CN108241059B - 伏马毒素检测胶体金速测卡和试剂盒以及对伏马毒素进行检测的方法 - Google Patents

伏马毒素检测胶体金速测卡和试剂盒以及对伏马毒素进行检测的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物检测领域，公开了伏马毒素检测胶体金速测卡和试剂盒以及对伏马毒素进行检测的方法，具体的，公开了用于伏马毒素检测的胶体金速测卡，该胶体金速测卡包括依次排列在底板上的加样区、结合物区、观测区和吸水区；还公开了对伏马毒素进行检测的方法，所述方法包括：对待测样品进行前处理，得到伏马毒素提取物，并使用所述胶体金速测卡对所述伏马毒素提取物进行检测以及结果分析。同时公开了一种检测伏马毒素用试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括所述胶体金速测卡、装有纯净水的小瓶和装有醇的小瓶。本发明的胶体金速测卡，能够快速有效的提高检测的灵敏度、特异性和精准度。

Description

伏马毒素检测胶体金速测卡和试剂盒以及对伏马毒素进行检 测的方法
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体地，涉及一种用于伏马毒素检测的胶体金速测卡、一种对伏马毒素进行检测的方法以及一种检测伏马毒素用试剂盒。
背景技术
真菌毒素是真菌在食品或饲料里生长所产生的代谢产物，对人类和动物都有害。真菌毒素造成中毒的最早记载是11世纪欧洲的麦角中毒，这种中毒的临床症状曾在中世纪的圣像画中描述过。
常见的真菌毒素为黄曲霉毒素(B1)、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏马毒素、T-2毒素、赭曲霉毒素A。
伏马毒素是一组主要由串珠镰刀菌在一定温度和湿度条件下繁殖所产生的真菌毒素，迄今为止已发现了28种伏马毒素类似物，分为A，B，C和P族4种类型。同时伏马毒素B1毒性在伏马毒素在伏马毒素中最强，研究也最为深入，对多种动物有较严重的毒副作用。伏马毒素可引起马大脑白质软化症、肝损伤、肺水肿、胸腔积水、动脉粥样硬化和婴幼儿发育迟缓等症状。伏马毒素广泛存在于粮食作物，尤其是玉米中，污染呈现出范围广、毒性作用也较大的特点。
目前，伏马毒素的检测普遍采用免疫亲和柱净化-高效液相色谱法，如国标GB/T30957-2014，其他检测方法还有薄层色谱测定方法和酶联免疫吸附(ELISA)法，如国标GB/T19539-2004。这些方法为检测机构实验室常规检测方法，由于该方法需大型仪器、或需专业人员操作、或前处理步骤复杂等特点，所以并不适用于大量样品的现场即时快速检测。
目前，我国部分高校或企业已对该类伏马毒素技术产品做了很好的研究，如南昌大学(专利号CN 104569405 A和专利CN 101696975 B)和中国计量学院(专利号CN101281195 B)，这些专利对伏马毒素免疫技术产品的抗体制备和产品制备做了研究。但目前市场上该类免疫技术产品仍然存在检测稳定性差、产品批次差异大、假阳性或假阴性问题依然存在。另外，现有技术的方法的灵敏度以及特异性也较低。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中对伏马毒素检测时间长、灵敏度、特异性和精准度低且成本高和稳定性差的缺陷，提供一种能快速的、高灵敏度、高特异性、高精准度和稳定性的检测伏马毒素的胶体金速测卡和试剂盒以及一种对伏马毒素进行检测的方法。
为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种用于伏马毒素检测的胶体金速测卡，该胶体金速测卡包括依次排列在底板上的加样区、结合物区、观测区和吸水区；
其中，所述结合物区包括抗体金标垫，所述抗体金标垫上固定有胶体金颗粒和抗伏马毒素的单克隆抗体的偶联结合物；其中，所述胶体金颗粒的粒径为20-35nm，所述抗伏马毒素的单克隆抗体的效价大于10000；
所述加样区包括能够吸收样品的样品垫；
所述观测区包括层析膜，所述层析膜上固定有检测线和质控线，其中，所述检测线包被有待检测的伏马毒素与BSA的偶联物，所述质控线包被有与抗伏马毒素的单克隆抗体特异性结合的二抗。
