ES2281971T3 - Producto y procedimiento de separacion de una muestra que contiene multiples fuentes de material genetico usando un medio solido. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para la separación de un material genético seleccionado a partir de una muestra bruta que contiene material genético aplicado a un medio sólido, comprendiendo el procedimiento una etapa de: - aplicación de una solución de limpieza que es una solución alcalina, parcialmente acuosa, la cual incluye un disolvente miscible en agua en combinación con una fuente de pH alto para proporcionar una solución de limpieza de pH 9, 0 hasta 13 a la muestra de material genético sobre el medio sólido, destruyendo la solución el RNA en la muestra; - aplicación de una solución de elución a la muestra de material genético sobre el medio sólido; y - recolección del material genético en la solución de elución.
Description
Producto y procedimiento de separación de una
muestra que contiene múltiples fuentes de material genético usando
un medio sólido.
La presente invención se dirige al
almacenamiento, separación y análisis de material genético. La
invención es particularmente adecuada para la separación de un
material genético a partir de una muestra que contiene múltiples
fuentes de un material genético que usa un medio sólido.
La purificación de material genético a partir de
una muestra bruta para posterior análisis puede ser laboriosa. El
inadecuado aislamiento del material genético a partir de
hemoglobina, proteínas u otra sustancia frecuentemente asociada con
el material genético en una muestra bruta puede inhibir o interferir
con algunos procedimientos analíticos tales como, por ejemplo, la
reacción en cadena de la polimerasa ("PCR"). Más aún, si la
muestra bruta incluye material genético procedente de múltiples
fuentes puede producir la confusión del material genético
analizado.
analizado.
Las muestras brutas que tienen múltiples fuentes
de material genético incluyen, por ejemplo, sangre, heces, fluidos
de tejidos, bacterias que contienen plásmidos, etc. El uso de
bacterias para la propagación de plásmidos es común en el estudio
de la genómica, biología molecular analítica, preparación de
biología molecular, etc. Los procedimientos para la propagación de
bacterias que contienen plásmidos son conocidos. Los procedimientos
comunes para el almacenamiento de bacterias que contienen plásmidos
antes del análisis del material genético del plásmido incluyen, por
ejemplo, papel de filtro, plástico, material cerámico,
semi-conductor, metal, etc.
Recientemente, se han convertido en
comercialmente disponibles nuevos dispositivos y procedimientos para
almacenamiento y purificación de material genético que están
tratados para proteger el material genético de la degradación
durante el almacenamiento y antes del análisis. Los ejemplos de
dichos dispositivos incluyen productos bajo el nombre comercial
FTA® disponible de Fitzco, Inc., Plymouth, MN. Otros ejemplos se
encuentran descritos en las Patentes de EE.UU. Nos. 5.807.527;
5.756.126; y 5.496.562 y la Solicitud de Patente de EE.UU. en
tramitación con la presente No. de Serie 08/574.888. Otro ejemplo
de un producto relacionado es IsoCode® disponible de Schleicher
& Schuell, Keene, New Hampshire.
La purificación y análisis de material genético
que usa un medio sólido, tales como los descritos anteriormente,
proporcionan muchas ventajas sobre los procedimientos de
almacenamiento en húmedo. Sin embargo, si bien estos dispositivos
son adecuados para almacenamiento y tratamiento de material
genético, frecuentemente el material genético se almacena en la
forma de una muestra bruta y puede incluir material genético
derivado de dos o más fuentes diferentes. Por ejemplo, en el caso
de una bacteria que contiene un plásmido, se encuentra presente
material genético procedente tanto de la bacteria como del plásmido.
De acuerdo con ello, si bien una muestra única puede incluir
material genético procedente de múltiples fuentes, frecuentemente es
ventajoso ser capaces de distinguir la fuente de cualquier pieza
particular de material genético cuando se analiza la muestra.
