）のフェノールサルフェート－ｄ３を得て、これをさらに精製することなく使用した。高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）の質量電荷比（ｍ／ｚ）は、Ｃ６Ｈ３Ｄ３Ｏ４Ｓ－Ｈ］－について１７６．０１０２と計算された。合成されたフェノールサルフェート－ｄ３で観察されたｍ／ｚは１７６．０１０６であった。
エチルフェニルサルフェート－ｄ ４
ピリジン（１．０ｍＬ）中の４－エチルフェノール－２，３，５，６－ｄ４（５０．０ｍｇ、０．３９４ｍｍｏｌ、１．０当量）の撹拌懸濁液に、ＳＯ３－Ｐｙｒ（９３．０ｍｇ、０．５９１ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を加えた。反応混合物を６０℃で一晩、次に室温で１週間撹拌した。溶媒を窒素流下で除去した。固体をＥｔＯＡｃで粉砕し、濾過し、溶媒を除去して、９０ｍｇ（１３４％、粗製）のエチルフェニルサルフェート－ｄ４を得て、これをさらに精製することなく使用した。高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）の質量電荷比（ｍ／ｚ）は、Ｃ８Ｈ６Ｄ４Ｏ４Ｓ－Ｈ］－の場合２０５．０４７８と計算された。合成されたエチルフェニルサルフェート－ｄ４で観察されたｍ／ｚは２０５．０４７９であった。
ピリジン（１．０ｍＬ）中の４－エチルフェノール－２，３，５，６－ｄ４（５０．０ｍｇ、０．３９４ｍｍｏｌ、１．０当量）の撹拌懸濁液に、ＳＯ３－Ｐｙｒ（９３．０ｍｇ、０．５９１ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を加えた。反応混合物を６０℃で一晩、次に室温で１週間撹拌した。溶媒を窒素流下で除去した。固体をＥｔＯＡｃで粉砕し、濾過し、溶媒を除去して、９０ｍｇ（１３４％、粗製）のエチルフェニルサルフェート－ｄ４を得て、これをさらに精製することなく使用した。高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）の質量電荷比（ｍ／ｚ）は、Ｃ８Ｈ６Ｄ４Ｏ４Ｓ－Ｈ］－の場合２０５．０４７８と計算された。合成されたエチルフェニルサルフェート－ｄ４で観察されたｍ／ｚは２０５．０４７９であった。
ラフィノース－ｄ ９
Ｄ２Ｏ（１．０ｍＬ）中のラフィノース（２０．０ｍｇ）の撹拌懸濁液に、５％Ｒｕ／Ｃ（３．０ｍｇ）を加えた。反応混合物をＨ２雰囲気下、８０℃で一晩撹拌した。Ｈ－Ｄ交換がＨＲＭＳ（ｄ０＝＜０．５％）によって完了したと判断された場合、反応混合物をろ過および凍結乾燥して１２．０ｍｇ（８０％、粗製）のラフィノース－ｄ９を得、これをさらに精製することなく使用した。高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）の質量電荷比（ｍ／ｚ）は、Ｃ１８Ｈ２３Ｄ９Ｏ１６－Ｈ］－について５１３．２１８２と計算された。合成されたラフィノース－ｄ９で観察されたｍ／ｚは５１３．２２５８であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）で分析した同位体分布は、ｄ０＝０％、ｄ１＝０％、ｄ２＝０％、ｄ３＝０％、ｄ４＝０％、ｄ５＝０％、ｄ６＝１％、ｄ７＝５％、ｄ８＝１２％、ｄ９＝２１％、ｄ１０＝２４％、ｄ１１＝１９％、ｄ１２＝１０％、ｄ１３＝４％、ｄ１４＝４％、ｄ１５＝１％であった。
Ｄ２Ｏ（１．０ｍＬ）中のラフィノース（２０．０ｍｇ）の撹拌懸濁液に、５％Ｒｕ／Ｃ（３．０ｍｇ）を加えた。反応混合物をＨ２雰囲気下、８０℃で一晩撹拌した。Ｈ－Ｄ交換がＨＲＭＳ（ｄ０＝＜０．５％）によって完了したと判断された場合、反応混合物をろ過および凍結乾燥して１２．０ｍｇ（８０％、粗製）のラフィノース－ｄ９を得、これをさらに精製することなく使用した。高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）の質量電荷比（ｍ／ｚ）は、Ｃ１８Ｈ２３Ｄ９Ｏ１６－Ｈ］－について５１３．２１８２と計算された。合成されたラフィノース－ｄ９で観察されたｍ／ｚは５１３．２２５８であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）で分析した同位体分布は、ｄ０＝０％、ｄ１＝０％、ｄ２＝０％、ｄ３＝０％、ｄ４＝０％、ｄ５＝０％、ｄ６＝１％、ｄ７＝５％、ｄ８＝１２％、ｄ９＝２１％、ｄ１０＝２４％、ｄ１１＝１９％、ｄ１２＝１０％、ｄ１３＝４％、ｄ１４＝４％、ｄ１５＝１％であった。
スタキオース－ｄ ７
Ｄ２Ｏ（１．０ｍＬ）中のスタキオース（１５．０ｍｇ）の撹拌懸濁液に、５％Ｒｕ／Ｃ（３．０ｍｇ）を加えた。反応混合物をＨ２雰囲気下、８０℃で一晩撹拌した。Ｈ－Ｄ交換がＨＲＭＳ（ｄ０＝＜０．５％）によって完了したと判断された場合、反応混合物をろ過および凍結乾燥して、１２ｍｇ（８０％、粗製）のスタキオース－ｄ７を得て、これをさらに精製することなく使用した。高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）の質量電荷比（ｍ／ｚ）は、Ｃ１８Ｈ２３Ｄ９Ｏ１６－Ｈ］－で６７２．２５８５と計算された。合成されたスタキオース－ｄ７で観察されたｍ／ｚは６７２．２６００であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）で分析した同位体分布は、ｄ０＝０％、ｄ１＝０％、ｄ２＝０％、ｄ３＝１％、ｄ４＝４％、ｄ５＝１１％、ｄ６＝１７％、ｄ７＝２１％、ｄ８＝１８％、ｄ９＝１３％、ｄ１０＝７％、ｄ１１＝４％、ｄ１２＝２％であった。
Ｄ２Ｏ（１．０ｍＬ）中のスタキオース（１５．０ｍｇ）の撹拌懸濁液に、５％Ｒｕ／Ｃ（３．０ｍｇ）を加えた。反応混合物をＨ２雰囲気下、８０℃で一晩撹拌した。Ｈ－Ｄ交換がＨＲＭＳ（ｄ０＝＜０．５％）によって完了したと判断された場合、反応混合物をろ過および凍結乾燥して、１２ｍｇ（８０％、粗製）のスタキオース－ｄ７を得て、これをさらに精製することなく使用した。高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）の質量電荷比（ｍ／ｚ）は、Ｃ１８Ｈ２３Ｄ９Ｏ１６－Ｈ］－で６７２．２５８５と計算された。合成されたスタキオース－ｄ７で観察されたｍ／ｚは６７２．２６００であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）で分析した同位体分布は、ｄ０＝０％、ｄ１＝０％、ｄ２＝０％、ｄ３＝１％、ｄ４＝４％、ｄ５＝１１％、ｄ６＝１７％、ｄ７＝２１％、ｄ８＝１８％、ｄ９＝１３％、ｄ１０＝７％、ｄ１１＝４％、ｄ１２＝２％であった。
カテコールサルフェート－ １３ Ｃ ６
ピリジン（５０μＬ）中の１３Ｃ６標識カテコール（２．５ｍｇ、０．０２１５４ｍｍｏｌ、１．０当量）の撹拌溶液に、ＳＯ３－Ｐｙｒ（３．８ｍｇ、０．０２３６９ｍｍｏｌ、１．１当量）を加えた。反応混合物を４０℃で数時間撹拌したが、出発物質は完全には消費されなかった。ＳＯ３－Ｐｙｒの追加のアリコート（２．０ｍｇ）に追加のピリジン（～２００μＬ）を加え、混合物を一晩撹拌した。一部の出発物質が残ったが、反応混合物を１Ｍ ＫＯＨ（１５０μＬ）でクエンチした。この溶液を２－プロパノール（２ｍＬ）に滴下し、混合物を遠心分離し、上澄みをデカントした。このプロセスを２回繰り返し、得られた残留物を真空下で乾燥させて、カテコールサルフェート－１３Ｃ６（約１０ｍｇ）を得て、これをさらに精製することなく使用した。１３Ｃ６Ｈ６Ｏ２Ｓ－Ｈ］－について計算されたＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚは１９５．００６４であった。合成されたカテコールサルフェート－１３Ｃ６で観察されたｍ／ｚは１９５．００８０であった。
ピリジン（５０μＬ）中の１３Ｃ６標識カテコール（２．５ｍｇ、０．０２１５４ｍｍｏｌ、１．０当量）の撹拌溶液に、ＳＯ３－Ｐｙｒ（３．８ｍｇ、０．０２３６９ｍｍｏｌ、１．１当量）を加えた。反応混合物を４０℃で数時間撹拌したが、出発物質は完全には消費されなかった。ＳＯ３－Ｐｙｒの追加のアリコート（２．０ｍｇ）に追加のピリジン（～２００μＬ）を加え、混合物を一晩撹拌した。一部の出発物質が残ったが、反応混合物を１Ｍ ＫＯＨ（１５０μＬ）でクエンチした。この溶液を２－プロパノール（２ｍＬ）に滴下し、混合物を遠心分離し、上澄みをデカントした。このプロセスを２回繰り返し、得られた残留物を真空下で乾燥させて、カテコールサルフェート－１３Ｃ６（約１０ｍｇ）を得て、これをさらに精製することなく使用した。１３Ｃ６Ｈ６Ｏ２Ｓ－Ｈ］－について計算されたＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚは１９５．００６４であった。合成されたカテコールサルフェート－１３Ｃ６で観察されたｍ／ｚは１９５．００８０であった。
ＩＩＩ．内部標準の調製
作業用内部標準（ＷＩＳ）溶液は、水：アセトニトリル（１：１）中で表１に示される濃度で調製された。いくつかの例では、異なるサンプルタイプに対して異なるＷＩＳ濃度が必要になる場合がある。当業者は、所与のサンプルタイプのＷＩＳを決定する方法を理解するであろう。
作業用内部標準（ＷＩＳ）溶液は、水：アセトニトリル（１：１）中で表１に示される濃度で調製された。いくつかの例では、異なるサンプルタイプに対して異なるＷＩＳ濃度が必要になる場合がある。当業者は、所与のサンプルタイプのＷＩＳを決定する方法を理解するであろう。
ＩＶ．キャリブレーション標準の合成
本明細書に記載の方法で使用されるカテコールサルフェートの較正標準は、商業的供給源から入手できず、社内で合成された。
本明細書に記載の方法で使用されるカテコールサルフェートの較正標準は、商業的供給源から入手できず、社内で合成された。
カテコールサルフェート、二カリウム塩
ピリジン（１．７５ｍＬ）中のカテコール（４２４ｍｇ、３．８５ｍｍｏｌ、１．０当量）の撹拌溶液に、ＳＯ３－Ｐｙｒ（６６５ｍｇ、４．２０ｍｍｏｌ、１．１当量）を加えた。反応混合物を４０℃で数時間撹拌し、１Ｍ ＫＯＨ（１７．５ｍＬ）でクエンチした。この溶液の約半分を２－プロパノールに滴下した。最初、生成物は固体として沈殿したが、最終的には油を塗った。混合物を遠心分離し、上澄みをデカントした。この粉砕プロセスを２回繰り返し、得られた残留物を真空下で乾燥させて、カテコールサルフェート、二カリウム塩（約２００ｍｇ）を固体として得、これをさらに精製することなく使用した。定量的ＮＭＲ分析は、おそらく硫酸カリウムとの混合物中の二カリウム塩として、材料が約３６％純粋であることを示した。Ｃ６Ｈ６Ｏ２Ｓ－Ｈ］－について計算されたＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚは１８８．９８６３であった。カテコールサルフェート、二カリウム塩で観察されたｍ／ｚは１８８．９８６０であった。１Ｈ ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ；Ｄ２Ｏ）；δ（ｐｐｍ）７．３４－７．２８（ｄｄ、１Ｈ）；７．０５－７．０１（ｄｔ、１Ｈ）；６．７６－６．７４（ｄｄ、１Ｈ）、６．５６－６．５３（ｄｔ、１Ｈ）。
