CN112326959A - 多色荧光信号打开型竞争免疫层析试纸条制备及检测装置 - Google Patents

多色荧光信号打开型竞争免疫层析试纸条制备及检测装置 Download PDF

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Abstract

一种多色荧光信号打开型竞争免疫层析试纸条制备及检测装置，试纸条以“红、橙、黄、绿、蓝”五色量子点荧光作为五种真菌毒素检测线背景信号，银纳米粒子分别与五种真菌毒素的单克隆抗体结合作为量子点激发光的内滤探针，抗兔IgG与兔IgG作为独立对照线体系。检测时试纸条插入荧光读取盒，通过智能手机APP分析荧光信号，以各检测线荧光信号强度与对照线荧光信号强度比值准确定量。本发明可用于同时快速定量检测粮油制品中黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇及伏马菌素B1等五种真菌毒素。

Description

多色荧光信号打开型竞争免疫层析试纸条制备及检测装置
技术领域
本发明涉及快速检测技术领域，具体涉及一种基于多色荧光“信号打开”型竞争免疫层析试纸条及其检测装置。
背景技术
我国是粮食生产和消费大国，加强粮食的质量控制意义重大。我国食品安全国家标准（2017）对谷物中四种真菌毒素制定了限量要求：黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1, AFB1）5~20µg/kg、赭曲霉毒素A（ochratoxin A, OTA）5µg/kg、玉米赤霉烯酮（zearalenone, ZEN）60µg/kg和脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol, DON）1000µg/kg。此外，由于伏马菌素（Fumonisin）的毒性及污染的严重性，2019年食品安全国家标准真菌毒素限量征求意见稿中增加了伏马菌素B1，B2和B3总量的限量要求：玉米、玉米面（渣）和含有玉米原料的谷物制品限量分别为4000、2000和1000µg/kg。建立同时检测多种真菌毒素的高灵敏快速检测方法对维护食品安全具有重要意义。
免疫层析方法因具有操作简便、快速、抗基质干扰能力强等优点，是现场快速筛查的常用方法。真菌毒素属于小分子物质，在免疫层析中通常使用竞争反应模式。此方法待检物数量与检测线上信号强度成反比，通常以检测线（T线）上“信号消失”作为判读标准，灵敏度不高。构建基于“信号打开”模式的竞争免疫层析技术，即检测信号随着小分子待检物浓度增大从无到有，可显著提高方法学检测灵敏度。
有学者提出基于荧光共振能量转移（FRET）的“信号打开”型免疫层析方法，其灵敏度较传统的竞争免疫层析更高。而FRET只能作用于荧光物质发射光，对于多色荧光构建“信号打开”模式的竞争免疫层析，需要多种吸收光谱的能量受体，而不同吸收光谱的纳米粒子在形貌、大小、生物相容性、适合的pH值及缓冲液盐浓度等方面存在较大差异，不适合在同一试纸条上统一使用。因此，基于FRET的“信号打开”模式的竞争免疫层析不适合于多色荧光指示的多重检测。
针对该问题，本发明提出基于内滤效应（IFE）的“信号打开”型竞争免疫层析试纸条，IFE是指贵金属纳米粒子对荧光物质特定激发光或发射光强烈的吸收效应，由于IFE可以作用于激发光，而一些荧光物质如量子点具有宽激发光谱的特性，因此可以通过对单一激发光的IFE实现多色荧光的“信号打开”。