El Documento
WO-A-96/18731 describe un
procedimiento de aislamiento de ácido nucleico a partir de una
muestra, comprendiendo dicho procedimiento la puesta en contacto de
dicha muestra con un detergente y un soporte sólido, con lo cual el
ácido nucleico soluble en dicha muestra se une al soporte, y la
separación de dicho soporte con el material genético unido
procedente de la muestra.
El Documento
WO-A-96/39813 describe un
procedimiento para la inmovilización de material genético sobre un
medio sólido seguido de elución. La Patente de EE.UU. No. 3.872.082
describe de manera fortuita (Ejemplo 8) componentes que podrían
usarse en los procedimientos de la presente solicitud.
De acuerdo con ello, existe una continua
necesidad de productos y procedimientos que proporcionen la
purificación o separación de un material genético particular a
partir de una muestra bruta, incluyendo una muestra que contenga
material genético procedente de múltiples fuentes.
En un primer aspecto, la presente invención
proporciona un procedimiento para la separación de un material
genético seleccionado a partir de una muestra bruta que contiene
material genético aplicado a un medio sólido, comprendiendo el
procedimiento una etapa de:
- aplicación de una solución de limpieza que es
una solución alcalina, parcialmente acuosa, la cual incluye un
disolvente miscible en agua en combinación con una fuente de pH alto
para proporcionar una solución de limpieza de pH 9,0 hasta 13 a la
muestra de material genético sobre el medio sólido, destruyendo la
solución el RNA en la muestra;
- aplicación de una solución de elución a la
muestra de material genético sobre el medio sólido; y
recolección del material genético en la solución
de elución.
En un aspecto adicional, la presente invención
proporciona un kit para la realización del procedimiento establecido
inmediatamente más arriba, para el almacenamiento de una muestra de
material genético, comprendiendo el kit:
- un medio sólido;
- una solución de limpieza que es una solución
alcalina, parcialmente acuosa, la cual incluye un disolvente
miscible en agua que es un alcohol en combinación con una fuente de
pH alto para proporcionar una solución de limpieza de pH 9,0 hasta
13, destruyendo la solución el RNA en la muestra; y
- una solución de elución.
En un aspecto adicional, la presente invención
proporciona un procedimiento para la separación de material
genético de un plásmido a partir de material genético de una
bacteria aplicado como una muestra a un medio sólido, comprendiendo
el procedimiento:
- aplicación de una muestra que incluye la
bacteria que contiene el plásmido a un medio sólido;
- aplicación de una solución de limpieza que es
una solución alcalina, parcialmente acuosa, la cual incluye un
disolvente miscible en agua en combinación con una fuente de pH alto
para proporcionar una solución de limpieza de pH 9,0 hasta 13 a la
muestra sobre el medio sólido, destruyendo la solución el RNA en la
muestra;
- aplicación de una solución de lavado a la
muestra sobre el medio sólido;
- aplicación de una solución de elución a la
muestra de material genético sobre el medio sólido; y
- recolección del material genético seleccionado
de la bacteria y del plásmido en las soluciones de elución.
La presente invención se dirige a productos y
procedimientos para la purificación o separación de un material
genético a partir de una muestra bruta aplicada a un medio sólido.
En algunas realizaciones, la invención proporciona la separación de
un material genético seleccionado a partir de una muestra que
contiene material genético procedente de múltiples fuentes.
A lo largo de la memoria descriptiva, se
comprenderá que pueden proporcionarse guías a través de las listas
de ejemplos. En cada caso, las listas referidas sirven únicamente
como un grupo representativo. No obstante, esto no significa que
las listas sean exclusivas.
De acuerdo con la invención, puede almacenarse
una muestra de material genético sobre un medio sólido tal como se
describe más adelante. Una vez aplicado al medio sólido, el material
no genético típicamente asociado con una muestra bruta, por
ejemplo, proteínas, grasas, etc., puede separarse del medio sólido
seco usando una solución de limpieza. A continuación, el medio
sólido seco puede lavarse usando una solución de lavado y la
muestra genética analizarse in situ. Como alternativa, el
material genético puede eluirse del medio sólido y analizarse por
separado del medio sólido.