ピリジン（１．７５ｍＬ）中のカテコール（４２４ｍｇ、３．８５ｍｍｏｌ、１．０当量）の撹拌溶液に、ＳＯ３－Ｐｙｒ（６６５ｍｇ、４．２０ｍｍｏｌ、１．１当量）を加えた。反応混合物を４０℃で数時間撹拌し、１Ｍ ＫＯＨ（１７．５ｍＬ）でクエンチした。この溶液の約半分を２－プロパノールに滴下した。最初、生成物は固体として沈殿したが、最終的には油を塗った。混合物を遠心分離し、上澄みをデカントした。この粉砕プロセスを２回繰り返し、得られた残留物を真空下で乾燥させて、カテコールサルフェート、二カリウム塩（約２００ｍｇ）を固体として得、これをさらに精製することなく使用した。定量的ＮＭＲ分析は、おそらく硫酸カリウムとの混合物中の二カリウム塩として、材料が約３６％純粋であることを示した。Ｃ６Ｈ６Ｏ２Ｓ－Ｈ］－について計算されたＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚは１８８．９８６３であった。カテコールサルフェート、二カリウム塩で観察されたｍ／ｚは１８８．９８６０であった。１Ｈ ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ；Ｄ２Ｏ）；δ（ｐｐｍ）７．３４－７．２８（ｄｄ、１Ｈ）；７．０５－７．０１（ｄｔ、１Ｈ）；６．７６－６．７４（ｄｄ、１Ｈ）、６．５６－６．５３（ｄｔ、１Ｈ）。
Ｖ．校正範囲の決定
各分析物の較正範囲は、既知の濃度の較正標準をスパイクした溶液を使用して決定された。各分析物について、ＬＬＯＱはキャリブレーション範囲の下限を表し、キャリブレーション範囲の上限はＵＬＯＱで表される。
各分析物の較正範囲は、既知の濃度の較正標準をスパイクした溶液を使用して決定された。各分析物について、ＬＬＯＱはキャリブレーション範囲の下限を表し、キャリブレーション範囲の上限はＵＬＯＱで表される。
一例では、糞便サンプルの較正範囲をカバーするために、８つの較正標準（表２の標準Ａ～Ｈ）が使用された。
別の例では、血清サンプル中の較正範囲をカバーするために、以下の較正範囲が使用された：４－エチルフェニルサルフェートについては１．００～４００ｎｇ／ｍＬ、ｐ－クレゾールサルフェートについては５．００～２０００ｎｇ／ｍＬ、３－インドキシルサルフェートの場合は１０．０～４０００ｎｇ／ｍＬ、カテコールサルフェートの場合は１０．０～４０００ｎｇ／ｍＬ、インドールラクテートの場合は１０．０～４０００ｎｇ／ｍＬ、インドールプロピオネートの場合は５．００～２０００ｎｇ／ｍＬ、トリメチルアミンオキシド（ＴＭＡＯ）の場合は７．５０～３０００ｎｇ／ｍＬ。
当業者は、過度の実験なしに、追加の分析物および／またはサンプルタイプの較正範囲を決定する方法を理解するであろう。キャリブレーションスパイク溶液は、対応するキャリブレーション濃度の１００倍または２５０倍で調製できる。スパイク溶液は、分析作業用の複合キャリブレーション標準を作成するために使用される。
ＶＩ．サンプル調製
固体サンプル
約２０ｍｇの実験サンプル材料（ヒトの糞便材料）を１．５ｍＬのチューブに量り入れ、正確な重量を記録した。糞便サンプルなどの一部の固体サンプルでは、サンプルを計量する前にサンプルを乾燥させるために凍結乾燥が必要になる場合がある。
固体サンプル
約２０ｍｇの実験サンプル材料（ヒトの糞便材料）を１．５ｍＬのチューブに量り入れ、正確な重量を記録した。糞便サンプルなどの一部の固体サンプルでは、サンプルを計量する前にサンプルを乾燥させるために凍結乾燥が必要になる場合がある。
糞便用のＱＣサンプルは、糞便サンプルをプールし、分析物で強化するか、または必要に応じてＰＢＳまたは水で希釈して、所望の分析物レベルを得ることによって調製した。使用前は、すべてのＱＣサンプルを－８０℃で保存した。
較正標準、ブランク、およびブランク－ＩＳサンプルの場合、２０．０μＬの水を１．５ｍＬチューブに加えた。ＱＣサンプルの場合、実験サンプルタイプに対応する約２０．０ｍｇのＱＣサンプル材料を１．５ｍＬチューブに追加し、正確な重量を記録した。複合キャリブレーション標準の場合、測定する各分析物に対して決定されたキャリブレーション範囲に対応する８０．０μＬのキャリブレーション溶液を、対応する複合キャリブレーション標準チューブ（ＡＨなど）に追加し、８０．０μＬのエタノール／アセトニトリル／標準、ブランク－ＩＳ、ＱＣ、および実験サンプルに水（２：１：１）を追加した。２０．０μＬのＷＩＳ溶液を、キャリブレーション標準、ブランク－ＩＳ、ＱＣ、および実験サンプルの組み合わせに追加し、２０．０μＬのアセトン／水（１：１）をブランクサンプルに追加した。
液体サンプル
５０．０μｌの実験サンプル（猫血清）をマイクロタイタープレートのウェルに加えた。血清のＱＣサンプルは、１２の血清ロットをプールし、プールされたサンプルのアリコートを採取することによって調製された。分析物は内因性レベルであった。すべてのＱＣサンプルは、分析に使用するまで－８０℃で保存した。
５０．０μｌの実験サンプル（猫血清）をマイクロタイタープレートのウェルに加えた。血清のＱＣサンプルは、１２の血清ロットをプールし、プールされたサンプルのアリコートを採取することによって調製された。分析物は内因性レベルであった。すべてのＱＣサンプルは、分析に使用するまで－８０℃で保存した。
ブランクおよびブランク－ＩＳサンプルの場合、５０．０μＬの水をマイクロタイタープレートのウェルに加えた。キャリブレーション標準の場合、５０．０μＬの対応するキャリブレーション溶液をマイクロタイタープレートのウェルに加えた。ＱＣサンプルの場合、対応するサンプルタイプのＱＣサンプル材料５０．０μＬをマイクロタイタープレートのウェルに添加した。２０．０μＬのＷＩＳ溶液をキャリブレーション標準、ブランク－ＩＳ、ＱＣサンプル、および実験サンプルに追加し、２０．０μＬの水をブランクサンプルに追加した。
ＶＩＩ．抽出
クロマトグラフィー法１～３の場合、タンパク質を沈殿させ、７０％メタノール中の２００μＬの１％ギ酸をすべてのサンプルに加えることによって分析物を抽出し、サンプルを５分間振とうまたはボルテックスし、続いて４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。１５０μＬの透明な上清を新しい９６ウェルプレートに移した。プレートに蓋をして、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析にかけた。
クロマトグラフィー法１～３の場合、タンパク質を沈殿させ、７０％メタノール中の２００μＬの１％ギ酸をすべてのサンプルに加えることによって分析物を抽出し、サンプルを５分間振とうまたはボルテックスし、続いて４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。１５０μＬの透明な上清を新しい９６ウェルプレートに移した。プレートに蓋をして、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析にかけた。
クロマトグラフィー法４および５では、４０μＬのＡＣＮ／水をブランクサンプルに加え、２０μＬのＡＣＮ／水をブランク－ＩＳ、ＱＣ、および実験サンプルに加えた。すべてのサンプルに２００μＬのメタノールを加えてタンパク質を沈殿させ、分析物を抽出し、サンプルを振とうまたはボルテックスしてから遠心分離した。１００μＬの透明な上清を新しい９６ウェルプレートに移した。プレートに蓋をして、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析にかけた。
例１：サンプルからの分析物のクロマトグラフィーによる精製と分離
クロマトグラフィー法は、最大５８個の分析物を分析するためにＵＨＰＬＣを使用して開発された。分析物はパネルに分割され、各パネルには個別のクロマトグラフィー法がある。
クロマトグラフィー法は、最大５８個の分析物を分析するためにＵＨＰＬＣを使用して開発された。分析物はパネルに分割され、各パネルには個別のクロマトグラフィー法がある。
各クロマトグラフィー法について、最終抽出溶液の１．０μＬの単一の固定アリコートを、分析された各サンプルについてＵＰＬＣカラムに注入した。バイナリ溶媒ポンプユニット、冷却オートサンプラー（４℃に設定）、およびカラムヒーター（クロマトグラフィー法１～３の場合は６０℃、クロマトグラフィー法４および５の場合は５０℃に設定）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＵＨＰＬＣシステムを、クロマトグラフィー法１、２、および４では逆相カラム（Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＢＥＨ Ｃ１８、１．７ μｍ、２．１ｘ１００ｍｍ）を備え、クロマトグラフィー法３ではＨＩＬＩＣカラム（ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅ、２．５ミクロン２．１×１００ｍｍ）を備え、およびクロマトグラフィー法５ではＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅ（１．７ミクロン、２．１×１５０ｍｍ）カラムを備えた、液体クロマトグラフィーで使用した。各クロマトグラフィー法を以下にさらに例示する。
Ａ．クロマトグラフィー法１
一例では、液体クロマトグラフィー法が、同じ注入で、下記からなる最大１９の分析物のパネルの精製および分離のために開発された：Ｎ－パルミトイルセリノール、インドールプロピオネート、インドール、トリプトファン、５－アミノ吉草酸、ピペコレート、Ｎ－アセチル－カダベリン、カダベリン、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、セロトニン、プロピオン酸イミダゾール、乳酸イミダゾール、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、ファモチジン、ジアミノピメレート、およびトリメチルアミン（ＴＭＡ）。この方法を使用して、１つまたは複数の分析物（例えば、当該パネルから選択される２つ以上、３つ以上および最大１９の分析物およびそれらの組み合わせ）の量を測定することができる。
