CN113156112A - 同时检测四种硝基呋喃类代谢物的荧光免疫层析试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了同时检测四种硝基呋喃类代谢物的荧光免疫层析试剂盒及其制备方法和应用，属于抗生素检测技术领域，所述试剂盒包括层析试纸和量子点探针；所述层析试纸的硝酸纤维素膜上设置检测线T1、T2、T3、T4和质控线C；所述检测线T1、T2、T3、T4分别喷涂包被抗原2‑NPAOZ‑BSA、2‑NPAHD‑BSA、2‑NPSEM‑BSA和2‑NPAMOZ‑BSA；所述量子点探针包括红光量子点偶联的2‑NPAOZ抗体、黄光量子点偶联的2‑NPAHD抗体，绿光量子点偶联的2‑NPSEM抗体和橙光量子点偶联的2‑NPAMOZ抗体。本发明所述试剂盒，能够同时检测四种硝基呋喃类代谢物，灵敏度高。

Description

同时检测四种硝基呋喃类代谢物的荧光免疫层析试剂盒及其 制备方法和应用
技术领域
本发明属于抗生素检测技术领域，尤其涉及同时检测四种硝基呋喃类代谢物的荧光免疫层析试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术
硝基呋喃类药物是一种广谱抗生素，主要包括呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃它酮和呋喃西林。因其价格低廉、抗菌效果好，被广泛的应用于水产动物的细菌性疾病的预防和治疗。由于硝基呋喃类药物具有致突变性和致癌性，包括我国在内的许多国家在动物食品生产中早已禁止使用。然而硝基呋喃类药物残留超标事件仍时有发生，因此对该类药物残留的检测具有重要意义。
硝基呋喃类药物进入动物体内代谢迅速，在食品检测中主要检测硝基呋喃类代谢物。目前该类药物的检测方法主要是仪器法，然而仪器法所需仪器昂贵，操作复杂，不适用于现场快速检测。
胶体金免疫层析技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，因具有方便快捷、结果肉眼可视、可适用多种检测条件等优点，被应用于硝基呋喃类药物的现场检测和快速筛查。然而该技术存在的最大问题是灵敏度仍有待提高。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供同时检测四种硝基呋喃类代谢物的荧光免疫层析试剂盒及其制备方法和应用；所述荧光免疫层析试剂盒以四种量子点为标记物分别标记四种硝基呋喃代谢物抗体，将量子点荧光寿命长、量子产率高、光稳定性好等优点与免疫层析技术结合，在实现同时检测四种硝基呋喃类代谢物的基础上，提高了检测的灵敏度。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了同时检测四种硝基呋喃类代谢物的荧光免疫层析试剂盒，其特征在于，包括层析试纸和量子点探针；
所述层析试纸包括PVC底板以及顺次搭接固定于所述PVC底板上的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上设置检测线T1、T2、T3、T4和质控线C；所述检测线T1、T2、T3、T4分别喷涂包被抗原2-NPAOZ-BSA、2-NPAHD-BSA、2-NPSEM-BSA和2-NPAMOZ-BSA；所述质控线C喷涂兔抗鼠IgG；
所述量子点探针包括红光量子点偶联的2-NPAOZ抗体、黄光量子点偶联的2-NPAHD抗体、绿光量子点偶联的2-NPSEM抗体和橙光量子点偶联的2-NPAMOZ抗体。
优选的，所述包被抗原2-NPAOZ-BSA、2-NPAHD-BSA、2-NPSEM-BSA和2-NPAMOZ-BSA的喷涂浓度分别为0.1～0.5mg/mL、0.05～0.3mg/mL、0.2～0.6mg/mL、0.5～2mg/mL，所述包被抗原2-NPAOZ-BSA、2-NPAHD-BSA、2-NPSEM-BSA和2-NPAMOZ-BSA的喷涂量分别为0.8～1.2μL/cm。
优选的，所述兔抗鼠IgG的喷涂浓度为0.08～0.12mg/mL；所述兔抗鼠IgG的喷涂量为0.8～1.2μL/cm。
优选的，所述红光量子点偶联的2-NPAOZ抗体、黄光量子点偶联的2-NPAHD抗体，绿光量子点偶联的2-NPSEM抗体和橙光量子点偶联的2-NPAMOZ抗体的使用体积比为(4～6)：(4～6)：(8～12)：(4～6)。
优选的，所述试剂盒还包括吐温20。
