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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Lagerung, Auftrennung und Analyse
von genetischem Material. Die Erfindung ist insbesondere zum Auftrennen
eines genetischen Materials von einer Probe, die mehrere Quellen
eines genetischen Materials enthält,
unter Verwendung eines festen Mediums geeignet.
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Die
Reinigung von genetischem Material aus einer Rohprobe für eine anschließende Analyse
kann mühsam
sein. Eine unzureichende Isolierung des genetischen Materials von
Hämoglobin,
Proteinen oder anderen Substanzen, die häufig mit dem genetischen Material
in einer Rohprobe einhergehen, kann einige analytische Vorgänge, wie
z.B. die Polymerasekettenreaktion („PCR"), hemmen oder stören. Darüber hinaus kann dann, wenn
die Rohprobe genetisches Material von mehreren Quellen umfasst,
eine Verwechslung des analysierten genetischen Materials resultieren.
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Rohproben,
die mehrere Quellen von genetischem Material aufweisen, umfassen
z.B. Blut, Stuhl, Gewebefluide, Plasmid-enthaltende Bakterien, usw. Die
Verwendung von Bakterien zur Vermehrung von Plasmiden ist bei der
Untersuchung des Genoms, der analytischen Molekularbiologie, der
präparativen
Molekularbiologie, usw., gebräuchlich.
Verfahren zur Vermehrung Plasmid-enthaltender Bakterien sind bekannt.
Gebräuchliche
Verfahren zur Lagerung von Bakterien, die Plasmide enthalten, vor
der Analyse des genetischen Materials des Plasmids umfassen z.B.
Filtrierpapier, Kunststoff, Keramik, Halbleiter, Metall, usw.
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Seit
kurzem sind neue Vorrichtungen und Verfahren zur Lagerung und Reinigung
von genetischem Material, die so behandelt sind, dass sie das genetische
Material während
der Lagerung und vor der Analyse vor einer Zersetzung schützen, erhältlich.
Beispiele für
solche Vorrichtungen umfassen Produkte unter der Handelsbezeichnung
FTA
®,
die von Fitzco, Inc., Plymouth, MN, erhältlich sind. Andere Beispiele
sind in den
US-Patenten 5,807,527 ,
5,756,126 und
5,496,562 und der gleichzeitig anhängigen
US-Anmeldung mit der Seriennummer 08/574,888 beschrieben.
Ein weiteres Beispiel eines entsprechenden Produkts ist IsoCode
®,
das von Schleicher & Schuell,
Keene, New Hampshire, erhältlich
ist.
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Die
Reinigung und Analyse von genetischem Material unter Verwendung
eines festen Mediums, wie z.B. der vorstehend beschriebenen festen
Medien, stellt im Vergleich zu Feucht- bzw. Nasslagerverfahren viele Vorteile
bereit. Während
diese Vorrichtungen zum Lagern und Verarbeiten von genetischem Material
geeignet sind, wird jedoch das genetische Material häufig in
der Form einer Rohprobe gelagert und kann genetisches Material enthalten,
das von zwei oder mehr verschiedenen Quellen stammt. Beispielsweise
liegt in dem Fall eines Bakteriums, das ein Plasmid enthält, genetisches
Material sowohl von dem Bakterium als auch von dem Plasmid vor. Während eine
einzelne Probe genetisches Material von mehreren Quellen enthalten
kann, ist es folglich häufig
vorteilhaft, dass die Quelle von jedwedem speziellen Teil eines
genetischen Materials unterschieden werden kann, wenn die Probe
analysiert wird.
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WO-A-96/18731 beschreibt
ein Verfahren des Isolierens von Nukleinsäure von einer Probe, wobei
das Verfahren das Inkontaktbringen der Probe mit einem Detergens
und einem festen Träger,
wobei die lösliche
Nukleinsäure
in der Probe an den Träger
gebunden wird, und das Abtrennen des Trägers mit der gebundenen Nukleinsäure von
der Probe umfasst.
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WO-A-96/39813 beschreibt
ein Verfahren zum Immobilisieren von genetischem Material auf einem
festen Medium, gefolgt von einer Elution.
