JP2017116421A - 親水性化合物の分離分析方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】従来法では分離が難しい構造が似ている２種以上の糖類等の親水性化合物を、液体クロマトグラフィーにより完全に分離する方法を提供する。
【解決手段】親水性相互作用クロマトグラフィー用カラムを用いて親水性化合物を分離分析する方法であって、ｐＨが１２．５以上の揮発性の溶離液を用いることを特徴とする。
【選択図】なし
【解決手段】親水性相互作用クロマトグラフィー用カラムを用いて親水性化合物を分離分析する方法であって、ｐＨが１２．５以上の揮発性の溶離液を用いることを特徴とする。
【選択図】なし
Description
本発明は、親水性化合物の分離分析方法に関する。
糖類等の親水性化合物の分離には、液体クロマトグラフィーが広く用いられている。糖類等の分離分析方法としては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー用カラムを用いる方法、親水性相互作用クロマトグラフィー用カラムを用いる方法等が挙げられる。
イオン交換クロマトグラフィー用カラムを用いる方法では、溶離液として、不揮発性の塩基性化合物を添加した強アルカリ水溶液が用いられる（例えば、非特許文献１参照）。この方法では、糖類等の親水性化合物の分離性能が高い反面、溶離液に不揮発性の化合物が含まれる。そのため、この方法では、質量分析装置や荷電化粒子検出器等の装置内部で溶離液を揮発させるタイプの検出器を用いて糖類等の親水性化合物の高感度分析ができないという課題がある。
また、親水性相互作用クロマトグラフィー用カラムを用いる方法では、糖類等の親水性化合物の親水性の違いを利用して、糖類等を分離する（例えば、非特許文献２参照）。しかし、糖類等の中には、構造が非常に似ているために、親水性の違いだけで分離することが難しいものもある。例えば、グルコースとガラクトースは、５つある水酸基のうちの１つの結合の向きが異なるのみであり、その他の構造は共通している。そのため、この方法では、構造が似ている糖類等を分離することが非常に難しいという課題がある。
Ｔ．Ｒ．Ｉ．Ｃａｔａｌｄｉ ｅｔ．ａｌ． Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ８５５（１９９９）５３９−５５０
Ｚ．Ｇｕｏ ｅｔ．ａｌ． Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（２００７）２４９１−２４９３
本発明は、従来法では分離が難しかった構造が似ている２種以上の糖類等の親水性化合物を完全に分離することができる、液体クロマトグラフィーによる糖類等の親水性化合物の分離分析方法を提供することを目的とする。
本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、親水性相互作用クロマトグラフィー用カラムを用いた液体クロマトグラフィーにおいて、ｐＨが１２．５以上の揮発性の溶離液を用いることにより、従来法では分離が難しかった構造が似ている２種以上の糖類等の親水性化合物を完全に分離することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
［１］親水性相互作用クロマトグラフィー用カラムを用いた液体クロマトグラフィーにより親水性化合物を分離分析する方法であって、ｐＨが１２．５以上の揮発性の溶離液を用いることを特徴とする親水性化合物の分離分析方法。
［２］前記親水性化合物は、糖類である［１］に記載の親水性化合物の分離分析方法。
［３］前記糖類は、アラビノース、キシロース、マンノース、ガラクトースおよびグルコースからなる群から選択される少なくとも１種である［１］または［２］に記載の親水性化合物の分離分析方法。
［４］前記溶離液は、揮発性の有機溶媒と、揮発性の塩基性化合物と、水と、を含む［１］〜［３］に記載の親水性化合物の分離分析方法。
［５］前記揮発性の有機溶媒は、水溶性の有機溶媒である［４］に記載の親水性化合物の分離分析方法。
［６］前記水溶性の有機溶媒は、アセトニトリルである［５］に記載の親水性化合物の分離分析方法。
［７］前記親水性相互作用クロマトグラフィー用カラムに充填された充填剤が、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、または、ポリアクリレートを含む［１］〜［６］のいずれかに記載の親水性化合物の分離分析方法。
［８］前記充填剤が、アミノ基を有する充填剤である［７］に記載の親水性化合物の分離分析方法。
［９］前記親水性相互作用クロマトグラフィー用カラムで分離した親水性化合物を、質量分析装置を用いて検出する［１］〜［８］のいずれかに記載の親水性化合物の分離分析方法。
［１０］前記親水性相互作用クロマトグラフィー用カラムで分離した親水性化合物を、荷電化粒子検出器または蒸発光散乱検出器を用いて検出する［１］〜［８］のいずれかに記載の親水性化合物の分離分析方法。
本発明によれば、従来法では分離が難しかった構造が似ている２種以上の糖類等の親水性化合物を完全に分離することができる、液体クロマトグラフィーによる糖類等の親水性化合物の分離分析方法を提供することができる。また、揮発性の溶離液を用いることにより、質量分析装置、荷電化粒子検出器、蒸発光散乱検出器等の装置内部で溶離液を揮発させる形式の検出器による糖類等の親水性化合物の高感度分析が可能となる。
