CN112903649A - 双激发正交发射上转换发光纳米颗粒、多通量检测免疫层析试纸及其应用 - Google Patents

双激发正交发射上转换发光纳米颗粒、多通量检测免疫层析试纸及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种双激发正交发射上转换发光纳米颗粒，其特征在于，其是一种具有两层外壳的核壳结构的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒，其以掺杂有Yb、Tm和Er的NaYF4纳米颗粒为内核，有Yb掺杂的NaYF4形成第一壳层，有Yb、Nd掺杂的NaYF4形成第二壳层，构成Yb、Tm、Er和Nd共掺杂的NaYF4:Yb/Tm/Er@NaYF4:Yb@NaYF4:Yb/Nd核壳纳米颗粒结构；在纳米颗粒表面标记有检测物的抗原，其在近红外光980nm波长的激光激发下发出红光，在808nm波长的激光激发下发出绿光。本发明还公开了采用该纳米颗粒的多通量检测免疫层析试纸及其应用。本发明通过对于纳米颗粒材料、试纸及检测方法的同步改进，大幅简化了检测操作步骤，成本低廉，检测灵敏性较高，可以实现对食品的多通量、快速、定性及定量的检测。

Description

双激发正交发射上转换发光纳米颗粒、多通量检测免疫层析 试纸及其应用
技术领域
本发明属于生物医学诊断材料及检测技术领域，具体涉及一种双激发正交发射上转换发光纳米颗粒、多通量检测免疫层析试纸及其应用。
背景技术
在全球影响粮油质量安全的最主要问题中，粮油产品受真菌毒素、重金属、农药残留污染的问题最为严重。据联合国粮农组织(FAO)统计，全球25％的粮食受到黄曲霉毒素等真菌毒素的污染，霉变损失达总产量的1.5％-3％。黄曲霉毒素B1是谷物生长和储存过程中始终产生的重要有毒真菌毒素，摄入AFB1可能会引起严重疾病，例如急性肝硬化，细胞坏死和癌变，因此开发用于食品检测的技术具有重要意义。
现有技术中，真菌毒素、重金属、农药残留等有毒有害物质的检测方法主要分为两大类：即确认方法和快速方法。确认方法主要基于理化仪器设备，如薄层色谱法(TLC)、气相色谱法 (GC)、高压液相色谱法(HPLC)和各种联用技术如气质联用(GC-MS)、液质联用(HPLC-MS)等；快速方法主要是基于免疫化学基础上的免疫分析方法如酶联免疫吸附法(ELlSA)、胶体金免疫层析法、荧光定量免疫层析法等。
结果准确、法定认可是理化方法最大的优点，但是仪器设备价格昂贵，前处理过程复杂、操作繁琐、效率低，成本极高，因此不适用于大规模样本的筛查和日常的内控检测，一般仅用于最终的确证。酶联免疫吸附法ELISA方法和胶体金快速检测卡是企业常用的快速检测方法，但也均存在各自的优缺点：ELISA方法能灵敏度相对较高，且能定量检测，但操作过程相对复杂，对环境和人员要求高，环境干扰因素复杂，重复性较差；传统胶体金检测卡可以满足现场快速的要求，能在5-10min内快速测定，但是只能定性，且灵敏度较低，肉眼观察主观性较强，重复性差，且需要多个抗体修饰的AuNP均匀地固定在相同的结合垫上，这将导致不同的AuNP与测试线之间的交叉反应，并降低检测精度。
掺杂镧系元素的上转换发光纳米颗粒(UCNPs)是将长波长即低能量的激发光转换为短波长即高能量的发射光的纳米颗粒，一般通过颗粒的组成不同获得不同的吸收和发射光谱。本发明人于2019年提出了专利申请号为201911118844.5的一种荧光淬灭的胶体金免疫层析试纸条、制备方法及其应用，其提供的一种荧光淬灭胶体金层析试纸条，在硝酸纤维素膜上固定有双激发双发射的上转换纳米颗粒标记的检测物的抗原及检测T线；上转换纳米颗粒可同时在两种的不同近红外光激发下发出红光或绿光。但是，在实际应用于中，发明人发现，该胶体金层析试纸条一次只能检测一种待检测物质的成分及浓度，不能满足对食品中多重物质的快速检测需求，也不适合采用设备进行自动化、多通量的检测，因此其存在着检测速度慢、效率低的问题，还需要进一步改进。
发明内容
为克服上述现有技术所存在的上述不足之处，本发明提供一种双激发正交发射上转换发光纳米颗粒，该上转换发光纳米颗粒通过特定的结构，使其具备特殊的光学特性，可以同时在两种的不同近红外光激发下发出红光或绿光任意一个波段，即一种近红外激发光可以激发一种波段的光；
本发明还提供一种多通量检测免疫层析试纸及其应用，将双激发正交发射上转换发光纳米颗粒与胶体金结合，利用液滴的自扩散特性，提出了一种全新的环流检测模式，以实现对食品中多重物质的单线检测和多通量检测。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种双激发正交发射上转换发光纳米颗粒，其特征在于，其是一种具有两层外壳的核壳结构的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒，其以掺杂有Yb、Tm和Er的NaYF4纳米颗粒为内核，在所述内核外包裹有Yb掺杂的NaYF4第一壳层，且在所述第一壳层外包裹有Yb、Nd掺杂的NaYF4第二壳层，构成Yb、Tm、Er和Nd共掺杂的 NaYF4:Yb/Tm/Er@NaYF4:Yb@NaYF4:Yb/Nd核壳纳米颗粒结构；在该双激发正交发射上转换发光纳米颗粒表面标记有检测物的抗原，该双激发正交发射上转换发光纳米颗粒UCNPs，在近红外光980nm波长的激光激发下发出红光，在808nm波长的激光激发下发出绿光。