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Das
US-Patent 3,872,082 beschreibt
zufällig (Beispiel
8) Komponenten, die in den Verfahren der vorliegenden Anmeldung
verwendet werden könnten.
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Demgemäß gibt es
einen kontinuierlichen Bedarf für
Produkte und Verfahren, die eine Reinigung oder Auftrennung eines
spezifischen genetischen Materials von einer Rohprobe, einschließlich einer
Probe, die genetisches Material von mehreren Quellen enthält, bereitstellen.
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In
einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren
zum Auftrennen eines ausgewählten
genetischen Materials aus einer Rohprobe, enthaltend genetisches
Material, welches auf ein festes Medium aufgebracht ist, bereit,
wobei das Verfahren die Schritte:
- – Aufbringen
einer Reinigungslösung,
die eine teilweise wässrige
alkalische Lösung
ist, welche ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel in Kombination
mit einer Quelle eines hohen pH-Werts einschließt bzw. umfasst, um eine Reinigungslösung mit
einem pH-Wert von 9,0 bis 13 bereitzustellen, auf die Probe des
genetischen Materials auf dem festen Medium, wobei die Lösung RNA
in der Probe zerstört,
- – Aufbringen
einer Elutionslösung
auf die Probe von genetischem Material auf dem festen Medium, und
- – Sammeln
des ausgewählten
genetischen Materials in der Elutionslösung umfasst.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Kit
zur Durchführung
des unmittelbar vorstehend beschriebenen Verfahrens zum Lagern einer
Probe von genetischem Material bereit, wobei der Kit:
- – ein
festes Medium,
- – eine
Reinigungslösung,
die eine teilweise wässrige
alkalische Lösung
ist, welche ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel, welches ein Alkohol ist,
in Kombination mit einer Quelle eines hohen pH-Werts umfasst, um
eine Reinigungslösung
mit einem pH-Wert von 9,0 bis 13 bereitzustellen, wobei die Lösung RNA
in der Probe zerstört,
und
- – eine
Elutionslösung
umfasst.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren
zum Auftrennen von genetischem Material eines Plasmids von genetischem Material
aus Bakterien, das als eine Probe auf ein festes Medium aufgebracht
wird, bereit, wobei das Verfahren:
- – das Aufbringen
einer Probe, welche Bakterien einschließt bzw. umfasst, die das Plasmid
enthalten, auf ein festes Medium,
- – das
Aufbringen einer Reinigungslösung,
die eine teilweise wässrige
alkalische Lösung
ist, welche ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel in Kombination
mit einer Quelle eines hohen pH-Werts umfasst, um eine Reinigungslösung mit einem
pH-Wert von 9,0 bis 13 bereitzustellen, auf die Probe auf dem festen
Medium, wobei die Lösung
RNA in der Probe zerstört,
- – das
Aufbringen einer Spüllösung auf
die Probe auf dem festen Medium,
- – das
Aufbringen einer Elutionslösung
auf die Probe auf dem festen Medium und
- – das
Sammeln des genetischen Materials einer ausgewählten Art von Bakterien und
Plasmid in den Elutionslösungen
umfasst.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Produkte und Verfahren zum Reinigen
oder Auftrennen eines genetischen Materials von einer Rohprobe,
die auf ein festes Medium aufgebracht ist. In einigen Ausführungsformen
stellt die Erfindung das Auftrennen eines ausgewählten genetischen Materials
von einer Probe, die genetisches Material von mehreren Quellen enthält, bereit.
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Es
sollte beachtet werden, dass in der Beschreibung eine Anleitung
durch Listen von Beispielen bereitgestellt werden kann. In jedem
Fall dienen die angegebenen Listen jedoch nur als repräsentative
Gruppe. Dies soll nicht bedeuten, dass diese Listen ausschließlich sind.