优选的，所述样品垫与硝酸纤维素膜重叠1～2mm，所述吸水垫与硝酸纤维素膜重叠1～2mm。
本发明提供了所述试剂盒的制备方法，包括层析试纸的制备和量子点探针的制备；
所述层析试纸的制备包括以下步骤：
用预处理液对样品垫进行浸泡处理后，烘干获得处理后的样品垫；
将处理后的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫顺次搭接并固定于PVC底板上；
将包被抗原2-NPAOZ-BSA、2-NPAHD-BSA、2-NPSEM-BSA、2-NPAMOZ-BSA和兔抗鼠IgG分别喷涂于检测线T1、T2、T3、T4和质控线C上；
所述量子点探针的制备包括以下步骤：
将红光CdSe/ZnS QDs、黄光CdSe/ZnS QDs、绿光CdSe/ZnS QDs、橙光CdSe/ZnS QDs分别用MES缓冲液稀释至0.08～0.12mg/mL获得稀释后的红光CdSe/ZnS QDs、黄光CdSe/ZnSQDs、绿光CdSe/ZnS QDs、橙光CdSe/ZnS QDs溶液；
将所述稀释后的红光CdSe/ZnS QDs、黄光CdSe/ZnS QDs、绿光CdSe/ZnS QDs、橙光CdSe/ZnS QDs溶液分别与EDC、NHS混合进行活化获得活化后的红光CdSe/ZnS QDs、黄光CdSe/ZnS QDs、绿光CdSe/ZnS QDs、橙光CdSe/ZnS QDs量子点溶液；
将所述活化后的红光CdSe/ZnS QDs、黄光CdSe/ZnS QDs、绿光CdSe/ZnS QDs、橙光CdSe/ZnS QDs量子点溶液分别与2-NPAOZ抗体、2-NPAHD抗体、2-NPSEM抗体和2-NPAMOZ抗体偶联获得红光量子点偶联的2-NPAOZ抗体、黄光量子点偶联的2-NPAHD抗体、绿光量子点偶联的2-NPSEM抗体和橙光量子点偶联的2-NPAMOZ抗体。
优选的，所述预处理液以PBS为溶剂，包括质量百分含量为1.5～2.5％的蔗糖，质量百分含量为0.4～0.6％的BSA和体积百分含量为0.04～0.06％的Tween-20。
本发明提供了所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
将含有待检测物质的溶液、量子点探针和吐温20混合孵育获得反应液，然后将反应液与层析试纸样品垫接触层析读取结果。
本发明提供了所述试剂盒在检测硝基呋喃类药物残留中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供的同时检测四种硝基呋喃类代谢物的荧光免疫层析试剂盒包括层析试纸和量子点探针；所述量子点探针以四种量子点为标记物分别标记四种硝基呋喃代谢物抗体，将量子点荧光寿命长、量子产率高、光稳定性好等优点与免疫层析技术结合，在实现同时检测四种硝基呋喃类代谢物的同时，提高了检测的灵敏度。根据实施例记载，所述四种硝基呋喃类代谢物的检测线分别为AOZ(T1)检出限：0.4μg/mL；AHD(T2)检出限：0.1μg/mL；SEM(T3)检出限：0.4μg/mL；AMOZ(T4)检出限：0.5μg/mL。
附图说明
图1为不同浓度的硝基呋喃类代谢物的荧光免疫层析检测结果；其中：
试纸条0接触的待检测物的溶液中AOZ、AHD、SEM、AMOZ浓度均为0ng/mL；
试纸条1接触的待检测物的溶液中AHD为20ng/mL，AOZ、SEM、AMOZ均为50ng/mL；
试纸条2接触的待检测物的溶液中AHD为40ng/mL，AOZ、SEM、AMOZ均为100ng/mL；
试纸条3接触的待检测物的溶液中AHD为60ng/mL，AOZ、SEM、AMOZ均为200ng/mL；
试纸条4接触的待检测物的溶液中AHD为80ng/mL，AOZ、SEM、AMOZ均为300ng/mL；
试纸条5接触的待检测物的溶液中AHD为100ng/mL，AOZ、SEM、AMOZ均为400ng/mL；
试纸条6接触的待检测物的溶液中AHD为150ng/mL，AOZ、SEM、AMOZ均为500ng/mL；
试纸条7接触的待检测物的溶液中AHD为200ng/mL，AOZ、SEM、AMOZ均为600ng/mL；
图2为本发明中的荧光免疫层析试剂盒的非特异性检测结果；其中：
试纸条1接触的待测溶液中AOZ、AHD、SEM、AMOZ均为阴性；
试纸条2接触的待测溶液中AOZ为阳性，AHD、SEM、AMOZ均为阴性；