第二方面，本发明提供了一种对伏马毒素进行检测的方法，所述方法包括：对待测样品进行前处理，得到伏马毒素提取物，并将所述伏马毒素提取物滴加至如上所述的胶体金速测卡的样品垫中部，之后对所述伏马毒素提取物进行结果分析，其中，上样量为50-150μL。
第三方面，本发明还提供了一种检测伏马毒素用试剂盒，其中，该试剂盒包括如上所述的胶体金速测卡、装有纯净水的小瓶和装有醇的小瓶。
本发明提供了一种快速，准确且稳定的检测伏马毒素，优选伏马毒素B1的胶体金快速检测试剂。这种检测方法不需要任何辅助仪器进行处理和判读，检测费用低，操作简便，并且能快速得到实验结果，十分适合在生产一线进行初筛检测。用于伏马毒素检测的胶体金速测卡是基于免疫学原理制备的快速检测试剂。用于检测的基质主要是粮油作物及饲料等样品，该方法前处理简单，检测时只需要使用甲醇溶液作为提取液即可进行检测，检测过程为将检测样品滴入加样孔中，通过检测线和控制线的显色情况对结果进行判定。本方法相较大型仪器方法，具有便携和即时以及灵敏度、特异性、精准度和稳定性高等优点，并且检测结果可视化，适用范围广，同时能够产生一定经济效益和社会效益。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
一方面，本发明提供了一种用于伏马毒素检测的胶体金速测卡，该胶体金速测卡包括依次排列在底板上的加样区、结合物区、观测区和吸水区；
其中，所述结合物区包括抗体金标垫，所述抗体金标垫上固定有胶体金颗粒和抗伏马毒素的单克隆抗体的偶联结合物；其中，所述胶体金颗粒的粒径为20-35nm，所述抗伏马毒素的单克隆抗体的效价大于10000；
所述加样区包括能够吸收样品的样品垫；
所述观测区包括层析膜，所述层析膜上固定有检测线和质控线，其中，所述检测线包被有待检测的伏马毒素与BSA的偶联物，所述质控线包被有与抗伏马毒素的单克隆抗体特异性结合的二抗。
根据本发明，优选的，所述样品垫浸泡液为含有BSA、蔗糖和/或海藻糖、吐温以及胆酸的pH值为7-9.5的PBS缓冲液或PB缓冲液，pH值优选为8.5-9。其中，吐温的浓度可以为0.0001-0.2体积％，优选为0.005-0.05体积％；BSA的浓度可以为1-10重量％，优选为1-5重量％；蔗糖和/或海藻糖的浓度可以为2-4.5重量％，优选为3-4重量％；所述胆酸的浓度为0.01-2重量％，优选为0.1-1重量％。更进一步优选的，所述吐温为吐温80。此处需要说明的是，当含有蔗糖和海藻糖中的一种时，如上的浓度指的是其中一种的浓度，当含有蔗糖和海藻糖两种时，如上的浓度指的是这两种的浓度。
其中，所述PBS缓冲液以及PB缓冲液均为本领域公知常用的缓冲液，此处不再详细赘述。
其中，将样品垫在如上的样品垫浸泡液中进行浸泡，能够显著降低后续检测过程中抗原抗体结合过程中的假阴性率。且样品垫在本发明的样品垫浸泡液中具有显著提高的亲水性。
根据本发明，所述样品垫在样品垫浸泡液中浸泡的时间可以在较宽的范围内进行选择，只要使得浸泡液中的成分能够充分的结合在样品垫上即可，例如，20-120min，优选30-90min。
根据本发明，对所述浸泡的样品垫进行干燥的方法可以为本领域常规的选择，例如，所述干燥的温度可以为35-60℃，干燥的时间可以为120-300min，优选120-240min。
根据本发明，所述样品垫优选为玻璃纤维膜、聚酯膜等高吸水材料。
根据本发明，所述伏马毒素可以为本领域常规的各种伏马毒素，优选为伏马毒素B1。
根据本发明，优选的，所述固定有抗伏马毒素，特别是伏马毒素B1的单克隆抗体的抗体金标垫通过如下的方法进行制备：
(1)将抗待测伏马毒素B1的单克隆抗体加入至pH 7-9的胶体金溶液中，接触40-80min，得到标记有所述单克隆抗体的胶体金溶液；
(2)向步骤(1)得到的标记有所述单克隆抗体的胶体金溶液中加入BSA溶液，接触40-80min；
(3)将步骤(2)得到的混合物料进行固液分离，将沉淀物复溶于含有蔗糖/或海藻糖、BSA和叠氮钠的硼酸溶液中，得到金标抗体溶液；