一种所述双激发正交发射上转换发光纳米颗粒的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：
(1)采用晶种法制备具有两层外壳的核壳结构的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒，其以掺杂有Yb、Tm和Er的NaYF4纳米颗粒为内核，在所述内核外包裹有Yb掺杂的NaYF4第一壳层，且在所述第一壳层外包裹有Yb、Nd掺杂的NaYF4第二壳层，构成Yb、Tm、Er 和Nd共掺杂的NaYF4:Yb/Tm/Er@NaYF4:Yb@NaYF4:Yb/Nd核壳结构；并进一步将其制备为水溶性的该双激发正交发射上转换发光纳米颗粒UCNPs；
(2)UCNPs-抗原的制备：将待检测物大分子的抗原，通过物理吸附作用在水溶性的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒表面上，获得标记有待检测物抗原的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒。
一种采用所述双激发正交发射上转换发光纳米颗粒的多通量检测免疫层析试纸，其特征在于，其为一种环流检测免疫层析试纸条，其包括结合垫和硝酸纤维素膜；其中硝酸纤维素膜上设置有至少一个检测环线，在该检测环线内固定有双激发正交发射上转换发光纳米颗粒，在双激发正交发射上转换发光纳米颗粒上标记有检测物的抗原，形成一个环形检测圈；在该环形检测圈的圆心位置设有结合垫；在所述结合垫上设置有金纳米颗粒，在金纳米颗粒上标记有待检测物的抗体，所述的结合垫与硝酸纤维素膜局部相互粘连；将双激发正交发射上转换发光纳米颗粒在近红外激发光下发射的一个波段的光信号作为检测T线，另一个波段的光信号作为质控C线，进行环形单线检测。
所述的硝酸纤维素膜上设置有均匀排列的n*n个环形检测圈(n≥2)，在该每一环形检测圈内均固定有双激发正交发射上转换发光纳米颗粒；每一环形检测圈的圆心位置均设有一结合垫。
所述金纳米颗粒，是采用如下步骤制备而成：
(1)制备胶体金溶液：
0.25mL 0.1M的氯金酸溶液加入到100mL的超纯水中，磁力搅拌下加热回流至沸腾。迅速加入1.5mL 1％的柠檬酸钠溶液，继续回流约30分钟。期间溶液的颜色由淡黄色变为黑色然后变为深红色。降至室温后，所制备的酒红色的金纳米粒子溶胶用0.22μm的滤膜过滤，获得金纳米颗粒；
(2)标记AuNPs-抗体：将待检测物的抗体，通过物理吸附作用使其附着在金纳米颗粒表面上，获得标记有待检测物抗体的金纳米颗粒。
所述硝酸纤维素膜的尺寸为2.5*3cm；所述结合垫是直径为4mm的圆形玻璃纤维，环形检测圈的直径为11mm，各结合垫分别设置在每个环形检测圈的圆心位置。
一种制备所述多通量检测免疫层析试纸的方法，其特征在于，其包括如下步骤：(1)分别制备双激发正交发射上转换发光纳米颗粒、金纳米颗粒、结合垫和硝酸纤维素膜；(2)在硝酸纤维素膜上设置n个适宜尺寸的检测环线即环形轨道，将处理好的UCNPs溶液沿该环形轨道喷洒到硝酸纤维素膜上形成n个环形检测圈；(3)将金纳米颗粒设置在结合垫上，然后将结合垫分别设置在各检测环线的圆心位置，即制得环形单线多通量检测免疫层析试纸。
一种所述多通量检测免疫层析试纸的应用，其特征在于：将其应用于食品环流检测，其检测方法包括如下步骤：
(1)将制备好的多通量检测免疫层析试纸在未将待检测试样滴加在结合垫中心时，分别通过980nm和808nm激光激发硝酸纤维素膜上固定有双激发正交发射上转换发光纳米颗粒标记的检测物的抗原，得到两种不同的检测光信号；
(2)将试样滴加在结合垫中心，当试样中未含检测物质时，所述金纳米颗粒全部流入硝酸纤维素膜并与硝酸纤维素膜上固定的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒标记的检测物的抗原相结合；此时金纳米颗粒的520nm波长吸收区域恰好与上转换发光纳米颗粒808nm激光激发下的绿光发射540nm波长区域相重合，从而该金纳米颗粒淬灭上转换发光纳米颗粒的绿光；但上转换发光纳米颗粒的红光发射区660nm波长不受影响，该980nm激光激发下的红光信号即为检测试样的质控C线。
所述的步骤(2)还包括如下步骤：