试纸条3接触的待测溶液中AHD为阳性，AOZ、SEM、AMOZ均为阴性；
试纸条4接触的待测溶液中SEM为阳性，AOZ、AHD、AMOZ均为阴性；
试纸条5接触的待测溶液中AMOZ为阳性，AOZ、AHD、SEM均为阴性；
试纸条6接触的待测液中AOZ、AHD、SEM、AMOZ均为阳性；
图3为不同浓度的呋喃唑酮代谢物的胶体金层析检测结果；
图4为不同浓度的呋喃妥因代谢物的胶体金层析检测结果；
图5为不同浓度的呋喃西林代谢物的胶体金层析检测结果；
图6为不同浓度的呋喃它酮代谢物的胶体金层析检测结果；
图7为本发明提供的同时检测四种硝基呋喃类代谢物的荧光免疫层析试剂盒中的层析试纸检测原理示意图。
具体实施方式
本发明提供了同时检测四种硝基呋喃类代谢物的荧光免疫层析试剂盒，包括层析试纸和量子点探针；所述层析试纸包括PVC底板以及顺次搭接固定于所述PVC底板上的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上设置检测线T1、T2、T3、T4和质控线C；所述检测线T1、T2、T3、T4分别喷涂包被抗原2-NPAOZ-BSA、2-NPAHD-BSA、2-NPSEM-BSA和2-NPAMOZ-BSA；所述质控线C喷涂兔抗鼠IgG；所述量子点探针包括红光量子点偶联的2-NPAOZ抗体、黄光量子点偶联的2-NPAHD，绿光量子点偶联的2-NPSEM和橙光量子点偶联的2-NPAMOZ。
在本发明中，所述层析试纸包括样品垫，所述样品垫优选为玻璃纤维材质，所述样品垫与硝酸纤维素膜搭接，所述搭接重叠的长度优选为1～2mm。
在本发明中，所述层析试纸包括硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上设置检测线T1、T2、T3、T4和质控线C；所述检测线T1、T2、T3、T4分别喷涂包被抗原2-NPAOZ-BSA、2-NPAHD-BSA、2-NPSEM-BSA和2-NPAMOZ-BSA；在本发明中，所述包被抗原2-NPAOZ-BSA、2-NPAHD-BSA、2-NPSEM-BSA和2-NPAMOZ-BSA的浓度分别优选为0.1～0.5mg/mL、0.05～0.3mg/mL、0.2～0.6mg/mL、0.5～2mg/mL，更优选为0.2～0.4mg/mL、0.08～0.12mg/mL、0.3～0.5mg/mL、0.8～1.2mg/mL，最优选为0.3mg/mL、0.1mg/mL、0.4mg/mL、1mg/mL。在本发明中，所述包被抗原(来源：山东蓝都生物科技有限公司)2-NPAOZ-BSA、2-NPAHD-BSA、2-NPSEM-BSA和2-NPAMOZ-BSA的喷涂量分别优选为0.8～1.2μL/cm，更优选为0.9～1.1μL/cm，最优选为1.0μL/cm。在本发明中，质控线C上喷涂兔抗鼠IgG，所述兔抗鼠IgG的浓度优选为0.08～0.12mg/mL，更优选为0.09～0.11mg/mL，最优选为0.1mg/mL；所述兔抗鼠IgG的喷涂量优选为0.8～1.2μL/cm，更优选为0.9～1.1μL/cm，最优选为1.0μL/cm。
在本发明中，所述层析试纸包括吸水垫，所述吸水垫优选为滤纸；所述吸水垫与硝酸纤维素膜搭接，所述搭接重叠的长度优选为1～2mm。
在本发明中，所述层析试纸包括PVC底板，所述样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫粘贴固定于PVC底板上。
在本发明中，所述层析试纸的宽度优选为3.4～3.6cm，更优选为3.5cm。
在本发明中，所述试剂盒还包括量子点探针；所述量子点探针包括红光量子点偶联的2-NPAOZ抗体、黄光量子点偶联的2-NPAHD抗体，绿光量子点偶联的2-NPSEM抗体和橙光量子点偶联的2-NPAMOZ抗体。在本发明中，所述红光量子点偶联的2-NPAOZ抗体、黄光量子点偶联的2-NPAHD抗体，绿光量子点偶联的2-NPSEM抗体和橙光量子点偶联的2-NPAMOZ抗体的使用体积比优选为(4～6)：(4～6)：(8～12)：(4～6)，更优选为5：5：10：5。
在本发明中，所述试剂盒优选的还包括吐温20，所述吐温20的作用是增加标记抗体在层析体系中的分散性，增加层析速度；同时降低非特异性。本发明还提供了所述试剂盒的制备方法，包括层析试纸的制备和量子点探针的制备。
在本发明中，所述层析试纸的制备包括以下步骤：
