CN110987882A - 一种荧光淬灭的胶体金免疫层析试纸条、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种荧光淬灭胶体金层析试纸条，其包括底板，以及由左向右依次设置在该底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；样品垫与结合垫、结合垫与硝酸纤维素膜、硝酸纤维素膜与吸水纸的局部相互层叠；在所述结合垫上设置有金纳米颗粒，在金纳米颗粒上标记有待检测物的抗体；在硝酸纤维素膜上固定有双激发双发射的上转换纳米颗粒标记的检测物的抗原及检测T线；上转换纳米颗粒可同时在两种的不同近红外光激发下发出红光或绿光。本发明还公开了其制备及检测方法。本发明提供的层析试纸条及其检测方法，能在近红外光激发下直接观测结果、对敏感组分进行精准的定量检测，消除了背景干扰，背景值低、信号稳定、灵敏度大大提高。

Description

一种荧光淬灭的胶体金免疫层析试纸条、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物医学诊断及食品安全检测技术领域，具体涉及基于双激发双发射的上转换发光纳米颗粒的荧光淬灭的胶体金免疫层析试纸条、制备方法及其应用。

背景技术

环境和食品样品中的有害化学和生物污染物由于对生态系统的不利影响而成为全球关注的问题。这些物质来源于残留的医疗(药物污染物)，农业(杀虫剂)，生物(病原体及其释放的毒素)和工业(化学溶剂，工业副产品等)废物，这些物质致癌性极高，对人类健康造成不利的影响。因此，对于食品中致癌物、致病菌的及时检测已成为现代生物医学的重大课题。

免疫层析技术(ImmunochromatographicAssay，ICA)是20世纪末发展起来的结合免疫技术和色谱层析技术的一种分析方法，该方法具有特异性、操作简单、快速等特点，广泛应用于临床诊断、环境监测、食品安全等重要领域。传统免疫层析技术以胶体金为标记物，通过条带显色对目标物定性检测或半定量分析。该方法虽然简单快速，但灵敏度较差，难以准确定量。荧光免疫层析技术作为一项新型免疫检测技术，既保留了传统胶体金试纸条的现场快速检测优点，又加入了荧光检测技术的高灵敏度特点，成为提高免疫层析方法检测性能的主要途径之一。

荧光免疫层析技术是基于抗原抗体特异性免疫反应的新型膜检测技术。该技术以固定有检测线(包被抗体或包被抗原)和质控线(抗抗体)的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，荧光标记抗体或抗原固定于连接垫，通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。对于带有多个抗原决定簇的大分子抗原(蛋白、病毒、致病菌等)，通常采用“三明治”型双抗夹心免疫层析方法，即待测物在流动相作用下先与荧光标记抗体结合，当到达检测线时再与包被抗体结合形成双抗夹心的“三明治”型。

免疫层析试纸条是基于毛细管作用力，通过抗原抗体特异性的免疫反应，以条带显色对目标检测物进行定性或定量分析。上转换荧光纳米颗粒是将长波长的激发光转换为短波长的发射光的纳米颗粒，一般通过颗粒的组成不同获得不同的吸收和发射光谱。

在现有食品安全检测技术中，对于多种食源性致病菌都需要进行快速检测。其中，黄曲霉素是一类结构相似、致毒基团相同的次级代谢产物，主要是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的一类毒素。黄曲霉素具有致癌、致畸、致突变的生殖毒性，其中黄曲霉素AFB1的毒性最大、危害最强。此外，乙型副伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌O1和0139群、大肠杆菌O157，甲型副伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌等10种食源性致病菌，也需要进行快速的定量检测。

现有的荧光材料在免疫层析技术中的应用显著提高了该方法的检测性能，但是现有的上转换试纸条在检测黄曲霉素(AFT)等致癌物的免疫层析检测时，由于所采用的有机染料标记物光照下易分解，易发生光漂白现象，具有浓度猝灭特征，影响了分析结果的准确性和可靠性；将其用于标记致癌物抗体或者致病菌抗体的纳米颗粒只有一种检测信号、灵敏度低，因而获得的待检测试样中所含致癌物含量的定量检测结果准确性不高。同时，现有技术中的免疫层析试纸的制备、检测方法，也不能支持其对敏感组分或物质的精准定量检测。