(21)预先获得已知浓度的待检测试样中所含组分的定量检测标准曲线：分别取已知的同浓度的检测物溶液分别滴加在结合垫上进行检测，检测试样中的检测物大分子与金纳米颗粒上所标记的待检测物相应的抗体结合，检测试样与一部分金纳米颗粒形成团聚物，被留在结合垫上，另一部分金纳米颗粒会和剩下的检测试样一起流入硝酸纤维素膜并与膜上固定的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒标记的检测物的抗原相结合；由于金纳米颗粒只有一部分与硝酸纤维素膜上固定的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒标记的检测物的抗原相结合，因而金纳米颗粒无法完全淬灭上转换发光纳米颗粒的绿光，且随着检测物的浓度增大，淬灭效果会逐渐降低，即绿光信号逐渐增加；此时808nm激光激发下的绿光信号可以作为检测试样的检测T线；通过980nm和808nm激光激发，分别获得不同浓度对应的检测T线与质检C线的荧光强度，并建立T线和C线荧光强度比值，即建立标准曲线；
(22)检测未知浓度的检测物溶液时，取将浓度检测物的溶液滴加在结合垫上进行检测；检测试样会与金纳米颗粒上所标记的待检测物相应的抗体结合，检测试样会和一部分金纳米颗粒形成团聚物，被留在结合垫上，另一部分金纳米颗粒会和剩下的检测试样一起流入硝酸纤维素膜并与膜上固定的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒标记的检测物的抗原相结合；由于金纳米颗粒只有一部分与硝酸纤维素膜上固定的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒标记的检测物的抗原相结合，因而金纳米颗粒无法完全淬灭上转换发光纳米颗粒的绿光，且随着检测物的浓度增大，淬灭效果会逐渐降低，即绿光信号逐渐增加；此时808nm激光激发下的绿光信号为检测试样的检测T线，980nm激光激发下的红光信号为检测试样的质控C线；将所获得的检测T线与质检C线的荧光强度及其比值，与标准曲线对比后得到对应的浓度，即可完成待检测试样中所含组分的定量检测。
所述的检测物为食品中的大分子，包括并不限于蛋白、病毒、致病菌等。
相比现有技术，本发明的有益为：
1、本发明提供的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒，具有独特的结构和光学特性，该双激发双发射上转换发光纳米颗粒在980nm波长激光激发时发红光、808nm波长激光激发时发绿光；其平均粒径小：d≈30nm；分散度好：PDI<0.3；与其他纳米颗粒相比，该上转换荧光纳米颗粒毒性低、灵敏度高、稳定强，且受背景信号的干扰较少，因此，将UCNPs与传统胶体金免疫层析试纸结合，可以排除生物样品的自发光干扰现象，提高信噪比，增强灵敏度和稳定性，实现高灵敏度的定量检测；同时，该UCNPs对检测者和环境无害，安全性好
2、本发明提供的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒的制备方法，其工艺简洁、易于实施；
3、本发明提供的多通量检测免疫层析试纸，可用于环流检测免疫层析检测，其采用双激发正交发射上转换发光纳米颗粒，只包含NC膜和结合垫，结构简单，是一种能快速检测多种致癌物的新型免疫试纸条，主要是利用双激发正交发射上转换发光纳米颗粒具有两种信号，与胶体金结合后可以实现对多种检测物质的单线检测。同时，该试纸条稳定性好，可稳定保持至少3年，有利于批量生产和大规模推广。
4、本发明提供的多通量检测免疫层析试纸的应用，即所提供的环流检测免疫层析试纸条的检测方法，以UCNPs为生物标记物标记抗体，能在近红外光激发下直接观测环形发光结果，基于UCNPs独特的光学特性，消除了背景干扰，背景值低、信号稳定、灵敏度大大提高；可以实现对多种检测物质的单线检测，结合检测设备可以实现多通量、高效率、快速的单线检测，同时该检查方法操作简便，成本低廉，灵敏性较高；其试纸中的UCNPs对检测者和环境无害，安全性好，也不会造成环境污染。
5、本发明提供的环流检测免疫层析试纸条的检测方法，对待检测样品无需进行较多的前处理，借助上转换发光传感器可直接实现定量测量，操作简单快捷，可现场操作、可实现多通量检测，通过3～10min内快检即可获得检测结果，且检测结果的准确性高。
6、本发明通过对于纳米颗粒材料、试纸及检测方法的同步改进，大幅简化了检测操作步骤，成本低廉，检测背景值低、信号稳定、灵敏性较高，可以实现对食品的多通量、快速、定性及定量的检测。
附图说明
图1为本发明实施例双激发正交发射上转换纳米颗粒的透射电镜图；
图2为本发明实施例环流多通量检测免疫层析试纸条的立体结构示意图；
图3为本发明实施例双激发正交发射上转换纳米颗粒与金纳米颗粒的制备过程示意图；
图4为本发明实施例环流多通量检测免疫反应的过程示意图，其中包括T线和C线荧光强度比值与检测物浓度相对应的标准曲线；
图5为本发明实施例环流多通量检测过程及检测结果示意图。
具体实施方式
请参见图1至图5，以下通过实施例和附图对本发明的技术方案进行细致说明。
实施例：