一例では、液体クロマトグラフィー法が、同じ注入で、下記からなる最大１９の分析物のパネルの精製および分離のために開発された：Ｎ－パルミトイルセリノール、インドールプロピオネート、インドール、トリプトファン、５－アミノ吉草酸、ピペコレート、Ｎ－アセチル－カダベリン、カダベリン、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、セロトニン、プロピオン酸イミダゾール、乳酸イミダゾール、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、ファモチジン、ジアミノピメレート、およびトリメチルアミン（ＴＭＡ）。この方法を使用して、１つまたは複数の分析物（例えば、当該パネルから選択される２つ以上、３つ以上および最大１９の分析物およびそれらの組み合わせ）の量を測定することができる。
移動相Ａは水中のＰＦＰＡであり、移動相Ｂはアセトニトリル中のＰＦＰＡであった。線形勾配溶出は、０．５％移動相Ｂ（９９．５％移動相Ａ）および６００μＬ／分の流速の初期条件で実行された。クロマトグラフィーと質量分析を含む総分析時間は７．００分であった。
クロマトグラフィー法１の一例では、糞便サンプルを上記のように調製した。最終分析サンプルの１．０μＬの単一の固定アリコートを、分析する各サンプルのクロマトグラフィーカラム上に注入した。この例では、クロマトグラフィー法１により、ピーク形状が良好な複数の最大１７の分析物が分離された。糞便サンプルについて下記の得られた分離分析物の例示的なクロマトグラムを図１（Ａ―Ｂ）に示す：Ｎ－パルミトイルセリノール、インドールプロピオネート、インドール、トリプトファン、５－アミノ吉草酸、ピペコレート、Ｎ－アセチル－カダベリン、カダベリン、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）、ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、セロトニン、プロピオン酸イミダゾール、乳酸イミダゾール、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、およびファモチジン。おおよその保持時間（分単位）を表３に示す。
Ｂ．クロマトグラフィー法２
別の例では、同じ注入で下記からなる最大３２の分析物のパネルの精製および分離のために、液体クロマトグラフィー法が開発された：クレゾール、３－インドキシルサルフェート、４－ヒドロキシフェニルアセテート、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート、ベンゾエート、フェニル酢酸、フェニルラクテート、ヒプラート、ラクテート、フェニルプロピオニルグリシン、フェニルアセチルグリシン、エチルフェニルサルフェート、フェノールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、ｐ－クレゾールグルクロニド、エンテロジオール、エンテロラクトン、エクオール、ダイゼイン、アピゲニン、ナリンゲニン、ゲニスタイン、デオキシコレート、リトコレート、タウロデオキシコレート、３－フェニルプロピオネート、４－エチルフェノール、４－ヒドロキシフェニルラクテート、シンナメート、シンナモイルグリシン、フェノールグルクロニド、およびウロリチンＡ。この方法を使用して、１つまたは複数の分析物（例えば、当該パネルから選択される２つ以上、３つ以上および最大３２の分析物およびそれらの組み合わせ）の量を測定することができる。
別の例では、同じ注入で下記からなる最大３２の分析物のパネルの精製および分離のために、液体クロマトグラフィー法が開発された：クレゾール、３－インドキシルサルフェート、４－ヒドロキシフェニルアセテート、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート、ベンゾエート、フェニル酢酸、フェニルラクテート、ヒプラート、ラクテート、フェニルプロピオニルグリシン、フェニルアセチルグリシン、エチルフェニルサルフェート、フェノールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、ｐ－クレゾールグルクロニド、エンテロジオール、エンテロラクトン、エクオール、ダイゼイン、アピゲニン、ナリンゲニン、ゲニスタイン、デオキシコレート、リトコレート、タウロデオキシコレート、３－フェニルプロピオネート、４－エチルフェノール、４－ヒドロキシフェニルラクテート、シンナメート、シンナモイルグリシン、フェノールグルクロニド、およびウロリチンＡ。この方法を使用して、１つまたは複数の分析物（例えば、当該パネルから選択される２つ以上、３つ以上および最大３２の分析物およびそれらの組み合わせ）の量を測定することができる。
移動相Ａは水中のギ酸であり、移動相Ｂはアセトニトリル中のギ酸であった。線形勾配溶出は、０％移動相Ｂ（１００％移動相Ａ）および６００μＬ／分の流速の初期条件で実行された。クロマトグラフィーと質量分析を含む総分析時間は９．００分であった。
クロマトグラフィー法２の一例では、糞便サンプルを上記のように調製した。最終分析サンプルの１．０μＬの単一の固定アリコートを、分析する各サンプルのクロマトグラフィーカラム上に注入した。この例では、クロマトグラフィー法２により、ピーク形状が良好な複数の最大２５の分析物が分離された。糞便サンプルについて、得られた分離された下記の分析物の例示的なクロマトグラムを図２（Ａ－Ｃ）に示す：クレゾール、３－インドキシルサルフェート、４－ヒドロキシフェニルアセテート、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート、ベンゾエート、フェニル酢酸、フェニルラクテート、ヒプラート、ラクテート、フェニルプロピオニルグリシン、フェニルアセチルグリシン、エチルフェニルサルフェート、フェノールサルフェート、ｐ－硫酸クレゾール、ｐ－クレゾールグルクロニド、エンテロジオール、エンテロラクトン、エクオール、ダイゼイン、アピゲニン、ナリンゲニン、ゲニステイン、デオキシコレート、リトコレート、およびタウロデオキシコレート。おおよその保持時間（分単位）を表４に示す。
Ｃ．クロマトグラフィー法３
別の例では、同じ注入で、キシロース、ラフィノース、スタキオース、Ｎ－アセチルムラミネート、およびＮ－アセチルノイラミネート（シアル酸）からなる最大５つの分析物のパネルの精製および分離のために、液体クロマトグラフィー法が開発された。この方法を使用して、１つまたは複数の分析物（例えば、当該パネルから選択される２つ以上、３つ以上、および最大５つの分析物およびそれらの組み合わせ）の量を測定することができる。
別の例では、同じ注入で、キシロース、ラフィノース、スタキオース、Ｎ－アセチルムラミネート、およびＮ－アセチルノイラミネート（シアル酸）からなる最大５つの分析物のパネルの精製および分離のために、液体クロマトグラフィー法が開発された。この方法を使用して、１つまたは複数の分析物（例えば、当該パネルから選択される２つ以上、３つ以上、および最大５つの分析物およびそれらの組み合わせ）の量を測定することができる。
移動相Ａは水中のトリエチルアミンであり、移動相Ｂはアセトニトリル中のトリエチルアミンであった。線形勾配溶出は、２％移動相Ａ（９８％移動相Ｂ）および６００μＬ／分の流速の初期条件で実行された。クロマトグラフィーと質量分析を含む総分析時間は６．００分であった。
クロマトグラフィー法３の一例では、糞便サンプルを上記のように調製した。最終分析サンプルの１．０μＬの単一の固定アリコートを、分析する各サンプルのクロマトグラフィーカラム上に注入した。この例では、クロマトグラフィー法３により、複数の最大３つの分析物が良好なピーク形状で分離された。糞便サンプルについて、得られた分離分析物のキシロース、ラフィノース、スタキオースのクロマトグラムの例を、図３に示す。おおよその保持時間（分単位）を表５に示す。
Ｄ．クロマトグラフィー法４
別の例では、同じ注入で、カテコールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、エチルフェニルサルフェート、インドールラクテート、インドールプロピオネート、およびインドキシルサルフェートからなる最大６つの分析物のパネルの精製および分離のために、液体クロマトグラフィー法が開発された。この方法を使用して、１つまたは複数の分析物（例えば、当該パネルから選択された２つ以上、３つ以上、および最大６つの分析物およびそれらの組み合わせ）の量を測定することができる。
別の例では、同じ注入で、カテコールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、エチルフェニルサルフェート、インドールラクテート、インドールプロピオネート、およびインドキシルサルフェートからなる最大６つの分析物のパネルの精製および分離のために、液体クロマトグラフィー法が開発された。この方法を使用して、１つまたは複数の分析物（例えば、当該パネルから選択された２つ以上、３つ以上、および最大６つの分析物およびそれらの組み合わせ）の量を測定することができる。
移動相Ａは水中のギ酸であり、移動相Ｂはアセトニトリル中のギ酸であった。線形勾配溶出は、１０％移動相Ｂ（９０％移動相Ａ）および５５０μＬ／分の流速の初期条件で実行された。クロマトグラフィーと質量分析を含む総分析時間は５．５０分であった。
クロマトグラフィー法４の一例では、血清サンプルを上記のように調製した。最終分析サンプルの１．０μＬの単一の固定アリコートを、分析する各サンプルのクロマトグラフィーカラム上に注入した。クロマトグラフィー法４は、良好なピーク形状を持つ複数の最大６つの分析物を分離した。得られた分離分析物のカテコールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、エチルフェニルサルフェート、インドールラクテート、インドールプロピオネート、およびインドキシルサルフェートの例示的なクロマトグラムを、図４に示す。おおよその保持時間（分単位）を表６に示す。
Ｅ．クロマトグラフィー法５