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Erfindungsgemäß kann eine
Probe von genetischem Material in der nachstehend beschriebenen
Weise auf einem festen Medium gelagert werden. Nach dem Aufbringen
auf das feste Medium kann ein nicht-genetisches Material, das typischerweise
mit einer Rohprobe einhergeht, wie z.B. Proteine, Fette, usw., unter
Verwendung einer Reinigungslösung
von dem trockenen festen Medium entfernt werden. Das trockene feste
Medium kann dann unter Verwendung einer Spüllösung gespült und die genetische Probe
in situ analysiert werden. Alternativ kann das genetische Material
von dem festen Medium eluiert und von dem festen Medium getrennt
analysiert werden.
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In
einigen Ausführungsformen
stellt die Erfindung ferner das Reinigen und Entfernen eines ausgewählten genetischen
Materials von einer Probe bereit, die genetisches Material, gegebenenfalls
genetisches Material von mehr als einer Quelle, umfasst. Gemäß dieser
Ausführungsform
kann das genetische Material, das auf dem festen Medium verbleibt, weiter
in situ analysiert werden, oder alternativ kann das genetische Material,
das von dem festen Medium entfernt worden ist, getrennt von dem
festen Medium weiter analysiert werden.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Produkte und Verfahren, die ein Auftrennen
von genetischem Material bereitstellen, das von einer Rohprobe stammt,
die genetisches Material von mehr als einer Quelle enthalten kann.
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Der
Ausdruck „genetisches
Material", der hier
verwendet wird, umfasst eine Nukleotidsequenz, die zwei oder mehr
Nukleotidbasen umfasst, einschließlich z.B. DNA, RNA, cDNA,
Oligonukleotide, vollständige
Gene, Teilgene, vollständige
Genome, usw. Eine „Rohprobe" bezieht sich auf
eine Probe von genetischem Material, die Komponenten umfasst, die
typischerweise mit dem genetischen Material in vivo einhergehen
(z.B. Proteine, Fette, usw.), und z.B. auf einen bukkalen Abstrich,
Blut, Serum, Plasma, Samen, Stuhl, Urin, Hirn-Rückenmarksflüssigkeit,
Gelenkschmiere, Lymphflüssigkeit,
usw. Eine „Rohprobe" umfasst auch Bakterienkulturen,
Virensuspensionen, usw. Eine „Quelle", von der das genetische
Material stammt, umfasst z.B. jedwede Art von eukaryotischer oder
prokaryotischer Zelle, Viren, Plasmide, Phagen, Archaea, Plastide,
Cosmide, Viroide, Gewebefluide (Blut, Hirn-Rückenmarksflüssigkeit,
Lymphflüssigkeit,
Speichel, Urin, usw.) usw. In einer Ausführungsform sind die Produkte
und Verfahren der Erfindung insbesondere zum Reinigen von genetischem
Plasmidmaterial und zum Auftrennen von genetischem Material von
Plasmiden von Bakterien, welche die Plasmide enthalten, geeignet.
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Erfindungsgemäß kann eine
Probe, die genetisches Material enthält, auf ein Medium aufgebracht
und darauf gelagert werden, das eine Trägermatrix, wie z.B. Papier
(Cellulose, Nitro cellulose, usw.), Kunststoff, Keramik, Halbleiter,
Metall oder ein anderes poröses
Material oder eine Oberfläche
mit Mikrovertiefungen oder eine Oberfläche, die mit Mikroerhebungen
oder Mikrostäbchen
ausgestattet ist, umfasst. Darüber
hinaus können
die erfindungsgemäßen Verfahren
auch mit genetischen Proben verwendet werden, die auf einer halbfesten
Matrix aufgebracht und darauf gelagert sind, wie z.B. Agargel, Agarosegel,
Polyacrylamidgel, usw.
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Das
Lagermedium kann auch eine oder mehrere Komponente(n) umfassen,
die das gelagerte genetische Material vor einer Schädigung oder
einer Zersetzung schützt
bzw. schützen,
Proteine denaturiert, oder die zur Analyse des gelagerten genetischen
Materials geeignet sind. Beispiele für einige solcher Matrizen sind
in den
US-Patenten 5,939,259 ,
5,807,527 ,
5,756,126 und
5,496,562 beschrieben.