(4)将步骤(3)所制备的金标抗体溶液喷涂于在含有吐温、BSA、蔗糖和/或海藻糖以及聚乙二醇(PEG2000)的金标垫浸泡液中浸泡后且经干燥至含水量70-80重量％的金标垫上，之后干燥至含水量小于10重量％。
根据本发明，步骤(1)中，可以通过常规的pH调节剂对如上所述制备的胶体金溶液的pH值进行调节，例如，硼酸、磷酸、盐酸、醋酸、乙二酸等有机或无机酸。本发明优选通过硼酸对其pH进行调节。
根据本发明，所述抗待测伏马毒素的单克隆抗体的加入量优选使得所述抗体能够和胶体金颗粒进行充分的结合，优选的，所述单克隆抗体的加入量使得所述单克隆抗体的浓度为0.2-3mg/ml。其中，所述抗体可以为本领域公知的可商购的针对特定毒素的单克隆抗体，也可以通过公知的单克隆抗体制备方法自行制备，本发明对此并没有特别的限制。
根据本发明，所述接触优选为动态接触，例如，在振动或者颠倒混合的条件下接触，所述接触的温度优选为室温，例如，15-35℃。
根据本发明，步骤(2)中，为了稳定并且封闭步骤(1)中得到的结合有抗体的胶体金颗粒，本发明需要向步骤(1)的产物中加入BSA溶液，其中，所述BSA溶液的加入量并没有特别的限制，只要能够充分将步骤(1)的产物进行稳定且封闭即可，优选的，其加入量使得BSA的浓度为0.5-1.5重量％。其中，与BSA的接触优选为动态接触，例如，在振动或者颠倒混合的条件下接触，所述接触的温度优选为室温，例如，15-35℃。
根据本发明，步骤(3)中，将步骤(2)得到的混合物料进行固液分离的方法可以为本领域常规的选择，本发明对此并没有特别的限制，例如，可以通过离心的方法(10000-15000rpm，30-50min，2-6℃)，或者过滤的方法。
另外，本发明的发明人在研究的过程中还发现，通过使用含有蔗糖/或海藻糖、BSA和叠氮钠的硼酸溶液对如上固液分离后的固相进行复溶，以得到金标抗体溶液，使用该金标抗体溶液涂覆金标垫，能够使得对毒素检测的灵敏度、特异性以及精准度得到进一步的提升。优选的情况下，在所述硼酸溶液中，蔗糖和/或海藻糖的浓度为0.5-4重量％，优选为1-3重量％；BSA的浓度为0.5-1.5重量％，优选为0.8-1.2重量％；叠氮钠的浓度为0.01-1重量％，优选为0.03-0.08重量％；所述硼酸溶液的pH值为7-9，优选为7.5-8.5。此处需要说明的是，当含有蔗糖和海藻糖中的一种时，“蔗糖和/或海藻糖的浓度为0.5-4重量％，优选为1-3重量％”指的是其中一种的浓度，当含有蔗糖和海藻糖两种时，“蔗糖和/或海藻糖的浓度为0.5-4重量％，优选为1-3重量％”指的是这两种的浓度。
在步骤(4)中，本发明的发明人发现，在本发明如上特定的制备抗体金标垫的制备过程中结合特定的金标垫浸泡液，能够使得最终制备的包括有所述抗体金标垫的胶体金速测卡对毒素检测的灵敏度、特异性以及精准度得到大大地提升。其中，进一步优选的，所述吐温的浓度为0.001-0.1体积％，优选为0.005-0.05体积％，BSA的浓度为0.5-5重量％，优选为1-2重量％，所述蔗糖和/或海藻糖的浓度为2-10重量％，优选为3-8重量％，聚乙二醇的浓度为0.01-1重量％，优选为0.03-0.1重量％。在该优选的情况下，本发明的方法可以对伏马毒素的检测实现最大的检测灵敏度、特异性和精准度。,其中，所述吐温优选为吐温80，所述聚乙二醇优选为聚乙二醇2000。此处需要说明的是，当含有蔗糖和海藻糖中的一种时，“所述蔗糖和/或海藻糖的浓度为2-10重量％，优选为3-8重量％”指的是其中一种的浓度，当含有蔗糖和海藻糖两种时，“所述蔗糖和/或海藻糖的浓度为2-10重量％，优选为3-8重量％”指的是这两种的浓度。
根据本发明，所述金标垫在金标垫浸泡液中浸泡的时间可以在较宽的范围内进行选择，只要使得浸泡液中的成分能够充分的结合在金标垫上即可，例如，20-40min。
根据本发明，对所述浸泡的金标垫进行干燥的方法可以为本领域常规的选择，例如，所述干燥的温度可以为35-40℃，干燥的时间可以为60-300min，优选120-240min。
根据本发明，为了进一步增加由本发明制备的抗体金标垫制备的胶体金速测卡对真菌毒素检测的灵敏度、特异性和精准度，本发明的方法还包括：在涂覆所述金标颗粒溶液前将干燥的浸泡过金标抗体溶液的金标垫于相对湿度大于80％，优选为80-90％且2-6℃的条件下放置20-60min。