別の例では、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）の精製および分離のために液体クロマトグラフィー法が開発された。トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）の量は、この方法を使用して測定できる。
別の例では、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）の精製および分離のために液体クロマトグラフィー法が開発された。トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）の量は、この方法を使用して測定できる。
移動相Ａは水中のギ酸アンモニウムであり、移動相Ｂはアセトニトリル／水中のギ酸アンモニウムであった。線形勾配溶出は、５％移動相Ａ（９５％移動相Ｂ）および５５０μＬ／分の流速の初期条件で実行された。クロマトグラフィーと質量分析を含む総分析時間は４．３０分であった。
クロマトグラフィー法５の一例では、血清サンプルを上記のように調製した。最終分析サンプルの１．０μＬの単一の固定アリコートを、分析する各サンプルのクロマトグラフィーカラム上に注入した。クロマトグラフィー法５は、良好なピーク形状でトリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）を分離した。トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）のクロマトグラムの例を図５に示し、おおよその保持時間（分単位）を表４に示す。
例２：分析物の質量分析測定
質量分析は、ターボＶ源（ＥＳＩ）を備えたＡＢ Ｓｃｉｅｘ ＱＴｒａｐ ６５００質量分析計を使用して、以下の方法に記載されるようにサンプル抽出物に対して実施された。生データは機器から取得され、Ａｎａｌｙｓｔ １．６．２ソフトウェア（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ）を使用して処理された。定量では、分析物と内部標準のピーク面積比を、加重（１／ｘ）線形または２次回帰によってキャリブレーション標準の濃度に適合させた。得られた検量線の傾きと切片を使用して、実験サンプルの未知の濃度を計算した。
質量分析は、ターボＶ源（ＥＳＩ）を備えたＡＢ Ｓｃｉｅｘ ＱＴｒａｐ ６５００質量分析計を使用して、以下の方法に記載されるようにサンプル抽出物に対して実施された。生データは機器から取得され、Ａｎａｌｙｓｔ １．６．２ソフトウェア（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ）を使用して処理された。定量では、分析物と内部標準のピーク面積比を、加重（１／ｘ）線形または２次回帰によってキャリブレーション標準の濃度に適合させた。得られた検量線の傾きと切片を使用して、実験サンプルの未知の濃度を計算した。
Ａ． ＭＳ法１
分析物の量を検出および決定するために、ＭＳ法が開発された。この方法（ＭＳ法１）では、機器は正多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードで操作された。イオンスプレー電圧は５．５ｋＶ、ソース温度は５００℃、カーテンガス（例：窒素）は３５ｐｓｉ、ネブライザーと脱溶媒ガス（例：窒素）の流量は７０ｐｓｉ、衝突活性化解離（ＣＡＤ）ガス（例：窒素）中程度に設定した。ニードルウォッシュにはメタノールを使用した。
分析物の量を検出および決定するために、ＭＳ法が開発された。この方法（ＭＳ法１）では、機器は正多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードで操作された。イオンスプレー電圧は５．５ｋＶ、ソース温度は５００℃、カーテンガス（例：窒素）は３５ｐｓｉ、ネブライザーと脱溶媒ガス（例：窒素）の流量は７０ｐｓｉ、衝突活性化解離（ＣＡＤ）ガス（例：窒素）中程度に設定した。ニードルウォッシュにはメタノールを使用した。
ＭＳ法１を使用して、１回の注入で、下記からなる分析物のパネルの量を検出および決定することができる：Ｎ－パルミトイルセリノール、インドールプロピオネート、インドール、トリプトファン、５－アミノバレレート、ピペコレート、Ｎ－アセチル－カダベリン、カダベリン、トリメチルアミン－ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、セロトニン、プロピオン酸イミダゾール、乳酸イミダゾール、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、ファモチジン、ジアミノピメレート、およびトリメチルアミン（ＴＭＡ）。この方法を使用して、１つまたは複数の分析物（例えば、当該パネルから選択される２つ以上、３つ以上および最大１９の分析物およびそれらの組み合わせ）の量を測定することができる。
一例では、ＭＳ法１をクロマトグラフィー法１とともに使用して、分析物のパネルの量を決定した。この例では、実施例１、クロマトグラフィー法１に記載のクロマトグラフィーカラムからの溶離液を、質量分析計のエレクトロスプレー源中に直接かつ自動的に導入した。
クロマトグラフィー法１／ＭＳ法１を使用して、下記の定量のために生成された例示的なイオンを、表３に示す：インドールプロピオネート、インドール、トリプトファン、５－アミノバレレート、ピペコレート、Ｎ－アセチル－カダベリン、カダベリン、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、セロトニン、Ｎ－パルミトイルセリノール、プロピオン酸イミダゾール、乳酸イミダゾール、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、およびファモチジン。親イオンは「親イオン（ｍ／ｚ）」という見出しの列の下にリストされ、娘イオンは「娘イオン（ｍ／ｚ）」というラベルの付いた列にリストされている。この例での定量用の娘イオンの選択は、分析測定範囲全体の感度に対して最適化された。ただし、追加の娘イオンを選択して、例での定量に使用される娘イオンを置き換えたり、増強したりすることができる。
別の例では、ＭＳ法１をクロマトグラフィー法５とともに使用して、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）の量を検出および決定した。この例では、実施例１、クロマトグラフィー法５に記載のクロマトグラフィーカラムからの溶離液を、質量分析計のエレクトロスプレー源中に直接かつ自動的に導入した。
クロマトグラフィー法５／ＭＳ法１を使用してトリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）を定量するために生成された例示的なイオンを表４に列挙する。
Ｂ． ＭＳ法２
分析物の量を検出および決定するために、ＭＳ法（ＭＳ法２）が開発された。この方法では、ＭＳ機器は負のＭＲＭモードで操作された。イオンスプレー電圧は－４．５ｋＶ、ソース温度は５００℃、カーテンガス（例：窒素）は３５ｐｓｉ、ネブライザーと脱溶媒ガス（例：窒素）の流量は７０ｐｓｉ、衝突活性化解離（ＣＡＤ）ガス（例えば、窒素）中程度に設定した。ニードルウォッシュにはメタノールを使用した。
分析物の量を検出および決定するために、ＭＳ法（ＭＳ法２）が開発された。この方法では、ＭＳ機器は負のＭＲＭモードで操作された。イオンスプレー電圧は－４．５ｋＶ、ソース温度は５００℃、カーテンガス（例：窒素）は３５ｐｓｉ、ネブライザーと脱溶媒ガス（例：窒素）の流量は７０ｐｓｉ、衝突活性化解離（ＣＡＤ）ガス（例えば、窒素）中程度に設定した。ニードルウォッシュにはメタノールを使用した。
一例では、ＭＳ法２をクロマトグラフィー法２とともに使用して、１回の注入で、下記からなる分析物のパネルの量を検出および決定した：クレゾール、３－インドキシルサルフェート、４－ヒドロキシフェニルアセテート、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート、ベンゾエート、フェニル酢酸、フェニルラクテート、ヒプラート、ラクテート、フェニルプロピオニルグリシン、フェニルアセチルグリシン、エチルフェニルサルフェート、フェノールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、ｐ－クレゾールグルクロニド、エンテロジオール、エンテロラクトン、エクオール、ダイゼイン、アピゲニン、ナリンゲニン、ゲニスタイン、デオキシコレート、リトコレート、タウロデオキシコレート、３－フェニルプロピオネート、４－エチルフェノール、４－ヒドロキシフェニルラクテート、シンナメート、シンナモイルグリシン、フェノールグルクロニド、およびウロリチンＡ。
この実施例において、実施例１、クロマトグラフィー法２に記載されたクロマトグラフィーカラムからの溶離液は、質量分析計のエレクトロスプレー源中に直接かつ自動的に導入された。
クロマトグラフィー法２／ＭＳ法２を使用して、下記の定量のために生成された例示的なイオンを、表５に示す：クレゾール、３－インドキシルサルフェート、４－ヒドロキシフェニルアセテート、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート、ベンゾエート、フェニル酢酸、フェニルラクテート、ヒプラート、ラクテート、フェニルプロピオニルグリシン、フェニルアセチルグリシン、エチルフェニルサルフェート、フェノールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、ｐ－クレゾールグルクロニド、エンテロジオール、エンテロラクトン、エクオール、ダイゼイン、アピゲニン、ナリンゲニン、ゲニステイン、デオキシコレート、リトコレート、およびタウロデオキシコレート。
別の例では、ＭＳ法２をクロマトグラフィー法４とともに使用して、カテコールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、エチルフェニルサルフェート、インドールラクテート、インドールプロピオネート、およびインドキシルサルフェートからなる分析物のパネルの量を検出および決定した。
実施例１、クロマトグラフィー法４に記載のクロマトグラフィーカラムからの溶離液を、質量分析計のエレクトロスプレー源中に直接かつ自動的に導入した。
クロマトグラフィー法４／ＭＳ法２を使用して、カテコールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、エチルフェニルサルフェート、インドールラクテート、インドールプロピオネート、およびインドキシルサルフェートを定量するために生成された例示的なイオンを表６に示す。