发明内容

为克服上述现有技术所存在的上述不足之处，本发明提供一种基于双激发双发射的上转换发光纳米颗粒的荧光淬灭的胶体金免疫层析试纸条、制备方法及其检测方法，其采用的特制的上转换纳米颗粒，可以同时在两种的不同近红外光激发下发出红光或绿光任意一个波段，即一种近红外激发光可以激发一种波段的光，可通过对检测物质的单线检测、实现对病菌等敏感物质含量的精准定量检测。

为实现发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种荧光淬灭胶体金层析试纸条，其特征在于，其包括底板，以及由左向右依次设置在该底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；其中硝酸纤维素膜设置在底板的中部，样品垫设置在硝酸纤维素膜的左侧、二者之间为结合垫；吸水纸设置在硝酸纤维素膜的右侧；其中，样品垫与结合垫、结合垫与硝酸纤维素膜、硝酸纤维素膜与吸水纸的局部相互层叠；在所述结合垫上设置有金纳米颗粒，在金纳米颗粒上标记有待检测物的抗体；在硝酸纤维素膜上固定有双激发双发射的上转换纳米颗粒标记的检测物的抗原及检测T线；所述的上转换纳米颗粒可同时在两种的不同近红外光激发下发出红光或绿光两种波段中任意一个波段，即一种近红外激发光可以激发一种波段的光。

所述的底板为黏性塑料底板，其上表面设有黏性物质；组装顺序为：从黏性塑料底板的左侧向右侧依次粘合处理后的样品垫、粘合处理后的结合垫、粘合处理后的硝酸纤维素膜，最后粘合吸水纸。

所述黏性塑料底板的长度为60mm；所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸的长度为8～17mm，组装时各部分的接触区域相互叠压1～3mm。

所述的荧光淬灭的胶体金层析试纸条，其中所述的双激发双发射的上转换纳米颗粒，采用如下步骤制备：

(1)采用晶种法制备具有三层核壳结构的双激发双发射的上转换纳米颗粒，其以掺杂有Yb、Tm和Er的NaYF₄纳米颗粒为内核，在所述内核外包裹有Yb掺杂的NaYF₄第一壳层，且在所述第一壳层外包裹有Yb、Nd掺杂的NaYF₄第二壳层，构成Yb、Tm、Er和Nd共掺杂的NaYF₄:Yb/Tm/Er@NaYF4:Yb@NaYF₄:Yb/Nd核壳结构，即制得水溶性的双激发双发射的上转换纳米颗粒UCNPs；该上转换纳米颗粒在近红外光980nm激发下发出红光，在近红外光808nm激发下发出绿光。

(2)UCNPs-抗原的制备：将步骤(1)制备的双激发双发射的上转换纳米颗粒UCNPs，进一步通过物理吸附处理，在水溶性的该双激发双发射的上转换纳米颗粒表面标记上检测物的抗原，获得标记有待检测物抗原的双激发双发射的上转换纳米颗粒。

所述的荧光淬灭的胶体金层析试纸条，其中所述的金纳米颗粒AuNPs，其采用如下步骤制备：

(1)胶体金溶液的制备：

0.25mL 0.1M的氯金酸溶液加入到100mL的超纯水中，磁力搅拌下加热回流至沸腾。迅速加入1.5mL 1％的柠檬酸钠溶液，继续回流约30分钟。期间溶液的颜色由淡黄色变为黑色然后变为深红色。降至室温后，所制备的酒红色的金纳米粒子溶胶用0.22μm的滤膜过滤，获得金纳米颗粒；

(2)AuNPs-抗体的制备：通过物理吸附处理在该金纳米颗粒表面标记上检测物的抗体，获得标记有待检测物抗体的金纳米颗粒。

前述的荧光淬灭的胶体金层析试纸条的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：

(1)样品垫的处理

以纤维素膜作为样品垫材料，将样品垫在样品垫处理液中浸泡不超过30min后，37℃烘干，完成样品垫的处理；样品垫处理液为含有质量浓度0.5％BAS和1％Tween-20的0.01M、pH＝8.0的PBS缓冲溶液；

(2)结合垫的处理

以玻璃纤维素膜作为结合垫材料，首先将结合垫在结合垫处理液中浸泡24h后，37℃烘干，将结合垫放入步骤1所得标记有待检测的AFB1抗体的双金纳米颗粒的溶液中浸泡10min后，37℃烘干，完成结合垫的处理；结合垫处理液为含有质量浓度1％BAS、2％Tween-20和5％蔗糖的0.01M、pH＝7.4的PBS缓冲溶液；