En algunas realizaciones, la invención
proporciona además la purificación y separación de un material
genético seleccionado a partir de una muestra que incluye material
genético, opcionalmente incluyendo material genético procedente de
más de una fuente. De acuerdo con esta realización, el material
genético que permanece sobre el medio sólido puede analizarse
además in situ, o, como alternativa, el material genético
separado del medio sólido puede analizarse además por separado del
medio sólido.
La presente invención se dirige a productos y
procedimientos que proporcionan la separación de material genético
derivado a partir de una muestra bruta que puede contener material
genético procedente de más de una fuente.
Tal como se usa aquí, el término "material
genético" incluye una secuencia nucleótida que comprende dos o
más bases nucleótidas incluyendo, por ejemplo, DNA, RNA, cDNA,
oligonucleótidos, genes enteros, genes parciales, genomas enteros,
etc. Una "muestra bruta" se refiere a una muestra de material
genético que incluye componentes típicamente asociados con el
material genético in vivo (por ejemplo, proteínas, grasas,
etc.) e incluye, por ejemplo, un bastoncillo bucal, sangre, suero,
semen, heces, orina, líquido cerebroespinal, líquido sinovial,
líquido linfático, etc. Una "muestra bruta" incluye igualmente
cultivos bacterianos, suspensiones virales, etc. Una "fuente"
a partir de la cual deriva el material genético incluye, por
ejemplo, cualquier tipo de célula eucariótica o procariótica,
virus, plásmidos, fagos, arqueobacterias, plástidas, cósmidos,
viroides, líquidos de tejidos (sangre, líquido cerebroespinal,
líquido linfático, saliva, orina, etc.), etc. En una realización,
los procedimientos y productos de la invención son particularmente
adecuados para la purificación de material genético plásmido y la
separación de material genético de plásmidos procedentes de
bacterias que contienen los plásmidos.
De acuerdo con la invención, una muestra que
contiene material genético puede aplicarse y almacenarse sobre un
medio que comprende una matriz soporte tal como papel (celulosa,
nitrocelulosa, etc.), plástico, material cerámico,
semi-conductor, metal, u otro material poroso o
superficie micro-indentada o superficie equipada
con microporos o microtrabéculas. Además, los procedimientos de la
invención pueden usarse igualmente sobre muestras genéticas
aplicadas y almacenadas sobre una matriz semi-sólida
tal como gel de agar, gel de agarosa, gel de poliacrilamida,
etc.
El medio de almacenamiento puede incluir
igualmente uno o más componentes que protegen al material genético
almacenado de daños o degradación, proteínas desnaturalizadas o que
son útiles para el análisis del material genético almacenado. En
las Patentes de EE.UU. Nos. 5.939,259; 5.807.527; 5.756.126; y
5.496.562, se describen ejemplos de algunas de dichas matrices.
Tal como se usa aquí, el "análisis" del
material genético incluye procedimientos usados en la técnica para
analizar DNA o RNA tales como secuenciación, amplificación,
hibridación, sondado, restricción endonucleasa, clonación por
ligamiento, preparación para espectroscopia de masa o irradiación, o
cualquier otro procedimiento que se lleve a cabo para obtener
información sobre el material genético. El material genético puede
analizarse inmediatamente después de tomar la muestra o almacenarse
para posterior análisis.
De acuerdo con la invención, parte o la
totalidad del análisis a llevar a cabo sobre una fuente particular
de material genético puede analizarse in situ (es decir,
sobre el medio) en tanto que la fuente(s) que no han de ser
analizadas se separan del medio antes del análisis. Como
alternativa, el material genético a analizar puede separarse del
medio, por ejemplo, las fuentes de material genético que no han de
ser analizadas pueden permanecer sobre el medio y el material
genético a analizar separarse del medio antes del análisis. De
acuerdo con ello, para analizar una fuente particular de material
genético a partir de una muestra de múltiple fuente, los
procedimientos aquí descritos proporcionan la separación selectiva a
partir del medio sólido de o bien el material genético a analizar o
bien el material genético (y/o material no genético asociado) que no
ha de ser analizado.