Ｃ． ＭＳ法３
別のＭＳ法（ＭＳ法３）は、キシロース、ラフィノース、スタキオース、Ｎ－アセチルムラミネート、およびＮ－アセチルノイラミネート（シアル酸）からなる分析物のパネルの量を１回の注入で検出および決定するために開発された。この方法を使用して、１つまたは複数の分析物（例えば、当該パネルから選択される２つ以上、３つ以上および最大５つの分析物およびそれらの組み合わせ）の量を測定することができる。
別のＭＳ法（ＭＳ法３）は、キシロース、ラフィノース、スタキオース、Ｎ－アセチルムラミネート、およびＮ－アセチルノイラミネート（シアル酸）からなる分析物のパネルの量を１回の注入で検出および決定するために開発された。この方法を使用して、１つまたは複数の分析物（例えば、当該パネルから選択される２つ以上、３つ以上および最大５つの分析物およびそれらの組み合わせ）の量を測定することができる。
機器は、負のＭＲＭモードで操作された。イオンスプレー電圧は－３．５ｋＶ、ソース温度は５００℃、カーテンガス（例：窒素）は２０ｐｓｉ、ネブライザーと脱溶媒ガス（例：窒素）の流量は６０ｐｓｉ、衝突活性化解離（ＣＡＤ）ガス（例えば、窒素）中程度に設定した。
一例では、実施例１、クロマトグラフィー法３に記載のクロマトグラフィーカラムからの溶離液を、質量分析計のエレクトロスプレー源中に直接かつ自動的に導入した。キシロース、ラフィノース、およびスタキオースの定量のために生成された例示的なイオンを表７に示す。
例３：固体実験サンプル中の分析物の定量的測定。
糞便サンプルを、乾燥するまで一晩凍結乾燥した。乾燥したサンプルをホモジナイズし、約２０ｍｇのサンプルを１．５ｍＬチューブ中に量り入れ；正確な重量が記録された。実験用糞便サンプルに加えて、組み合わせたキャリブレーション標準、ブランク、ブランク－ＩＳ、およびＱＣサンプルを各分析実験用に調製した。キャリブレーション標準、ブランク、およびブランク－ＩＳサンプルの場合、２０．０μＬの水を１．５ｍＬチューブに追加した。ＱＣサンプルの場合、約２０．０ｍｇの凍結乾燥ＱＣサンプルを１．５ｍＬチューブに加え、正確な重量を記録した。組合せキャリブレーション標準サンプルの場合、例Ｖ．キャリブレーション範囲の決定で決定した各分析物のキャリブレーション範囲レベルに対応する８０．０μＬのキャリブレーション溶液を、対応するチューブに追加し、８０．０μＬのエタノール／アセトニトリル／水（２：１：１）を、標準、ブランク－ＩＳ、ＱＣ、および実験サンプルを含むチューブに添加した。２０．０μＬのＷＩＳ溶液を、キャリブレーション標準、ブランク－ＩＳ、ＱＣ、および実験サンプルを含むチューブに追加し、２０．０μＬのアセトニトリル／水（１：１）を、ブランクサンプル用に使用するチューブに追加した。
糞便サンプルを、乾燥するまで一晩凍結乾燥した。乾燥したサンプルをホモジナイズし、約２０ｍｇのサンプルを１．５ｍＬチューブ中に量り入れ；正確な重量が記録された。実験用糞便サンプルに加えて、組み合わせたキャリブレーション標準、ブランク、ブランク－ＩＳ、およびＱＣサンプルを各分析実験用に調製した。キャリブレーション標準、ブランク、およびブランク－ＩＳサンプルの場合、２０．０μＬの水を１．５ｍＬチューブに追加した。ＱＣサンプルの場合、約２０．０ｍｇの凍結乾燥ＱＣサンプルを１．５ｍＬチューブに加え、正確な重量を記録した。組合せキャリブレーション標準サンプルの場合、例Ｖ．キャリブレーション範囲の決定で決定した各分析物のキャリブレーション範囲レベルに対応する８０．０μＬのキャリブレーション溶液を、対応するチューブに追加し、８０．０μＬのエタノール／アセトニトリル／水（２：１：１）を、標準、ブランク－ＩＳ、ＱＣ、および実験サンプルを含むチューブに添加した。２０．０μＬのＷＩＳ溶液を、キャリブレーション標準、ブランク－ＩＳ、ＱＣ、および実験サンプルを含むチューブに追加し、２０．０μＬのアセトニトリル／水（１：１）を、ブランクサンプル用に使用するチューブに追加した。
タンパク質を沈殿させ、分析物を抽出するために、７０％メタノール中の２００μＬの１％ギ酸をサンプルに加え、サンプルを５分間振とうまたはボルテックスし、そして４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。サンプル分析のために、１５０．０μＬの透明な上清を新しい９６ウェルプレートの適切なウェル中に移した。プレートに蓋をして、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析にかけた。
分析物は、実施例１および２に記載のＬＣおよびＭＳ法を使用して実験サンプルで測定された。方法は、糞便サンプル中下記の分析物の絶対量を決定するために使用された：Ｎ－パルミトイルセリノール、インドールプロピオネート、インドール、トリプトファン、５－アミノ吉草酸、ピペコレート、Ｎ－アセチル－カダベリン、カダベリン、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、セロトニン、プロピオン酸イミダゾール、乳酸イミダゾール、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、ファモチジン、クレゾール、３－インドキシルサルフェート、４－ヒドロキシフェニルアセテート、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート、ベンゾエート、フェニル酢酸、フェニルラクテート、ヒプラート、ラクテート、フェニルプロピオニルグリシン、フェニルアセチルグリシン、エチルフェニルサルフェート、フェノールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、ｐ－クレゾールグルクロニド、エンテロジオール、エンテロラクトン、エクオール、ダイゼイン、アピゲニン、ナリンゲニン、ゲニスタイン、デオキシコレート、リトコレート、タウロデオキシコレート、キシロース、ラフィノース、およびスタキオース。
実行時間７．０分で１回の注入でクロマトグラフィー法１およびＭＳ法１を使用して、下記の分析物が測定された：Ｎ－パルミトイルセリノール、インドールプロピオネート、インドール、トリプトファン、５－アミノ吉草酸、ピペコレート、Ｎ－アセチル－カダベリン、カダベリン、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、セロトニン、イミダゾールプロピオネート、イミダゾールラクテート、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、およびファモチジン。
実行時間９．０分で１回の注入でクロマトグラフィー法２およびＭＳ法２を使用して、下記の分析物が測定された：クレゾール、３－インドキシルサルフェート、４－ヒドロキシフェニルアセテート、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート、ベンゾエート、フェニル酢酸、フェニルラクテート、ヒプラート、ラクテート、フェニルプロピオニルグリシン、フェニルアセチルグリシン、エチルフェニルサルフェート、フェノールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、ｐ－クレゾールグルクロニド、エンテロジオール、エンテロラクトン、エクオール、ダイゼイン、アピゲニン、ナリンゲニン、ゲニステイン、デオキシコレート、リトコレート、およびタウロデオキシコレート。
分析物のキシロース、ラフィノース、およびスタキオースは、クロマトグラフィー法３およびＭＳ法３を使用して、６．０分の実行時間での単一の注入で測定された。
記載された方法を使用して決定されたサンプル中の分析物の測定された量は、表８に示されている。
例４：液体実験サンプル中の分析物の定量的測定。
複数のドナーからの血清サンプルをプールし、プールしたサンプルの５０．０μｌのアリコートをマイクロタイタープレートのウェルに加えた。ブランクおよびブランク－ＩＳサンプルの場合、５０．０μＬのＰＢＳをマイクロタイタープレートのウェルに添加した。結合キャリブレーション標準サンプルの場合、測定する各分析物の決定されたキャリブレーション範囲に対応する５０．０μＬのキャリブレーション溶液をマイクロタイタープレートのウェルに添加した。ＱＣサンプルの場合、対応するサンプルタイプのＱＣサンプル５０．０μＬをマイクロタイタープレートのウェルに添加した。２０．０μＬのＷＩＳ溶液を、キャリブレーション標準、ブランク－ＩＳ、ＱＣ、および実験サンプルを含むウェルに追加し、２０．０μＬの水を、ブランクサンプルを含むウェルに追加した。ブランクサンプルのあるウェルには４０μＬのＡＣＮ／水を加え、ブランク－ＩＳ、ＱＣ、および実験サンプルを含有するウェルには、２０μＬのＡＣＮ／水を加えた。
複数のドナーからの血清サンプルをプールし、プールしたサンプルの５０．０μｌのアリコートをマイクロタイタープレートのウェルに加えた。ブランクおよびブランク－ＩＳサンプルの場合、５０．０μＬのＰＢＳをマイクロタイタープレートのウェルに添加した。結合キャリブレーション標準サンプルの場合、測定する各分析物の決定されたキャリブレーション範囲に対応する５０．０μＬのキャリブレーション溶液をマイクロタイタープレートのウェルに添加した。ＱＣサンプルの場合、対応するサンプルタイプのＱＣサンプル５０．０μＬをマイクロタイタープレートのウェルに添加した。２０．０μＬのＷＩＳ溶液を、キャリブレーション標準、ブランク－ＩＳ、ＱＣ、および実験サンプルを含むウェルに追加し、２０．０μＬの水を、ブランクサンプルを含むウェルに追加した。ブランクサンプルのあるウェルには４０μＬのＡＣＮ／水を加え、ブランク－ＩＳ、ＱＣ、および実験サンプルを含有するウェルには、２０μＬのＡＣＮ／水を加えた。
タンパク質を沈殿させ、分析物を抽出するために、２００μＬのメタノールをすべてのサンプルに加え、サンプルを振とうまたはボルテックスし、次に遠心分離した。１００μＬの透明な上清を新しい９６ウェルプレートに移した。プレートに蓋をして、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析にかけた。
分析物は、実施例１および２に記載のＬＣおよびＭＳ法を使用して実験サンプルで測定された。これらの方法を使用して、血清サンプル中の下記の分析物の絶対量を、決定した：カテコールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート（硫酸クレゾール）、エチルフェニルサルフェート、乳酸インドール（インドールラクテート）、プロピオン酸インドール（インドールプロピオネート）、インドキシルサルフェート、およびトリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）。