IFE体系的灵敏程度主要与以下三个要素密切相关：第一，吸收剂的吸收光谱与荧光剂的激发或发射光谱有效的重叠（此为必要条件），且重叠程度越高，IFE越显著；第二，吸收剂的摩尔消光系数，摩尔消光系数越高表明其对光的吸收越强烈，从而IFE越显著；第三，荧光剂的性能，荧光作为体系的输出信号，荧光剂发光强度越高、稳定性越好，IFE导致的荧光信号变化程度越大，即体系越灵敏。
在传统的荧光材料和吸光材料中，满足上述三个要素的荧光剂-吸收剂组合较少，限制了该方法在生物传感方面的应用。随着新型纳米材料的发展，为荧光剂-吸收剂组合提供了更多选择，大大促进了IFE在生物检测方面的应用。银纳米粒子的摩尔消光系数大于1010 cm-1 M-1，高于胶体金100倍，且其具有吸收光谱可调、稳定性和生物相容性好等优良性能，是IFE体系理想的吸收剂。与常规有机荧光染料相比，量子点具有荧光产率高、光稳定性好、激发光谱宽而发射光谱窄且对称以及随粒径变化呈现不同色彩的光谱等优点，是理想的荧光剂。在免疫层析试纸条上利用银纳米粒子吸收光谱与多色量子点激发光谱有效重叠，结合银纳米粒子的强消光特性，通过IFE将银纳米粒子数量呈指数关系地转化为多色量子点的荧光信号，可实现多种小分子待检物的同时高灵敏检测。
免疫层析检测单一目标物时，多采用T/C比值法（即T线与对照线信号强度比值）定量。该方法可以在一定程度上消除外因干扰对免疫学反应的影响，因此定量检测结果比较准确。但在多重检测时，对照线（C线，通常喷涂抗鼠IgG抗体）信号同时受检测体系中多种待检物浓度的影响，无法用T/C比值法定量，因此免疫层析多重定量分析方法常采用T线信号定量。但由于试纸条T线信号是一个动态变化过程，随反应时间延长信号将逐渐变化直至趋于相对稳定，且这种动态过程受试纸条生产工艺、检测环境、待检样本以及操作习惯差异等诸多不确定性外部因素的影响，在实际检测时定量偏差较大。针对该问题，本发明设计独立C线信号体系，使C线信号不受多种待检物干扰，以此实现T/C比值法多重定量检测，保证多重检测的准确性。
近年来，基于智能手机的光学检测设备得到了广泛的研究。研究人员通过结合一些终端组件，以智能手机作为光学信号接收和处理工具，已经实现了比色信号、荧光信号、拉曼散射信号等的高灵敏度检测。如Yeo等设计了基于智能手机的荧光免疫层析试纸条的信号检测器；Zheng等利用基于色调–饱和度–亮度（HSL）的色彩识别智能手机APP对胶体金聚集程度进行信号采集和分析。
发明内容
本发明的目的是提出一种多色荧光信号打开型竞争免疫层析试纸条制备及检测装置。
本发明是通过以下技术方案实现的。
本发明所述的一种多色荧光信号打开型竞争免疫层析试纸条制备，包括以下步骤。
（1）独立对照线体系的选择。
筛选得到与五种真菌毒素的鼠源性单抗无交叉反应的兔源IgG及抗兔IgG抗体作为独立C线体系，对照线体系与检测探针之间无交叉反应。
在对照探针数量和抗兔IgG抗体用量最佳配比条件下，对照线荧光消减50%。
（2）银内滤探针制备。
在1000mL体系中调整柠檬酸钠（SC）浓度至5 mM，单宁酸（TA）0.025mM，剧烈搅拌下加热至沸腾，加入10mL浓度为25mM硝酸银，溶液变成亮黄色。移出200mL反应液，反应体系中再加入170mL水，温度设定90℃，加入5mL浓度为25 mM的SC，15mL浓度为2.5mM的TA，10mL浓度为25mM硝酸银，90℃，保持30分钟。重复上述移出加入操作步骤，共计11次，获得最大吸收峰为450nm的银纳米粒子溶液。
