ES2163865T5 - Aislamiento en fase solida de acidos nucleicos. - Google Patents
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Abstract
Un método para detectar la presencia o ausencia de una célula diana eucariótica o procariótica en una muestra, comprendiendo dicho método: (a) proporcionar un soporte sólido en partículas y mezclarlo con la muestra y permitir la unión de las células en dicha muestra al soporte sólido, para aislar células de la muestra; (b) lisar las células aisladas; (c) unir el ácido nucleico liberado de dichas células lisadas al mismo dicho soporte sólido; y (d) detectar la presencia o ausencia de ácido nucleico característico de dichas células diana dentro de dicho ácido nucleico unido.
Description
Aislamiento en fase sólida de ácidos
nucleicos.
La presente invención se refiere a métodos para
la detección de la presencia o ausencia de células procarióticas o
eucarióticas, y especialmente a un método que combina una etapa de
aislamiento de células en fase sólida con una etapa de aislamiento
de DNA en fase sólida.
El aislamiento de ácidos nucleicos es una etapa
importante en muchos procedimientos bioquímicos y diagnósticos. Por
ejemplo, la separación de ácidos nucleicos de las mezclas complejas
en las que se encuentran habitualmente, es necesaria frecuentemente
antes de que puedan llevarse a cabo otros estudios y procedimientos,
por ejemplo detección, clonación, secuenciación, amplificación,
hibridación, síntesis de cDNA, etc.; la presencia de grandes
cantidades de materiales contaminantes celulares o de otro tipo, por
ejemplo proteínas o carbohidratos, en dichas mezclas complejas,
frecuentemente impide muchas de las reacciones y técnicas utilizadas
en biología molecular. Además, el DNA puede contaminar
preparaciones de RNA y viceversa. Así, se demandan métodos
para el aislamiento de ácidos nucleicos de mezclas complejas tales
como células, tejidos etc., no solo desde el punto de vista
preparativo, sino también desde el de muchos métodos utilizados hoy
día, que están basados en la identificación de DNA o RNA, por
ejemplo, el diagnóstico de infecciones microbianas, la ciencia
forense, el tipaje de tejidos y sangre, la detección de variaciones
genéticas, etc.
La utilización de identificación de DNA o RNA
está actualmente ampliamente aceptada como método para distinguir
entre diferentes células o tipos celulares, o entre variantes del
mismo tipo celular que contienen mutaciones de DNA. Así el tipaje
HLA, que se realiza más comúnmente mediante identificación de
antígenos de superficie característicos utilizando anticuerpos,
puede hacerse alternativamente mediante identificación del DNA que
codifica para dichos antígenos. La infección microbiana o
contaminación puede identificarse mediante análisis de ácidos
nucleicos para detectar el organismo diana, mejor que apoyándose en
la detección de datos característicos de las células del
microorganismo, por ejemplo morfológicas o bioquímicas. Las
variaciones genéticas pueden identificarse por métodos
similares.
En general, el DNA o RNA se identifican mediante
hibridación a uno o más oligonucleótidos, bajo condiciones
suficientemente rigurosas para asegurar un bajo nivel de unión no
específica. Habitualmente, los nucleótidos de hibridación se
utilizan en parejas, como cebadores en las diversas formas de
amplificación in vitro actualmente disponibles,
principalmente la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), pero
también en la Reacción de Amplificación de Ligasa (LAR), la
Replicación de Secuencias Automantenida (3SR), y el sistema de
amplificación de la Q-beta replicasa. Después de la
amplificación, el DNA puede posteriormente caracterizarse mediante
secuenciación, por ejemplo, mediante el método de Sanger. La
amplificación y la secuenciación pueden combinarse.
Como se ha mencionado antes, todos los métodos
requieren generalmente una etapa inicial de aislamiento de ácido
nucleico, para separar el ácido nucleico de materiales como por
ejemplo proteínas, que pueden interferir en las técnicas de
hibridación y amplificación que se utilizan.
Se conocen una variedad de métodos para el
aislamiento de ácidos nucleicos, pero generalizando, éstos están
basados en una compleja serie de etapas de extracción y lavado, que
consumen tiempo y son laboriosos de realizar.
Los métodos clásicos para el aislamiento de
ácidos nucleicos, a partir de materiales iniciales complejos tales
como sangre o productos sanguíneos o tejidos, incluyen lisis de los
materiales biológicos mediante un detergente o caotropo,
posiblemente en presencia de enzimas degradantes de proteínas,
seguida por varias extracciones con solventes orgánicos, por
ejemplo fenol y/o cloroformo, precipitación con etanol,
centrifugación y diálisis de los ácidos nucleicos. Estos métodos no
solo son engorrosos de realizar y consumen tiempo, sino que además,
el relativamente gran número de etapas requeridas aumenta el riesgo
de degradación, la pérdida de muestra, o la contaminación cruzada
de muestras cuando se están procesando varias muestras
simultáneamente.
Por lo tanto, continuamente se busca mejorar los
métodos para aislar ácidos nucleicos, y más recientemente, se han
propuesto otros métodos que están basados en la utilización de una
fase sólida. En la Patente
US-A-5.234.809, por ejemplo, se
describe un método en el que los ácidos nucleicos se unen a una fase
sólida en forma de partículas de sílice, en presencia de un agente
caotrópico como una sal de guanidinio, y así se separan del resto de
la muestra. La Patente WO 91/12079 describe un método en el que el
ácido nucleico es atrapado sobre la superficie de una fase sólida
mediante precipitación. Generalizando, se utilizan alcoholes y sales
como precipitantes.