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Die „Analyse" des genetischen
Materials umfasst hier Verfahren, die in dem Fachgebiet zur Analyse
von DNA oder RNA verwendet werden, wie z.B. Sequenzieren, Amplifizieren,
Hybridisieren, Einführen
von Sonden, Endonukleaserestriktion, Ligationsklonieren, Vorbereitung
für eine
Massenspektroskopie oder eine Bestrahlung oder jedwedes andere Verfahren,
das durchgeführt
wird, um Informationen über das
genetische Material zu erhalten. Das genetische Material kann sofort
nach der Probennahme analysiert werden oder zur Analyse zu einem
späteren Zeitpunkt
gelagert werden.
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Erfindungsgemäß kann ein
Teil oder die gesamte Analyse, die mit einer bestimmten Quelle von genetischem
Material durchgeführt
werden muss, in situ (d.h. auf dem Medium) durchgeführt werden, während (eine)
Quelle(n), die nicht analysiert werden soll(en), vor der Analyse
von dem Medium entfernt wird bzw. werden. Alternativ kann das zu
analysierende genetische Material von dem Medium entfernt werden,
wobei beispielsweise die Quellen von genetischem Material, die nicht
analysiert werden sollen, auf dem Medium verbleiben können, und
das genetische Material, das analysiert werden soll, vor der Analyse
von dem Medium entfernt wird. Um folglich eine bestimmte Quelle
von genetischem Material von einer Probe mit mehreren Quellen zu
analysieren, stellen die hier beschriebenen Verfahren eine selektive
Entfernung entweder des zu analysierenden genetischen Materials
oder des nicht zu analysierenden genetischen Materials (und/oder
des damit einhergehenden nicht-genetischen Materials) von dem festen Medium
bereit.
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In
einer Ausführungsform
kann eine Probe von genetischem Material das genetische Material
eines Bakteriums (z.B. DNA und/oder RNA) und das genetische Material
eines Plasmids (z.B. DNA) umfassen, das innerhalb der Bakterien
enthalten ist. In einem Beispiel dieser Ausführungsform kann eine nasse
bzw. feuchte Probe der Bakterien, die das Plasmid enthalten, auf
das Medium aufgebracht und trocknen gelassen werden. Nach dem Trocknen
und typischerweise vor der Analyse des genetischen Materials wird
das genetische Material der Bakterien und des Plasmids aufgetrennt.
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Entweder
das bakterielle genetische Material oder das genetische Material
des Plasmids kann aus dem Medium entfernt werden und das genetische Material,
das auf dem Medium zurückbleibt,
kann in situ analysiert werden und/oder das genetische Material
kann von dem Medium entfernt und getrennt von dem Medium analysiert
werden. In einem Beispiel kann das genetische Material des Plasmids
von dem Medium entfernt werden und das bakterielle genetische Material
kann auf dem Medium belassen werden. Wenn es bevorzugt ist, das
genetische Material des Plasmids zu analysieren, kann das Plasmid in
eine Elutionslösung
eluiert werden, mit der eine weitere Analyse des genetischen Materials
des Plasmids durchgeführt
werden kann. Wenn es bevorzugt ist, das genetische Material der
Bakterien zu analysieren, kann alternativ, sobald das genetische
Material des Plasmids von dem Medium entfernt worden ist, das bakterielle
genetische Material in situ auf dem Medium analysiert werden.
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Gemäß dem vorstehend
genannten Beispiel kann zur Auftrennung des genetischen Materials
des Plasmids von dem bakteriellen genetischen Material eine Reinigungslösung aufgebracht
werden, um die Komponenten der Rohprobe zu entfernen, die auf dem
Medium vorliegen und welche die Analyse des genetischen Materials
stören
oder für
diese nicht erforderlich sind. Der Reinigungslösung kann eine Spüllösung folgen.
Anschließend
kann eine Elutionslösung
aufgebracht werden, um das genetische Material der Quelle(n), die
zur Entfernung ausgewählt worden
ist bzw. sind, zu entfernen, ohne das genetische Material, das zum
Verbleib auf dem Medium ausgewählt
worden ist, wesentlich zu entfernen.