根据本发明，所述抗体金标垫优选为玻璃纤维膜或聚酯膜。
根据本发明，将如上制备的金标抗体喷涂于所述金标垫上的喷涂量可以在较宽的范围内进行变化。优选的，喷涂量为0.5-1.5μL/cm。
本发明的发明人在研究的过程中发现，通过在特定的条件下将特定比例的氯金酸和柠檬酸钠进行氧化还原反应，并且使反应产物在特定的速率进行降温，能够得到颗粒大小均一的且粒径在10-35nm，优选为10-30nm范围内的胶体金颗粒。当用此胶体金颗粒制备胶体金速测卡以用于真菌毒素的检测时，能够有效提高检测的灵敏度、特异性以及精准度。因此，本发明的胶体金溶液中的胶体金颗粒的制备方法优选包括：
(i)在搅拌的条件下，向沸腾的氯金酸溶液中加入柠檬酸钠，使氯金酸与柠檬酸钠接触反应5-15min，得到反应产物；
(ii)将步骤(1)得到的反应产物在15-20℃/min降温速度下降温至20-35℃，得到粒径为10-35nm的胶体金颗粒；
其中，柠檬酸钠的加入量使得氯金酸与柠檬酸钠的重量比为1：2-4，优选为1：3-4。所述氯金酸溶液优选为氯金酸的水溶液，并且进一步优选的，在所述氯金酸溶液中，所述氯金酸的浓度为1-2重量％。
根据本发明，当在所述氯金酸溶液中加入柠檬酸钠溶液后，在加热沸腾且搅拌的条件下，溶液的颜色会呈现出浅蓝、蓝色、紫色至酒红色的变化，当呈现出酒红色后，溶液颜色不再发生变化，此时再在加热沸腾且搅拌的条件下保持3-10min，即可得到反应产物。该历程总共大概需要5-15min的时间。
根据本发明，将所述反应产物进行降温的方法可以为本领域常规的选择，例如，可以通过与冷却介质接触进行降温，本发明在此不再赘述。
根据本发明，所述柠檬酸钠可以为柠檬酸三钠。
根据本发明，所述层析膜优选通过以下步骤进行制备：将所述伏马毒素与BSA的偶联物和所述二抗固定于所述层析膜上，然后干燥并组装；干燥前所述层析膜含水量为50-80重量％；干燥后所述层析膜含水量为小于10重量％。其中，所述固定优选通过喷涂的方式进行。所述干燥的方法已经在上文中进行了具体的描述，此处不再详细赘述。
根据本发明，所述二抗优选为羊抗鼠二抗。
其中，所述固定的方式可以为本领域常规的选择，例如，用于固定的的包被缓冲液为pH7.4的PB缓冲液，之后使用BSA对T线和C线进行封闭处理。其中，在包被缓冲液中，呕吐毒素与BSA偶联物的浓度可以为0.1-0.5mg/mL，二抗浓度为0.1-0.5mg/mL，喷涂包被量均为0.3-1μL/cm。进一步的，将包被好的层析膜按照如上的任意方式进行干燥。
另外，在组装时，所述检测线距离结合物区可以为0.5-1mm，所述质控线距离检测线可以为0.5-1mm。其中，进一步优选的，所述样品垫与金标垫、金标垫与层析膜、层析膜与吸水区的相互重叠覆盖宽度为1-2mm。
根据本发明，所述层析膜可以为硝酸纤维素膜。
根据本发明，所述吸水区的基底为吸水纸。
第二方面，本发明提供了一种对伏马毒素进行检测的方法，所述方法包括：对待测样品进行前处理，得到伏马毒素提取物，并使用如上所述的胶体金速测卡对所述伏马毒素提取物进行检测以及结果分析。对待测样品进行前处理，得到伏马毒素提取物，并将所述伏马毒素提取物滴加如上所述的胶体金速测卡的样品垫中部，之后对所述伏马毒素提取物进行结果分析，其中，上样量为50-150μL。
根据本发明，对待测样品中的毒素进行提取的方法优选使用甲醇溶液，优选60-85体积％的甲醇溶液对待测样品进行处理。其中，优选情况下，相对于1g的待测样品，所述甲醇溶液的加入量为3-10mL，优选为5-8mL。使用甲醇溶液对待测样品进行处理的方法可以为常规的选择，例如，震荡混匀，或是手动上下颠倒混匀，本发明对此并没有特别的限制。处理的时间优选为5-30min。处理接触后，优选通过离心(4000-6000rpm，4-8min，20-35℃)的方法进行固液分离，获得上清液。