取六份100mL银纳米粒子溶液（粒子数约为1011个/mL），6500转离心15分钟，弃上清；沉淀分别重悬于100mL含兔IgG及五种真菌毒素鼠单抗腹水的0.1M pH7.5的硼酸缓冲液；室温缓慢搅拌2h，6500转离心15分钟，弃上清；沉淀重悬于含0.1%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）的硼酸缓冲液（储存液）中，5分钟后，6500转离心15分钟，沉淀重悬于10mL储存液中，4℃保存备用。
考虑到国家标准中对伏马菌素B1、B2和B3的总量限量，本发明选择与FB2、FB3交叉反应率大于70%的抗FB1的鼠单抗，由此制备的银探针可以反映伏马菌素B1、B2和B3的总量。
（3）CdSe/ZnS量子点（QD）与BSA偶联。
五种色彩CdSe/ZnS QD，分别为蓝色（QD500）、绿色（QD530）、黄色（QD570）、橙色（QD600）和红色（QD630），表面羧基化处理，经1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）活化后与BSA偶联。五种羧基化量子点调整浓度为1μM，分别取1mL，调整pH 至5.7，室温低速搅拌下，加入0.1mL新鲜配制的1mg/mL EDC水溶液，活化5分钟，随后加入0.1mL 1% BSA溶液，室温反应1h，再加入0.12mL新鲜配制的1mg/mL EDC溶液，5分钟后加入0.12mL 1% BSA溶液，室温反应1h，第三次加入0.15mL新鲜配制的1mg/mL EDC溶液，5分钟后加入0.15mL 1% BSA溶液，室温反应2h。1000转离心5分钟去除过度聚合物，4℃储存待用。
（4）免疫层析试纸条的组装。
试纸条由滤纸、样本垫、结合垫、硝酸纤维素膜（NC膜）和吸水纸等五部分按照附图1方式交叠固定在粘性卡纸上。
最底层为粘性卡纸，其中间部位粘贴NC膜，NC膜预先喷涂兔IgG与五种检测抗原和五色BSA–QD混合物。NC膜左边的粘性卡纸上依次粘贴喷涂六种银内滤探针的结合垫、样本垫和滤纸，结合垫右侧边缘与NC膜左侧边缘层叠1至2 mm，样本垫层叠在结合垫上面，左侧错开1至2 mm粘贴在卡纸上，滤纸层叠在样本垫上，同样左侧错开1至2 mm粘贴在卡纸上。NC膜右边粘贴吸水纸，吸水纸左侧边缘与NC膜右侧边缘层叠1至2 mm，检测时待测液经滤纸、样本垫、结合垫，在吸水纸毛细作用下进入NC膜，自左向右流动。
样品垫预先用50 mM pH 7.5的磷酸盐缓冲盐水（包含1%的BSA，0.5%的吐温20和0.05%的叠氮钠）浸润处理，真空干燥。
结合垫承载五种检测探针及独立对照线探针，用10mM pH 7.5的磷酸盐缓冲盐水（包含0.2%吐温20和2%蔗糖）浸润、干燥处理后，六种银内滤探针混合物以25μL/cm喷涂在结合垫，置于37℃的真空干燥箱中干燥6 h。
NC膜上依次喷涂抗兔IgG与BSA–QD630（红色）混合物、FB1检测抗原与BSA–QD500（蓝色）混合物、DON检测抗原与BSA–QD530（绿色）混合物、ZEN检测抗原与BSA–QD570（黄色）混合物，OTA检测抗原与BSA–QD600（橙色）混合物及AFB1检测抗原与BSA–QD630（红色）混合物，形成一条对照线及五条T线；检测抗原为各真菌毒素与BSA偶联物，偶联摩尔比为15:1，喷涂浓度以BSA质量计算为1.5mg/mL；各色BSA–QD喷涂量在450nm LED灯下观测到明显条带的基础上调整；喷涂后的NC膜置于37 ℃的真空干燥箱中干燥6 h。
商业化的滤纸和吸水纸不经特殊处理，直接使用。
将滤纸、样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸等五部分组合后，切割成宽度4mm每条，装入试纸条卡壳中，然后与干燥剂一起装入避光袋密封保存。试纸条卡壳内有试纸条固定卡槽，在试纸条的滤纸位置设置加样孔，在NC膜对照线和五条检测线区域设置检测观测口。