本实施例提供的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒，其是一种具有两层外壳的核壳结构的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒，其以掺杂有Yb、Tm和Er的NaYF4纳米颗粒为内核，在所述内核外包裹有Yb掺杂的NaYF4第一壳层，且在所述第一壳层外包裹有Yb、Nd掺杂的NaYF4第二壳层，构成Yb、Tm、Er和Nd共掺杂的 NaYF4:Yb/Tm/Er@NaYF4:Yb@NaYF4:Yb/Nd核壳纳米颗粒结构；在该双激发正交发射上转换发光纳米颗粒表面标记有检测物的抗原，该双激发正交发射上转换发光纳米颗粒UCNPs，在近红外光980nm波长的激光激发下发出红光，在808nm波长的激光激发下发出绿光。
一种所述双激发正交发射上转换发光纳米颗粒的制备方法，其包括如下步骤：
(1)采用晶种法制备具有两层外壳的核壳结构的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒，其以掺杂有Yb、Tm和Er的NaYF4纳米颗粒为内核，在所述内核外包裹有Yb掺杂的NaYF4第一壳层，且在所述第一壳层外包裹有Yb、Nd掺杂的NaYF4第二壳层，构成Yb、Tm、Er 和Nd共掺杂的NaYF4:Yb/Tm/Er@NaYF4:Yb@NaYF4:Yb/Nd核壳结构；并进一步将其制备为水溶性的该双激发正交发射上转换发光纳米颗粒UCNPs；
(2)UCNPs-抗原的制备：将待检测物大分子的抗原，通过物理吸附作用在水溶性的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒表面上，获得标记有待检测物抗原的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒。
一种采用所述双激发正交发射上转换发光纳米颗粒的多通量检测免疫层析试纸，其为一种环流检测免疫层析试纸条，其包括结合垫2和硝酸纤维素膜1；其中硝酸纤维素膜1上设置有至少一个检测环线3，在该检测环线3内固定有双激发正交发射上转换发光纳米颗粒，在双激发正交发射上转换发光纳米颗粒上标记有检测物的抗原，形成一个环形检测圈；在该环形检测圈的圆心位置设有结合垫2；在所述结合垫2上设置有金纳米颗粒，在金纳米颗粒上标记有待检测物的抗体，所述的结合垫2与硝酸纤维素膜2局部相互粘连；将双激发正交发射上转换发光纳米颗粒在近红外激发光下发射的一个波段的光信号作为检测T线，另一个波段的光信号作为质控C线，进行环形单线检测。
所述的硝酸纤维素膜上设置有均匀排列的n*n个环形检测圈(n≥2)，在该每一环形检测圈内均固定有双激发正交发射上转换发光纳米颗粒；每一环形检测圈的圆心位置均设有一结合垫。该n为大于等于2的自然数，具体的取值，可根据实际需求而选择，通常可以选择 n＝2～6。
所述金纳米颗粒，是采用如下步骤制备而成：
(1)制备胶体金溶液：
0.25mL 0.1M的氯金酸溶液加入到100mL的超纯水中，磁力搅拌下加热回流至沸腾。迅速加入1.5mL 1％的柠檬酸钠溶液，继续回流约30分钟。期间溶液的颜色由淡黄色变为黑色然后变为深红色。降至室温后，所制备的酒红色的金纳米粒子溶胶用0.22μm的滤膜过滤，获得金纳米颗粒；
(2)标记AuNPs-抗体：将待检测物的抗体，通过物理吸附作用使其附着在金纳米颗粒表面上，获得标记有待检测物抗体的金纳米颗粒。
所述硝酸纤维素膜的尺寸为2.5*3cm；所述结合垫是直径为4mm的圆形玻璃纤维，环形检测圈的直径为11mm，各结合垫分别设置在每个环形检测圈的圆心位置。
一种制备所述多通量检测免疫层析试纸的方法，其包括如下步骤：(1)分别制备双激发正交发射上转换发光纳米颗粒、金纳米颗粒、结合垫和硝酸纤维素膜；(2)在硝酸纤维素膜上设置n个适宜尺寸的检测环线即环形轨道，将处理好的UCNPs溶液沿该环形轨道喷洒到硝酸纤维素膜上形成n个环形检测圈；(3)将金纳米颗粒设置在结合垫上，然后将结合垫分别设置在各检测环线的圆心位置，即制得环形单线多通量检测免疫层析试纸。
一种所述多通量检测免疫层析试纸的应用，将其应用于食品环流检测，其检测方法包括如下步骤：
(1)将制备好的多通量检测免疫层析试纸在未将待检测试样滴加在结合垫中心时，分别通过980nm和808nm激光激发硝酸纤维素膜上固定有双激发正交发射上转换发光纳米颗粒标记的检测物的抗原，得到两种不同的检测光信号；
(2)将试样滴加在结合垫中心，当试样中未含检测物质时，所述金纳米颗粒全部流入硝酸纤维素膜并与硝酸纤维素膜上固定的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒标记的检测物的抗原相结合；此时金纳米颗粒的520nm波长吸收区域恰好与上转换发光纳米颗粒808nm激光激发下的绿光发射540nm波长区域相重合，从而该金纳米颗粒淬灭上转换发光纳米颗粒的绿光；但上转换发光纳米颗粒的红光发射区660nm波长不受影响，该980nm激光激发下的红光信号即为检测试样的质控C线。
所述的步骤(2)还包括如下步骤：