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Die „Reinigungslösung" stellt hier die
Entfernung eines nicht-genetischen Materials bereit. Ein nicht-genetisches
Material umfasst Probenbestandteile, wie z.B. Proteine, Fette, Zelltrümmer, bakterielle
Teichonsäuren,
Pflanzentannine, andere sekundäre
Pflanzenprodukte oder Komponenten des Mediums, wie z.B. Proteindenaturierungsmittel
(z.B. Detergentien; Harnstoff; Guanidiniumsalze, wie z.B. Guanidinthiocyanat,
Guanidinisothiocyanat, Guanidinhydrochlorid; Natriumiodid; Chelatisierungsmittel, wie
z.B. EDTA; Fänger
für freie
Radikale, wie z.B. Harnsäure
oder ein Harnsäuresalz,
Guanidinthiocyanat, usw.; Schutzmittel; usw. In einigen Ausführungsformen,
wie z.B. während
der Plasmidherstellung kann die Reinigungslösung auch für die RNA-Entfernung, z.B.
durch eine selektive RNA-Zerstörung
in alkalischer Lösung,
sorgen.
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In
einer Ausführungsform
kann die Reinigungslösung
eine „teilweise
wässrige
alkalische Lösung" (PAA) sein. Eine „PAA"-Lösung umfasst
hier ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel
(z.B. Alkohol, Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol, deren isometrischen
Diole oder Polyole, usw.; Aceton, usw.) in Kombination mit einer
Quelle eines hohen pH-Werts. Wenn das mit Wasser mischbare Lösungsmittel
der Alkohol Ethanol ist, können
die Konzentrationen an Ethanol etwa 30 bis 90 %, typischerweise
etwa 45 % bis 70 % betragen. Im Allgemeinen stellt eine Quelle eines „hohen
pH-Werts" einen
pH-Wert der PAA-Lösung
von etwa 9,0 bis 13, vorzugsweise von etwa 11 bereit. Beispiele
für Quellen
eines hohen pH-Werts umfassen: NaOH, KOH, LiOH, ein Hydroxid auf
der Basis von quartärem
Stickstoff, tertiäre,
sekundäre oder
primäre
Amine, usw. Eine bevorzugte PAA kann sowohl als Denaturierungsmittel
als auch als Lösungsmittel
zum Solubilisieren und Entfernen von Protein von dem Medium dienen.
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In
einem Beispiel für
das Entfernen von Plasmid-DNA und das Zurücklassen bakterieller DNA auf dem
festen Medium erleichtern ein komplementäres Vernetzen und die relative
Größe der bakteriellen DNA
die Retention an dem festen Medium. Es ist auch zu erwarten, dass
ein kovalentes Binden von DNA-Sequenzen oder Peptid NA (PNA)-Sequenzen an
das Medium genutzt werden kann, um das differenzierende Binden einer
Quelle von genetischem Material bezogen auf eine andere Quelle zu
verstärken.
Auch das verstärkte
Binden einer Art von genetischem Material bezogen auf eine andere
Art von genetischem Material kann durch Einbringen gewisser Umkehrphaseneigenschaften
in das Medium bereitgestellt werden. Solche Umkehrphaseneigenschaften
können
z.B. durch geringfügiges
Siliziumbehandeln eines hydrophoben Mediums oder Binden von Benzylgruppen,
Naphthylgruppen oder ähnlichen Gruppen
bereitgestellt werden.
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Eine „Spüllösung" stellt hier die
Entfernung von nicht-genetischem Material, das nach der Entfernung
der Reinigungslösung
zurückbleibt,
sowie die Entfernung oder Neutralisation von Komponenten der Reinigungslösung bereit.