本発明の親水性化合物の分離分析方法の実施の形態について説明する。
なお、本実施の形態は、発明の趣旨をより良く理解させるために具体的に説明するものであり、特に指定のない限り、本発明を限定するものではない。
なお、本実施の形態は、発明の趣旨をより良く理解させるために具体的に説明するものであり、特に指定のない限り、本発明を限定するものではない。
［親水性化合物の分離分析方法］
本発明の親水性化合物の分離分析方法は、親水性相互作用クロマトグラフィー用カラムを用いた液体クロマトグラフィーによる分離分析方法であって、ｐＨが１２．５以上の揮発性の溶離液を用いる方法である。本発明の親水性化合物の分離分析方法は、糖類等の親水性化合物の分析だけではなく、糖類等の親水性化合物の分取（糖類等の親水性化合物を分離して、回収すること）も含む。
本発明の親水性化合物の分離分析方法は、親水性相互作用クロマトグラフィー用カラムを用いた液体クロマトグラフィーによる分離分析方法であって、ｐＨが１２．５以上の揮発性の溶離液を用いる方法である。本発明の親水性化合物の分離分析方法は、糖類等の親水性化合物の分析だけではなく、糖類等の親水性化合物の分取（糖類等の親水性化合物を分離して、回収すること）も含む。
「ｐＨ」
本発明における溶離液のｐＨとは、有機溶媒と、塩基性化合物と、水とを混合してなる混合液の状態で測定した値を指す。溶離液のｐＨを測定する方法としては、特に限定されないが、例えば、ｐＨメータを用いた測定方法が用いられる。
本発明における溶離液のｐＨとは、有機溶媒と、塩基性化合物と、水とを混合してなる混合液の状態で測定した値を指す。溶離液のｐＨを測定する方法としては、特に限定されないが、例えば、ｐＨメータを用いた測定方法が用いられる。
「分離分析の対象となる物質」
親水性相互作用クロマトグラフィーは、分離分析の対象となる物質（以下、「分析対象物質」と言う。）と充填剤との間での親水性相互作用によって分析対象物質を分離する。本発明の親水性化合物の分離分析方法では、調製時の温度（室温（２５℃））においてｐＨが１２．５以上の揮発性の溶離液を用いることによって、親水性を有する分離対象物質の保持性の違いが増強すると考えられる。したがって、本発明における分析対象物質は親水性化合物である。ここで、親水性化合物とは、構造内に親水性官能基を有する化合物を意味し、親水性官能基としては、例えば、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、カルボニル基、リン酸基、スルホ基、シアノ基、アミド基等が挙げられる。本発明における親水性化合物としては、単糖、二糖、オリゴ糖等の糖類が好ましい。
糖類としては、例えば、アラビノース、キシロース、マンノース、ガラクトース、グルコース、エリトロース、トレオース、リボース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、スクロース、ラクツロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、ニゲロース、ラフィノース、パノース、マルトトリオース、メレジトース、スタキオース等が挙げられる。これらの中でも、アラビノース、キシロース、マンノース、ガラクトースおよびグルコースからなる群から選択される少なくとも１種の分析において、本発明の親水性化合物の分離分析方法はより効果を発揮する。また、本発明の親水性化合物の分離分析方法は、上記で例示した糖類から選ばれる２種以上、特にアラビノース、キシロース、マンノース、ガラクトースおよびグルコースからなる群から選択される２種以上または全種の一斉分析において特に効果を発揮する。
親水性相互作用クロマトグラフィーは、分離分析の対象となる物質（以下、「分析対象物質」と言う。）と充填剤との間での親水性相互作用によって分析対象物質を分離する。本発明の親水性化合物の分離分析方法では、調製時の温度（室温（２５℃））においてｐＨが１２．５以上の揮発性の溶離液を用いることによって、親水性を有する分離対象物質の保持性の違いが増強すると考えられる。したがって、本発明における分析対象物質は親水性化合物である。ここで、親水性化合物とは、構造内に親水性官能基を有する化合物を意味し、親水性官能基としては、例えば、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、カルボニル基、リン酸基、スルホ基、シアノ基、アミド基等が挙げられる。本発明における親水性化合物としては、単糖、二糖、オリゴ糖等の糖類が好ましい。
糖類としては、例えば、アラビノース、キシロース、マンノース、ガラクトース、グルコース、エリトロース、トレオース、リボース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、スクロース、ラクツロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、ニゲロース、ラフィノース、パノース、マルトトリオース、メレジトース、スタキオース等が挙げられる。これらの中でも、アラビノース、キシロース、マンノース、ガラクトースおよびグルコースからなる群から選択される少なくとも１種の分析において、本発明の親水性化合物の分離分析方法はより効果を発揮する。また、本発明の親水性化合物の分離分析方法は、上記で例示した糖類から選ばれる２種以上、特にアラビノース、キシロース、マンノース、ガラクトースおよびグルコースからなる群から選択される２種以上または全種の一斉分析において特に効果を発揮する。