En una realización, una muestra de material
genético puede incluir el material genético de una bacteria (por
ejemplo, DNA y/o RNA) y el material genético de un plásmido (por
ejemplo, DNA) que está contenido dentro de las bacterias. En un
ejemplo de esta realización, puede aplicarse al medio una muestra
húmeda de las bacterias que contienen el plásmido y dejarla secar.
Después del secado, y típicamente antes del análisis del material
genético, se separan el material genético de las bacterias y el
plásmido.
Tanto el material genético bacteriano como el
material genético del plásmido pueden separarse del medio y el
material genético que permanece sobre el medio analizarse in
situ y/o el material genético separado del medio analizarse por
separado del medio. En un ejemplo, el material genético del plásmido
puede separarse del medio y el material genético bacteriano dejarse
sobre el medio. Si se desea analizar el material genético del
plásmido, el plásmido puede eluirse dentro de una solución de
elución a partir de la cual puede llevarse a cabo el análisis
posterior del material genético del plásmido. Como alternativa, si
se desea analizar el material genético de las bacterias, una vez
que el material genético del plásmido se ha separado del medio, el
material genético bacteriano puede analizarse in situ sobre
el medio.
De acuerdo con el ejemplo anterior, para separar
el material genético del plásmido del material genético bacteriano,
puede aplicarse una solución de limpieza para separar los
componentes de la muestra bruta que están presentes sobre el medio
y los cuales pueden interferir con, o no son necesarios para, el
análisis del material genético. La solución de limpieza puede estar
seguida por una solución de lavado. Posteriormente, puede aplicarse
una solución de elución para separar el material genético de la
fuente(s) seleccionada para ser separada sin separar
substancialmente el material genético seleccionado para permanecer
sobre el medio.
Tal como se usa aquí, una "solución de
limpieza" proporciona la separación del material no genético. El
material no genético incluye constituyentes de la muestra tales
como proteínas, grasas, residuos celulares, ácidos tecoicos
bacterianos, taninos de plantas, otros productos de plantas
secundarios o componentes del medio tales como agentes
desnaturalizantes de proteínas (por ejemplo, detergentes; urea;
sales guanidio, tales como tiocianato de guanidina, isotiocianato
de guanidina, clorhidrato de guanidina; yoduro sódico; agentes
quelantes tales como EDTA; trampas de radicales libres tales como
ácido úrico o una sal de urato, tiocianato de guanidina, etc.;
agentes protectores; etc. En algunas realizaciones, tal como durante
la preparación de plásmidos, la solución de limpieza puede
proporcionar igualmente la separación de RNA, por ejemplo, mediante
la destrucción selectiva de RNA en solución alcalina.
En una realización, la solución de limpieza
puede ser una "solución alcalina, parcialmente acuosa" (PAA).
Tal como se usa aquí, una solución "PAA" incluye un disolvente
miscible en agua (por ejemplo, alcohol, metanol, etanol, propanol,
butanol, sus dioles o polioles isómeros, etc.; acetona, etc.) en
combinación con una fuente de pH alto. Cuando el disolvente
miscible en agua es alcohol etanol, las concentraciones de etanol
pueden ser aproximadamente 30 hasta 90%, típicamente
aproximadamente 45% hasta 70%. Generalmente, una fuente de "pH
alto" proporciona un pH de solución PAA de aproximadamente 9,0
hasta 13, preferiblemente aproximadamente 11. Los ejemplos de
fuentes de pH alto incluyen: NaOH, KOH, LiOH, hidróxido con base
nitrógeno cuaternario, aminas terciaria, secundaria o primaria,
etc. Una PAA preferida puede funcionar como un agente
desnaturalizante así como un disolvente para solubilización y
separación de proteína del medio.