分析物であるカテコールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、エチルフェニルサルフェート、インドールラクテート、インドールプロピオネート、およびインドキシルサルフェートを、クロマトグラフィー法４およびＭＳ法２を使用して、５．５０分の実行時間で１回の注入で測定した。
分析物トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）は、クロマトグラフィー法５およびＭＳ法１を使用して、４．３０分の実行時間での単一の注入で測定された。
記載された方法を使用して決定された代表的なプールされた血清サンプル中の分析物の測定された量は、表９に示されている。
Claims (38)
- 質量分析によりサンプル中の１つまたは複数の分析物の量を決定する方法であって、
１つまたは複数の分析物は、下記からなる群から選択され：Ｎ－パルミトイルセリノール、インドールプロピオネート、インドール、トリプトファン、５－アミノバレレート、ピペコレート、Ｎ－アセチル－カダベリン、カダベリン、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、セロトニン、イミダゾールプロピオネート、イミダゾールラクテート、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、ファモチジン、クレゾール、３－インドキシルサルフェート、４－ヒドロキシフェニルアセテート、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート、ベンゾエート、フェニル酢酸、フェニルラクテート、ヒプラート、ラクテート、フェニルプロピオニルグリシン、フェニルアセチルグリシン、エチルフェニルサルフェート、フェノールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、ｐ－クレゾールグルクロニド、エンテロジオール、エンテロラクトン、エクオール、ダイゼイン、アピゲニン、ナリンゲニン、ゲニスタイン、デオキシコレート、リトコレート、タウロデオキシコレート、キシロース、ラフィノース、スタキオース、ジアミノピメレート、トリメチルアミン（ＴＭＡ）、３－フェニルプロピオネート、４－エチルフェノール、４－ヒドロキシフェニルラクテート、シンナメート、シンナモイルグリシン、フェノールグルクロニド、ウロリチンＡ、Ｎ－アセチルムラミネート、Ｎ－アセチルノイラミネート（シアル酸）、カテコールサルフェート、３－インドールラクテート、およびそれらの組み合わせ；
しかも、下記を含む前記の方法：
ａ）１つまたは複数の分析物のそれぞれから質量分析によって検出可能な１つまたは複数のイオンを生成するのに適した条件下でサンプルをイオン化源に導入し、ここで、分析物はイオン化の前に誘導体化されないこと；
ｂ）質量分析によって、１つまたは複数の分析物のそれぞれからの１つまたは複数のイオンの量を測定すること；及び
ｃ）１つまたは複数のイオンの測定量を使用して、サンプル中の１つまたは複数の分析物のそれぞれの量を決定すること。 - １つまたは複数の分析物が、下記からなる群から選択され：
Ｎ－パルミトイルセリノール、インドールプロピオネート、インドール、トリプトファン、５－アミノバレレート、ピペコレート、Ｎ－アセチル－カダベリン、カダベリン、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、セロトニン、イミダゾールプロピオネート、イミダゾールラクテート、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、ファモチジン、ジアミノピメレート、およびトリメチルアミン（ＴＭＡ）、
ここで、１つまたは複数の分析物の量は、単一の注入で決定される、請求項１に記載の方法 - 前記１つまたは複数の分析物が、下記からなる群から選択され：
クレゾール、３－インドキシルサルフェート、４－ヒドロキシフェニルアセテート、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート、ベンゾエート、フェニル酢酸、フェニルラクテート、ヒプラート、ラクテート、フェニルプロピオニルグリシン、フェニルアセチルグリシン、エチルフェニルサルフェート、フェノールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、ｐ－クレゾールグルクロニド、エンテロジオール、エンテロラクトン、エクオール、ダイゼイン、アピゲニン、ナリンゲニン、ゲニスタイン、デオキシコレート、リトコレート、タウロデオキシコレート、３－フェニルプロピオネート、４－エチルフェノール、４－ヒドロキシフェニルラクテート、シンナメート、シンナモイルグリシン、フェノールグルクロニド、およびウロリチンＡ、
ここで、１つまたは複数の分析物の量は、単一の注入で決定される、請求項１に記載の方法。 - 前記１つまたは複数の分析物が、キシロース、ラフィノース、スタキオース、Ｎ－アセチルムラミネート、およびＮ－アセチルノイラミネート（シアル酸）からなる群から選択され、１つまたは複数の分析物の量が、１回の注入で測定される、請求項１に記載の方法。
- 前記１つまたは複数の分析物が、カテコールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、エチルフェニルサルフェート、インドールラクテート、インドールプロピオネート、およびインドキシルサルフェートからなる群から選択され、１つまたは複数の分析物の量が、１回の注入で測定される、請求項１に記載の方法。
- 前記サンプルが、イオン化源に導入される前に、液体クロマトグラフィーによって精製されている、請求項１に記載の方法。
- 前記液体クロマトグラフィーが、高速液体クロマトグラフィー、超高速液体クロマトグラフィー、および乱流液体クロマトグラフィーからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
- 前記サンプルが、イオン化源に導入される前に、高速液体クロマトグラフィーまたは超高速液体クロマトグラフィーのいずれかによって精製されている、請求項１に記載の方法。
- 前記複数の分析物が２つ以上の分析物を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の分析物が３つ以上の分析物を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の分析物が４つ以上の分析物を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の分析物が５つ以上の分析物を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の分析物が６つ以上の分析物を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の分析物が７つ以上の分析物を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
- 複数の分析物が、Ｎ－パルミトイルセリノールと、下記からなる群から選択される１つ以上の分析物とを含む、請求項１に記載の方法：
インドールプロピオネート、インドール、トリプトファン、５－アミノバレレート、ピペコレート、Ｎ－アセチル－カダベリン、カダベリン、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、セロトニン、イミダゾールプロピオネート、イミダゾールラクテート、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、ファモチジン、クレゾール、３－インドキシルサルフェート、４－ヒドロキシフェニルアセテート、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート、ベンゾエート、フェニル酢酸、フェニルラクテート、ヒプラート、ラクテート、フェニルプロピオニルグリシン、フェニルアセチルグリシン、エチルフェニルサルフェート、フェノールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、ｐ－クレゾールグルクロニド、エンテロジオール、エンテロラクトン、エクオール、ダイゼイン、アピゲニン、ナリンゲニン、ゲニスタイン、デオキシコレート、リトコレート、タウロデオキシコレート、キシロース、ラフィノース、スタキオース、ジアミノピメレート、トリメチルアミン（ＴＭＡ）、３－フェニルプロピオネート、４－エチルフェノール、４－ヒドロキシフェニルラクテート、シンナメート、シンナモイルグリシン、フェノールグルクロニド、ウロリチンＡ、Ｎ－アセチルムラミネート、Ｎ－アセチルノイラミネート（シアル酸）、カテコールサルフェート、および３－インドールラクテート。 - 前記イオン化源が正イオン化モードで動作する、請求項２に記載の方法。
- イオン化源が負イオン化モードで動作する、請求項３～５のいずれか一項に記載の方法。
- 複数の分析物の第１の１つまたは複数の分析物は、Ｎ－パルミトイルセリノール、インドールプロピオネート、インドール、トリプトファン、５－アミノバレレート、ピペコレート、Ｎ－アセチル－カダベリン、カダベリン、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）、ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、セロトニン、イミダゾールプロピオネート、イミダゾールラクテート、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、ファモチジン、ジアミノピメレート、およびトリメチルアミン（ＴＭＡ）からなる群から選択され、および、複数の分析物の第１の１つまたは複数の分析物が１回の注入で決定され；そして