Im Allgemeinen kann eine Spüllösung das
mit Wasser mischbare Lösungsmittel
der Reinigungslösung
umfassen. Folglich umfasst die Spüllösung Alkohole, wie z.B. Methanol, Ethanol,
Propanol, Butanol, deren isometrischen Diole oder Polyole usw.;
Aceton, usw. Die Spüllösung kann
entweder ungepuffert sein oder einen Puffer bei einem neutralen
pH-Wert oder geringfügig
unter pH 7,0 enthalten. Wenn dieser vorliegt, unterstützt ein Puffer
bei der Neutralisation des Alkali der Reinigungslösung. Die
Zusammensetzung des Puffers wird so ausgewählt, dass Spuren des Puffers,
die durch das Herstellungsverfahren verschleppt werden, mit dem
anschließenden
Aufbringen des genetischen Materials verträglich sind. Beispielsweise
sind Tris- und EDTA-Puffer geeignet, wenn der schließliche Gebrauch
der DNA in einer Lösung
in EDTA-enthaltenden Puffern besteht. Ein bevorzugter Puffer für einen
allgemeinen Gebrauch ist jedoch Ammoniumacetat bei Konzentrationen
zwischen 5 mM und 100 mM mit oder ohne eine geringe Menge von EDTA, wie
z.B. 0,1 mM EDTA.
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Eine „Elutionslösung" ist hier eine Lösung, die
selektiv das genetische Material von einer oder mehreren Quelle(n)
von dem Medium entfernt, ohne andere Quellen wesentlich zu entfernen. „Wesentlich" bedeutet hier, dass,
während
die Auftrennung der Quelle(n) von genetischem Material, die zur
Entfernung ausgewählt
wird bzw. werden, und der Quelle(n), die zum Verbleib ausgewählt wird
bzw. werden, nicht perfekt sein kann, die Auftrennung ausreichend ist,
um verlässliche
analytische Ergebnisse des zu analysierenden genetischen Materials
bereitzustellen. in einer typischen Ausführungsform ist die Elutionslösung eine
Kochsalz-Elutionslösung. Beispiele für geeignete
Kochsalz-Elutionslösungen
umfassen Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Natriumcitrat, Acetat,
Tris-EDTA-Puffer (TE), Ammoniumacetat (z.B. mit einer Konzentration
von 10 mM), Carbonatsalze, Hydrogencarbonate (z.B. mit einer Konzentration
von 10 mM), usw. Tris-EDTA-Puffer kann durch Vereinigen von 10 mM
freier Tris-Base
und 1 mM EDTA und Einstellen auf pH 8 mit HCl hergestellt werden.
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In
einer Ausführungsform
kann die Elutionslösung
auch Ethanol, Aceton, Methanol, Propanol, Butanol, usw., und deren
isomeren Diole und Polyole enthalten. Die vorstehend genannten Komponenten können in
niedrigeren Konzentrationen vorliegen, als sie in der Reinigungs-
und/oder Spüllösung vorliegen,
wie z.B. 0 % bis 55 % v/v. Die bevorzugte Konzentration dieser Komponenten
für eine
nichtselektive Extraktion beträgt
jedoch 0 %.
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Nach
dem Aufbringen der Elutionslösung kann
das von dem Medium zu eluierende genetische Material unter Verwendung
von Verfahren wie z.B. Zentrifugation, Vakuum, Diffusion, Elektrophorese und
Elektroosmose eluiert werden.
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Die
Erfindung wird mittels der folgenden Beispiele weiter beschrieben.
Es sollte beachtet werden, dass die Beispiele die Erfindung nicht
beschränken, sondern
vielmehr nur die Ausführung
der Erfindung verdeutlichen sollen.
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Beispiele
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Beispiel 1
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Das
Verfahren dieses Beispiels kann vorteilhaft eingesetzt werden, wenn
eine geringe Menge von Plasmiden von einer großen Anzahl von Proben benötigt wird,
wie z.B. wenn eine große
Anzahl von Plasmiden sequenziert wird. Gemäß diesem Beispiel wird die
Handhabung minimiert, während
die für
das Verfahren erforderliche Zeit gegebenenfalls länger ist.
Alle Vorgänge
fanden bei Raumtemperatur (d.h. etwa 20°C) statt.
