CN104297329B

CN104297329B - 一种应用于脂肪酸分子定性定量分析检测和高通量筛选增强试剂盒及其制备

Info

Publication number: CN104297329B
Application number: CN201410452869.XA
Authority: CN
Inventors: 成晓亮; 郑可嘉
Original assignee: WUHAN QUALITY LIFE TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Fuzhou Pinsheng Medical Technology Co., Ltd; Nanjing Pinsheng Medical Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2014-09-09
Filing date: 2014-09-09
Publication date: 2017-07-04
Anticipated expiration: 2034-09-09
Also published as: CN104297329A

Abstract

一种应用于脂肪酸分子定性定量分析检测和高通量筛选剂盒的制备，具体步骤如下：将样本放置室温，充分解冻,加入‑20度同等体积的试剂QLF，在50度水浴中反应5分钟；离心后，收集上清液；取上清后，加入同等体积的制备试剂QLB1；充分混合后，取溶液点在靶板上，静置后进样进样检测；QLF物质组成及体积比为：50‑90％甲醇，10‑50毫摩尔的氨水；QLB1物质组成及体积比为：50‑70％甲醇，30‑50％离子水，1‑7％三氟乙酸；此试剂盒制备方法简单、成本较低。

Description

一种应用于脂肪酸分子定性定量分析检测和高通量筛选增强试剂盒及其制备

技术领域

本技术属于分析化学应用领域，具体涉及表面激光解析质谱领域。

背景技术

表面激光解析质谱是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，其中以基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)为最重要的实例，此项发明获得过诺贝尔化学奖。主要由两部分组成：基质辅助激光解吸电离离子源(MALDI)和飞行时间质量分析器(TOF)。MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，在电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。因此它是一种软电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比(M/Z)与离子的飞行时间成正比，检测离子。MALDI-TOF-MS具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，为生命科学等领域提供了一种强有力的分析测试手段。

然而，以基质辅助激光解析电离飞行时间质谱为首的所有基于表面激光解析的质谱都需要将样品制备在特制靶板上面，其操作是将样品分散在基质分子中并形成晶体。当用激光照射晶体时，基质从激光中吸收能量，样品解吸附，基质-样品之间发生电荷转移使得样品分子电离，电离的样品在电场作用下飞过真空的飞行管，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即通过离子的质量电荷之比(M/Z)与离子的飞行时间成正比来分析离子，并测得样品分子的分子量。焦点问题就在于通用的基质分子的分子量在1000-3000da,造成了过量的背景质谱峰。这就决定了所有此类基于表面激光解析的质谱分析只能适用于大分子检测，比如蛋白质，长链多肽，核酸，高分子材料等等，而不能应用于小分子检测(分子量小于1000da)，或者说基于表面激光解析的质谱分析的高灵敏度/高通量等独特的优势无法施展在小分子分析检测上面.而分子量小于1000da的小分子却是对人类最重要的最具应用价值的一类化学产品，例如95％以上的药物小分子，所有的氨基酸，维生素等等和人类生活健康相关的化学物质。

目前现有技术针对小分子检测和筛选还停留在光谱法检测，例如荧光发光检测或者衍生出可以荧光检测的底物，但此类检测要求目标小分子分子结构具有光活性集团，另一弊端就是往往光度法灵敏度较低，检测不到微量的小分子浓度。液相质谱(LC-MS)及气相质谱(GC-MS)的已经开始应用在小分子的检测和高通量筛选。但需要消耗大量的人力和溶剂耗材，而且一个样品从制备到质谱分析再到出结果需要相当长一个过程，根据要求不同，分析一个样品从样品制备到拿到结果需要30-60分钟，远远不能满足现代生物医药发展的高通量筛选要求。

发明内容

发明目的：找到一种制备方法简单、成本较低的增强电离缓冲液制备方法，节省开支与时间。

技术方案：一种应用于脂肪酸分子定性定量分析检测和高通量筛选试剂盒，由用QLF已裂解样本和同等体积的制备试剂QLB1组成，QLF物质组成及体积比为：50-90％甲醇，10-50毫摩尔的氨水；QLB1物质组成及体积比为：50-70％甲醇，30-50％离子水，1-7％三氟乙酸。

一种应用于脂肪酸分子定性定量分析检测和高通量筛选试剂盒的制备，具体步骤如下：将样本放置室温，充分解冻,加入-20度同等体积的试剂QLF，在50度水浴中反应5分钟；离心后，收集上清液；取上清后，加入同等体积的制备试剂QLB1；充分混合后，取溶液点在靶板上，静置后进样进样检测；QLF物质组成及体积比为：50-90％甲醇，10-50毫摩尔的氨水；QLB1物质组成及体积比为：50-70％甲醇，30-50％离子水，1-7％三氟乙酸。

优选方案为：QLF物质组成及体积比为：甲醇：氨水＝90：20；QLB1物质组成及体积比为：甲醇:离子水:三氟乙酸＝50：30：3。

有益效果：1、制备方法简单；2、成本较低。

附图说明

图1利用本发明检测到的脂肪酸分子质谱图,图中为本技术发明检测到的从12碳链到18碳链不等，饱和与不饱和脂肪酸质谱图。

具体实施方式

饱和与不饱和脂肪酸均含有长链的烷烃碳链，这一特殊的结构决定了脂肪酸分子的疏水性和在碱缓冲液的强烈反应性。疏水性促进了脂肪酸分子和靶板的非化学性结合，更易被解离。

将样本(单个离心管，96孔多孔板，384孔多孔板)放置室温10分钟，充分解冻。加入-20度同等体积的试剂QLF(QLF物质组成及体积比为：50-90％甲醇，10-50毫摩尔的氨水；QLB1物质组成及体积比为：QLB1物质组成及体积比为：50-70％甲醇，30-50％离子水，1-7％三氟乙酸)，作用15分钟，并在50度水浴中作用5分钟。3000rmp离心10分钟后，收集上清液。

取上清后，加入同等体积的制备试剂QLB1(50-70％甲醇，30-50％离子水，1-7％三氟乙酸)。充分混合后，取0.5微升溶液点在靶板上，通风处下静置10分钟后进样即可。

如图1所示为将高产脂肪酸的微生物细胞裂解后的筛选结果，灵敏度达到纳摩尔级别。我们同时可以检测到高达8种短链脂肪素，包括饱和和非饱和类型。同时通量可达到每日9000个样品的分析处理能力。

Claims

1.一种应用于脂肪酸分子的基于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱定性定量分析检测和高通量筛选试剂盒，其特征在于，由用QLF已裂解样本和同等体积的制备试剂QLB1组成，QLF物质组成及体积比为：50-90％甲醇，10-50毫摩尔的氨水；QLB1物质组成及体积比为：50-70％甲醇，30-50％离子水，1-7％三氟乙酸。

2.权利要求1所述的一种应用于脂肪酸分子的基于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱定性定量分析检测和高通量筛选试剂盒的制备，其特征在于，具体步骤如下：将样本放置室温，充分解冻,加入-20度同等体积的试剂QLF，在50度水浴中反应5分钟；离心后，收集上清液；取上清后，加入同等体积的制备试剂QLB1；充分混合后，取溶液点在靶板上，静置后进样进样检测；QLF物质组成及体积比为：50-90％甲醇，10-50毫摩尔的氨水；QLB1物质组成及体积比为：50-70％甲醇，30-50％离子水，1-7％三氟乙酸。