「溶離液」
本発明における揮発性の溶離液は、揮発性の有機溶媒と、揮発性の塩基性化合物と、水と、を含む。
本発明における揮発性の溶離液とは、溶離液に含まれる全ての成分の常圧（１０１．３２５ｋＰａ）下での沸点が１８０℃以下であるものを言う。
本発明における揮発性の溶離液は、揮発性の有機溶媒と、揮発性の塩基性化合物と、水と、を含む。
本発明における揮発性の溶離液とは、溶離液に含まれる全ての成分の常圧（１０１．３２５ｋＰａ）下での沸点が１８０℃以下であるものを言う。
本発明における溶離液は、溶離液調製時の温度（室温（２５℃））においてｐＨが１２．５以上であり、１２．５以上、１４．０以下であることが好ましい。親水性化合物の分離性能をより高めるためには、溶離液のｐＨは１３．０以上、１４．０以下であることがより好ましい。すなわち、本発明における溶離液は、アルカリ性である。
溶離液のｐＨが１２．５未満では、親水性化合物の保持時間が長くなり、また、親水性化合物の分離性能が低くなるため、構造が似ている２種以上の糖類等の親水性化合物を完全に分離することができない。
溶離液のｐＨが１２．５未満では、親水性化合物の保持時間が長くなり、また、親水性化合物の分離性能が低くなるため、構造が似ている２種以上の糖類等の親水性化合物を完全に分離することができない。
本発明における溶離液のｐＨは、揮発性の有機溶媒と、揮発性の塩基性化合物と、水との混合比によって調整することができる。
本発明における揮発性の塩基性化合物は、常圧（１０１．３２５ｋＰａ）下において、１８０℃以下の沸点を有する化合物である。
本発明における揮発性の塩基性化合物としては、アンモニア（沸点：−３３℃）またはアミン類が好ましい。
アミン類としては、例えば、メチルアミン（沸点：−６℃）、ジメチルアミン（沸点：−７℃）、トリメチルアミン（沸点：２．９℃）、エチルアミン（沸点：１６．６℃）、ジエチルアミン（沸点：５５．５℃）、トリエチルアミン（沸点：８９．７℃）、エチレンジアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ジイソプロピルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、テトラメチルエチレンジアミン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、オキサゾール、チアゾール等が挙げられる。これらの中でも、ジエチルアミンが特に好ましい。ジエチルアミンが好ましい理由は、揮発性があり、かつ、強いアルカリ性を示すことに加え、ジエチルアミンを含む溶離液を用いて糖類の分析を行った場合、比較的短時間で分析を行うことが可能であるからである。これらの塩基性化合物は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
本発明における揮発性の塩基性化合物としては、アンモニア（沸点：−３３℃）またはアミン類が好ましい。
アミン類としては、例えば、メチルアミン（沸点：−６℃）、ジメチルアミン（沸点：−７℃）、トリメチルアミン（沸点：２．９℃）、エチルアミン（沸点：１６．６℃）、ジエチルアミン（沸点：５５．５℃）、トリエチルアミン（沸点：８９．７℃）、エチレンジアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ジイソプロピルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、テトラメチルエチレンジアミン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、オキサゾール、チアゾール等が挙げられる。これらの中でも、ジエチルアミンが特に好ましい。ジエチルアミンが好ましい理由は、揮発性があり、かつ、強いアルカリ性を示すことに加え、ジエチルアミンを含む溶離液を用いて糖類の分析を行った場合、比較的短時間で分析を行うことが可能であるからである。これらの塩基性化合物は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
本発明における揮発性の有機溶媒は、常圧（１０１．３２５ｋＰａ）下において、１８０℃以下の沸点を有する化合物である。
本発明における揮発性の有機溶媒としては、水と任意の量で相溶するものが好適に用いられる。このような有機溶媒としては、例えば、アセトニトリル（沸点：８２℃）、テトラヒドロフラン、アセトン、エタノール、メタノール等が挙げられる。これらの有機溶媒は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
本発明における揮発性の有機溶媒としては、水と任意の量で相溶するものが好適に用いられる。このような有機溶媒としては、例えば、アセトニトリル（沸点：８２℃）、テトラヒドロフラン、アセトン、エタノール、メタノール等が挙げられる。これらの有機溶媒は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
本発明における溶離液において、親水性化合物の保持時間が長くならず、また、分離性能を高めるためには、溶離液を構成する有機溶媒の比率は、仕込み時において７０体積％以上であることが好ましく、９０体積％以上であることがより好ましく、９０体積％〜９５体積％であることがさらに好ましい。
