JP4096118B2 - プロテインチップ - Google Patents
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Description
一方はTBに対して血清陰性で他方は血清陽性な2人の患者からヒト血清を単離し、それをpH7.4の燐酸緩衝生理食塩水+0.05%(w/v)アジ化ナトリウム+0.1%(v/v)Tween-20(燐酸緩衝生理食塩水−洗浄緩衝液(PBS−WB))を用いて10倍に希釈した後、0.22μmのシリンジフィルタ(オーストラリア国ノースライドのミリポア(Millipore)社製)でろ過した。pH7.4のPBSに38kDa精製TB抗原を370μg/mlで溶解した液4μlをニトロセルロース膜(カリフォルニア州ハーキュリーズのバイオラッド(Bio-Rad)社製)に加えた後、乾燥させた。その後、0.5%(w/v)カゼイン(オーストラリア国キャッスルヒルのシグマ(Sigma)社製)のPBS−WB溶液を使用して、ニトロセルロース上の非特異的結合部位を15分間ブロッキングした。その後、55μmのオリフィスを有するAB-55微量噴射装置(テキサス州プレーノーのマイクロファブ・テクノロジーズ(MicroFab Technologies)社製)#B0-13-12を周波数240Hzで使用して、各血清サンプルの、スポットあたり100滴の4x4アレイを個々のTB抗原スポットに微量噴射した。ニトロセルロースの下にPBS−WBで飽和させたろ紙を敷くことによって、血清注入の間ニトロセルロースを湿潤状態に保った。血清噴射の10秒後、トランスファーピペットを用いて、ニトロセルロースをPBS−WB数滴ですすいだ。引き続いて、二トロセルロースを、フルオレッセインイソチオシアネート(カリフォルニア州サンフランシスコのザイメッド(Zymed)社製)に共役結合された抗ヒト免疫グロブリンGを0.5%(w/v)カゼインのpH7.4PBS−WB溶液に100倍の希釈率で希釈させたもので1時間温置した後、PBS−WBで洗浄した。標識された抗原を、バイオラッド(Bio-Rad)社(カリフォルニア州ハーキュリーズ)のFluorSTM マルチイメージャー(Multi-Imager)を用いて検出した。
図6(a)及び図6(b)に示す装置を用いてニトロセルロースの下に吸収性組織を敷くこと以外は、上記の方法を繰り返した。吸収性薄紙は、TB抗原を含んだニトロセルロース膜の下に挿し込まれた。その後、この材料全体を、噴射対象領域を円形オリフィス18から露呈させた状態で図6(a)乃至図6(c)に示す装置の内部に閉じ込めるようにして圧締した。薄紙の下敷きにより、噴射溶液又は付与される少量の緩衝液や試薬を、瞬間的かつ特異な反応を許容する薄紙にニトロセルロースを通して確実に直ちに引き込むことができた。この手法により、免疫グロブリンの非特異的染色、ひいては非特異的反応の両方を防止し、ニトロセルロースの表面を横切って特定の抗体が注入されるのを防止することができた(下記参照)。方法1と異なり、この装置は、噴射中にニトロセルロース膜を乾燥状態に保った。その後、この膜をトランスファーピペットを用いて1滴のPBS−WBで処理した後、上述したように、抗原上に血清を噴射させた。
38kDaTB抗原14.8μgを、等倍のSDS−PAGE非還元サンプル緩衝液を用いて200μlまで希釈させた。その後、サンプルを、4乃至12%(w/v)トリス−ビスポリアクリルアミド勾配ゲル(カリフォルニア州カールズバッドのインビトロジェン(Invitrogen)社製)を用いてSDS−PAGE(1レーンあたり抗原1.48μg)により解析した後、ニトロセルロースに電気的に転写させた。ブロットの2つのレーンをダイレクトブルー染色によって可視化する一方(図8)、他の2つのレーンは染色しなかった。両方のブロットともに、室温で乾燥させ、続いて0.5%(w/v)カゼインのPBS−WB溶液で15分間ブロッキングした。その後、両方のブロットをPBS−WBですすぎ、乾燥させた。その後、ブロットを図1に記載の吸着装置内に取り付けた後、血清陰性又は血清陽性のTB血清を、上述したように、1x5アレイの形でダイレクトブルー染色ブロットと非染色ブロットを交互に配した38kDaバンド上に噴射させた。約10秒後に、トランスファーピペットを用いて両ブロットをPBS−WB2滴で洗浄した。その後、0.5%(w/v)カゼインのPBS−WB溶液で10倍に希釈されたフルオレッセインイソチオシアネート標識つき二次抗体5μlをブロットに付与し、その10秒後に、トランスファーピペットを用いてPBS−WB2滴を加えた。標識された抗原をバイオラッド(Bio-Rad)社(カリフォルニア州ハーキュリーズ)のFluorSTM マルチイメージャー(Multi-Imager)で解析した。