複数の分析物のうちの第２の１つまたは複数の分析物は、クレゾール、３－インドキシルサルフェート、４－ヒドロキシフェニルアセテート、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート、ベンゾエート、フェニル酢酸、フェニルラクテート、ヒプラート、ラクテート、フェニルプロピオニルグリシン、フェニルアセチルグリシン、エチルフェニルサルフェート、フェノールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、ｐ－クレゾールグルクロニド、エンテロジオール、エンテロラクトン、エクオール、ダイゼイン、アピゲニン、ナリンゲニン、ゲニスタイン、デオキシコレート、リトコレート、タウロデオキシコレート、３－フェニルプロピオネート、４－エチルフェノール、４－ヒドロキシフェニルラクテート、シンナメート、シンナモイルグリシン、フェノールグルクロニド、およびウロリチンＡからなる群から選択され、複数の分析物の第２の１つまたは複数の分析物が１回の注入で測定される、
請求項１に記載の方法。 - 複数の分析物の第１の１つまたは複数の分析物は、Ｎ－パルミトイルセリノール、インドールプロピオネート、インドール、トリプトファン、５－アミノバレレート、ピペコレート、Ｎ－アセチル－カダベリン、カダベリン、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）、ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、セロトニン、イミダゾールプロピオネート、イミダゾールラクテート、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、ファモチジン、ジアミノピメレート、およびトリメチルアミン（ＴＭＡ）からなる群から選択され、および複数の分析物の第１の１つまたは複数の分析物が１回の注入で決定される；そして
複数の分析物のうちの第２の１つ以上の分析物は、クレゾール、３－インドキシルサルフェート、４－ヒドロキシフェニルアセテート、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート、ベンゾエート、フェニル酢酸、フェニルラクテート、ヒプラート、ラクテート、フェニルプロピオニルグリシン、フェニルアセチルグリシン、エチルフェニルサルフェート、フェノールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、ｐ－クレゾールグルクロニド、エンテロジオール、エンテロラクトン、エクオール、ダイゼイン、アピゲニン、ナリンゲニン、ゲニスタイン、デオキシコレート、リトコレート、タウロデオキシコレート、３－フェニルプロピオネート、４－エチルフェノール、４－ヒドロキシフェニルラクテート、シンナメート、シンナモイルグリシン、フェノールグルクロニド、およびウロリチンＡからなる群から選択され、複数の分析物の第２の１つまたは複数の分析物が１回の注入で測定される；そして
複数の分析物のうちの第３の１つまたは複数の分析物は、キシロース、ラフィノース、スタキオース、Ｎ－アセチルムラミネート、およびＮ－アセチルノイラミネート（シアル酸）からなる群から選択され、複数の分析物のうちの第３の１つまたは複数の分析物は、１回の注入で測定される、
前記請求項１に記載の方法。 - 複数の分析物のそれぞれの量を決定するために使用される１つまたは複数のイオンが、表３、４、５、６、および７のイオンから選択される１つまたは複数のイオンである、請求項１に記載の方法。
- １つまたは複数の分析物のうちの１つが、Ｎ－パルミトイルセリノールを含み、１つ以上のイオンが、３３０．３±０．５、３１２．１±０．５、２３９．１±０．５、１４９．１±０．５、１３９．１±０．５、９２．１±０．５、および７４．１±０．５の質量電荷比を有するイオンからなる群から選択される１つ以上のイオンを含む、請求項２０に記載の方法。
- 内部標準を使用して、前記サンプル中の１つまたは複数の分析物のそれぞれの量を決定する、請求項１に記載の方法。
- 内部標準が、測定される１つまたは複数の分析物のうちの少なくとも１つの同位体標識された類似体を含む、請求項２２に記載の方法。
- 内部標準が、下記からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法：
Ｎ－パルミトイルセリノール－ｄ３、トリメチルアミンＮ－オキシド－１３Ｃ３、３－インドールプロピオン酸－ｄ２、インドール－ｄ７、Ｎ－アセチルカダベリン－ｄ３、５－アミノ吉草酸－ｄ４、カダベリン－ｄ４、ファモチジン－１３Ｃ３、ガンマ－アミノ酪酸－ｄ６、セロトニン－ｄ４、ピペコール酸－ｄ９、イミダゾールプロピオン酸－ｄ３、イミダゾール乳酸－ｄ３、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）－ｄ３、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）－ｄ３、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）－ｄ４、トリプトファン－ｄ５、ｐ－クレゾール－ｄ７、安息香酸－ｄ５、ヒプラートｄ５、４－ヒドロキシフェニル酢酸－ｄ６、３－フェニル乳酸－ｄ５、（４－ヒドロキシフェニル）－２－プロピオン酸－ｄ６、ナリンゲニン－ｄ３、（３－フェニルプロピオニル）グリシン－１３Ｃ２，１５Ｎ１、フェニルアセチルグリシン－ｄ５、ｐ－クレゾールサルフェート－ｄ７、エンテロジオール－ｄ６、エンテロラクトン－ｄ６、フェノールサルフェート－ｄ３、ダイゼイン－ｄ４、アピゲニン－ｄ５、ｐ－クレゾールグルクロニド－ｄ７、ゲニスタイン－ｄ４、エチルフェニルサルフェート－ｄ４、エクオール－ｄ４、３－インドキシルサルフェート－１３Ｃ６、フェニル酢酸－ｄ７、デオキシコール酸－ｄ４、リトコール酸－ｄ４、タウロデオキシコール酸－ｄ５、乳酸－ｄ４、キシロース－１３Ｃ５、ラフィノース－ｄ９、スタキオース－ｄ７、ジアミノピメリン酸－１３Ｃ７，１５Ｎ２、トリメチルアミン－１３Ｃ３、ヒドロ桂皮－ｄ５酸、４－エチルフェノール－２，３，５，６－ｄ４，ＯＤ、４－ヒドロキシフェニルラクテート－ｄ２、桂皮－ｄ５酸、シンナモイルグリシン－２，２－ｄ２、フェノールグルクロニド－ｄ５、ウロリチンＢ－１３Ｃ６、Ｎ－アセチルムラミン酸－ｄ３、Ｎ－アセチル－Ｄ－ノイラミン酸－１，２，３－１３Ｃ３、カテコールサルフェート－１３Ｃ６、およびインドールラクテート－ｄ５、およびそれらの組み合わせ。 - 質量分析がタンデム質量分析である、請求項１に記載の方法。
- 下記からなる群から選択される１つまたは複数の分析物のそれぞれの内部標準として１つまたは複数の同位体標識類似体を含むキットであって：
Ｎ－パルミトイルセリノール、インドールプロピオネート、インドール、トリプトファン、５－アミノバレレート、ピペコレート、Ｎ－アセチル－カダベリン、カダベリン、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、セロトニン、イミダゾールプロピオネート、イミダゾールラクテート、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、ファモチジン、クレゾール、３－インドキシルサルフェート、４－ヒドロキシフェニルアセテート、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート、ベンゾエート、フェニル酢酸、フェニルラクテート、ヒプラート、ラクテート、フェニルプロピオニルグリシン、フェニルアセチルグリシン、エチルフェニルサルフェート、フェノールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、ｐ－クレゾールグルクロニド、エンテロジオール、エンテロラクトン、エクオール、ダイゼイン、アピゲニン、ナリンゲニン、ゲニスタイン、デオキシコレート、リトコレート、タウロデオキシコレート、キシロース、ラフィノース、スタキオース、ジアミノピメレート、トリメチルアミン（ＴＭＡ）、３－フェニルプロピオネート、４－エチルフェノール、４－ヒドロキシフェニルラクテート、シナメート、シナモイルグリシン、フェノールグルクロニド、ウロリチンＡ、Ｎ－アセチルムラミネート、Ｎ－アセチルノイラミネート（シアル酸）、カテコールサルフェート、３－インドールラクテート、およびそれらの組み合わせ；
しかも、パッケージ材料及びキットの使用説明書を含む、前記のキット。 - １つまたは複数の分析物が、Ｎ－パルミトイルセリノール、インドールプロピオネート、インドール、トリプトファン、５－アミノバレレート、ピペコレート、Ｎ－アセチル－カダベリン、カダベリン、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、セロトニン、イミダゾールプロピオネート、イミダゾールラクテート、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、ファモチジン、ジアミノピメレート、トリメチルアミン（ＴＭＡ）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２６に記載のキット。
- 前記１つまたは複数の分析物が、クレゾール、３－インドキシルサルフェート、４－ヒドロキシフェニルアセテート、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート、ベンゾエート、フェニル酢酸、フェニルラクテート、ヒプラート、ラクテート、フェニルプロピオニルグリシン、フェニルアセチルグリシン、エチルフェニルサルフェート、フェノールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、ｐ－クレゾールグルクロニド、エンテロジオール、エンテロラクトン、エクオール、ダイゼイン、アピゲニン、ナリンゲニン、ゲニスタイン、デオキシコレート、リトコレート、タウロデオキシコレート、３－フェニルプロピオネート、４－エチルフェノール、４－ヒドロキシフェニルラクテート、シンナメート、シンナモイルグリシン、フェノールグルクロニド、ウロリチンＡ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２６に記載のキット。
- 前記１つまたは複数の分析物が、キシロース、ラフィノース、スタキオース、Ｎ－アセチルムラミネート、およびＮ－アセチルノイラミネート（シアル酸）、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２６に記載のキット。