En un ejemplo de separación de DNA plásmido y
mantenimiento de DNA bacteriano sobre el medio sólido, la
reticulación complementaria y el tamaño relativo del DNA bacteriano
facilita la retención al medio sólido. Sin embargo, es previsible
que las secuencias de DNA o las secuencias NA péptidas (PNA) que
unen covalentemente al medio pueden ser usadas para potenciar la
unión diferencial de una fuente de material genético sobre otra.
Igualmente, puede proporcionarse la unión potenciada de un tipo de
material genético frente a otro mediante la incorporación de
algunas características de fase inversa al medio. Dichas
características de fase inversa pueden ser proporcionadas, por
ejemplo, siliconizando ligeramente un medio hidrófobo o uniendo
grupos bencilo, naftilo o similares.
Tal como se usa aquí, una "solución de
lavado" proporciona la separación de material no genético que
permanece después de la separación de la solución de limpieza así
como la separación o neutralización de componentes de la solución
de limpieza. Generalmente, una solución de lavado puede comprender
el disolvente miscible en agua de la solución de limpieza. De
acuerdo con ello, esta incluye alcoholes tales como metanol, etanol,
propanol, butanol, sus dioles o polioles isómeros, etc; acetona,
etc. La solución de lavado puede estar o bien sin tamponar o bien
contener un tampón a pH neutro o ligeramente por debajo de pH 7,0.
Cuando se encuentra presente, un tampón adyuva en la neutralización
del álcali de la solución de limpieza. La composición del tampón se
selecciona de manera que las trazas del tampón que son arrastradas
a través del procedimiento de preparación sean compatibles con la
posterior aplicación del material genético. Por ejemplo, los
tampones Tris y EDTA son adecuados si el uso final del DNA es para
estar en forma de una solución en tampones que contienen EDTA. Sin
embargo, un tampón preferido para uso general es acetato amónico a
concentraciones entre 5 mM y 100 mM, con o sin una pequeña cantidad
de EDTA, por ejemplo, EDTA 0,1 mM.
Tal como se usa aquí, una "solución de
elución" es una solución que separa selectivamente el material
genético de una o más fuentes a partir del medio sin separar
substancialmente otras fuentes. Tal como se usa aquí
"substancialmente" significa que aunque la separación de la
fuente(s) de material genético seleccionado a separar y la
fuente(s) seleccionadas para permanecer pueda no ser
perfecta, la separación es suficiente para proporcionar resultados
analíticos fiables del material genético a analizar. En una
realización típica, la solución de elución es una solución de
elución salina. Los ejemplos de soluciones de elución salinas
adecuadas incluyen ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), citrato
sódico, acetato, tampón Tris EDTA (TE), acetato amónico (por
ejemplo, concentración 10 mM), etc. El tampón Tris EDTA puede
prepararse combinando base libre de Tris 10 mM y EDTA 1 mM, y
ajustando a pH 8 con HCl.
En una realización, la solución de elusión puede
contener igualmente acetona etanólica, metanol, propanol, butanol,
etc. y sus dioles y polioles isómeros. Los componentes anteriores
pueden estar presentes en niveles más bajos que los contenidos en
la solución de limpieza y/o lavado, por ejemplo, 0% hasta 55% v/v.
La concentración preferida de estos componentes para extracción no
selectiva es, sin embargo, de 0%.
Después de la aplicación de la solución de
elución, el material genético a eluir a partir del medio, puede ser
eluido usando procedimientos tales como centrifugación, vacío,
difusión, electroforesis y electro-ósmosis.
La invención se describirá adicionalmente con
referencia a los Ejemplos siguientes. Debería darse por entendido
que los Ejemplos no están destinados a limitar la invención, sino
más bien únicamente a clarificar el procedimiento de la
invención.
Ejemplo
1
El procedimiento de este Ejemplo es ventajoso
para usar cuando son necesarios una pequeña cantidad de plásmidos a
partir de grandes números de muestras tal como, por ejemplo, cuando
la secuenciación de grandes números de plásmidos. De acuerdo con
este Ejemplo, se minimiza la manipulación al mismo tiempo que puede
incrementarse el tiempo consumido por el procedimiento. Todas las
operaciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente (es decir,
aproximadamente 20ºC).