用预处理液对样品垫进行浸泡处理后，烘干获得处理后的样品垫；将处理后的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫顺次搭接并固定于PVC底板上；将包被抗原2-NPAOZ-BSA、2-NPAHD-BSA、2-NPSEM-BSA、2-NPAMOZ-BSA和兔抗鼠IgG分别喷涂于检测线T1、T2、T3、T4和质控线C上。
在本发明中，用预处理液对样品垫进行浸泡处理后，烘干获得处理后的样品垫。在本发明中，所述预处理液优选的以PBS为溶剂，包括质量百分含量为1.5～2.5％的蔗糖，质量百分含量为0.4～0.6％的BSA和体积百分含量为0.04～0.06％的Tween-20，更优选的以PBS为溶剂，包括质量百分含量为2％的蔗糖，质量百分含量为0.5％的BSA和体积百分含量为0.05％的Tween-20。在本发明中，所述浸泡处理的时间优选为4～6min，更优选为5min；本发明对所述烘干的方法和时间没有特殊限定，采用本领域常规的烘干方法和时间即可。
本发明将处理后的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫顺次搭接并固定于PVC底板上。在本发明中，所述处理后的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫优选的粘贴在PVC底板上；所述样品垫、吸水垫分别与硝酸纤维素膜搭接，所述搭接重叠的长度优选为1～2mm。
本发明将包被抗原2-NPAOZ-BSA、2-NPAHD-BSA、2-NPSEM-BSA、2-NPAMOZ-BSA和兔抗鼠IgG分别喷涂于检测线T1、T2、T3、T4和质控线C上。在本发明中，所述包被抗原2-NPAOZ-BSA、2-NPAHD-BSA、2-NPSEM-BSA、2-NPAMOZ-BSA和兔抗鼠IgG的喷涂优选的采用划膜仪实现。在本发明中，优选的将喷涂后的层析试纸烘干后切割。在本发明中，所述烘干的温度优选为35～40℃，更优选为37℃，所述烘干的时间优选为1.5～2.5h，更优选为2h；本发明对所述切割的具体操作没有特殊限定，采用本领域的常规切割方法即可。
在本发明中，所述量子点探针的制备包括以下步骤：
将红光CdSe/ZnS QDs、黄光CdSe/ZnS QDs、绿光CdSe/ZnS QDs、橙光CdSe/ZnS QDs分别用MES缓冲液稀释至0.08～0.12mg/mL获得稀释后的红光CdSe/ZnS QDs、黄光CdSe/ZnSQDs、绿光CdSe/ZnS QDs、橙光CdSe/ZnS QDs溶液。在本发明中，所述红光CdSe/ZnS QDs、黄光CdSe/ZnS QDs、绿光CdSe/ZnS QDs、橙光CdSe/ZnS QDs的浓度分别优选为8～12mg/mL，更优选为10mg/mL；所述红光CdSe/ZnS QDs、黄光CdSe/ZnS QDs、绿光CdSe/ZnS QDs、橙光CdSe/ZnS QDs优选的购自上海昆道生物技术有限公司。在本发明中，将所述红光CdSe/ZnSQDs、黄光CdSe/ZnS QDs、绿光CdSe/ZnS QDs、橙光CdSe/ZnS QDs分别与MES缓冲液混合进行稀释；在本发明中，所述稀释优选的还包括超声处理，所述超声处理的功率优选为25～35kHz，更优选为30kHz，所述超声处理的时间优选为0.5～1.5min，更优选为1min。
在本发明中，将所述稀释后的红光CdSe/ZnS QDs、黄光CdSe/ZnS QDs、绿光CdSe/ZnS QDs、橙光CdSe/ZnS QDs溶液分别与EDC、NHS混合进行活化获得活化后的红光CdSe/ZnSQDs、黄光CdSe/ZnS QDs、绿光CdSe/ZnS QDs、橙光CdSe/ZnS QDs量子点溶液。在本发明中，所述稀释后的红光CdSe/ZnS QDs溶液、黄光CdSe/ZnS QDs、绿光CdSe/ZnS QDs、橙光CdSe/ZnS QDs溶液与EDC、NHS的体积比分别优选为(48～52)：1:1，更优选为50:1:1。在本发明中，所述EDC的浓度优选为0.8～1.2mg/mL，更优选为1mg/mL；所述NHS的浓度为1.5～2.5mg/mL，更优选为2mg/mL。在本发明中，所述活化优选的在摇床上进行，所述活化的转速优选为180～220rom，更优选为200rpm，所述活化的时间优选为25～35min，更优选为30min；所述活化优选的在黑暗条件下进行。