当使用本发明的胶体金速测卡对待测毒素进行检测时，当待测样品中含有待检测的毒素时，待测样品被加入到加样区后，在吸水区的作用下，待测样品从加样区向吸水区运动，当运动到结合物区时，待检测的毒素与结合物的特异性抗体结合，随后继续向前运动，由于结合物区的特异性抗体与样品中的毒素提前进行了结合，待运动至检测线(T线)时，便不会再与T线中的偶联物结合，从而T线不显色，当运动至质控线(C线)时，C线中的抗体与待检测的毒素的特异性抗体特异性结合，从而发生显色。也即，当T线不显色，而C线显色时，结果为阳性。反之，当样品中不含有待检测的毒素时，结合物区的毒素特异性抗体会与所述偶联物结合，从而发生显色，也即，当T线和C线均显色时，结果为阴性。如果，C线未显色，则可直接判断检测结果无效。
第三方面，本发明还提供了一种检测伏马毒素用试剂盒，该试剂盒包括如上所述的胶体金速测卡、装有纯净水的小瓶和装有醇的小瓶。其中，所述纯净水和醇可用于提取样品中的毒素，所述提取的方法可以通过简单的浸泡提取，所述醇优选为甲醇。进一步的，所述试剂盒中还包括有所述胶体金速测卡的使用方法和毒素提取方法的说明书。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，
实施例1
本实施例用于说明本发明提供的胶体金速测卡的制备方法
(1)胶体金溶液的制备
将浓度为1.2重量％的氯金酸溶液放置于加热磁力搅拌器上，加热至沸腾，快速加入3ml柠檬酸三钠溶液(氯金酸与柠檬酸三钠的重量比为1：3.8)，溶液开始变色，由浅蓝、蓝色、紫色、酒红色依次变色，当溶液变为酒红色时，继续加热5min，然后以15℃/min的速度降温至室温，放于4℃备用。经透射电镜镜检，胶体金颗粒大小一致，均在20-25nm之间、成规则的球形；
(2)金标抗体的制备
1)使用硼酸缓冲液将步骤(1)制备的胶体金溶液的pH值调节至8.5；
2)在搅拌的条件下，向胶体金溶液中迅速加入抗伏马毒素B1的单克隆抗体(效价1:100000)，抗体浓度达到2.0mg/mL，室温缓慢颠倒混匀1h；
3)向标记有抗体的胶体金溶液中加入10重量％的BSA溶液，使BSA的终浓度为0.5重量％，以稳定封闭胶体金溶液，室温缓慢颠倒混匀1h；
4)离心(12000rpm，40min，约4℃)后弃上清，用含2重量％蔗糖、1重量％BSA和0.05重量％的叠氮钠的pH8.0的硼酸缓冲液复溶沉淀物，约4℃下储藏备用；
(3)抗体金标垫的制备
1)称取或量取0.01mL吐温80、1.5g BSA、3g蔗糖以及0.05g的PEG2000，用0.01重量％的PBS缓冲液(pH 9.0)定容到100mL，完全溶解后继续慢速混匀30min，得到金标垫浸泡液；
2)将玻璃纤维金标垫完全浸泡于配制好的金标垫浸泡液中30min；之后用洁净镊子取出金标垫，放置于洁净的37℃环境中，烘干3h；
4)将干燥后的金标垫放置于相对湿度为80％温度约4℃的环境中30min，以增加金标垫的亲水性，之后喷涂步骤(2)中制备的金标抗体，喷涂结束后立即放置于洁净的37℃环境中，烘干2h。
(4)样品垫的制备
1)称取或量取0.01mL吐温80、5g BSA，3.5g海藻糖，0.5mL胆酸，用0.01重量％的PBS缓冲液(pH 8.5)定容到100mL，完全溶解后继续慢速混匀20min；
2)将双层玻璃纤维样品垫完全浸泡于配制好的样品垫浸泡液中60min；之后用洁净镊子取出金标垫，放置于洁净的37℃环境中，烘干3h。
(5)硝酸纤维素膜(NC膜)的制备
将伏马毒素B1与BSA偶联，并包被于NC膜上作为T线，将羊抗鼠二抗喷涂于NC膜上作为C线，其中，包被缓冲液为pH 7.4的PB缓冲液，之后使用BSA对T线和C线进行封闭处理。其中，在包被缓冲液中，伏马毒素B1与BSA偶联物的浓度为0.3mg/mL，二抗浓度为0.4mg/mL，喷涂包被量均为0.8μL/cm。进一步的，将包被好的层析膜置于洁净的37℃环境中，烘干3h。
(6)胶体金速测卡的组装
将样品垫、金标垫、NC膜和吸水垫依次贴于PVC底板上，其中，NC膜贴于金标垫之下，重叠1.5mm，且T线距离金标垫0.8mm，C线距离T线0.8mm；吸水纸与NC膜重叠1.5mm，另外，样品垫与金标垫也重叠1.5mm。
实施例2
本实施例用于说明本发明提供的胶体金速测卡的制备方法
(1)胶体金溶液的制备