- １つまたは複数の分析物が、Ｎ－アセチル－カダベリン、５－アミノバレレート、イミダゾールプロピオネート、β－イミダゾール乳酸、Ｎ－パルミトイルセリノール、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート、ナリンゲニン、フェノールサルフェート、エチルフェニルサルフェート、ラフィノース、スタキオース、４－ヒドロキシフェニルラクテート、フェノールグルクロニド、Ｎ－アセチルムラミネート、カテコールサルフェート、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２６に記載のキット。
- 内部標準が、下記からなる群から選択される１つ以上の内部標準を含む、請求項２６に記載のキット：
Ｎ－パルミトイルセリノール－ｄ３、トリメチルアミンＮ－オキシド－１３Ｃ３、３－インドールプロピオン酸－ｄ２、インドール－ｄ７、Ｎ－アセチルカダベリン－ｄ３、５－アミノ吉草酸－ｄ４、カダベリン－ｄ４、ファモチジン－１３Ｃ３、ガンマ－アミノ酪酸－ｄ６、セロトニン－ｄ４、ピペコール酸－ｄ９、イミダゾールプロピオン酸－ｄ３、イミダゾール乳酸－ｄ３、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）－ｄ３、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）－ｄ３、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）－ｄ４、トリプトファン－ｄ５、ｐ－クレゾール－ｄ７、安息香酸－ｄ５、ヒプラート－ｄ５、４－ヒドロキシフェニル酢酸－ｄ６、３－フェニル乳酸－ｄ５、（４－ヒドロキシフェニル）－２－プロピオン酸－ｄ６、ナリンゲニン－ｄ３、（３－フェニルプロピオニル）グリシン－１３Ｃ２，１５Ｎ１、フェニルアセチルグリシン－ｄ５、ｐ－クレゾールサルフェート－ｄ７、エンテロジオール－ｄ６、エンテロラクトン－ｄ６、フェノールサルフェート－ｄ３、ダイゼイン－ｄ４、アピゲニン－ｄ５、ｐ－クレゾールグルクロニド－ｄ７、ゲニスタイン－ｄ４、エチルフェニルサルフェート－ｄ４、エクオール－ｄ４、３－インドキシルサルフェート－１３Ｃ６、フェニル酢酸－ｄ７、デオキシコール酸－ｄ４、リトコール酸－ｄ４、タウロデオキシコール酸－ｄ５、乳酸－ｄ４、キシロース－１３Ｃ５、ラフィノース－ｄ９、スタキオース－ｄ７、ジアミノピメリン酸－１３Ｃ７，１５Ｎ２、トリメチルアミン－１３Ｃ３、ヒドロ桂皮－ｄ５酸、４－エチルフェノール－２，３，５，６－ｄ４，ＯＤ、４－ヒドロキシフェニルラクテート－ｄ２、桂皮－ｄ５酸、シンナモイルグリシン－２，２－ｄ２、フェノールグルクロニド－ｄ５、ウロリチンＢ－１３Ｃ６、Ｎ－アセチルムラミン酸－ｄ３、Ｎ－アセチル－Ｄ－ノイラミン酸－１，２，３－１３Ｃ３、カテコールサルフェート－１３Ｃ６、インドールラクテート－ｄ５、およびそれらの組み合わせ。 - 内部標準が、Ｎ－パルミトイルセリノール－ｄ３、３－インドールプロピオン酸－ｄ２、インドール－ｄ７、トリプトファン－ｄ５、５－アミノ吉草酸－ｄ４、ピペコール酸－ｄ９、Ｎ－アセチルカダベリン－ｄ３、カダベリン－ｄ４、トリメチルアミンＮ－オキシド－１３Ｃ３、ガンマアミノ酪酸－ｄ６、セロトニン－ｄ４、イミダゾールプロピオン酸－ｄ３、イミダゾール乳酸－ｄ３、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）－ｄ３、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）－ｄ３、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）－ｄ４、ファモチジン－１３Ｃ３、ジアミノピメリン酸－１３Ｃ７，１５Ｎ２、トリメチルアミン－１３Ｃ３、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の内部標準を含む、請求項２７に記載のキット。
- 内部標準が、ｐ－クレゾール－ｄ７、３－インドキシルサルフェート－１３Ｃ６、４－ヒドロキシフェニル酢酸－ｄ６、（４－ヒドロキシフェニル）－２－プロピオン酸－ｄ６、安息香酸－ｄ５、フェニル酢酸－ｄ７、３－フェニル乳酸－ｄ５、ヒプラートｄ５、乳酸－ｄ４、（３－フェニルプロピオニル）グリシン－１３Ｃ２，１５Ｎ１、フェニルアセチルグリシン－ｄ５、エチルフェニルサルフェート－ｄ４、フェノールサルフェート－ｄ３、ｐ－クレゾールサルフェート－ｄ７、ｐ－クレゾールグルクロニド－ｄ７、エンテロジオール－ｄ６、エンテロラクトン－ｄ６、エクオール－ｄ４、ダイゼイン－ｄ４、アピゲニン－ｄ５、ナリンゲニン－ｄ３、ゲニスタイン－ｄ４、デオキシコール酸－ｄ４、リトコール酸－ｄ４、タウロデオキシコール酸－ｄ５、ヒドロ桂皮－ｄ５酸、４－エチルフェノール－２，３，５，６－ｄ４，ＯＤ、４－ヒドロキシフェニルラクテート－ｄ２、桂皮－ｄ５酸、シンナモイルグリシン－２，２－ｄ２、フェノールグルクロニド－ｄ５、ウロリチンＢ－１３Ｃ６、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の内部標準を含む、請求項２８に記載のキット。
- 内部標準が、キシロース－１３Ｃ５、ラフィノース－ｄ９、スタキオース－ｄ７、Ｎ－アセチルムラミン酸－ｄ３、Ｎ－アセチル－Ｄ－ノイラミン酸－１，２，３－１３Ｃ３、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の内部標準を含む、請求項２９に記載のキット。
- １つまたは複数の内部標準が、Ｎ－アセチル－カダベリン－ｄ３、５－アミノバレレート－ｄ４、イミダゾールプロピオネート－ｄ３、β－イミダゾール乳酸－ｄ３、Ｎ－パルミトイルセリノール－ｄ３、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）－ｄ３、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）－ｄ３、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）－ｄ４、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート－ｄ６、ナリンゲニン－ｄ３ナトリウム塩、フェノールサルフェート－ｄ３、エチルフェニルサルフェート－ｄ４、ラフィノース－ｄ９、スタキオース－ｄ７、４－ヒドロキシフェニルラクテート－ｄ２、フェノールグルクロニド－ｄ５、Ｎ－アセチルムラミン酸－ｄ３、カテコールサルフェート－１３Ｃ６、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３０に記載のキット。
- 複数の分析物の第１の１つまたは複数の分析物は、Ｎ－パルミトイルセリノール、インドールプロピオネート、インドール、トリプトファン、５－アミノバレレート、ピペコレート、Ｎ－アセチル－カダベリン、カダベリン、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）、ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、セロトニン、イミダゾールプロピオネート、イミダゾールラクテート、シクロ（－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）、シクロ（－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）、シクロ（－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ）、ファモチジン、ジアミノピメレート、およびトリメチルアミン（ＴＭＡ）からなる群から選択され、および複数の分析物の第１の１つまたは複数の分析物が１回の注入で決定される；そして
複数の分析物のうちの第２の１つ以上の分析物は、クレゾール、３－インドキシルサルフェート、４－ヒドロキシフェニルアセテート、２－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート、ベンゾエート、フェニル酢酸、フェニルラクテート、ヒプラート、ラクテート、フェニルプロピオニルグリシン、フェニルアセチルグリシン、エチルフェニルサルフェート、フェノールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、ｐ－クレゾールグルクロニド、エンテロジオール、エンテロラクトン、エクオール、ダイゼイン、アピゲニン、ナリンゲニン、ゲニスタイン、デオキシコレート、リトコレート、タウロデオキシコレート、３－フェニルプロピオネート、４－エチルフェノール、４－ヒドロキシフェニルラクテート、シンナメート、シンナモイルグリシン、フェノールグルクロニド、およびウロリチンＡからなる群から選択され、複数の分析物の第２の１つまたは複数の分析物が１回の注入で測定される；
複数の分析物のうちの第３の１つまたは複数の分析物は、キシロース、ラフィノース、スタキオース、Ｎ－アセチルムラミネート、およびＮ－アセチルノイラミネート（シアル酸）からなる群から選択され、複数の分析物のうちの第３の１つまたは複数の分析物は、１回の注入で測定される；そして
複数の分析物のうちの第４の１つまたは複数の分析物は、カテコールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、エチルフェニルサルフェート、インドールラクテート、インドールプロピオネート、およびインドキシルサルフェートからなる群から選択され、複数の分析物のうちの第４の１つまたは複数の分析物は、１回の注入で測定される、
請求項１に記載の方法。 - １つまたは複数の分析物が、カテコールサルフェート、ｐ－クレゾールサルフェート、エチルフェニルサルフェート、インドールラクテート、インドールプロピオネート、インドキシルサルフェート、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２６に記載のキット。
- 内部標準が、カテコールサルフェート－１３Ｃ６、ｐ－クレゾールサルフェート－ｄ７、エチルフェニルサルフェート－ｄ４、インドールラクテート－ｄ５、インドールプロピオネート－ｄ２、３－インドキシルサルフェート－１３Ｃ６、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の内部標準を含む、請求項２９に記載のキット。
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