本発明における溶離液において、親水性化合物の保持時間が長くならず、また、分離性能を高めるためには、溶離液を構成する水の比率は、仕込み時において３０体積％以下であることが好ましく、５体積％以下であることがより好ましく、１体積％〜５体積％であることがさらに好ましい。
本発明における溶離液において、親水性化合物の保持時間が長くならず、また、分離性能を高めるためには、溶離液を構成する塩基性化合物の比率は、仕込み時において１体積％以上であることが好ましく、２体積％以上であることがより好ましく、２体積％〜５体積％であることがさらに好ましい。
本発明における溶離液は、ｐＨ、揮発性、分離性能等を損なわない範囲で、前記の有機溶媒、前記の塩基性化合物、および、水以外の成分を含んでいてもよい。
前記の有機溶媒、前記の塩基性化合物、および、水以外の成分としては、例えば、二酸化炭素、ギ酸等が挙げられる。これらの成分は、緩衝作用を発現させるために加えられる。
前記の有機溶媒、前記の塩基性化合物、および、水以外の成分としては、例えば、二酸化炭素、ギ酸等が挙げられる。これらの成分は、緩衝作用を発現させるために加えられる。
「カラム」
本発明で用いられるカラムは、例えば、円筒形状をなすハウジングと、そのハウジングの内部に充填された後述する充填剤とから概略構成されている。ハウジングの材質および大きさは、特に限定されない。
本発明では、親水性相互作用クロマトグラフィー用カラムが用いられる。本発明における親水性相互作用クロマトグラフィーとは、移動相に有機溶媒と水の混合溶媒を用い、固定相に高極性官能基を用いる分析方法を指す。
本発明で用いられるカラムは、例えば、円筒形状をなすハウジングと、そのハウジングの内部に充填された後述する充填剤とから概略構成されている。ハウジングの材質および大きさは、特に限定されない。
本発明では、親水性相互作用クロマトグラフィー用カラムが用いられる。本発明における親水性相互作用クロマトグラフィーとは、移動相に有機溶媒と水の混合溶媒を用い、固定相に高極性官能基を用いる分析方法を指す。
「充填剤」
充填剤は、シリカゲルやポリマー等の基材、または、イオン交換基や極性基のような官能基を前記基材に導入した粒子である。
本発明において、基材としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、ポリアクリレート等のアルカリ耐性の高い基材が好ましく用いられる。
基材に導入する官能基としては、アミノ基が好ましい。
本発明において、充填剤としては、高い親水性を有し、糖類のアノマー分離を抑制可能であるという観点から、アミノ基を有するポリビニルアルコールがより好ましい。
充填剤は、シリカゲルやポリマー等の基材、または、イオン交換基や極性基のような官能基を前記基材に導入した粒子である。
本発明において、基材としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、ポリアクリレート等のアルカリ耐性の高い基材が好ましく用いられる。
基材に導入する官能基としては、アミノ基が好ましい。
本発明において、充填剤としては、高い親水性を有し、糖類のアノマー分離を抑制可能であるという観点から、アミノ基を有するポリビニルアルコールがより好ましい。
基材に導入するアミノ基は、親水性に優れたアミノ基であることが好ましい。このようなアミノ基としては、具体的には、Ｄ−グルカミン（下記式（１））、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（下記式（２））、１−アミノ−１−デオキシ−Ｄ−マンニトール（下記式（３））、１−アミノ−１−デオキシ−Ｄ−ガラクチトール（下記式（４））、４−アミノ−１，２，３−ブタントリオール（下記式（５））、３−アミノ−１，２−プロパンジオール（下記式（６））、および、３−メチルアミノ−１，２−プロパンジオール（下記式（７））からなる群から選択される少なくとも１種を基材に化学結合させることによって基材に導入されたアミノ基が挙げられる。
「装置」
本発明の親水性化合物の分離分析方法では、例えば、図１に示すような液体クロマトグラフが用いられる。
図１に示す液体クロマトグラフ１００は、移動相としての溶離液２００が流される方向（溶離液２００の通液方向）に沿って順に設けられた、容器１１０と、通液ポンプ１２０と、試料導入部１３０と、カラム１４０と、検出器１５０と、を備えている。容器１１０と、通液ポンプ１２０と、試料導入部１３０と、カラム１４０と、検出器１５０とは、配管等からなる流路１６０を介して連結されている。
本発明の親水性化合物の分離分析方法では、例えば、図１に示すような液体クロマトグラフが用いられる。
図１に示す液体クロマトグラフ１００は、移動相としての溶離液２００が流される方向（溶離液２００の通液方向）に沿って順に設けられた、容器１１０と、通液ポンプ１２０と、試料導入部１３０と、カラム１４０と、検出器１５０と、を備えている。容器１１０と、通液ポンプ１２０と、試料導入部１３０と、カラム１４０と、検出器１５０とは、配管等からなる流路１６０を介して連結されている。
容器１１０内には、溶離液２００が収容されている。
溶離液２００としては、上記の揮発性の有機溶媒と、揮発性の塩基性化合物と、水と、を含むものが用いられる。
溶離液２００としては、上記の揮発性の有機溶媒と、揮発性の塩基性化合物と、水と、を含むものが用いられる。
通液ポンプ１２０は、容器１１０内の溶離液２００を一定の流量で送ることができる。