本发明将所述活化后的红光CdSe/ZnS QDs与2-NPAOZ抗体偶联获得红光量子点偶联的2-NPAOZ抗体；将所述活化后的黄光CdSe/ZnS QDs与2-NPAHD抗体偶联获得黄光量子点偶联的2-NPAHD抗体；将所述活化后的绿光CdSe/ZnS QDs与2-NPSEM抗体偶联获得绿光量子点偶联的2-NPSEM抗体；将所述橙光CdSe/ZnS QDs与2-NPAMOZ抗体偶联获得橙光量子点偶联的2-NPAMOZ抗体。在本发明中，所述2-NPAOZ抗体与原始红光CdSe/ZnS QDs的体积比优选为(1～4)：1；所述2-NPAHD抗体与原始黄光CdSe/ZnS QDs的体积比优选为(1～4)：1；所述2-NPSEM抗体与原始绿光CdSe/ZnS QDs的体积比优选为(1～4)：1；所述2-NPAMOZ抗体与原始橙光CdSe/ZnS QDs的体积比优选为(1～4)：1。在本发明中，所述偶联优选的在振荡的条件下进行，所述偶联的温度优选为20～25℃，所述偶联的时间优选为1.5～2.5h，更优选为2h；所述偶联优选的在摇床上进行；本发明在所述偶联后，优选的用BSA溶液封闭后保存，所述BSA溶液的质量百分含量优选为0.8～1.2％，更优选为1％；所述封闭的时间优选为1h，所述保存的温度优选为3～5℃，更优选为4℃。在本发明中，所述2-NPAOZ抗体、2-NPAHD抗体、2-NPSEM抗体和2-NPAMOZ抗体优选的购自山东蓝都生物科技有限公司。
在本发明中，所述红光量子点偶联的2-NPAOZ抗体、黄光量子点偶联的2-NPAHD抗体、绿光量子点偶联的2-NPSEM抗体和橙光量子点偶联的2-NPAMOZ抗体使用的体积比优选为(4～6)：(4～6)：(8～12)：(4～6)，更优选为5:5:10:5。
本发明将所述制备获得的层析试纸、量子点探针组装获得试剂盒。本发明对所述层析试纸和量子点探针的包装材料以及规格没有特殊限定，采用本领域常规的层析试纸和量子点探针的包装材料即可。在本发明中，优选的将吐温20独立包装并组装至试剂盒中。
本发明还提供了所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：将含有待检测物质的溶液、量子点探针和吐温20混合孵育获得反应液，然后将反应液与层析试纸样品垫接触后用紫外灯读取结果。
在本发明中，将含有待检测物质的溶液、量子点探针和吐温20混合孵育获得反应液；所述含有待检测物质的溶液、量子点探针和吐温20的体积比优选为100:25:10；所述混合孵育的温度优选为36～38℃，更优选为37℃，所述混合孵育的时间优选为10～20min，更优选为15min。在本发明中，所述混合孵育优选的在96孔反应容器中进行。在本发明中，所述含有待检测物质的溶液的制备方法参考国标/T 21311-2007中样品处理方法。
本发明在所述混合孵育后，获得反应液，将所述反应液与层析试纸样品垫接触后用紫外灯读取结果。在本发明中，优选的将所述层析试纸插入样品孔中层析后用紫外灯读取结果，所述层析的时间优选为25～35min，更优选为30min。
在本发明中，当检测线T1、T2、T3或T4呈现红、黄、绿或橙荧光条带时，表明待检测样品中不含对应的硝基呋喃类代谢物或含量低于检测限。当检测线T1、T2、T3或T4的荧光完全消失时，表明待检测样品中对应的硝基呋喃类代谢物含量高于检测限；T线荧光越弱，待检测样品中对应的硝基呋喃类代谢物残留量越高。
本发明还提供了所述试剂盒在检测硝基呋喃类药物残留中的应用。本发明对检测的样品种类没有特殊限定，任意可能含有硝基呋喃类药物残留的样品均可，例如食品。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
试纸条制备：
用预处理液(以PBS为溶剂，包括质量百分含量为2％的蔗糖，质量百分含量为0.5％的BSA和体积百分含量为0.05％的Tween-20)对样品垫浸泡处理5min后37℃烘箱烘2h。将烘干后的样品垫以及NC膜和吸水垫依次粘贴在PVC板上，并且样品垫和结合垫分别与NC膜重叠1.5mm。利用划膜仪将四种包被抗原2-NPAOZ-BSA、2-NPAHD-BSA、2-NPSEM-BSA、2-NPAMOZ-BSA和兔抗鼠IgG(均购自山东蓝都生物科技有限公司)以1μL/cm的单位喷液量固定在NC膜上作为检测线T1、T2、T3、T4和质控线C，且检测线的浓度依次为0.3mg/mL、0.1mg/mL、0.4mg/mL、1mg/mL，质控线C的浓度为0.1mg/mL。将制备好的试纸条放入37℃烘箱中干燥2h。随后将其切成3.5cm宽的试纸条备用。