本发明所述的一种多色荧光信号打开型竞争免疫层析试纸条的检测装置，包括试纸条的荧光读取盒及智能手机。
所述的试纸条荧光读取盒，为暗视野深色塑料卡盒，卡盒底部的一端设有试纸条插入孔，卡盒内壁两侧各置有450nm LED光源带一组，卡盒外设有开关，控制LED光源。卡盒顶部设有滤光片和观察窗口，荧光信号可通过观察窗口裸眼定性判读和智能手机定量判读。
智能手机安装“HSL图像分析APP”，预先设置程序及输入各条检测线荧光信号的对应方程，定量检测时将手机摄像头平放在试纸条荧光读取盒的观察窗口上，打开读取盒内450nm LED光源，智能手机自动拍照并进行图像的HSL分析和计算，直接给出样本中五种真菌毒素的检测结果。
试纸条使用。
称取5g粉碎的谷物，置于50mL离心管中，加入25mL甲醇–水溶液（60:40，v/v），剧烈振荡提取25min后，12000转离心l0min，上清稀释15倍，取80μL加入试纸条加样孔，15分钟后试纸条插入荧光读取盒，打开LED光源，智能手机自动拍照并进行图像的HSL分析和计算，直接给出样本中五种真菌毒素的检测结果。
本发明采用银纳米粒子作为“红、橙、黄、绿、蓝”多色量子点激发光的共同内滤剂，建立基于IFE的多色荧光“信号打开”型竞争免疫层析检测方法，通过设计独立C线信号体系，以T/C比值定量，结合智能手机HSL–APP分析，实现粮油制品中黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇及伏马菌素B1（AFB1、OTA、ZEN、DON和FB1）等五种真菌毒素的同时、高灵敏及快速定量检测。
附图说明
图1本发明方法试纸条结构示意图。
图2 本发明方法试纸条检测装置。
具体实施方式
为了使本发明更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中所涉及的五种真菌毒素单克隆抗体腹水、兔IgG（NC05）及抗兔IgG抗体（NC05-G11）由无锡中德伯尔生物技术有限公司提供；使用的五种羧基修饰量子点由美国Ocean–nano公司提供；所涉及的真菌毒素标准物质、EDC、BSA、SC、TA、和AgNO3等购买自Sigma公司；所涉及的化学试剂购买自 Aladdin公司；荧光读取盒为本实验室定制组装；智能手机图像分析处理软件由中国农业大学林建涵教授课题组提供。
实施例。
多色荧光信号打开型竞争免疫层析试纸条制备及其检测装置定量检测玉米中五种真菌毒素。
（1）银内滤探针制备。
用种子生长法合成粒径70nm的银纳米粒子，其SPR特征吸收峰为450nm。具体方案为：
（a）合成种子银：在100mL体系中调整SC浓度至5 mM，TA浓度0.025mM，剧烈搅拌下加热至沸腾，加入1mL AgNO3（25mM），溶液马上变成亮黄，此时种子大小约15nm。
（b）银的逐步生长：合成种子银后移出19.5mL反应液（4℃保存待用），反应体系中再加入16.5mL水，温度设定到90℃，加入0.5mL SC（25 mM），1.5mL TA（2.5mM），1mL AgNO3，每隔30min，重复这一过程。紫外扫描监测每次取出的银纳米粒子的吸收光谱，直到获得SPR吸收峰为450nm的银纳米粒子，在本实施例条件下，经过银种子11轮生长达到SPR吸收峰450nm。