(3)硝酸纤维素膜的处理

将标记有待检测的AFB1的抗原的双激发双发射的上转换纳米颗粒的溶液在硝酸纤维素膜上的某一区域以1.5μL/cm的参数划线，烘干，即完成硝酸纤维素膜的处理；

(4)试纸条的组装

从黏性塑料底板的前端向后端依次粘合处理后的样品垫、粘合处理后的结合垫、粘合处理后的硝酸纤维素膜，最后粘合吸水纸。

一种应用前述荧光淬灭胶体金层析试纸条的检测方法，其特征在于，其包括如下步骤：利用上转换纳米颗粒可以同时在两种的不同近红外光激发下发出红光或绿光两种波段中任意一个波段，在层析试纸条的硝酸纤维素膜上划一条固定有双激发双发射的上转换纳米颗粒标记的检测物的抗原的划线，此时双激发双发射颗粒在近红外激发光下的一个波段的信号作为检测T线，另一个波段的信号可作为质控C线，达到对待检测试样中所含组分的单线检测效果。

所述的检测方法，其特征在于，其具体包括如下步骤：

(1)制备好的层析试纸条在未将待检测试样滴加在样品垫上时，分别通过980nm和808nm激光激发硝酸纤维素膜上固定有双激发双发射的上转换纳米颗粒标记的检测物的抗原，记录所得到的两种不同的检测信号曲线，并以此作为标准信号曲线之一；

(2)当试样中未含检测的敏感组分或物质时，将试样滴加在样品垫上，所述金纳米颗粒上会全部流入硝酸纤维素膜并与膜上固定的双激发双发射的上转换纳米颗粒标记的检测物的抗原相结合；此时由于金纳米颗粒的吸收区域520nm与上转换纳米颗粒808nm激光激发下的绿光发射区域540nm相重合，从而金纳米颗粒可以淬灭上转换纳米颗粒的绿光，作为检测试样的检测T线；但此时上转换纳米颗粒的红光发射区660nm不受影响，因而980nm激光激发下的红光信号作为检测试样的质控C线；

(3)建立T线和C线的标准信号曲线及荧光强度比值曲线，根据检测获得的检测T线与质检C线的荧光强度，计算T线和C线荧光强度比值，将该荧光强度比值与标准信号曲线及荧光强度比值曲线进行对比，即可得到待检测试样中所含敏感组分的精确含量数值，实现待检测试样中所含敏感组分的定量检测。

所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤(2)还包括如下步骤：

(1)检测时，取含有不同浓度敏感组分或物质的检测物的溶液分别滴加在样品垫上进行检测；检测试样会与金纳米颗粒上所标记的待检测物相应的抗体结合，检测试样会和一部分金纳米颗粒形成团聚物，被留在结合垫上，另一部分金纳米颗粒会和剩下的检测试样一起流入硝酸纤维素膜并与膜上固定的双激发双发射的上转换纳米颗粒标记的检测物的抗原相结合；

(2)由于金纳米颗粒只有一部分与硝酸纤维素膜上固定的双激发双发射的上转换纳米颗粒标记的检测物的抗原相结合，因而金纳米颗粒无法完全淬灭上转换纳米颗粒的绿光，且随着检测物的浓度增大，淬灭效果会逐渐降低，即绿光信号逐渐增加；

(3)此时808nm激光激发下的绿光信号作为检测试样的检测T线；通过980nm和808nm激光激发，获得相应的检测T线与质检C线的荧光强度，并计算T线和C线荧光强度比值，将该荧光强度、比值分别与标准信号曲线进行对比，可实现待检测试样中所含组分的定量检测。

本发明的有益效果主要体现在：

1.本发明提供的改进设计的胶体金免疫层析试纸条及其检测方法，重点是利用双激发双发射的上转换发光纳米颗粒的荧光淬灭的特性，实现对敏感物质含量的高灵敏度的定量检测。与其他纳米颗粒相比，本发明提供的双激发双发射的上转换荧光纳米颗粒毒性低、灵敏度高、稳定强，且受背景信号的干扰较少，因此，将UCNPs与胶体金免疫层析试纸结合，可以排除生物样品的自发光干扰现象，提高信噪比，增强灵敏度和稳定性，实现高灵敏度的定量检测。