将浓度为1重量％的氯金酸溶液放置于加热磁力搅拌器上，加热至沸腾，快速加入2.5ml柠檬酸三钠溶液(氯金酸与柠檬酸三钠的重量比为1：3.3)，溶液开始变色，由浅蓝、蓝色、紫色、酒红色依次变色，当溶液变为酒红色时，继续加热8min，然后以18℃/min的速度降温至室温，放于4℃备用。经透射电镜镜检，胶体金颗粒大小一致，均在15-20nm之间、成规则的球形；
(2)金标抗体的制备
1)使用硼酸缓冲液将步骤(1)制备的胶体金溶液的pH值调节至7.5；
2)在搅拌的条件下，向胶体金溶液中迅速加入抗伏马毒素B1单克隆抗体(效价1:100000)，抗体浓度达到3.0mg/mL，室温缓慢颠倒混匀1h；
3)向标记有抗体的胶体金溶液中加入10重量％的BSA溶液，使BSA的终浓度为0.8重量％，以稳定封闭胶体金溶液，室温缓慢颠倒混匀1h；
4)离心(15000rpm，30min，约4℃)后弃上清，用含1重量％蔗糖、0.8重量％BSA和0.08重量％的叠氮钠的pH8.5的硼酸缓冲液复溶沉淀物，约4℃下储藏备用；
(3)抗体金标垫的制备
1)称取或量取0.005mL吐温80、2g BSA、5g海藻糖以及0.03g的PEG2000，用0.01重量％的PBS缓冲液(pH 8.5)定容到100mL，完全溶解后继续慢速混匀30min；
2)将玻璃纤维金标垫完全浸泡于配制好的金标垫浸泡液中20min；之后用洁净镊子取出金标垫，放置于洁净的35℃环境中，烘干4h；
4)将干燥后的金标垫放置于相对湿度为85％温度约4℃的环境中30min，以增加金标垫的亲水性，之后喷涂步骤(2)中制备的金标抗体，喷涂结束后立即放置于洁净的40℃环境中，烘干2h。
(4)样品垫的制备
1)称取或量取0.02mL吐温80、3g BSA，3g海藻糖和蔗糖(1：1)，0.1mL胆酸，用0.01重量％的PBS缓冲液(pH 9.0)定容到100mL，完全溶解后继续慢速混匀30min；
2)将双层玻璃纤维样品垫完全浸泡于配制好的样品垫浸泡液中30min；之后用洁净镊子取出金标垫，放置于洁净的37℃环境中，烘干4h。
(5)-(6)同实施例1。
实施例3
本实施例用于说明本发明提供的胶体金速测卡的制备方法
(1)胶体金溶液的制备
将浓度为1.5重量％的氯金酸溶液放置于加热磁力搅拌器上，加热至沸腾，快速加入2.5ml柠檬酸三钠溶液(氯金酸与柠檬酸三钠的摩尔比为1：3.3)，溶液开始变色，由浅蓝、蓝色、紫色、酒红色依次变色，当溶液变为酒红色时，继续加热10min，然后以20℃/min的速度降温至室温，放于4℃备用。经透射电镜镜检，胶体金颗粒大小一致，均在25-30nm之间、成规则的球形；
(2)金标抗体的制备
1)使用硼酸缓冲液将步骤(1)制备的胶体金溶液的pH值调节至9.0；
2)在搅拌的条件下，向胶体金溶液中迅速加入抗伏马毒素B1单克隆抗体(效价1:100000)，抗体浓度达到1.0mg/mL，室温缓慢颠倒混匀1h；
3)向标记有抗体的胶体金溶液中加入10％的BSA溶液，使BSA的终浓度为1.5重量％，以稳定封闭胶体金溶液，室温缓慢颠倒混匀1h；
4)离心(10000rpm，50min，约4℃)后弃上清，用含3重量％蔗糖、1.2重量％BSA和0.03重量％的叠氮钠的pH 7.5的硼酸缓冲液复溶沉淀物，约4℃下储藏备用；
(3)抗体金标垫的制备
1)称取或量取0.05mL吐温80、1g BSA、7g海藻糖以及0.08g的PEG2000，用0.01重量％的PBS缓冲液(pH 9.0)定容到100mL，完全溶解后继续慢速混匀30min；
2)将玻璃纤维金标垫完全浸泡于配制好的金标垫浸泡液中40min；之后用洁净镊子取出金标垫，放置于洁净的37℃环境中，烘干3h；
4)将干燥后的金标垫放置于相对湿度为90％温度约4℃的环境中30min，以增加金标垫的亲水性，之后喷涂步骤(2)中制备的金标抗体，喷涂结束后立即放置于洁净的37℃环境中，烘干3h。
(4)样品垫的制备
1)称取或量取0.05mL吐温80、1g BSA，4g蔗糖，0.8mL胆酸，用0.01重量％的PBS缓冲液(pH 9.5)定容到100mL，完全溶解后继续慢速混匀30min；
2)将双层玻璃纤维样品垫完全浸泡于配制好的样品垫浸泡液中30min；之后用洁净镊子取出金标垫，放置于洁净的37℃环境中，烘干2h。
(5)-(6)同实施例1。
实施例4