Se centrifugaron 1 ml de cultivos de cepa DH10B
de Escherichia coli (E. coli) conteniendo plásmidos
pBC-SR durante 5 minutos a 150.000 rpm. Cada
gránulo centrifugado se recogió en 10:1 de agua con una traza de
azul de bromocresol como indicador de la posición y, a
continuación, se depositó sobre una pieza de papel FTA® (disponible
de Fitzco, Inc., Plymouth, MN) en forma de una mancha azul, se dejó
secar y se almacenó en seco.
Se sacaron recortes de 3 x 2 mm procedentes de
las manchas de plásmidos coloreados sobre papel FTA® y se
introdujeron en un tubo vacío. Sobre los discos se agregó 1 ml de
una solución de limpieza de NaOH 0,1 M en etanol al 52,5% v/v y, a
continuación, se agitó suavemente para lavar e hidrolizar durante 40
minutos.
La solución de limpieza se aspiró y se agregó
una solución de lavado de 1,0 ml de etanol al 95% y se agitó
suavemente a temperatura ambiente y, a continuación, se secó.
Se aplicó una solución de elución de 15:1 de
tris EDTA 5 mM a pH 8,3 al disco y se dejó durante una noche a 4ºC
para permitir la elución del plásmido. La solución de elución y el
eluyente se separaron del tubo. El producto se electroforetizó
sobre gel de agarosa al 1% y se visualizó con bromuro de etidio
mediante tecnología convencional. Se observaron bandas de plásmido
débiles pero claras con la movilidad esperada y con un brillo
indicativo de un rendimiento satisfactorio para la muy pequeña
cantidad de material de partida.
Ejemplo
2
Este Ejemplo es ventajoso para usar cuando son
necesarias mayores cantidades de plásmidos, como por ejemplo,
cuando ha de llevarse a cabo el mapaje de restricción. Este Ejemplo
usa la decantación por centrifugación para separar soluciones del
papel en lugar de largos períodos de difusión, La decantación por
centrifugación se realizó a 2.500 rpm y cada decantación consumió 5
minutos más para la centrifugación. Todas las operaciones se
llevaron a cabo a temperatura ambiente (20ºC).
Una mancha de E. coli conteniendo el
plásmido, la cual se había mantenido durante 6 días sobre papel FTA®
tal como se ha descrito en el Ejemplo 1, se cortó en 4 secciones y
una de las cuatro secciones, de 4 mm cuadrados aproximadamente, se
colocó en un aparato adecuado para la decantación por centrifugación
(por ejemplo, un tubo de ensayo con un agujero en el fondo, dentro
de otro tubo que recoge el eluato) y se recolectaron los eluatos
centrifugados. Otros sistemas adecuados para decantación resultarán
obvios para los expertos en la técnica.
Se aplicó 4 veces solución de limpieza 150:1
durante aproximadamente 2,5 minutos cada vez. La solución de
limpieza estaba formada por alcohol al 62% y el resto agua con una
composición total para el agua más el alcohol de NaOH 0,1 M. La
sección se lavó dos veces durante aproximadamente 2 minutos cada vez
usando 150:1 de alcohol al 95%/agua. El tiempo transcurrido de
limpieza y lavado, incluyendo el tiempo de centrifugación, fue
aproximadamente de 1 hora. Se aplicó una solución de elución 15:1
de tampón TE durante 1 minuto seguido de centrifugación.
El producto observado en el tampón TE se
electroforetizó sobre gel de agarosa al 1% y se visualizó con
bromuro de etidio mediante tecnología convencional. Se observaron
bandas de las clases de tamaño esperadas con intensidades
apropiadas para la cantidad de E. coli del que procedían.