2、本发明提供的基于双激发双发射的上转换纳米颗粒的制备方法，其工艺简洁、易于实施；该双激发双发射上转换纳米颗粒980nm激发红光、808nm激发绿光；

3、本发明提供的层析试纸条，结构紧凑，是一种能快速检测致癌物的新型免疫试纸条，主要是利用双激发双发射的上转换纳米颗粒具有两种信号，与胶体金结合后可以实现对检测物质的单线检测。

4、本发明的层析试纸条的检测方法，以UCNPs为生物标记物标记抗体，能在近红外光激发下直接观测结果，由于UCNPs独特的光学特性，消除了背景干扰，背景值低、信号稳定、灵敏度大大提高；且试纸中的UCNPs对检测者和环境无害，安全性好。

5、本发明的层析试纸条级检测方法，对待检测样品无需进行较多的前处理，借助上转换发光传感器可直接实现定量测量，操作简单快捷，可现场操作，且结果准确性高。

6、本发明应用该改进设计的胶体金层析免疫试纸的检测方法操作简便、灵敏性较高。该胶体金层析免疫试纸检测快速，易操作，便携，可广泛应用于临床诊断、环境监测、食品安全等重要领域。

附图说明

图1为本发明胶体金免疫层析试纸条的结构示意图；

其中：A为俯视图，B为立体结构示意图。

图2为本发明检测方法中免疫反应过程示意图。

图中：1、底板；2、样品垫；3、结合垫；4、硝酸纤维素膜；5、吸水纸。

具体实施方式

请参见图1及图2，以下通过实施例和附图对本发明的技术方案进行细致说明。

实施例：

本发明实施例提供的荧光淬灭胶体金层析试纸条，其包括底板1，以及由左向右依次设置在该底板1上的样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水纸5；其中硝酸纤维素膜4设置在底板1的中部，样品垫2设置在硝酸纤维素膜4的左侧、二者之间为结合垫2；吸水纸5设置在硝酸纤维素膜4的右侧；其中，样品垫2与结合垫3、结合垫3与硝酸纤维素膜4、硝酸纤维素膜4与吸水纸5的局部相互层叠；在所述结合垫3上设置有金纳米颗粒，在金纳米颗粒上标记有待检测物的抗体；在硝酸纤维素膜4上固定有双激发双发射的上转换纳米颗粒标记的检测物的抗原及检测T线；所述的上转换纳米颗粒可同时在两种的不同近红外光激发下发出红光或绿光两种波段中任意一个波段，即一种近红外激发光可以激发一种波段的光。

具体的，本实施例中，该基于双激发双发射的上转换发光纳米颗粒的荧光淬灭的胶体金免疫层析试纸条，其包括底板1，以及由左向右依次设置在该底板1上的样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水纸5；其中硝酸纤维素膜4设置在底板1的中部，样品垫2设置在硝酸纤维素膜4的左侧、二者之间为结合垫3；吸水纸5设置在硝酸纤维素膜4的右侧；其中，样品垫2与结合垫3、结合垫3与硝酸纤维素膜4、硝酸纤维素膜4与吸水纸5的局部相互层叠；在所述结合垫3上设置有金纳米颗粒，在金纳米颗粒上标记有待检测的AFB1的抗体；在硝酸纤维素膜4上固定有双激发双发射的上转换纳米颗粒标记的检测物的抗原；结合垫上固定有金纳米颗粒标记的检测物的抗体。所述层析试纸条的底板1为黏性塑料底板，其上表面设有黏性物质；组装顺序为：从黏性塑料底板1的左侧向右侧依次粘合处理后的样品垫2、粘合处理后的结合垫3、粘合处理后的硝酸纤维素膜4，最后粘合吸水纸5。

所述黏性塑料底板的长度为60mm；所述样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4、吸水纸5的长度为8～17mm，组装时各接触区域部分的相互叠压长度为1～3mm。

本实施例提供的双激发双发射的上转换纳米颗粒的制备方法，用来制备980nm激发红光，808nm激发绿光的双激发双发射上转换纳米颗粒，然后再结合胶体金，制成层析试纸条，并对AFB1(AFT中一类)进行检测，其包括如下步骤：

1、UCNPs的制备

1.1采用晶种法制备具有三层核壳结构的双激发双发射的上转换纳米颗粒，其以掺杂有Yb、Tm和Er的NaYF₄纳米颗粒为内核，在所述内核外包裹有Yb掺杂的NaYF₄第一壳层，且在所述第一壳层外包裹有Yb、Nd掺杂的NaYF₄第二壳层，构成Yb、Tm、Er和Nd共掺杂的NaYF₄:Yb/Tm/Er@NaYF4:Yb@NaYF₄:Yb/Nd核壳结构；制得水溶性的双激发双发射的上转换纳米颗粒UCNPs，该上转换纳米颗粒在近红外光980nm激发下发出红光，在近红外光808nm激发下发出绿光。