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1
ml-Kulturen von Escherichia coli (E. coli) des Stamms DH10B, die
pBC-SR-Plasmide enthielten, wurden 5 min bei 150000 U/min zentrifugiert.
Jedes zentrifugierte Pellet wurde in 10:1 Wasser mit einer Spur
Bromphenolblau als Positionsindikator aufgenommen und dann auf einem
Stück FTA®-Papier (von
Fitzco, Inc. Plymouth, MN erhältlich)
als ein blauer Fleck aufgebracht, trocknen gelassen und trocken
gelagert.
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3 × 2 mm-Ausstanzungen
wurden von den gefärbten
Plasmidflecken auf dem FTA®-Papier entnommen und
in ein leeres Reagenzglas eingebracht. 1 ml einer Reinigungslösung von
0,1 M NaOH in 52,5 % Ethanol v/v wurde auf die Scheiben aufgebracht und
dann etwas bewegt, um 40 min ein Waschen und Hydrolysieren durchzuführen.
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Die
Reinigungslösung
wurde abgesaugt und eine Spüllösung von
1,0 ml 95 %igem Ethanol wurde zugesetzt und 5 min bei Raumtemperatur
etwas bewegt und dann wurde getrocknet.
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Eine
Elutionslösung
von 15:1 5 mM Tris-EDTA bei pH 8,3 wurde auf die Scheibe aufgebracht
und zur Elution des Plasmids über
Nacht bei 4°C
stehengelassen. Die eluierende Lösung
und das Elutionsmittel wurden aus dem Reagenzglas entfernt. Mit dem
Produkt wurde eine Elektrophorese auf einem 1 % Agarosegel durchgeführt und
es wurde mit einer Standardtechnologie mit Ethidiumbromid sichtbar
gemacht. Schwache, jedoch deutliche Plasmidbanden wurden mit der
erwarteten Mobilität
und mit einer Helligkeit festgestellt, die für die sehr geringe Menge an Ausgangsmaterial
eine zufrieden stellende Ausbeute anzeigte.
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Beispiel 2
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Dieses
Beispiel kann vorteilhaft eingesetzt werden, wenn größere Mengen
an Plasmid benötigt werden,
wie z.B. wenn eine Restriktionskartierung durchgeführt werden
soll. Dieses Beispiel nutzt ein Zentrifugalabstreifen zur Entfernung
von Lösungen von
dem Papier anstelle von langen Diffusionszeiträumen. Das Zentrifugalabstreifen
fand bei 2500 U/min statt und jedes Abstreifen erforderte zusätzliche
5 min für
die Zentrifugation. Alle Vorgänge
fanden bei Raumtemperatur (20°C)
statt.
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Ein
Fleck von Plasmid-enthaltenden E. coli, der 6 Tage auf FTA®-Papier
gehalten worden ist, wie es im Beispiel 1 beschrieben worden ist,
wurde in 4 Abschnitte geschnitten und einer der vier Abschnitte von
etwa 4 mm im Quadrat wurde in einer Vorrichtung angeordnet, die
für ein
Zentrifugalabstreifen geeignet war (z.B. ein Reagenzglas mit einem
Loch im Boden innerhalb eines anderen Reagenzglases, welches das
Eluat sammelt), und die zentrifugierten Eluate wurden gesammelt.
Andere geeignete Systeme zum Abstreifen sind dem Fachmann bekannt.
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150:1
Reinigungslösung
wurde viermal für jeweils
etwa 2,5 min aufgebracht. Die Reinigungslösung umfasste 62 % Alkohol
und als Rest Wasser mit einer Gesamtzusammensetzung für das Wasser
plus Alkohol von 0,1 M NaOH. Der Abschnitt wurde zweimal für jeweils
etwa 2 min unter Verwendung von 150:1 95 % Alkohol-Wasser gespült. Die
Zeit für
das Waschen und Spülen,
einschließlich
der Zentrifugationszeit, beträgt
etwa 1 Stunde. Eine Elutionslösung von
15:1 TE-Puffer wurde 1 min aufgebracht, worauf zentrifugiert wurde.