試料導入部１３０は、通液ポンプ１２０とカラム１４０を連結する流路１６０の途中に設けられている。この試料導入部１３０から、流路１６０を流れる溶離液２００に、分離分析の対象となる試料が導入される。
試料導入部１３０は、通液ポンプ１２０とカラム１４０を連結する流路１６０の途中に設けられている。この試料導入部１３０から、流路１６０を流れる溶離液２００に、分離分析の対象となる試料が導入される。
カラム１４０は、ハウジングに、上記の基材、または、基材に官能基を化学結合させた粒子からなる充填剤が充填されたものである。カラム１４０は、試料に含まれる分離対象化合物（糖類等の親水性化合物）を分離する。
検出器１５０は、カラム１４０にて分離された化合物を検出する。溶離液２００が揮発性であるため、検出器１５０としては、質量分析装置、荷電化粒子検出器、蒸発光散乱検出器等の、装置内部で溶離液２００を揮発させる形式の装置を用いることができる。
また、液体クロマトグラフ１００では、試料導入部１３０、カラム１４０および検出器１５０が、図示しない恒温漕内に設置されていてもよい。恒温漕は、温度制御機能を備え、試料導入部１３０、カラム１４０、および、検出器１５０の温度を制御する。これにより、安定した分析を行うことができる。
また、液体クロマトグラフ１００では、試料導入部１３０、カラム１４０および検出器１５０が、図示しない恒温漕内に設置されていてもよい。恒温漕は、温度制御機能を備え、試料導入部１３０、カラム１４０、および、検出器１５０の温度を制御する。これにより、安定した分析を行うことができる。
質量分析装置（Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＭＳ）は、カラム１４０で分離された化合物を高真空下でイオン化し、そのイオンを電磁気的に分離して検出する装置である。
荷電化粒子検出器は、カラム１４０で分離された化合物を含む溶離液２００を噴霧し、微粒子になった成分にコロナ放電によって電荷を持たせ、電気的に検出する装置である。
蒸発光散乱検出器は、カラムで分離された化合物を含む溶離液２００を蒸発させることにより、その化合物を微粒子化し、その散乱光を測定する装置である。
荷電化粒子検出器は、カラム１４０で分離された化合物を含む溶離液２００を噴霧し、微粒子になった成分にコロナ放電によって電荷を持たせ、電気的に検出する装置である。
蒸発光散乱検出器は、カラムで分離された化合物を含む溶離液２００を蒸発させることにより、その化合物を微粒子化し、その散乱光を測定する装置である。
液体クロマトグラフ１００を用いた分析では、試料導入部１３０から流路１６０内に注入された試料が、通液ポンプ１２０によって流路１６０内を通液される溶離液２００により、カラム１４０へと導かれる。カラム１４０にて、試料中の分離対象化合物（糖類等の親水性化合物）が分離され、分離された化合物が、検出器１５０にて溶離液２００のみの信号からの変化量として計測される。検出器１５０からの出力信号を、検出器１５０に接続された図示しないデータ処理部でクロマトグラムに変換する。
溶離液２００、すなわち、移動相の流量（カラム１４０内を流れる速さに比例）は、特に限定されないが、０．５ｍＬ／ｍｉｎ〜１．５ｍＬ／ｍｉｎであることが好ましい。
また、移動相を通液する際のカラム１４０の温度は、特に限定されないが、３０℃〜６０℃であることが好ましい。
カラム１４０の長手方向と垂直な断面の直径は、２．０ｍｍ〜４．６ｍｍであることが好ましい。
また、移動相を通液する際のカラム１４０の温度は、特に限定されないが、３０℃〜６０℃であることが好ましい。
カラム１４０の長手方向と垂直な断面の直径は、２．０ｍｍ〜４．６ｍｍであることが好ましい。
本発明の親水性化合物の分離分析方法によれば、親水性相互作用クロマトグラフィー用カラムを用いた液体クロマトグラフィーにおいて、ｐＨが１２．５以上の揮発性の溶離液を用いることにより、従来法では分離が難しかった構造が似ている２種以上の糖類等の親水性化合物を完全に分離し、定量性に優れた分析が可能である。また、揮発性の溶離液を用いることにより、質量分析装置、荷電化粒子検出器、蒸発光散乱検出器を用いた高感度分析が可能である。
本発明の親水性化合物の分離分析方法では、アルカリ性の溶離液を用いるため、カラムにシリカゲル基材からなる充填剤を用いた場合、カラムの分離能が劣化するという問題が発生することがある。そこで、上述のように、本発明の親水性化合物の分離分析方法では、例えば、ポリビニルアルコール等のアルカリ耐性の高い基材を用いることにより、長寿命で安定性に優れた分析が可能である。
また、本発明の親水性化合物の分離分析方法では、糖類等の親水性化合物を分離した後、回収することもできる。
親水性化合物の回収方法としては、例えば、上記の液体クロマトグラフ１００の流路１６０の出口側（つまり、検出器１５０の下流側）に回収容器を設置し、示差屈折（ＲＩ）検出器や紫外可視分光（ＵＶ−ｖｉｓ）検出器等の検出器のクロマトグラムを参考に、溶離液２００とともに流れてくる糖類等の親水性化合物を、成分ごとに分けて回収する。前記溶離液には、不揮発性の化合物を混合していないため、溶離液を蒸発させる操作のみで目的成分（糖類等の親水性化合物）を単離することが可能である。溶離液に不揮発性化合物を含む場合、目的成分の単離のためには分液操作などが必要となり、操作が煩雑となる。