所述的步骤(1)，其具体包括如下步骤：

a、合成掺杂有Yb、Tm和Er的NaYF₄纳米颗粒作为内核

称取油酸(OA)10mL、十八烯(ODE)10mL、NaF固体0.84g、Yb(OAc)₃0.0683g、Tm(OAc)₃0.0017g、Er(OAc)₃0.2752g，加入到三口烧瓶A中，磁力搅拌升温至110℃～120℃，保持10min，然后抽真空除去水和氧气；除尽后通N₂，升温至300℃，反应1h；

b、在所述内核外包裹Yb掺杂的NaYF₄第一壳层

称取油酸(OA)4mL、十八烯(ODE)4mL、NaF固体0.4788g、Yb(OAc)₃0.07g，加入到三口烧瓶B中，磁力搅拌升温至110℃～120℃，保持10min，然后抽真空除去水和氧气；除尽后通N₂，升温至150℃，并在步骤a反应结束后，用针管以0.13mL/min的速度将其注入到所述三口烧瓶A中，300℃反应1h；

c、在所述第一壳层外包裹Yb、Nd的第二壳层

称取油酸(OA)4mL、十八烯(ODE)4mL、Yb(OAc)₃0.0525g、Nd(OAc)₃0.4333g，加入到三口烧瓶C中，磁力搅拌升温至110℃～120℃，保持10min，然后抽真空除去水和氧气；除尽后通N₂，并在步骤b反应结束后，用针管以0.13mL/min的速度将其注入到所述三口烧瓶A中，300℃反应100min；反应完成后降至室温，将三口烧瓶A中反应液于离心管中，离心分离出所得纳米颗粒；

d、剥离步骤c所得纳米颗粒表面的油酸

取步骤c所得纳米颗粒，向其中加pH＝1的乙醇和浓盐酸的混合液(7.5mL乙醇、62.5μL浓盐酸)，超声分散均匀后，再边震荡边超声30min，然后离心后去掉上清液，再向所得纳米颗粒中加入pH＝4的乙醇和浓盐酸的混合液(7.5mL乙醇、7.5mL浓盐酸)，超声分散均匀后，再边震荡边超声30min，然后再次离心分离，所得纳米颗粒经水洗后，即为水溶性的双激发双发射的上转换纳米颗粒UCNPs。

2、UCNPs-抗原的制备

在浓度为1mg/mL的水溶性双激发双发射的上转换纳米颗粒中加入0.02moL/L的K₂CO₃溶液，将混合溶液的pH调至8.5左右。在混合溶液中加入10μg AFB1的抗原，均匀混合30s后，在振荡器中于37℃下震荡孵育23min。而后在混合溶液中加入200μL BSA(质量分数为10％)溶液和200μL PEG 20000(质量分数为1％)溶液，继续在振荡器中于110℃下震荡孵育15min。将混合溶液置于离心管中，以13000r/min，4℃离心30min，再分散于含1％BSA的0.01M、pH＝7.0的PBS缓冲溶液中，即完成所述的标记有待检测的AFB1的抗原的双激发双发射的上转换纳米颗粒的溶液的配制。

3、胶体金溶液的制备：

0.25mL 0.1M的氯金酸溶液加入到100mL的超纯水中，磁力搅拌下加热回流至沸腾。迅速加入1.5mL 1％的柠檬酸钠溶液，继续回流约30分钟。期间溶液的颜色由淡黄色变为黑色然后变为深红色。降至室温后，所制备的酒红色的金纳米粒子溶胶用0.22μm的滤膜过滤，获得金纳米颗粒。

4、AuNPs-抗体的制备

取10mL制备好的金纳米颗粒，通过离心浓缩至2mL。在浓度为1mg/mL的金纳米颗粒中加入0.02moL/L的K₂CO₃溶液，将混合溶液的pH调至8.5左右。在混合溶液中加入10μg AFB1的抗体，均匀混合30s后，在振荡器中于110℃下震荡孵育20min。在混合溶液中加入200μLBSA(质量分数为10％)溶液和200μL PEG 20000(质量分数为1％)溶液，继续在振荡器中于37℃下震荡孵育15min。将混合溶液置于离心管中，以13000r/min，4℃离心30min,，再分散于含1％BSA的0.01M、pH＝7.0的PBS缓冲溶液中，即完成所述的标记有待检测的AFB1的抗体的金纳米颗粒的溶液的配制。