量子点探针的制备：
取5μL 10mg/mL红光CdSe/ZnS QDs，加495μLMES缓冲液进行稀释，混匀，30kHz超声处理1min。随后分别加入10μL现配的EDC(1mg/mL)和10μL现配的NHS(2mg/mL)进行活化，200rpm摇床上暗反应30min。活化后的量子点溶液超声1min后，加入10μL1mg/mL的2-NPAOZ抗体(购自山东蓝都生物科技有限公司)进行偶联，在摇床上25℃振荡反应2h，加入20μL1％BSA封闭1h，4℃冰箱备用。
四种量子点荧光探针合成方式一致，区别在于红光CdSe/ZnS QDs标记2-NPAOZ抗体，黄光CdSe/ZnS QDs标记2-NPAHD抗体，绿光CdSe/ZnS QDs标记2-NPSEM抗体，橙光CdSe/ZnS QDs标记2-NPAMOZ抗体。
将含有待检测物的溶液100μL、红光CdSe/ZnS QDs标记2-NPAOZ抗体5μL，黄光CdSe/ZnS QDs标记2-NPAHD抗体5μL，绿光CdSe/ZnS QDs标记2-NPSEM抗体10μL，橙光CdSe/ZnS QDs标记2-NPAMOZ抗体5μL和吐温20(Tween-20)10μL混合、摇匀，37℃孵育15min，随后将试纸条插入样品孔中层析反应30min后用紫外灯读取结果。
结果判断
阴性(-)：当检测线T1/T2/T3/T4呈现红/黄/绿/橙荧光条带时，表明样品中该种硝基呋喃类代谢物残留量低于检测限或者不含该种硝基呋喃类代谢物残留。
阳性(+)：当检测线T1/T2/T3/T4的荧光完全消失时，表明样品中该种硝基呋喃类代谢物残留量高于检测限，T线荧光越弱，样品中该类硝基呋喃类代谢物残留量越高。
表1结果判定情况
Figure BDA0003037128500000111
用8个试纸条分别对8种含有待检测物质的溶液进行检测，结果如图1所示，其中试纸条0接触的待检测物的溶液中：AOZ(3-氨基-2-恶唑烷酮)、AHD(1-氨基乙内酰脲)、SEM(氨基脲)、AMOZ(3-氨基-5-吗啉甲基-2-恶唑烷酮)浓度均为0ng/mL；
试纸条1接触的待检测物的溶液中：AHD：20ng/mL，AOZ、SEM、AMOZ均为50ng/mL；
试纸条2接触的待检测物的溶液中：AHD：40ng/mL，AOZ、SEM、AMOZ均为100ng/mL；
试纸条3接触的待检测物的溶液中：AHD：60ng/mL，AOZ、SEM、AMOZ均为200ng/mL；
试纸条4接触的待检测物的溶液中：AHD：80ng/mL，AOZ、SEM、AMOZ均为300ng/mL；
试纸条5接触的待检测物的溶液中：AHD：100ng/mL，AOZ、SEM、AMOZ均为400ng/mL；
试纸条6接触的待检测物的溶液中：AHD：150ng/mL，AOZ、SEM、AMOZ均为500ng/mL；
试纸条7接触的待检测物的溶液中：AHD：200ng/mL，AOZ、SEM、AMOZ均为600ng/mL。
检测结果为：AOZ(T1)的检出限：0.4μg/mL；AHD(T2)检出限：0.1μg/mL；SEM(T3)检出限：0.4μg/mL；AMOZ(T4)检出限：0.5μg/mL。
特异性检测：
特异性检测方法如下：将红光CdSe/ZnS QDs标记2-NPAOZ抗体5μL，黄光CdSe/ZnSQDs标记2-NPAHD抗体5μL，绿光CdSe/ZnS QDs标记2-NPSEM抗体10μL，橙光CdSe/ZnS QDs标记2-NPAMOZ抗体5μL和吐温20(Tween-20)10μL分别加入到不含有AOZ、AHD、SEM、AMOZ的待测液；只单独含有AOZ、AHD、SEM、AMOZ中的一种的待测液以及同时含有AOZ、AHD、SEM、AMOZ的待测液混合、摇匀，37℃孵育15min，随后将试纸条插入样品孔中层析反应30min后用紫外灯读取结果。
检测结果如表2和图2所示：
试纸条1接触的待测溶液中AOZ、AHD、SEM、AMOZ四种物质均为阴性，因而试纸条检测线分别呈现红、黄、绿、橙荧光条带；
试纸条2接触的待测溶液中AOZ为阳性，AHD、SEM、AMOZ为阴性，因而AOZ对应的检测线荧光条带消失，其他检测线分别呈现黄、绿、橙荧光条带；
试纸条3接触的待测溶液中AHD为阳性，AOZ、SEM、AMOZ为阴性，因而AHD对应的检测线荧光条带消失，其他检测线分别呈现红、绿、橙荧光条带；