本实施例用于说明本发明提供的胶体金速测卡的制备方法
按照实施例1的方法进行胶体金速测卡的制备，所不同的是，步骤(2)中，所述单克隆抗体的浓度为1mg/mL，在所述硼酸溶液中，所述蔗糖的浓度为0.1重量％，所述BSA的浓度为3重量％，不含叠氮钠，放置2周后使用。
实施例5
本实施例用于说明本发明提供了胶体金速测卡的制备方法
按照实施例1的方法进行胶体金速测卡的制备，所不同的是，步骤(3)中，所述金标垫浸泡液仅由BSA组成。
实施例6
本实施例用于说明本发明提供了胶体金速测卡的制备方法
按照实施例1的方法进行胶体金速测卡的制备，所不同的是，步骤(3)中，所述金标垫浸泡液不含有PEG2000。
实施例7
本实施例用于说明本发明提供了胶体金速测卡的制备方法
按照实施例1的方法进行胶体金速测卡的制备，所不同的是，在步骤(3)中，在涂覆所述金标抗体溶液前，不将干燥的金标垫于湿度大于80％且约4℃的条件下放置。
实施例8
本实施例用于说明本发明提供了胶体金速测卡的制备方法
按照实施例1的方法进行胶体金速测卡的制备，所不同的是，所述样品垫浸泡液不含有胆酸以及吐温。
实施例9
本对比例用于说明参比的方法提供了胶体金速测卡的制备方法
按照实施例1的方法进行胶体金速测卡的制备，所不同的是，步骤(1)中，反应产物在搅拌的条件下以5℃/min的降温速度下降温至室温，且氯金酸与柠檬酸钠的重量比为1：2。所得到胶体金颗粒的大小在30-50nm之间。
实施例10
本实施例用于说明本发明提供了胶体金速测卡的制备方法
按照实施例1的方法进行胶体金速测卡的制备，所不同的是，所述样品垫浸泡液为含有0.01体积％的吐温20和5重量％的环糊精溶液的PBS溶液。
对比例1
本实施例用于说明本发明提供了胶体金速测卡的制备方法
按照实施例1的方法进行胶体金速测卡的制备，所不同的是，所述真菌毒素为黄曲霉毒素，所述特异性抗体为黄曲霉毒素单克隆抗体，效价1:500000。
测试例1
将实施例1-10和对比例1的胶体金速测卡平放在检测台面上，然后滴加自行配置的含有1ng/ml伏马毒素B1的溶液于加样孔中，待样品刚好移动到NC膜时，停止滴加样品液，15min后记录结果。每个样品重复10次，同时记录阳性样品个数。结果见表1。
另外，滴加含有10ng/ml黄曲霉毒素的溶液至实施例1-10以及对比例1的加样孔中，待样品刚好移动到NC膜时，停止滴加样品液，每个样品重复10次，同时记录交叉反应样品个数和记录检测线和质控线的显色时间。结果见表1。
结果判断：
阴性结果：在C线处显示一条发光条带，在T线处显示发光条带。
阳性结果：在C线处显示一条发光条带，同时在T线处不显示显色发光条带。
无效：反应完成后，若在C线处未显示发光条带，证明该检测系统无效。
表1
Figure BDA0001189610900000171
测试例2
(1)分别配制如下浓度的伏马毒素B1的溶液：500ng/ml，250ng/ml，125ng/ml，63ng/ml，32ng/ml，16ng/ml，8ng/ml，4ng/ml，2ng/ml，1ng/ml，0.5ng/ml。
(2)按照测试例1的方法使用实施例1-10以及对比例1制备的胶体金速测卡对上述样品进行检测。
(3)观察显色情况。并记录每种胶体金速测卡的最小有效显色毒素浓度。每个浓度梯度重复3次。结果见表2。
表2
最小显色浓度(ng/ml)
实施例1 10
实施例2 10
实施例3 10
实施例4 100
实施例5 60
实施例6 200
实施例7 400
实施例8 200
实施例9 60
实施例10 60
对比例1 -------
由以上表1和表2的结果可以看出，采用本发明的方法制备的胶体金速测卡的精准度、特异性和灵敏度均较高，并且在本发明优选的情况下，所述检测性能能够得到进一步提升。
测试例3
选取河北、山东、山西等地的玉米100个批次，将所述玉米粒研磨为粉末状态后，使用70％的甲醇在搅拌的条件下浸泡10min，取上清至离心管中。按照测试例1的方法使用实施例1的胶体金速测卡对所述上清液中的伏马毒素1进行检测。阳性结果检出率为2％。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (5)