所述双激发双发射的上转换发光纳米颗粒的荧光淬灭的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其包括如下步骤：

(1)样品垫的处理

以纤维素膜作为样品垫材料，将样品垫在样品垫处理液中浸泡不超过30min后，37℃烘干，完成样品垫的处理；样品垫处理液为含有质量浓度0.5％BAS和1％Tween-20的0.01M、pH＝8.0的PBS缓冲溶液；

(2)结合垫的处理

以玻璃纤维素膜作为结合垫材料，首先将结合垫在结合垫处理液中浸泡24h后，37℃烘干，将结合垫放入步骤1所得标记有待检测的AFB1抗体的双金纳米颗粒的溶液中浸泡10min后，37℃烘干，完成结合垫的处理；结合垫处理液为含有质量浓度1％BAS、2％Tween-20和5％蔗糖的0.01M、pH＝7.4的PBS缓冲溶液。

(3)硝酸纤维素膜的处理

将标记有待检测的AFB1的抗原的双激发双发射的上转换纳米颗粒的溶液在硝酸纤维素膜上的某一区域以1.5μL/cm的参数划线，烘干，即完成硝酸纤维素膜的处理；

(4)试纸条的组装

从黏性塑料底板的前端向后端依次粘合处理后的样品垫、粘合处理后的结合垫、粘合处理后的硝酸纤维素膜，最后粘合吸水纸。

应用上述荧光淬灭胶体金层析试纸条对敏感组分进行定量检测方法，其包括如下步骤：

(1)制备好的层析试纸条在未将待检测试样滴加在样品垫上时，分别通过980nm和808nm激光激发硝酸纤维素膜上固定有双激发双发射的上转换纳米颗粒标记的检测物的抗原，记录所得到的两种不同的检测信号曲线，并以此作为标准信号曲线之一；

(2)当试样中未含检测的敏感组分或物质时，将试样滴加在样品垫上，所述金纳米颗粒上会全部流入硝酸纤维素膜并与膜上固定的双激发双发射的上转换纳米颗粒标记的检测物的抗原相结合；此时由于金纳米颗粒的吸收区域520nm与上转换纳米颗粒808nm激光激发下的绿光发射区域540nm相重合，从而金纳米颗粒可以淬灭上转换纳米颗粒的绿光，作为检测试样的检测T线；但此时上转换纳米颗粒的红光发射区660nm不受影响，因而980nm激光激发下的红光信号作为检测试样的质控C线；

(3)建立T线和C线的标准信号曲线及荧光强度比值曲线，根据检测获得的检测T线与质检C线的荧光强度，计算T线和C线荧光强度比值，将该荧光强度比值与标准信号曲线及荧光强度比值曲线进行对比，即可得到待检测试样中所含敏感组分的精确含量数值，实现待检测试样中所含敏感组分的定量检测。

上述的步骤(2)(3)还包括如下步骤：

(1)检测时，取含有不同浓度敏感组分或物质的检测物的溶液分别滴加在样品垫上进行检测；检测试样会与金纳米颗粒上所标记的待检测物相应的抗体结合，检测试样会和一部分金纳米颗粒形成团聚物，被留在结合垫上，另一部分金纳米颗粒会和剩下的检测试样一起流入硝酸纤维素膜并与膜上固定的双激发双发射的上转换纳米颗粒标记的检测物的抗原相结合；

(2)由于金纳米颗粒只有一部分与硝酸纤维素膜上固定的双激发双发射的上转换纳米颗粒标记的检测物的抗原相结合，因而金纳米颗粒无法完全淬灭上转换纳米颗粒的绿光，且随着检测物的浓度增大，淬灭效果会逐渐降低，即绿光信号逐渐增加；

(3)此时808nm激光激发下的绿光信号作为检测试样的检测T线；通过980nm和808nm激光激发，获得相应的检测T线与质检C线的荧光强度，并计算T线和C线荧光强度比值，将该荧光强度、比值分别与标准信号曲线进行对比，实现待检测试样中所含敏感组分的定量检测。