试纸条4接触的待测溶液中SEM为阳性，AOZ、AHD、AMOZ为阴性，因而SEM对应的检测线荧光条带消失，其他检测线分别呈现红、黄、橙荧光条带；
试纸条5接触的待测溶液中AMOZ为阳性，AOZ、AHD、SEM为阴性，因而AMOZ对应的检测线荧光条带消失，其他检测线分别呈现红、黄、绿橙荧光条带；
试纸条6接触的待测溶液中AOZ、AHD、SEM、AMOZ均为阴性，因而试纸条四条检测线的荧光条带全部消失；
检测结果表明四种待测物之间均无交叉反应，说明该试纸条特异性良好。
表2非特异性检测结果
Figure BDA0003037128500000131
(+表示存在该种目标物，-表示不存在该种目标物)
用8个胶体金试纸条(购自深圳市宝安康生物技术有限公司)对含有不同浓度的呋喃唑酮代谢物溶液进行检测，结果如图3所示，从左至右试纸条依次编号为试纸条0～7；
其中试纸条0接触的待测溶液中AOZ浓度为0μg/mL；
试纸条1接触的待测溶液中AOZ浓度为0.005μg/mL；
试纸条2接触的待测溶液中AOZ浓度为0.01μg/mL；
试纸条3接触的待测溶液中AOZ浓度为0.05μg/mL；
试纸条4接触的待测溶液中AOZ浓度为0.1μg/mL；
试纸条5接触的待测溶液中AOZ浓度为0.5μg/mL；
试纸条6接触的待测溶液中AOZ浓度为1μg/mL；
试纸条7接触的待测溶液中AOZ浓度为10μg/mL；
用8个胶体金试纸条对含有不同浓度的呋喃妥因代谢物溶液进行检测，结果如图4所示，从左至右试纸条依次编号为试纸条0～7；
其中试纸条0接触的待测溶液中AHD浓度为0μg/mL；
试纸条1接触的待测溶液中AHD浓度为0.005μg/mL；
试纸条2接触的待测溶液中AHD浓度为0.01μg/mL；
试纸条3接触的待测溶液中AHD浓度为0.05μg/mL；
试纸条4接触的待测溶液中AHD浓度为0.1μg/mL；
试纸条5接触的待测溶液中AHD浓度为0.5μg/mL；
试纸条6接触的待测溶液中AHD浓度为1μg/mL；
试纸条7接触的待测溶液中AHD浓度为10μg/mL；
用8个胶体金试纸条对含有不同浓度的呋喃西林代谢物溶液进行检测，结果如图5所示，从左至右试纸条依次编号为试纸条0～7；
其中试纸条0接触的待测溶液中SEM浓度为0μg/mL；
试纸条1接触的待测溶液中SEM浓度为0.005μg/mL；
试纸条2接触的待测溶液中SEM浓度为0.01μg/mL；
试纸条3接触的待测溶液中SEM浓度为0.05μg/mL；
试纸条4接触的待测溶液中SEM浓度为0.1μg/mL；
试纸条5接触的待测溶液中SEM浓度为0.5μg/mL；
试纸条6接触的待测溶液中SEM浓度为1μg/mL；
试纸条7接触的待测溶液中SEM浓度为10μg/mL；
用8个胶体金试纸条对含有不同浓度的呋喃它酮代谢物溶液进行检测，结果如图6所示，从左至右试纸条依次编号为试纸条0～7；
其中试纸条0接触的待测溶液中AMOZ浓度为0μg/mL；
试纸条1接触的待测溶液中AMOZ浓度为0.005μg/mL；
试纸条2接触的待测溶液中AMOZ浓度为0.01μg/mL；
试纸条3接触的待测溶液中AMOZ浓度为0.05μg/mL；
试纸条4接触的待测溶液中AMOZ浓度为0.1μg/mL；
试纸条5接触的待测溶液中AMOZ浓度为0.5μg/mL；
试纸条6接触的待测溶液中AMOZ浓度为1μg/mL；
试纸条7接触的待测溶液中AMOZ浓度为10μg/mL；
检测结果为：AOZ的检出限：10μg/mL；AHD检出限：10μg/mL；SEM检出限：10μg/mL；AMOZ检出限：1μg/mL。灵敏度远远低于本发明的试纸条。
由上述实施例可知，本发明提供的同时检测四种硝基呋喃类代谢物的荧光免疫层析试剂盒，在实现同时检测四种硝基呋喃类代谢物的同时，提高了检测的灵敏度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.同时检测四种硝基呋喃类代谢物的荧光免疫层析试剂盒，其特征在于，包括层析试纸和量子点探针；
所述层析试纸包括PVC底板以及顺次搭接固定于所述PVC底板上的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上设置检测线T1、T2、T3、T4和质控线C；所述检测线T1、T2、T3、T4分别喷涂包被抗原2-NPAOZ-BSA、2-NPAHD-BSA、2-NPSEM-BSA和2-NPAMOZ-BSA；所述质控线C喷涂兔抗鼠IgG；