Ejemplo
3
El presente Ejemplo describe la purificación de
una muestra de DNA de sangre almacenado sobre un medio sólido y la
posterior separación del DNA del medio sólido.
Un disco de 6 mm de sangre seca (aproximadamente
16 \mul) se aplicó previamente a papel FTA® disponible de Fitzco,
Inc., Plymouth, MN. La muestra se lavó dos veces con una solución de
limpieza de 1,0 ml de NaCO_{3} 0,3 M a temperatura ambiente. El
primer lavado fue durante 30 minutos seguido de aspiración y el
segundo lavado durante 20 minutos seguido de aspiración y
centrifugación. A continuación, la muestra se lavó con ácido acético
50 mM durante aproximadamente 2 minutos seguido decantación por
centrifugación y secado por calentamiento durante 10 minutos a
99ºC. Posteriormente, se aplicaron a la muestra 20 \mul de
NaCO_{3} 15 mM a 99ºC durante 2-2,5 minutos y, a
continuación, se eluyó con 2 partes alícuotas de 50 \mul de agua.
El eluyente se congeló en lotes de 10 \mul y posteriormente se
analizó con éxito mediante reacción en cadena de la
polimerasa
(PCR).
(PCR).
Ejemplo
4
Se recortó un disco de 6 mm de una muestra de
sangre almacenada sobre papel FTA®. El material no genético (en
particular proteínas y componentes del papel FTA®) se limpió con
agitación suave del disco con 2 lavados de 500 \mul de NaCO_{3}
0,3 M. El primer lavado fue de 25 minutos (suficientemente largo
para embeber la sangre). El segundo lavado fue de 10 minutos y,
posteriormente, la muestra se decantó por centrifugación.
La solución de limpieza se separó mediante
lavado y decantación por centrifugación con 3 partes alícuotas de
200 \mul cada una de agua. La muestra se expuso al agua durante 1
a 2 minutos entre cada lavado. Al llegar a este punto, el color de
la sangre del disco se había perdido substancialmente.
Se aplicó ácido bórico 2 mM en una cantidad
suficiente para mojar cada disco (aproximadamente 14 \mul) y se
introdujo en un autoclave de laboratorio a
121-124ºC. El autoclave se fijó para ciclo húmedo a
una presión aproximada de 140 kPa. Las muestras se trataron en el
autoclave durante aproximadamente 5 a 10 minutos, típicamente
durante aproximadamente 7 minutos. Una vez alcanzada en el autoclave
la temperatura y presión ambiente, se aplicaron a cada disco 100
\mul de agua y el DNA se eluyó con dos partes alícuotas de 100
\mul de agua. Cada parte alícuota se separó de la muestra
mediante decantación por centrifugación. Posteriormente, el DNA
recolectado se analizó mediante PCR.
Durante el uso de este procedimiento, debería
tenerse cuidado de no dañar el DNA por unos tiempos excesivos de
tratamiento en autoclave. Una vez eluido el DNA, debería
mantenérsele enfriado, protegido mediante la adición de TE o un
tampón alcalino similar con una pequeña cantidad de EDTA, o bien
usarse inmediatamente.
Claims (20)
1. Un procedimiento para la separación de un
material genético seleccionado a partir de una muestra bruta que
contiene material genético aplicado a un medio sólido, comprendiendo
el procedimiento una etapa de:
- aplicación de una solución de limpieza que es
una solución alcalina, parcialmente acuosa, la cual incluye un
disolvente miscible en agua en combinación con una fuente de pH alto
para proporcionar una solución de limpieza de pH 9,0 hasta 13 a la
muestra de material genético sobre el medio sólido, destruyendo la
solución el RNA en la muestra;
- aplicación de una solución de elución a la
muestra de material genético sobre el medio sólido; y
- recolección del material genético en la
solución de elución.
2. Un procedimiento de acuerdo con la
Reivindicación 1, en el que la muestra bruta incluye material
genético procedente de múltiples fuentes.
3. El procedimiento de acuerdo con la
Reivindicación 1, en el que el material genético seleccionado además
se analiza mediante reacción en cadena de la polimerasa.