(21)预先获得已知浓度的待检测试样中所含组分的定量检测标准曲线：分别取已知的同浓度的检测物溶液分别滴加在结合垫上进行检测，检测试样中的检测物大分子与金纳米颗粒上所标记的待检测物相应的抗体结合，检测试样与一部分金纳米颗粒形成团聚物，被留在结合垫上，另一部分金纳米颗粒会和剩下的检测试样一起流入硝酸纤维素膜并与膜上固定的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒标记的检测物的抗原相结合；由于金纳米颗粒只有一部分与硝酸纤维素膜上固定的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒标记的检测物的抗原相结合，因而金纳米颗粒无法完全淬灭上转换发光纳米颗粒的绿光，且随着检测物的浓度增大，淬灭效果会逐渐降低，即绿光信号逐渐增加；此时808nm激光激发下的绿光信号可以作为检测试样的检测T线；通过980nm和808nm激光激发，分别获得不同浓度对应的检测T线与质检C线的荧光强度，并建立T线和C线荧光强度比值，即建立标准曲线；
(22)检测未知浓度的检测物溶液时，取将浓度检测物的溶液滴加在结合垫上进行检测；检测试样会与金纳米颗粒上所标记的待检测物相应的抗体结合，检测试样会和一部分金纳米颗粒形成团聚物，被留在结合垫上，另一部分金纳米颗粒会和剩下的检测试样一起流入硝酸纤维素膜并与膜上固定的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒标记的检测物的抗原相结合；由于金纳米颗粒只有一部分与硝酸纤维素膜上固定的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒标记的检测物的抗原相结合，因而金纳米颗粒无法完全淬灭上转换发光纳米颗粒的绿光，且随着检测物的浓度增大，淬灭效果会逐渐降低，即绿光信号逐渐增加；此时808nm激光激发下的绿光信号为检测试样的检测T线，80nm激光激发下的红光信号为检测试样的质控C线；将所获得的检测T线与质检C线的荧光强度及其比值，与标准曲线对比后得到对应的浓度，即可完成待检测试样中所含组分的定量检测。
所述的检测物为食品中的大分子，包括并不限于蛋白、病毒、致病菌，具体可以根据实际情况确定。
具体实施例1：
本实施例提供的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒及其制备方法，是用来制备980nm 波长激光激发红光，808nm波长激光激发绿光的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒，然后再结合胶体金，制成环流检测免疫层析试纸条，并对黄曲酶菌AFB1(AFT中一类)进行检测，其包括如下步骤：
1、UCNPs的制备
1.1采用晶种法制备具有两层外壳的核壳结构的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒，其以掺杂有Yb、Tm和Er的NaYF4纳米颗粒为内核，在所述内核外包裹有Yb掺杂的NaYF4第一壳层，且在所述第一壳层外包裹有Yb、Nd掺杂的NaYF4第二壳层，构成Yb、Tm、Er 和Nd共掺杂的NaYF4:Yb/Tm/Er@NaYF4:Yb@NaYF4:Yb/Nd核壳结构；制得水溶性的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒UCNPs，该上转换发光纳米颗粒在近红外光980nm激发下发出红光，在近红外光808nm激发下发出绿光。
所述的步骤(1)，其具体包括如下步骤：
a、合成掺杂有Yb、Tm和Er的NaYF4纳米颗粒作为内核
称取油酸(OA)10mL、十八烯(ODE)10mL、NaF固体0.84g、Yb(OAc)3 0.0683g、Tm(OAc)3 0.0017g、Er(OAc)3 0.2752g，加入到三口烧瓶A中，磁力搅拌升温至110℃～120℃，保持10min，然后抽真空除去水和氧气；除尽后通N2，升温至300℃，反应1h；
b、在所述内核外包裹Yb掺杂的NaYF4第一壳层
称取油酸(OA)4mL、十八烯(ODE)4mL、NaF固体0.4788g、Yb(OAc)3 0.07g，加入到三口烧瓶B中，磁力搅拌升温至110℃～120℃，保持10min，然后抽真空除去水和氧气；除尽后通N2，升温至150℃，并在步骤a反应结束后，用针管以0.13mL/min的速度将其注入到所述三口烧瓶A中，300℃反应1h；
c、在所述第一壳层外包裹Yb、Nd的第二壳层
称取油酸(OA)4mL、十八烯(ODE)4mL、Yb(OAc)3 0.0525g、Nd(OAc)3 0.4333g，加入到三口烧瓶C中，磁力搅拌升温至110℃～120℃，保持10min，然后抽真空除去水和氧气；除尽后通N2，并在步骤b反应结束后，用针管以0.13mL/min的速度将其注入到所述三口烧瓶A中，300℃反应100min；反应完成后降至室温，将三口烧瓶A中反应液于离心管中，离心分离出所得纳米颗粒；
d、剥离步骤c所得纳米颗粒表面的油酸