1.一种用于伏马毒素检测的胶体金速测卡，该胶体金速测卡包括依次排列在底板上的加样区、结合物区、观测区和吸水区；
其中，所述结合物区包括抗体金标垫，所述抗体金标垫上固定有胶体金颗粒和抗伏马毒素的单克隆抗体的偶联结合物；其中，所述胶体金颗粒的粒径为15-30nm，所述抗伏马毒素的单克隆抗体的效价大于10000；
胶体金颗粒的制备方法优选包括：
(i)在搅拌的条件下，向沸腾的氯金酸溶液中加入柠檬酸钠，使氯金酸与柠檬酸钠接触反应5-15min，得到反应产物；
(ii)将步骤(1)得到的反应产物在15-20℃/min降温速度下降温至20-35℃，得到粒径为10-30nm的胶体金颗粒；
其中，柠檬酸钠的加入量使得氯金酸与柠檬酸钠的重量比为1：3.3-3.8，所述氯金酸溶液为氯金酸的水溶液，在所述氯金酸溶液中，所述氯金酸的浓度为1-1.5重量％；
所述抗体金标垫的制备方法包括：
(1)将抗伏马毒素的单克隆抗体加入至pH 7.5-9的胶体金溶液中，接触40-80min，得到标记有所述单克隆抗体的胶体金溶液；
(2)向步骤(1)得到的标记有所述单克隆抗体的胶体金溶液中加入BSA溶液，接触40-80min；
(3)将步骤(2)得到的混合物料进行固液分离，将沉淀物复溶于含有蔗糖和/或海藻糖、BSA和叠氮钠的硼酸溶液中，得到金标抗体溶液；
(4)将步骤(3)所制备的金标抗体溶液喷涂于在含有吐温、BSA、蔗糖和/或海藻糖以及聚乙二醇的金标垫浸泡液中浸泡后且经干燥至含水量70-80重量％的金标垫上，之后干燥至含水量小于10重量％；
所述金标垫浸泡液中，吐温的浓度为0.005-0.05体积％，BSA的浓度为1-2重量％，所述蔗糖和/或海藻糖的浓度为3-7重量％，聚乙二醇的浓度为0.03-0.08重量％，用pH为8.5-9的PBS溶液定容；
其中，吐温为吐温80，聚乙二醇为聚乙二醇2000；
所述抗体金标垫的制备方法还包括：在涂覆所述金标抗体溶液前，将干燥的金标垫于相对湿度80-90％且2-6℃的条件下放置20-60min；
所述加样区包括能够吸收样品的样品垫；
所述样品垫为在含有BSA、蔗糖和/或海藻糖以及吐温的样品垫浸泡液中浸渍后并干燥的样品垫；
所述样品垫浸泡液为含有BSA、蔗糖和/或海藻糖、吐温以及胆酸的pH值为8.5-9.5的PBS溶液，其中，吐温的浓度为0.01-0.05体积％，BSA的浓度为1-5重量％，蔗糖和/或海藻糖的浓度为3-4重量％，胆酸的浓度为0.1-0.8体积％；
其中，吐温为吐温80；
所述观测区包括层析膜，所述层析膜上固定有检测线和质控线，其中，所述检测线包被有待检测的伏马毒素与BSA的偶联物，所述质控线包被有与抗伏马毒素的单克隆抗体特异性结合的二抗；
所述层析膜通过以下步骤进行制备：对所述伏马毒素与BSA的偶联物和所述二抗进行固定，然后干燥并组装；干燥前所述层析膜含水量为50-80重量％；干燥后所述层析膜含水量为小于10重量％。
2.根据权利要求1所述的胶体金速测卡，其中，所述样品垫与金标垫、金标垫与层析膜、层析膜与吸水区的相互重叠覆盖长度为1-1.5mm。
3.一种对伏马毒素进行检测的方法，所述方法包括：对待测样品进行前处理，得到伏马毒素提取物，并将所述伏马毒素提取物滴加至权利要求1或2所述的胶体金速测卡的样品垫中部，之后对所述伏马毒素提取物进行结果分析，其中，上样量为50-150μL。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，
所述前处理包括：将待测样品与甲醇溶液接触5-30min，之后固液分离取上清液；
所述结果分析包括：(1)当液体达到观测区时，检测线和质控线均可见，判定为阴性；(2)静置5-15min后，质控线可见、检测线不可见，判定为阳性；(3)静置5-15min后，检测线与质控线均不可见或检测线可见而质控线不可见，判定检测无效。
5.一种检测伏马毒素用试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求1或2所述的胶体金速测卡、装有纯净水的小瓶和装有醇的小瓶。
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