自由吸附法制备银–抗体荧光内滤探针，具体方案为：取六份1mL银纳米粒子溶液（粒子数约为1011个/mL），7000转离心10min，弃上清；沉淀分别重悬于1mL含兔IgG、抗AFB1、抗OTA、抗ZEN、抗DON和抗FB1的鼠单抗腹水的0.1M硼酸溶液（NaOH调整pH值7.5）；室温低速搅拌2h，7000转离心10min，弃上清；沉淀重悬于含0.1%（w/v）BSA的硼酸溶液（储存液）中，5min后，7000转离心10min，沉淀重悬于0.1mL储存液中，4℃保存备用。
（2）量子点与BSA偶联。
表面羧基修饰的QD500、QD530、QD570、QD600和QD630，浓度均为2μM，分别取0.05mL和0.05mL磷酸缓冲液（8mM, pH 5.7）在小烧杯中混匀，磁力搅拌器上低速搅拌，加入0.1mL新鲜配制的1mg/mL EDC溶液，活化5min，随后加入0.1mL 1% BSA溶液，室温反应1h，再加入0.12mL新鲜配制的1mg/mL EDC溶液，5分钟后加入0.12mL 1% BSA溶液，室温反应1h，第三次加入0.15mL新鲜配制的1mg/mL EDC溶液，5分钟后加入0.15mL 1% BSA溶液，室温反应2h。1000转离心5分钟，上清液4℃储存待用。
（3）免疫层析试纸条的组装。
试纸条由滤纸、样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸等五部分组成。
样品垫用50 mM pH 7.5的磷酸盐缓冲盐水（包含1%的BSA，0.5%的吐温20和0.05%的叠氮钠）浸润处理，真空干燥。
结合垫用10mM pH 7.5的磷酸盐缓冲盐水（包含0.2%吐温20和2%蔗糖）浸润、干燥处理后，六种银内滤探针混合物以25μL/cm喷涂在结合垫上，置于37 ℃的真空干燥箱中干燥6 h。
NC膜上依次喷涂抗兔IgG与BSA–QD630（红色）混合物、FB1检测抗原与BSA–QD500（蓝色）混合物、DON检测抗原与BSA–QD530（绿色）混合物、ZEN检测抗原与BSA–QD570（黄色）混合物，OTA检测抗原与BSA–QD600（橙色）混合物及AFB1检测抗原与BSA–QD630（红色）混合物，形成一条对照线和五条检测线。检测抗原为各真菌毒素与BSA偶联物，真菌毒素与BSA摩尔偶联比为15:1。喷涂液中抗兔IgG浓度为0.75mg/mL，各检测抗原浓度以BSA质量计算为1.5mg/mL，各BSA–QD用量以QD浓度计算分别为：BSA–QD630 3nM、BSA–QD500 30nM、BSA–QD530 10nM、BSA–QD570 10nM、BSA–QD600 4.5nM和BSA–QD630 3nM。
商业化的滤纸和吸水纸不经特殊处理，直接使用。
将滤纸、样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸等五部分按照图1方式交叠固定在粘性卡纸上，交叠部分约1.5mm。切割成宽度4mm每条，装入试纸条卡壳中，避光干燥保存。
图1为本实施例试纸条结构示意图，最底层为粘性卡纸，其中间部位粘贴NC膜，NC膜预先喷涂兔IgG与五种检测抗原和五色BSA–QD混合物。NC膜左边的粘性卡纸上依次粘贴喷涂六种银内滤探针的结合垫、样本垫和滤纸，结合垫右侧边缘与NC膜左侧边缘层叠1至2mm，样本垫层叠在结合垫上面，左侧错开1至2 mm粘贴在卡纸上，滤纸层叠在样本垫上，同样左侧错开1至2 mm粘贴在卡纸上。NC膜右边粘贴吸水纸，吸水纸左侧边缘与NC膜右侧边缘层叠1至2 mm，检测时待测液经滤纸、样本垫、结合垫，在吸水纸毛细作用下进入NC膜，自左向右流动。
（4）定量标准曲线的测定。