親水性化合物の回収方法としては、例えば、上記の液体クロマトグラフ１００の流路１６０の出口側（つまり、検出器１５０の下流側）に回収容器を設置し、示差屈折（ＲＩ）検出器や紫外可視分光（ＵＶ−ｖｉｓ）検出器等の検出器のクロマトグラムを参考に、溶離液２００とともに流れてくる糖類等の親水性化合物を、成分ごとに分けて回収する。前記溶離液には、不揮発性の化合物を混合していないため、溶離液を蒸発させる操作のみで目的成分（糖類等の親水性化合物）を単離することが可能である。溶離液に不揮発性化合物を含む場合、目的成分の単離のためには分液操作などが必要となり、操作が煩雑となる。
以下、実施例および比較例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
カラムとして、昭和電工社製のＳｈｏｄｅｘ（登録商標） ＨＩＬＩＣｐａｋ ＶＧ−５０ ４Ｅを用い、検出器として、荷電化粒子検出器である、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＣｏｒｏｎａ（登録商標） ＣＡＤを用いて、アラビノース、キシロース、マンノース、ガラクトース、グルコースの５種の糖を分析した。
Ｓｈｏｄｅｘ（登録商標） ＨＩＬＩＣｐａｋ ＶＧ−５０ ４Ｅは、ポリビニルアルコールからなる基材にアミノ基を化学結合させてなる充填剤を充填したカラムである。また、カラムの長手方向と垂直な断面の直径は４．６ｍｍ、カラムの長さは２５０ｍｍである。
溶離液としては、アセトニトリルと、ジエチルアミンと、水とを、仕込み時の体積比で、アセトニトリル：ジエチルアミン：水＝９５：４：１の割合で混合した混合溶液を用いた。この溶離液の調製時の温度（室温（２５℃））におけるｐＨは、ｐＨメータ（８８８ Ｔｉｔｒａｎｄｏ、Ｍｅｔｒｏｈｍ社製）を用いて測定したところ、１３．１であった。
溶離液の流量（カラム内を流れる溶離液の速さに比例）を１．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度を６０℃とした。
アラビノース、キシロース、マンノース、ガラクトースおよびグルコースは、各糖類の濃度が０．４ｍｇ／ｍＬとなるように、あらかじめ溶離液に溶かした試料を用意し、この試料を５μＬ注入した。
得られたクロマトグラムを図２に示す。図２において、１はアラビノースのピーク、２はキシロースのピーク、３はマンノースのピーク、４はガラクトースのピーク、５はグルコースのピークを示す。また、図２に示すクロマトグラムにおける糖類の分離度を表１に示す。表１において、１−２は、図２における１と２のピークの分離度、３−４は、図２における３と４のピークの分離度、４−５は、図２における４と５のピークの分離度を示す。
なお、クロマトグラムのピークの分離度は、隣接するピークからの分離の程度を表すものであり、例えば、ピーク１とピーク２が存在する場合、下記の式（１）または式（２）に基づいて算出される。
分離度＝２×［（ピーク２の保持時間）−（ピーク１の保持時間）］／［（ピーク１のベース幅）+（ピーク２のベース幅）］・・・（１）
分離度＝１．１８×［（ピーク２の保持時間）−（ピーク１の保持時間）］／［（ピーク１の半値幅）+（ピーク２の半値幅）］・・・（２）
本実施例では、上記の式（２）に基づいて、分離度を算出した。
カラムとして、昭和電工社製のＳｈｏｄｅｘ（登録商標） ＨＩＬＩＣｐａｋ ＶＧ−５０ ４Ｅを用い、検出器として、荷電化粒子検出器である、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＣｏｒｏｎａ（登録商標） ＣＡＤを用いて、アラビノース、キシロース、マンノース、ガラクトース、グルコースの５種の糖を分析した。
Ｓｈｏｄｅｘ（登録商標） ＨＩＬＩＣｐａｋ ＶＧ−５０ ４Ｅは、ポリビニルアルコールからなる基材にアミノ基を化学結合させてなる充填剤を充填したカラムである。また、カラムの長手方向と垂直な断面の直径は４．６ｍｍ、カラムの長さは２５０ｍｍである。
溶離液としては、アセトニトリルと、ジエチルアミンと、水とを、仕込み時の体積比で、アセトニトリル：ジエチルアミン：水＝９５：４：１の割合で混合した混合溶液を用いた。この溶離液の調製時の温度（室温（２５℃））におけるｐＨは、ｐＨメータ（８８８ Ｔｉｔｒａｎｄｏ、Ｍｅｔｒｏｈｍ社製）を用いて測定したところ、１３．１であった。
溶離液の流量（カラム内を流れる溶離液の速さに比例）を１．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度を６０℃とした。
アラビノース、キシロース、マンノース、ガラクトースおよびグルコースは、各糖類の濃度が０．４ｍｇ／ｍＬとなるように、あらかじめ溶離液に溶かした試料を用意し、この試料を５μＬ注入した。
得られたクロマトグラムを図２に示す。図２において、１はアラビノースのピーク、２はキシロースのピーク、３はマンノースのピーク、４はガラクトースのピーク、５はグルコースのピークを示す。また、図２に示すクロマトグラムにおける糖類の分離度を表１に示す。表１において、１−２は、図２における１と２のピークの分離度、３−４は、図２における３と４のピークの分離度、４−５は、図２における４と５のピークの分離度を示す。
なお、クロマトグラムのピークの分離度は、隣接するピークからの分離の程度を表すものであり、例えば、ピーク１とピーク２が存在する場合、下記の式（１）または式（２）に基づいて算出される。
分離度＝２×［（ピーク２の保持時間）−（ピーク１の保持時間）］／［（ピーク１のベース幅）+（ピーク２のベース幅）］・・・（１）