所述量子点探针包括红光量子点偶联的2-NPAOZ抗体、黄光量子点偶联的2-NPAHD抗体、绿光量子点偶联的2-NPSEM抗体和橙光量子点偶联的2-NPAMOZ抗体。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述包被抗原2-NPAOZ-BSA、2-NPAHD-BSA、2-NPSEM-BSA和2-NPAMOZ-BSA的喷涂浓度分别为0.1～0.5mg/mL、0.05～0.3mg/mL、0.2～0.6mg/mL、0.5～2mg/mL，所述包被抗原2-NPAOZ-BSA、2-NPAHD-BSA、2-NPSEM-BSA和2-NPAMOZ-BSA的喷涂量分别为0.8～1.2μL/cm。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述兔抗鼠IgG的喷涂浓度为0.08～0.12mg/mL；所述兔抗鼠IgG的喷涂量为0.8～1.2μL/cm。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述红光量子点偶联的2-NPAOZ抗体、黄光量子点偶联的2-NPAHD抗体，绿光量子点偶联的2-NPSEM抗体和橙光量子点偶联的2-NPAMOZ抗体的使用体积比为(4～6)：(4～6)：(8～12)：(4～6)。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括吐温20。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述样品垫与硝酸纤维素膜重叠1～2mm，所述吸水垫与硝酸纤维素膜重叠1～2mm。
7.权利要求1～6任意一项所述试剂盒的制备方法，包括层析试纸的制备和量子点探针的制备；
所述层析试纸的制备包括以下步骤：
用预处理液对样品垫进行浸泡处理后，烘干获得处理后的样品垫；
将处理后的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫顺次搭接并固定于PVC底板上；
将包被抗原2-NPAOZ-BSA、2-NPAHD-BSA、2-NPSEM-BSA、2-NPAMOZ-BSA和兔抗鼠IgG分别喷涂于检测线T1、T2、T3、T4和质控线C上；
所述量子点探针的制备包括以下步骤：
将红光CdSe/ZnS QDs、黄光CdSe/ZnS QDs、绿光CdSe/ZnS QDs、橙光CdSe/ZnS QDs分别用MES缓冲液稀释至0.08～0.12mg/mL获得稀释后的红光CdSe/ZnS QDs、黄光CdSe/ZnSQDs、绿光CdSe/ZnS QDs、橙光CdSe/ZnS QDs溶液；
将所述稀释后的红光CdSe/ZnS QDs、黄光CdSe/ZnS QDs、绿光CdSe/ZnS QDs、橙光CdSe/ZnS QDs溶液分别与EDC、NHS混合进行活化获得活化后的红光CdSe/ZnS QDs、黄光CdSe/ZnS QDs、绿光CdSe/ZnS QDs、橙光CdSe/ZnS QDs量子点溶液；
将所述活化后的红光CdSe/ZnS QDs、黄光CdSe/ZnS QDs、绿光CdSe/ZnS QDs、橙光CdSe/ZnS QDs量子点溶液分别与2-NPAOZ抗体、2-NPAHD抗体、2-NPSEM抗体和2-NPAMOZ抗体偶联获得红光量子点偶联的2-NPAOZ抗体、黄光量子点偶联的2-NPAHD抗体、绿光量子点偶联的2-NPSEM抗体和橙光量子点偶联的2-NPAMOZ抗体。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述预处理液以PBS为溶剂，包括质量百分含量为1.5～2.5％的蔗糖，质量百分含量为0.4～0.6％的BSA和体积百分含量为0.04～0.06％的Tween-20。
9.权利要求1～6任意一项所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
将含有待检测物质的溶液、量子点探针和吐温20混合孵育获得反应液，然后将反应液与层析试纸样品垫接触层析读取结果。
10.权利要求1～6任意一项所述试剂盒在检测硝基呋喃类药物残留中的应用。
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