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Das
in dem TE-Puffer festgestellte Produkt wurde auf 1 % Agarosegel
einer Elektrophorese unterzogen und mit einer Standardtechnologie
mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Banden der erwarteten Größenklassen
wurde mit Intensitäten
festgestellt, die für
die Menge an E. coli, wovon sie stammten, angemessen waren.
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Beispiel 3
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Das
vorliegende Beispiel beschreibt die Reinigung einer Probe von Blut-DNA,
die auf einem festen Medium gelagert ist, und die anschließende Entfernung
der DNA von dem festen Medium.
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Eine
6 mm-Scheibe von trockenem Blut (etwa 16 μl) wurde im Vorhinein auf FTA®-Papier,
das von Fitzco, Inc., Plymouth, MN erhältlich ist, aufgebracht. Die
Probe wurde dann zweimal mit einer Reinigungslösung von 1,0 ml 0,3 M NaCO3 bei Raumtemperatur gewaschen. Der erste
Waschvorgang wurde 30 min durchgeführt, worauf abgesaugt wurde,
und der zweite Waschvorgang wurde 20 min durchgeführt, worauf
abgesaugt und zentrifugiert wurde. Die Probe wurde dann mit 50 mM
Essigsäure etwa
2 min gewaschen, worauf durch Zentrifugieren abgestreift und 10
min bei 99°C
zur Trockne erhitzt wurde. Anschließend wurden 20 μl 15 mM NaCO3 auf die Probe bei 99°C für 2 bis 2,5 min aufgebracht
und dann mit 2 Aliquots von 50 μl
Wasser eluiert. Das Elutionsmittel wurde in 10 μl-Chargen eingefroren und anschließend durch
eine Polymerasekettenreaktion (PCR) erfolgreich analysiert.
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Beispiel 4
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Eine
6 mm-Scheibe wurde aus einer Blutprobe, die auf FTA®-Papier
gelagert war, ausgestanzt. Das nicht-genetische Material (insbesondere
Proteine und Komponenten des FTA®-Papiers) wurde durch
geringfügiges
Bewegen der Scheibe mit 2 Waschvorgängen mit 500 μl 0,3 M Na2CO3 gereinigt. Der
erste Waschvorgang wurde 25 min durchgeführt (lange genug, um das Blut
aufzunehmen). Der zweite Waschvorgang wurde 10 min durchgeführt und
die Probe wurde anschließend
durch Zentrifugieren abgestreift.
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Die
Reinigungslösung
wurde durch Waschen und Zentrifugalabstreifen mit 3 Aliquots von
jeweils 200 μl
Wasser entfernt. Die Probe wurde zwischen jedem Waschvorgang 1 bis
2 min dem Wasser ausgesetzt. Die Blutfarbe der Scheibe war an diesem
Punkt im Wesentlichen verschwunden.
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2
mM Borsäure
wurde in einer Menge angewandt, die ausreichend war, um jede Scheibe
zu tränken
(etwa 14 μl)
und die Scheiben wurden in einem Laborautoklaven bei 121 bis 124°C angeordnet.
Der Autoklav wurde für
einen Feuchtzyklus bei einem Druck von etwa 140 kPa eingestellt.
Die Proben können
etwa 5 bis 15 min, typischerweise etwa 7 min, autoklaviert werden.
Nachdem der Autoklav Raumtemperatur und Umgebungsdruck aufwies,
wurden auf jede Scheibe 100 μl
Wasser aufgebracht und die DNA wurde mit zwei 100 μl-Aliquots
Wasser eluiert. Jedes Aliquot wurde durch Zentrifugalabstreifen
von der Probe entfernt. Die gesammelte DNA wurde dann mittels PCR
analysiert.
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Bei
der Verwendung dieses Verfahrens sollte darauf geachtet werden,
die DNA nicht durch übermäßige Autoklavierzeiten
zu schädigen.
Sobald die DNA eluiert worden ist, sollte sie gekühlt gehalten werden,
durch die Zugabe von TE oder einem entsprechenden alkalischen Puffer
mit einer geringen Menge an EDTA geschützt oder sofort verwendet werden.