分離度＝１．１８×［（ピーク２の保持時間）−（ピーク１の保持時間）］／［（ピーク１の半値幅）+（ピーク２の半値幅）］・・・（２）
本実施例では、上記の式（２）に基づいて、分離度を算出した。
［実施例２］
溶離液として、アセトニトリルと、トリエチルアミンと、水とを、仕込み時の体積比で、アセトニトリル：トリエチルアミン：水＝９５：４：１の割合で混合した混合溶液を用いた以外は実施例１と同様にして、上記の５種の糖を分析した。この溶離液の調製時の温度（室温（２５℃））におけるｐＨは、ｐＨメータ（８８８ Ｔｉｔｒａｎｄｏ、Ｍｅｔｒｏｈｍ社製）を用いて測定したところ、１２．７であった。
得られたクロマトグラムを図３に示す。また、得られたクロマトグラムに基づく糖類の分離度を表１に示す。
溶離液として、アセトニトリルと、トリエチルアミンと、水とを、仕込み時の体積比で、アセトニトリル：トリエチルアミン：水＝９５：４：１の割合で混合した混合溶液を用いた以外は実施例１と同様にして、上記の５種の糖を分析した。この溶離液の調製時の温度（室温（２５℃））におけるｐＨは、ｐＨメータ（８８８ Ｔｉｔｒａｎｄｏ、Ｍｅｔｒｏｈｍ社製）を用いて測定したところ、１２．７であった。
得られたクロマトグラムを図３に示す。また、得られたクロマトグラムに基づく糖類の分離度を表１に示す。
［比較例１］
溶離液として、アセトニトリルと、ジエチルアミンと、水とを、仕込み時の体積比で、アセトニトリル：ジエチルアミン：水＝９５：１：４の割合で混合した混合溶液を用いた以外は実施例１と同様にして、上記の５種の糖を分析した。この溶離液の調製時の温度（室温（２５℃））におけるｐＨは、ｐＨメータ（８８８ Ｔｉｔｒａｎｄｏ、Ｍｅｔｒｏｈｍ社製）を用いて測定したところ、１２．３であった。
得られたクロマトグラムを図４に示す。また、得られたクロマトグラムに基づく糖類の分離度を表１に示す。
溶離液として、アセトニトリルと、ジエチルアミンと、水とを、仕込み時の体積比で、アセトニトリル：ジエチルアミン：水＝９５：１：４の割合で混合した混合溶液を用いた以外は実施例１と同様にして、上記の５種の糖を分析した。この溶離液の調製時の温度（室温（２５℃））におけるｐＨは、ｐＨメータ（８８８ Ｔｉｔｒａｎｄｏ、Ｍｅｔｒｏｈｍ社製）を用いて測定したところ、１２．３であった。
得られたクロマトグラムを図４に示す。また、得られたクロマトグラムに基づく糖類の分離度を表１に示す。
［比較例２］
溶離液として、アセトニトリルと、トリエチルアミンと、水とを、仕込み時の体積比で、アセトニトリル：トリエチルアミン：水＝９５：１：４の割合で混合した混合溶液を用いた以外は実施例１と同様にして、上記の５種の糖を分析した。この溶離液の調製時の温度（室温（２５℃））におけるｐＨは、ｐＨメータ（８８８ Ｔｉｔｒａｎｄｏ、Ｍｅｔｒｏｈｍ社製）を用いて測定したところ、１２．１であった。
得られたクロマトグラムを図５に示す。また、得られたクロマトグラムに基づく糖類の分離度を表１に示す。
溶離液として、アセトニトリルと、トリエチルアミンと、水とを、仕込み時の体積比で、アセトニトリル：トリエチルアミン：水＝９５：１：４の割合で混合した混合溶液を用いた以外は実施例１と同様にして、上記の５種の糖を分析した。この溶離液の調製時の温度（室温（２５℃））におけるｐＨは、ｐＨメータ（８８８ Ｔｉｔｒａｎｄｏ、Ｍｅｔｒｏｈｍ社製）を用いて測定したところ、１２．１であった。
得られたクロマトグラムを図５に示す。また、得られたクロマトグラムに基づく糖類の分離度を表１に示す。
一般的に、クロマトグラムのピークの分離度が１．５以上の場合、隣接するピークが完全に分離しているとされている。一方、クロマトグラムのピークの分離度が１．５未満の場合、隣接するピークが一部重なっていることになる。
表１の結果から、実施例１、および、実施例２では、全てのピークが完全に分離していることが分かった。一方、比較例１、および、比較例２では、３−４の分離度が１．５よりも低く、分離できていないことが分かった。以上の結果から、ｐＨが１２．５未満の溶離液を用いて分析を行った場合、上記の５種の糖を全て完全に分離できないことが分かった。
また、図２と図３の結果から、実施例２よりも実施例１の方が短時間で分析可能であることが分かった。この結果から、上記の５種の糖を全て完全に分離する場合に分析時間を短縮するという観点では、揮発性の塩基性化合物としては、ジエチルアミンの方がトリエチルアミンよりも有効であることが分かった。
表１の結果から、実施例１、および、実施例２では、全てのピークが完全に分離していることが分かった。一方、比較例１、および、比較例２では、３−４の分離度が１．５よりも低く、分離できていないことが分かった。以上の結果から、ｐＨが１２．５未満の溶離液を用いて分析を行った場合、上記の５種の糖を全て完全に分離できないことが分かった。
また、図２と図３の結果から、実施例２よりも実施例１の方が短時間で分析可能であることが分かった。この結果から、上記の５種の糖を全て完全に分離する場合に分析時間を短縮するという観点では、揮発性の塩基性化合物としては、ジエチルアミンの方がトリエチルアミンよりも有効であることが分かった。
［実施例３］
検出器として、島津製作所社製の質量分析装置ＬＣＭＳ‐８０３０を用い、アラビノース、キシロース、マンノース、ガラクトースおよびグルコースは、各糖類の濃度が０．０１ｍｇ／ｍＬとなるように、あらかじめ溶離液に溶かした試料を用意し、この試料を５μＬ注入した以外は実施例１と同様にして、上記の５種の糖を分析した。溶離液の調製時の温度（室温（２５℃））におけるｐＨは、ｐＨメータ（８８８ Ｔｉｔｒａｎｄｏ、Ｍｅｔｒｏｈｍ社製）を用いて測定したところ、１３．１であった。