本发明并不限于上述实施方式，采用与其相同或者相似方法所得到的其它类似的纳米复合材料的方法，在本发明各实施例记载的各组分取值范围内具体选择具体的数值，以及采用不同稀土离子掺杂的上转换纳米颗粒(NaYF₄:Yb,Tm、NaYF₄:Yb,Er,Tm、NaYF₄:Yb,Tm@NaYF₄、NaYF₄:Yb,Er,Tm@NaYF₄、NaYF₄:Yb,Tm@NaGdF₄、NaYF₄:Yb,Er,Tm@NaGdF₄、NaYF₄:Yb,Tm@NaYF₄@NaGdF₄、NaYF₄:Yb,Er,Tm@NaYF₄@NaGdF₄)等、用于进一步改善水溶性以及功能化的不同的有机分子等，均在本发明保护范围内，本发明实施例不再一一列出。

以上所述仅为本发明的示例性实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种荧光淬灭胶体金层析试纸条，其特征在于，其包括底板，以及由左向右依次设置在该底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；其中硝酸纤维素膜设置在底板的中部，样品垫设置在硝酸纤维素膜的左侧、二者之间为结合垫；吸水纸设置在硝酸纤维素膜的右侧；其中，样品垫与结合垫、结合垫与硝酸纤维素膜、硝酸纤维素膜与吸水纸的局部相互层叠；在所述结合垫上设置有金纳米颗粒，在金纳米颗粒上标记有待检测物的抗体；在硝酸纤维素膜上固定有双激发双发射的上转换纳米颗粒标记的检测物的抗原及检测T线；所述的上转换纳米颗粒可同时在两种的不同近红外光激发下发出红光或绿光两种波段中任意一个波段，即一种近红外激发光可以激发一种波段的光。

2.根据权利要求1所述的荧光淬灭胶体金层析试纸条，其特征在于，所述的底板为黏性塑料底板，其上表面设有黏性物质；组装顺序为：从黏性塑料底板的左侧向右侧依次粘合处理后的样品垫、粘合处理后的结合垫、粘合处理后的硝酸纤维素膜，最后粘合吸水纸。

3.根据权利要求1所述的荧光淬灭的胶体金层析试纸条，其特征在于：所述黏性塑料底板的长度为60mm；所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸的长度为8～17mm，组装时各部分的接触区域相互叠压1～3mm。

4.根据权利要求1所述的荧光淬灭的胶体金层析试纸条，其中所述的双激发双发射的上转换纳米颗粒，采用如下步骤制备：

(1)采用晶种法制备具有三层核壳结构的双激发双发射的上转换纳米颗粒，其以掺杂有Yb、Tm和Er的NaYF₄纳米颗粒为内核，在所述内核外包裹有Yb掺杂的NaYF₄第一壳层，且在所述第一壳层外包裹有Yb、Nd掺杂的NaYF₄第二壳层，构成Yb、Tm、Er和Nd共掺杂的NaYF₄:Yb/Tm/Er@NaYF4:Yb@NaYF₄:Yb/Nd核壳结构，即制得水溶性的双激发双发射的上转换纳米颗粒UCNPs；该上转换纳米颗粒在近红外光980nm激发下发出红光，在近红外光808nm激发下发出绿光；

(2)UCNPs-抗原的制备：将步骤(1)制备的双激发双发射的上转换纳米颗粒UCNPs，进一步通过物理吸附处理，在水溶性的该双激发双发射的上转换纳米颗粒表面标记上检测物的抗原，获得标记有待检测物抗原的双激发双发射的上转换纳米颗粒。

5.根据权利要求1所述的荧光淬灭的胶体金层析试纸条，其中所述的金纳米颗粒AuNPs，其采用如下步骤制备：

(1)胶体金溶液的制备：

0.25mL 0.1M的氯金酸溶液加入到100mL的超纯水中，磁力搅拌下加热回流至沸腾。迅速加入1.5mL 1％的柠檬酸钠溶液，继续回流约30分钟。期间溶液的颜色由淡黄色变为黑色然后变为深红色。降至室温后，所制备的酒红色的金纳米粒子溶胶用0.22μm的滤膜过滤，获得金纳米颗粒；

(2)AuNPs-抗体的制备：通过物理吸附处理在该金纳米颗粒表面标记上检测物的抗体，获得标记有待检测物抗体的金纳米颗粒。

6.根据权利要求1～5之一所述的荧光淬灭的胶体金层析试纸条的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：