取步骤c所得纳米颗粒，向其中加pH＝1的乙醇和浓盐酸的混合液(7.5mL乙醇、62.5μL 浓盐酸)，超声分散均匀后，再边震荡边超声30min，然后离心后去掉上清液，再向所得纳米颗粒中加入pH＝4的乙醇和浓盐酸的混合液(7.5mL乙醇、7.5mL浓盐酸)，超声分散均匀后，再边震荡边超声30min，然后再次离心分离，所得纳米颗粒经水洗后，即为水溶性的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒UCNPs。
2、UCNPs-抗原的制备
在浓度为1mg/mL的水溶性双激发正交发射上转换发光纳米颗粒中加入0.02moL/L的 K2CO3溶液，将混合溶液的pH调至8.5左右。取1mL混合溶液加入10μg AFB1的抗原，均匀混合30s后，在振荡器中于37℃下震荡孵育23min。而后在混合溶液中加入200μL BSA(质量分数为10％)溶液和200μL PEG 20000(质量分数为1％)溶液，继续在振荡器中于110℃下震荡孵育15min。将混合溶液置于离心管中，以13000r/min，4℃离心30min，再分散于含1％BSA的0.01M、pH＝7.0的1mLPBS缓冲溶液中，即完成所述的标记有待检测的AFB1 的抗原的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒的溶液的配制。
3、胶体金溶液的制备：
0.25mL 0.1M的氯金酸溶液加入到100mL的超纯水中，磁力搅拌下加热回流至沸腾。迅速加入1.5mL 1％的柠檬酸钠溶液，继续回流约30分钟。期间溶液的颜色由淡黄色变为黑色然后变为深红色。降至室温后，所制备的酒红色的金纳米粒子溶胶用0.22μm的滤膜过滤，获得金纳米颗粒。
4、AuNPs-抗体的制备
取10mL制备好的金纳米颗粒，通过离心浓缩至2mL。在浓度为1mg/mL的金纳米颗粒中加入0.02moL/L的K2CO3溶液，将混合溶液的pH调至8.5左右。在1mL混合溶液中加入 10μgAFB1的抗体，均匀混合30s后，在振荡器中于110℃下震荡孵育20min。在混合溶液中加入200μL BSA(质量分数为10％)溶液和200μL PEG 20000(质量分数为1％)溶液，继续在振荡器中于37℃下震荡孵育15min。将混合溶液置于离心管中，以13000r/min，4℃离心30min,，再分散于含1％BSA的0.01M、pH＝7.0的1mL PBS缓冲溶液中，即完成所述的标记有待检测的AFB1的抗体的金纳米颗粒的溶液的配制。
5、层析试纸条的制备方法，具体包括如下步骤：
将直径为4mm的圆形玻璃纤维(结合垫)浸入浓度为3mg/mL的抗体-Au NP溶液中10分钟，然后在37℃下干燥2小时。将抗原(AFB1-BSA)偶联的UCNPs溶液稀释至4mg /mL，并沿特定轨道以1.5μL/cm的浓度喷洒到NC膜上，形成直径11mm的环，将其进一步干燥2小时在37℃下。共轭垫组装在测试环的中心。最后，将组装好的测试条切成合适的尺寸，并存储在4℃的冰箱中以备将来使用。
所述硝酸纤维素膜的尺寸为2.5*3cm；所述结合垫为直径为4mm的圆形玻璃纤维，测试环的直径为11mm，组装时结合垫粘在每个测试环的圆心位置；其包括3*3个测试环。
制备所述采用正交发射上转换发光纳米材料的环流多通量检测免疫层析试纸条，还包括如下步骤：
(1)结合垫的处理
以玻璃纤维素膜作为结合垫材料，首先将结合垫在结合垫处理液中浸泡24h后，37℃烘干，将结合垫放入步骤1所得标记有待检测的AFB1抗体的双金纳米颗粒的溶液中浸泡10min 后，37℃烘干，完成结合垫的处理；结合垫处理液为含有质量分数1％BAS、2％Tween-20和 5％蔗糖的0.01M、pH＝7.4的PBS缓冲溶液。
(2)硝酸纤维素膜的处理
将标记有待检测的AFB1的抗原的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒的溶液在硝酸纤维素膜上的特定环形轨道以1.5μL/cm的参数划线，烘干，即完成硝酸纤维素膜的处理；
(3)试纸条的组装
将处理好的结合垫粘合到硝酸纤维素膜上每个测试环的圆心位置，即完成多重环流检测试纸条的组装。
6、胶体金免疫试纸条的检测方法及过程
(1)制备好的层析试纸条在未将待检测试样滴加在样品垫上时，分别通过980nm和808nm激光激发硝酸纤维素膜上固定有双激发正交发射上转换发光纳米颗粒标记的检测物的抗原，可得到两种不同的检测光信号(红光、绿光)；
(2)当试样中未含检测物质时，将试样滴加在样品垫上，所述金纳米颗粒会全部流入硝酸纤维素膜并与膜上固定的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒标记的检测物的抗原相结合；由于金纳米颗粒的吸收区域(520nm)正好与上转换发光纳米颗粒808nm激光激发下的绿光发射区域(540nm)相重合，从而金纳米颗粒可以淬灭上转换发光纳米颗粒的绿光；但此时上转换发光纳米颗粒的红光发射区(660nm)不受影响，因而将980nm激光激发下的红光信号作为检测试样的质控C线；