得られたクロマトグラムを図６に示す。また、得られたクロマトグラムに基づく糖類の分離度を表２に示す。
検出器として、島津製作所社製の質量分析装置ＬＣＭＳ‐８０３０を用い、アラビノース、キシロース、マンノース、ガラクトースおよびグルコースは、各糖類の濃度が０．０１ｍｇ／ｍＬとなるように、あらかじめ溶離液に溶かした試料を用意し、この試料を５μＬ注入した以外は実施例１と同様にして、上記の５種の糖を分析した。溶離液の調製時の温度（室温（２５℃））におけるｐＨは、ｐＨメータ（８８８ Ｔｉｔｒａｎｄｏ、Ｍｅｔｒｏｈｍ社製）を用いて測定したところ、１３．１であった。
得られたクロマトグラムを図６に示す。また、得られたクロマトグラムに基づく糖類の分離度を表２に示す。
［比較例３］
溶離液として、アセトニトリルと、ジエチルアミンと、水とを、仕込み時の体積比で、アセトニトリル：ジエチルアミン：水＝９５：１：４の割合で混合した混合溶液を用いた以外は実施例３と同様にして、上記の５種の糖を分析した。この溶離液の調製時の温度（室温（２５℃））におけるｐＨは、ｐＨメータ（８８８ Ｔｉｔｒａｎｄｏ、Ｍｅｔｒｏｈｍ社製）を用いて測定したところ、１２．３であった。
得られたクロマトグラムを図７に示す。また、得られたクロマトグラムに基づく糖類の分離度を表２に示す。
溶離液として、アセトニトリルと、ジエチルアミンと、水とを、仕込み時の体積比で、アセトニトリル：ジエチルアミン：水＝９５：１：４の割合で混合した混合溶液を用いた以外は実施例３と同様にして、上記の５種の糖を分析した。この溶離液の調製時の温度（室温（２５℃））におけるｐＨは、ｐＨメータ（８８８ Ｔｉｔｒａｎｄｏ、Ｍｅｔｒｏｈｍ社製）を用いて測定したところ、１２．３であった。
得られたクロマトグラムを図７に示す。また、得られたクロマトグラムに基づく糖類の分離度を表２に示す。
表２の結果から、実施例３では、全てのピークが完全に分離していることが分かった。一方、比較例３では、３−４の分離度が１．５よりも低く、分離できていないことが分かった。以上の結果から、ｐＨが１２．５未満の溶離液を用いて分析を行った場合、上記の５種の糖を全て完全に分離できないことが分かった。
本発明は、複数の糖類等の親水性化合物を分離し、定量する分離・分析手法として、すでに広く用いられている液体クロマトグラフィーによる親水性化合物の分離分析方法において、糖類等の親水性化合物の分離性能をさらに改善することに寄与するものである。分離能の改善は、溶離液の高流速化による分析時間の短縮、あるいは、カラムの小径化や短尺化による溶離液の消費量の削減に寄与する。
また、揮発性の溶離液を用いることにより、質量分析装置、荷電化粒子検出器、蒸発光散乱検出器等を用いた高感度分析が可能となり、分析試料の使用量の低減に寄与する。
１００・・・液体クロマトグラフ、１１０・・・容器、１２０・・・通液ポンプ、１３０・・・試料導入部、１４０・・・カラム、１５０・・・検出器、１６０・・・流路、２００・・・溶離液。
Claims (10)
- 親水性相互作用クロマトグラフィー用カラムを用いた液体クロマトグラフィーにより親水性化合物を分離分析する方法であって、
ｐＨが１２．５以上の揮発性の溶離液を用いることを特徴とする親水性化合物の分離分析方法。 - 前記親水性化合物は、糖類であることを特徴とする請求項１に記載の親水性化合物の分離分析方法。
- 前記糖類は、アラビノース、キシロース、マンノース、ガラクトースおよびグルコースからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項１または２に記載の親水性化合物の分離分析方法。
- 前記溶離液は、揮発性の有機溶媒と、揮発性の塩基性化合物と、水と、を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の親水性化合物の分離分析方法。
- 前記揮発性の有機溶媒は、水溶性の有機溶媒であることを特徴とする請求項４に記載の親水性化合物の分離分析方法。
- 前記水溶性の有機溶媒は、アセトニトリルであることを特徴とする請求項５に記載の親水性化合物の分離分析方法。
- 前記親水性相互作用クロマトグラフィー用カラムに充填された充填剤が、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、または、ポリアクリレートを含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の親水性化合物の分離分析方法。
- 前記充填剤が、アミノ基を有する充填剤であることを特徴とする請求項７に記載の親水性化合物の分離分析方法。
- 前記親水性相互作用クロマトグラフィー用カラムで分離した親水性化合物を、質量分析装置を用いて検出することを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の親水性化合物の分離分析方法。
- 前記親水性相互作用クロマトグラフィー用カラムで分離した親水性化合物を、荷電化粒子検出器または蒸発光散乱検出器を用いて検出することを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の親水性化合物の分離分析方法。
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