(1)样品垫的处理

以纤维素膜作为样品垫材料，将样品垫在样品垫处理液中浸泡不超过30min后，37℃烘干，完成样品垫的处理；样品垫处理液为含有质量浓度0.5％BAS和1％Tween-20的0.01M、pH＝8.0的PBS缓冲溶液；

(2)结合垫的处理

以玻璃纤维素膜作为结合垫材料，首先将结合垫在结合垫处理液中浸泡24h后，37℃烘干，将结合垫放入步骤1所得标记有待检测的AFB1抗体的双金纳米颗粒的溶液中浸泡10min后，37℃烘干，完成结合垫的处理；结合垫处理液为含有质量浓度1％BAS、2％Tween-20和5％蔗糖的0.01M、pH＝7.4的PBS缓冲溶液；

(3)硝酸纤维素膜的处理

将标记有待检测的AFB1的抗原的双激发双发射的上转换纳米颗粒的溶液在硝酸纤维素膜上的某一区域以1.5μL/cm的参数划线，烘干，即完成硝酸纤维素膜的处理；

(4)试纸条的组装

从黏性塑料底板的前端向后端依次粘合处理后的样品垫、粘合处理后的结合垫、粘合处理后的硝酸纤维素膜，最后粘合吸水纸，制得试纸条成品。

7.一种应用权利要求1～5之一所述荧光淬灭胶体金层析试纸条的检测方法，其特征在于，其包括如下步骤：利用上转换纳米颗粒可以同时在两种的不同近红外光激发下发出红光或绿光两种波段中任意一个波段，在层析试纸条的硝酸纤维素膜上划一条固定有双激发双发射的上转换纳米颗粒标记的检测物的抗原的划线，此时双激发双发射颗粒在近红外激发光下的一个波段的信号作为检测T线，另一个波段的信号可作为质控C线，达到对待检测试样中所含组分的单线检测效果。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，其具体包括如下步骤：

(1)制备好的层析试纸条在未将待检测试样滴加在样品垫上时，分别通过980nm和808nm激光激发硝酸纤维素膜上固定有双激发双发射的上转换纳米颗粒标记的检测物的抗原，记录所得到的两种不同的检测信号曲线，并以此作为标准信号曲线之一；

(2)当试样中未含检测的敏感组分或物质时，将试样滴加在样品垫上，所述金纳米颗粒上会全部流入硝酸纤维素膜并与膜上固定的双激发双发射的上转换纳米颗粒标记的检测物的抗原相结合；此时由于金纳米颗粒的吸收区域520nm与上转换纳米颗粒808nm激光激发下的绿光发射区域540nm相重合，从而金纳米颗粒可以淬灭上转换纳米颗粒的绿光，作为检测试样的检测T线；但此时上转换纳米颗粒的红光发射区660nm不受影响，因而980nm激光激发下的红光信号作为检测试样的质控C线；

(3)建立T线和C线的标准信号曲线及荧光强度比值曲线，根据检测获得的检测T线与质检C线的荧光强度，计算T线和C线荧光强度比值，将该荧光强度比值与标准信号曲线及荧光强度比值曲线进行对比，即可得到待检测试样中所含敏感组分的精确含量数值，实现待检测试样中所含敏感组分的定量检测。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤(2)还包括如下步骤：

(1)检测时，取含有不同浓度敏感组分或物质的检测物的溶液分别滴加在样品垫上进行检测；检测试样会与金纳米颗粒上所标记的待检测物相应的抗体结合，检测试样会和一部分金纳米颗粒形成团聚物，被留在结合垫上，另一部分金纳米颗粒会和剩下的检测试样一起流入硝酸纤维素膜并与膜上固定的双激发双发射的上转换纳米颗粒标记的检测物的抗原相结合；

(2)由于金纳米颗粒只有一部分与硝酸纤维素膜上固定的双激发双发射的上转换纳米颗粒标记的检测物的抗原相结合，因而金纳米颗粒无法完全淬灭上转换纳米颗粒的绿光，且随着检测物的浓度增大，淬灭效果会逐渐降低，即绿光信号逐渐增加；

(3)此时808nm激光激发下的绿光信号作为检测试样的检测T线；通过980nm和808nm激光激发，获得相应的检测T线与质检C线的荧光强度，并计算T线和C线荧光强度比值，将该荧光强度、比值分别与标准信号曲线进行对比，可实现待检测试样中所含组分的定量检测。

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