サンプルは、7M尿素、2Mチオ尿素、2%(w/v)CHAPS及び5mMトリスに全血漿を溶解させた液36μlであった。サンプルをXトリブチルホスフィンで還元し、zヨードアセトアミドでアルカリ化した。このサンプルを超音波処理した後、遠心分離して上澄みを集めた。その内容全体が本明細書に参照の形で盛り込まれている、ハーバート、ビー.(Herbert, B)及びリゲッティ、ピー.ジー.(Righetti, P. G.)「プロテオーム解析の転機:等電膜を用いた多室電解槽によるサンプル前分取(A turning point in proteome analysis: sample prefractionation via multicompartment electrolyzers with isoelectric membranes)」エレクトロフォレシス(Electrophoresis)21、3639〜3648(2000)に記載された方法を用いて、多室電解槽(MCE)を使用して前分取を実行した。
Claims (24)
- 支持体上で一次スポットアレイ状の複数の高分子に対して複数の解析を同時に行う方法であって、
1種類以上の試薬を含んだ複数の組成物を、該複数の組成物が、上記高分子の一次アレイの各スポットの範囲内に収まるより小型の二次スポットアレイにおいて、該より小型の二次スポットアレイの各スポットを形成するよう付与することと、
上記一次アレイの高分子と上記二次アレイの形で付与された組成物内の上記試薬との間で相互作用が発生したか否かを検出することを備えた方法。 - 上記一次アレイは、転写によって作成される請求項1記載の方法。
- 上記一次アレイは、クロマトグラフィーによって作成される請求項1又は2に記載の方法。
- 上記クロマトグラフィーは、電気泳動である請求項3記載の方法。
- 上記電気泳動は、ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動である請求項4記載の方法。
- 上記クロマトグラフィーは二次元で実行され、一次元目は等電点電気泳動を使用し、二次元目は非変性ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動又はドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルによる電気泳動を使用する請求項3乃至5のいずれかに記載の方法。
- 上記一次アレイは、クロマトグラフィーで作成された後に、膜に転写される請求項1乃至6のいずれかに記載の方法。
- 上記膜は、二フッ化ポリビニリデン、ニトロセルロース、ナイロン、テフロン(登録商標)、ザイテックス(登録商標)、ポリプロピレン、ポリ四フッ化エチレン、又はこれらのいずれかの誘導体である請求項7記載の方法。
- 上記高分子は、タンパク質、ペプチド、糖類、脂質、核酸分子、糖タンパク又はこれらのいずれかの混合物である請求項1乃至8のいずれかに記載の方法。
- 上記高分子は、タンパク質である請求項1記載の方法。
- 上記高分子は、ヒト又は動物由来のタンパク質である請求項10記載の方法。
- 上記高分子は、抗体である請求項1乃至9のいずれかに記載の方法。
- 上記高分子は、バクテリア由来の抗原である請求項1乃至9のいずれかに記載の方法。
- 上記試薬は、タンパク質である請求項1乃至13のいずれかに記載の方法。
- 上記タンパク質は、ヒト又は動物に由来する請求項14記載の方法。
- 上記試薬は、抗体である請求項14記載の方法。
- 上記試薬は、酵素である請求項14又は15記載の方法。
- 上記酵素は、エンドプロテイナーゼLys-C、エンドプロテイナーゼGlu-C、トリプシン、エンドプロテイナーゼAsp-N、エンドプロテイナーゼArg-C、ペプシン及びキモトリプシンからなる群から選択される請求項17記載の方法。
- 上記酵素は、トリプシン又はエンドプロテイナーゼGlu-Cである請求項18記載の方法。
- 上記一次アレイの高分子と上記二次アレイの形で付与された組成物内の上記試薬との間で相互作用が発生したか否かを検出する工程は、MALDI−TOF質量分析を用いて行われる請求項1記載の方法。
- 複数の高分子に対して複数の解析を同時に行う方法であって、
支持体上に、スポットの形で高分子の一次アレイを作成することと、
1種類以上の試薬を含んだ複数の組成物を、該複数の組成物が、上記高分子の一次アレイの各スポットの範囲内に収まる二次スポットアレイにおいて、該二次スポットアレイの各スポットを形成するよう付与することと、
上記一次アレイの高分子と上記二次アレイの形で付与された組成物内の上記試薬との間で相互作用が発生したか否かを検出することを備えた方法。 - 上記高分子の一次アレイは、電気泳動によって作成される請求項21記載の方法。
- 上記高分子は、タンパク質である請求項21記載の方法。
- 複数の高分子に対して複数の解析を同時に行う方法であって、
高分子の一次アレイを作成することと、
上記高分子のアレイを支持体上に転写することと、
1種類以上の試薬を含んだ複数の組成物を、該複数の組成物が、上記高分子の一次アレイの各スポット範囲内に収まるより小型の二次スポットアレイにおいて、該より小型の二次スポットアレイの各スポットを形成するよう付与することと、
上記一次アレイの高分子と上記二次アレイの形で付与された組成物内の上記試薬との間で相互作用が発生したか否かを検出することを備えた方法。
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