配制五种真菌毒素10份混合标准溶液，AFB1、OTA和ZEN浓度系列分别为：0，0.01，0.02，0.04，0.078，0.156，0.3125，0.625，1.25和2.5µg/L；DON和FB1浓度系列分别为0，0.4，0.78，1.56，3.125，6.25，12.5，25，50和100µg/L。每份混合标准溶液取80µL加入试纸条（做三个平行样本），15min后将试纸条插入荧光读取盒，打开智能手机图像分析处理软件，将手机摄像头平放在试纸条荧光读取盒的观察窗口上，打开读取盒内450nm LED光源，智能手机自动拍照并进行数据处理，以各T线和对照线HSL强度比值为纵坐标，五种真菌毒素浓度的对数值为横坐标，绘制标准曲线，得到各真菌毒素定量检测的标准方程。由于玉米样本经由5倍质量体积的溶剂提取，再稀释15倍去除基质干扰，即实际样本中真菌毒素稀释75倍后与标准曲线相对应。为了在实际样本检测时直接得到真菌毒素含量，各标准方程横坐标放大75倍后输入图像处理软件程式。
图2为本实施例试纸条检测装置，包括多色荧光信号打开型竞争免疫层析试纸条的荧光读取盒及安装图象处理软件的智能手机。读取盒为暗视野深色塑料卡盒，卡盒底部的一端设有试纸条插入孔，卡盒内壁两侧各置有450nm LED光源带一组，卡盒外设有开关，控制LED光源。卡盒顶部设有滤光片和观察窗口，荧光信号可通过观察窗口裸眼定性判读和智能手机定量判读。智能手机安装“HSL图像分析APP”，预先设置程序及输入各条检测信号的对应方程，定量检测时将手机摄像头平放在试纸条荧光读取盒的观察窗口上，打开读取盒内450nm LED光源，智能手机自动对焦拍照并进行图像分析，直接给出样本中五种真菌毒素的检测结果。
（5）玉米样本检测。
玉米取样后，在粉碎机中充分打碎。准确称取5g粉碎物，置于50mL离心管中，加入25mL甲醇–水溶液（60:40，v/v），剧烈振荡提取25min后，12000转离心l0min，吸取1mL上清液，加水14mL（稀释15倍），取80μL加入试纸条加样孔，15分钟后试纸条插入荧光读取盒。智能手机预先设置程序及输入各条检测信号的对应方程，打开图像处理APP，摄像头安置于读取盒观察窗口，打开荧光读取盒LED光源，手机自动对焦拍照并进行图像分析，根据各色信号对应的标准方程计算，蓝色信号对应FB1、绿色信号对应DON、黄色信号对应ZEN、橙色信号对应OTA、红色信号对应AFB1，直接给出样本中五种真菌毒素的检测结果。

Claims (2)

1.一种多色荧光信号打开型竞争免疫层析试纸条制备，其特征是包括以下步骤：
（1）独立对照线体系的选择：
筛选得到与五种真菌毒素的鼠源性单抗无交叉反应的兔源IgG及抗兔IgG抗体作为独立C线体系，对照线体系与检测探针之间无交叉反应；在对照探针数量和抗兔IgG抗体用量最佳配比条件下，对照线荧光消减50%；
（2）银内滤探针制备：
在1000mL体系中调整柠檬酸钠浓度至5 mM，单宁酸0.025mM，剧烈搅拌下加热至沸腾，加入10mL 25mM硝酸银，溶液变成亮黄色；移出200mL反应液，反应体系中再加入170mL水，温度设定90℃，加入5mL 25 mM柠檬酸钠，15mL 2.5mM单宁酸，10mL25mM硝酸银，90℃，保持30分钟；重复上述移出加入操作步骤，共计11次，获得最大吸收峰为450nm的银纳米粒子溶液；
取六份100mL粒子数为1011个/mL的银纳米粒子溶液，6500转离心15分钟，弃上清；沉淀分别重悬于100mL含兔IgG及五种真菌毒素鼠单抗腹水的0.1MpH7.5的硼酸缓冲液；室温缓慢搅拌2h，6500转离心15分钟，弃上清；沉淀重悬于含0.1%（w/v）牛血清白蛋白的硼酸缓冲液中，5分钟后，6500转离心15分钟，沉淀重悬于10mL储存液中，4℃保存备用；