所述的步骤(2)还包括如下步骤：
检测时，分别取不同浓度检测物的溶液分别滴加在样品垫上进行检测时，检测试样会与金纳米颗粒上所标记的待检测物相应的抗体结合，检测试样中的大分子会与一部分金纳米颗粒形成团聚物，被留在结合垫上，另一部分金纳米颗粒会和剩下的检测试样一起流入硝酸纤维素膜并与膜上固定的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒标记的检测物的抗原相结合。由于金纳米颗粒只有一部分与硝酸纤维素膜上固定的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒标记的检测物的抗原相结合，因而金纳米颗粒无法完全淬灭上转换发光纳米颗粒的绿光，且随着检测物的浓度增大，淬灭效果会逐渐降低，即绿光信号逐渐增加。此时808nm激光激发下的绿光信号可以作为检测试样的检测T线。通过980nm和808nm激光激发，获得相应的检测T 线与质检C线的荧光强度，并建立T线和C线荧光强度比值，通过与标准曲线的对比，以实现待检测试样中所含组分的定量检测。
进一步的，还可以预先建立T线和C线荧光强度比值与已知检测物浓度相对应的标准曲线，后续检测可通过将检测结果与标准曲线的对比，得到待检测试样中所含组分的准确浓度，实现定量检测。
本发明提供的采用正交发射上转换发光纳米材料的环流多通量检测免疫层析试纸条及其应用，可以结合专业的检测设备，进行多通量、多组分的批量化、规模化检测。该上转换发光纳米颗粒可以同时在两种不同的近红外光激发下发出红光或绿光任意一个波段，即一种近红外激发光可以激发一种波段的光。免疫层析试纸条由结合垫、硝酸纤维素膜组成，在硝酸纤维素膜上固定有双激发正交发射上转换发光纳米颗粒标记的检测物的抗原；结合垫上固定有金纳米颗粒标记的检测物的抗体。本发明可以实现对检测物质的高通量、快速检测。本发明通过对于纳米颗粒材料、试纸及检测方法的同步改进，大幅简化了检测操作步骤，成本低廉，检测背景值低、信号稳定、灵敏性较高，可以实现对食品的多通量、快速、定性及定量的检测。
以上所述仅为本发明的示例性实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种双激发正交发射上转换发光纳米颗粒，其特征在于，其是一种具有两层外壳的核壳结构的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒UCNPs，其以掺杂有Yb、Tm和Er的NaYF4纳米颗粒为内核，在所述内核外包裹有Yb掺杂的NaYF4形成的第一壳层，且在所述第一壳层外包裹有Yb、Nd掺杂的NaYF4形成的第二壳层，构成Yb、Tm、Er和Nd共掺杂的NaYF4:Yb/Tm/Er@NaYF4:Yb@NaYF4:Yb/Nd核壳纳米颗粒结构；在该双激发正交发射上转换发光纳米颗粒表面标记有检测物的抗原，其在近红外光980nm波长的激光激发下发出红光，在808nm波长的激光激发下发出绿光。
2.一种权利要求1所述双激发正交发射上转换发光纳米颗粒的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：
(1)采用晶种法制备具有两层外壳的核壳结构的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒，其以掺杂有Yb、Tm和Er的NaYF4纳米颗粒为内核，在所述内核外包裹有Yb掺杂的NaYF4第一壳层，且在所述第一壳层外包裹有Yb、Nd掺杂的NaYF4第二壳层，构成Yb、Tm、Er和Nd共掺杂的NaYF4:Yb/Tm/Er@NaYF4:Yb@NaYF4:Yb/Nd核壳结构；并进一步将其制备为水溶性的该双激发正交发射上转换发光纳米颗粒UCNPs；
(2)UCNPs-抗原的制备：将待检测物大分子的抗原，通过物理吸附作用在水溶性的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒表面上，获得标记有待检测物抗原的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒。
3.一种采用权利要求1所述双激发正交发射上转换发光纳米颗粒的多通量检测免疫层析试纸，其特征在于，其为一种环流检测免疫层析试纸条，其包括结合垫和硝酸纤维素膜；其中硝酸纤维素膜上设置有至少一个检测环线，在该检测环线内固定有双激发正交发射上转换发光纳米颗粒，在双激发正交发射上转换发光纳米颗粒上标记有检测物的抗原，形成一个环形检测圈；在该环形检测圈的圆心位置设有结合垫；在所述结合垫上设置有金纳米颗粒，在金纳米颗粒上标记有待检测物的抗体，所述的结合垫与硝酸纤维素膜局部相互粘连；将双激发正交发射上转换发光纳米颗粒在近红外激发光下发射的一个波段的光信号作为检测T线，另一个波段的光信号作为质控C线，进行环形单线检测。