4. El procedimiento de acuerdo con la
Reivindicación 1, en el que el material genético seleccionado además
se analiza mediante polimorfismo de tamaño de los fragmentos de
restricción.
5. El procedimiento de acuerdo con la
Reivindicación 1, en el que se analiza el material genético no
separado del medio sólido.
6. El procedimiento de acuerdo con la
Reivindicación 5, en el que el material genético no separado del
medio sólido se analiza mediante reacción en cadena de la
polimerasa in situ.
7. El procedimiento de acuerdo con la
Reivindicación 1, en el que el medio sólido comprende:
- una matriz sólida, y
- un agente desnaturalizante de proteínas.
8. El procedimiento de acuerdo con la
Reivindicación 7 que comprende además una trampa de radicales
libres.
9. El procedimiento de acuerdo con la
Reivindicación 8, en el que el agente desnaturalizante de proteínas
es un detergente y la trampa de radicales libres es ácido úrico o
una sal de urato.
10. El procedimiento de acuerdo con la
Reivindicación 8, en el que el agente desnaturalizante de proteínas
y la trampa de radicales libres es tiocianato de guanidina.
11. El procedimiento de acuerdo con la
Reivindicación 8, en el que el agente desnaturalizante de proteínas
es clorhidrato de guanidina y la trampa de radicales libres es ácido
úrico o una sal de urato.
12. El procedimiento de acuerdo con la
Reivindicación 7, en el que el agente desnaturalizante de
proteínas es una sal de guanidinio.
proteínas es una sal de guanidinio.
13. El procedimiento de acuerdo con la
Reivindicación 8, en el que la trampa de radicales libres es
tiocianato de guanidina.
14. El procedimiento de acuerdo con la
Reivindicación 8, en el que el agente desnaturalizante de proteínas
es urea y la trampa de radicales libres es ácido úrico o una sal de
urato.
15. Un kit para la realización del procedimiento
de acuerdo con la Reivindicación 1, comprendiendo el kit:
- un medio sólido;
- una solución de limpieza que es una solución
alcalina, parcialmente acuosa, la cual incluye un disolvente
miscible en agua que es un alcohol en combinación con una fuente de
pH alto para proporcionar una solución de limpieza de pH 9,0 hasta
13, destruyendo la solución el RNA en la muestra; y
- una solución de elución,
en el que el kit no comprende la
combinación de un medio sólido que es una placa de capa espesa de
gel de sílice, una solución de limpieza que es una mezcla de
isopropanol/amoníaco/agua en una relación de 7:1:2, y una solución
de elución que es
agua.
16. El kit de acuerdo con la Reivindicación 15,
en el que la solución de limpieza comprende etanol e hidróxido
sódico.
17. El kit de acuerdo con la Reivindicación 15,
en el que la solución de elución es una solución de elución
salina.
18. El kit de acuerdo con la Reivindicación 17,
en el que la solución salina comprende acetato amónico 10 mM.
19. El kit de acuerdo con la Reivindicación 17,
en el que la solución salina comprende bicarbonato amónico 10
mM.
20. Un procedimiento para la separación de
material genético de un plásmido a partir de material genético de
una bacteria aplicado como una muestra a un medio sólido,
comprendiendo el procedimiento:
- aplicación de una muestra que incluye la
bacteria que contiene el plásmido a un medio sólido;
- aplicación de una solución de limpieza que es
una solución alcalina, parcialmente acuosa, la cual incluye un
disolvente miscible en agua en combinación con una fuente de pH alto
para proporcionar una solución de limpieza de pH 9,0 hasta 13 a la
muestra sobre el medio sólido, destruyendo la solución el RNA en la
muestra;
- aplicación de una solución de lavado a la
muestra sobre el medio sólido;
- aplicación de una solución de elución a la
muestra de material genético sobre el medio sólido; y
- recolección del material genético seleccionado
de la bacteria y del plásmido en las soluciones de elución.
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