（3）量子点与牛血清白蛋白偶联：
五种色彩CdSe/ZnS量子点，分别为蓝色QD500、绿色QD530、黄色QD570、橙色QD600和红色QD630，表面羧基化处理，经EDC活化后与牛血清白蛋白偶联；五种羧基化量子点调整浓度为1μM，分别取1mL，调整pH 至5.7，室温低速搅拌下，加入0.1mL新鲜配制的1mg/mL EDC水溶液，活化5分钟，随后加入0.1mL 1% BSA溶液，室温反应1h，再加入0.12mL新鲜配制的1mg/mLEDC溶液，5分钟后加入0.12mL 1% BSA溶液，室温反应1h，第三次加入0.15mL新鲜配制的1mg/mL EDC溶液，5分钟后加入0.15mL 1% BSA溶液，室温反应2h；1000转离心5分钟去除过度聚合物，4℃储存待用；
（4）免疫层析试纸条的组装：
试纸条由滤纸、样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸交叠固定在粘性卡纸上；
最底层为粘性卡纸，其中间部位粘贴NC膜，NC膜预先喷涂兔IgG与五种检测抗原和五色BSA–QD混合物；NC膜左边的粘性卡纸上依次粘贴喷涂六种银内滤探针的结合垫、样本垫和滤纸，结合垫右侧边缘与NC膜左侧边缘层叠1至2 mm，样本垫层叠在结合垫上面，左侧错开1至2 mm粘贴在卡纸上，滤纸层叠在样本垫上，同样左侧错开1至2 mm粘贴在卡纸上；NC膜右边粘贴吸水纸，吸水纸左侧边缘与NC膜右侧边缘层叠1至2 mm，检测时待测液经滤纸、样本垫、结合垫，在吸水纸毛细作用下进入NC膜，自左向右流动；
样品垫预先用包含1% BSA，0.5% 吐温20和0.05%叠氮钠的50 mM pH 7.5的磷酸盐缓冲盐水浸润处理，真空干燥；
结合垫承载五种检测探针及独立对照线探针，用包含0.2%吐温20和2%蔗糖的10mM pH7.5的磷酸盐缓冲盐水浸润、干燥处理后，六种银内滤探针混合物以25μL/cm喷涂在结合垫，置于37℃的真空干燥箱中干燥6 h；
NC膜上依次喷涂抗兔IgG与BSA–QD630混合物、FB1检测抗原与BSA–QD500混合物、DON检测抗原与BSA–QD530混合物、ZEN检测抗原与BSA–QD570混合物，OTA检测抗原与BSA–QD600混合物及AFB1检测抗原与BSA–QD630混合物，形成一条对照线及五条T线；检测抗原为各真菌毒素与BSA偶联物，偶联摩尔比为15:1，喷涂浓度以BSA质量计算为1.5mg/mL；各色BSA–QD喷涂量在450nm LED灯下观测到明显条带的基础上调整；喷涂后的NC膜置于37 ℃的真空干燥箱中干燥6 h。
2.权利要求1所述的一种多色荧光信号打开型竞争免疫层析试纸条的检测装置，其特征是包括试纸条的荧光读取盒及智能手机；
所述的试纸条荧光读取盒，为暗视野深色塑料卡盒，卡盒底部的一端设有试纸条插入孔，卡盒内壁两侧各置有450nm LED光源带一组，卡盒外设有开关，控制LED光源；卡盒顶部设有滤光片和观察窗口，荧光信号通过观察窗口裸眼定性判读和智能手机定量判读；
智能手机安装HSL图像分析APP，预先设置程序及输入各条检测线荧光信号的对应方程，定量检测时将手机摄像头平放在试纸条荧光读取盒的观察窗口上，打开读取盒内450nmLED光源，智能手机自动拍照并进行图像的HSL分析和计算，直接给出样本中五种真菌毒素的检测结果。
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