4.根据权利要求3所述的多通量检测免疫层析试纸，其特征在于，所述的硝酸纤维素膜上设置有均匀排列的n*n个环形检测圈(n≥2)，在该每一环形检测圈内均固定有双激发正交发射上转换发光纳米颗粒；每一环形检测圈的圆心位置均设有一结合垫。
5.根据权利要求3所述的多通量检测免疫层析试纸，其特征在于，所述的金纳米颗粒，是采用如下步骤制备而成：
(1)制备胶体金溶液：
0.25mL 0.1M的氯金酸溶液加入到100mL的超纯水中，磁力搅拌下加热回流至沸腾。迅速加入1.5mL 1％的柠檬酸钠溶液，继续回流约30分钟。期间溶液的颜色由淡黄色变为黑色然后变为深红色。降至室温后，所制备的酒红色的金纳米粒子溶胶用0.22μm的滤膜过滤，获得金纳米颗粒；
(2)标记AuNPs-抗体：将待检测物的抗体，通过物理吸附作用使其附着在金纳米颗粒表面上，获得标记有待检测物抗体的金纳米颗粒。
6.根据权利要求3所述的多通量检测免疫层析试纸，其特征在于，所述硝酸纤维素膜的尺寸为2.5*3cm；所述结合垫是直径为4mm的圆形玻璃纤维，环形检测圈的直径为11mm，各结合垫分别设置在每个环形检测圈的圆心位置。
7.一种制备权利要求3～6之一所述多通量检测免疫层析试纸的方法，其特征在于，其包括如下步骤：(1)分别制备双激发正交发射上转换发光纳米颗粒、金纳米颗粒、结合垫和硝酸纤维素膜；(2)在硝酸纤维素膜上设置n个适宜尺寸的检测环线即环形轨道，将处理好的UCNPs溶液沿该环形轨道喷洒到硝酸纤维素膜上形成n个环形检测圈；(3)将金纳米颗粒设置在结合垫上，然后将结合垫分别设置在各检测环线的圆心位置，即制得环形单线多通量检测免疫层析试纸。
8.一种权利要求3～6之一所述多通量检测免疫层析试纸的应用，其特征在于：将其应用于食品环流检测，其检测方法包括如下步骤：
(1)将制备好的多通量检测免疫层析试纸在未将待检测试样滴加在结合垫中心时，分别通过980nm和808nm激光激发硝酸纤维素膜上固定有双激发正交发射上转换发光纳米颗粒标记的检测物的抗原，得到两种不同的检测光信号；
(2)将试样滴加在结合垫中心，当试样中未含检测物质时，所述金纳米颗粒全部流入硝酸纤维素膜并与硝酸纤维素膜上固定的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒标记的检测物的抗原相结合；此时金纳米颗粒的520nm波长吸收区域恰好与上转换发光纳米颗粒808nm激光激发下的绿光发射540nm波长区域相重合，从而该金纳米颗粒淬灭上转换发光纳米颗粒的绿光；但上转换发光纳米颗粒的红光发射区660nm波长不受影响，该980nm激光激发下的红光信号即为检测试样的质控C线。
9.根据权利要求8所述的多通量检测免疫层析试纸的应用，其特征在于：所述的步骤(2)还包括如下步骤：
(21)预先获得已知浓度的待检测试样中所含组分的定量检测标准曲线：分别取已知的同浓度的检测物溶液分别滴加在结合垫上进行检测，检测试样中的检测物大分子与金纳米颗粒上所标记的待检测物相应的抗体结合，检测试样与一部分金纳米颗粒形成团聚物，被留在结合垫上，另一部分金纳米颗粒会和剩下的检测试样一起流入硝酸纤维素膜并与膜上固定的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒标记的检测物的抗原相结合；由于金纳米颗粒只有一部分与硝酸纤维素膜上固定的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒标记的检测物的抗原相结合，因而金纳米颗粒无法完全淬灭上转换发光纳米颗粒的绿光，且随着检测物的浓度增大，淬灭效果会逐渐降低，即绿光信号逐渐增加；此时808nm激光激发下的绿光信号可以作为检测试样的检测T线；通过980nm和808nm激光激发，分别获得不同浓度对应的检测T线与质检C线的荧光强度，并建立T线和C线荧光强度比值，即建立标准曲线；
(22)检测未知浓度的检测物溶液时，取将浓度检测物的溶液滴加在结合垫上进行检测；检测试样会与金纳米颗粒上所标记的待检测物相应的抗体结合，检测试样会和一部分金纳米颗粒形成团聚物，被留在结合垫上，另一部分金纳米颗粒会和剩下的检测试样一起流入硝酸纤维素膜并与膜上固定的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒标记的检测物的抗原相结合；由于金纳米颗粒只有一部分与硝酸纤维素膜上固定的双激发正交发射上转换发光纳米颗粒标记的检测物的抗原相结合，因而金纳米颗粒无法完全淬灭上转换发光纳米颗粒的绿光，且随着检测物的浓度增大，淬灭效果会逐渐降低，即绿光信号逐渐增加；此时808nm激光激发下的绿光信号为检测试样的检测T线，980nm激光激发下的红光信号为检测试样的质控C线；将所获得的检测T线与质检C线的荧光强度及其比值，与标准曲线对比后得到对应的浓度，即可完成待检测试样中所含组分的定量检测。
10.根据权利要求8～9之一所述的多通量检测免疫层析试纸的应用，其特征在于：所述的检测物为食品中的大分子，包括蛋白、病毒、致病菌。
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