La Patente
WO-A-9207863 describe métodos para
aislar ácidos nucleicos que incluyen:
- a)
- inmovilizar las células en una matriz
- b)
- lisar las células
- c)
- fijar el ácido nucleico sobre la superficie de la matriz, y
- d)
- eluír los ácidos nucleicos.
La "matriz" de la Patente
WO-A-9207863 puede componerse de un
lecho de partículas, holgadamente agregadas, de tal forma que los
espacios entre ellas son de un tamaño adecuado para atrapar las
células. La superficie de la matriz puede poseer propiedades de
intercambio iónico, que permita la unión reversible de los ácidos
nucleicos a la superficie. No se describe la unión de las células a
la matriz. DE 195 20398 A1 describe un tipo de partícula magnética
que tiene una superficie externa de vidrio. Se sugiere en este
documento y se muestra en la Fig. 1 un método de aislamiento de
ácidos nucleicos que usa dos tipos de estas partículas. El primero
que lleva anticuerpos para unirse a células y un segundo grupo para
unirse a ácidos nucleicos.
Aunque estos métodos agilizan el proceso de
separación de ácidos nucleicos, todavía existe la necesidad de
métodos que sean más rápidos y sencillos de realizar, que permitan
obtener buenos rendimientos sin pérdidas, y en particular que sean
fácilmente utilizables para aislar ácidos nucleicos de células en
mezclas o en ambientes en los que pueden estar presentes a bajas
concentraciones, como una primera etapa preparatoria en el
aislamiento de ácidos nucleicos de células diana, en procedimientos
de detección de células basados en ácidos nucleicos. La presente
invención contesta esta necesidad. En particular, aunque las
técnicas basadas en hibridación, tales como la PCR y otros métodos
basados en ácidos nucleicos para detectar microorganismos, permiten
una elevada sensibilidad de detección de células en muestras, la
preparación de la muestra, es decir, la concentración de las
células diana y la purificación de ácido nucleico, son factores
cruciales para alcanzar la elevada sensibilidad y reproducibilidad
del método. En el momento actual, las células habitualmente se
aíslan primero de la muestra mediante filtración, centrifugación o
unión por afinidad a anticuerpos pegados a una fase sólida. Después
de la concentración celular realizada de esta forma, se purifica el
DNA de las células concentradas, frecuentemente mediante los
métodos de extracción clásicos con fenol/cloroformo, como se explicó
antes, con las desventajas señaladas.
Nosotros proponemos ahora una nueva aproximación
a este problema, que integra el aislamiento de células y la
purificación de ácido nucleico en una "etapa" única, mediante
la utilización de la misma fase sólida tanto para la adsorción
celular como para la purificación de ácido nucleico. Esto se
consigue mediante la unión de las células a un soporte sólido como
primera etapa. El mismo soporte sólido se utiliza entonces bajo
condiciones que lisan las células unidas, lo que permite al ácido
nucleico unirse al soporte.
De esta manera el ácido nucleico puede aislarse
de una muestra de una forma adecuada para detección, mediante un
procedimiento sencillo y rápido de realizar, que lleva menos de 45
minutos.
En un aspecto, la presente invención proporciona
así un método para detectar la presencia o ausencia de una célula
diana eucariótica o procariótica en una muestra, comprendiendo dicho
método:
- a)
- proporcionar un soporte sólido en partículas y mezclarlo con la muestra y permitir la unión de células en dicha muestra al soporte sólido, para aislar células de la muestra;
- b)
- lisar las células aisladas;
- c)
- unir el ácido nucleico liberado por dichas células lisadas a dicho mismo soporte sólido; y
- d)
- detectar la presencia o ausencia de un ácido nucleico característico de dichas células diana dentro de dicho ácido nucleico unido.
El ácido nucleico puede ser DNA, RNA o
cualquiera de sus modificaciones naturales o sintéticas, y sus
combinaciones. Preferiblemente, sin embargo, el ácido nucleico será
DNA, que puede ser de cadena sencilla o doble, o en cualquier otra
forma, por ejemplo linear o circular.
El término "célula" se utiliza aquí para
incluir todas las células procarióticas (incluyendo arqueobacterias)
y eucarióticas. "Células" representativas incluyen por lo tanto
todos los tipos de células animales de mamíferos y no mamíferos,
células de plantas, protoplastos, bacterias y protozoos.
La muestra puede ser por lo tanto cualquier
material que contenga ácido nucleico dentro de dichas células,
incluyendo por ejemplo alimentos y productos relacionados, muestras
clínicas y ambientales. Así, la muestra puede ser una muestra
biológica, que puede contener células procarióticas o eucarióticas y
protoplastos. Dichos materiales biológicos pueden por lo tanto
comprender todos los tipos de células animales de mamíferos y no
mamíferos, células de plantas, algas, incluyendo las algas
azul-verde, hongos, bacterias, protozoos etc.
Muestras representativas incluyen, por lo tanto, sangre completa y
productos derivados de la sangre tales como plasma o capa
plasmática de células blancas, orina, heces, líquido cefalorraquídeo
o cualquier otro fluido corporal, tejidos, cultivos celulares,
suspensiones celulares etc., y también muestras ambientales tales
como suelo, agua, o muestras de alimentos.
La muestra puede incluir también materiales de
comienzo relativamente puros o parcialmente purificados, tales como
preparaciones semi-puras obtenidas mediante otros
procedimientos de separación celular.
La unión de las células a un soporte sólido
puede conseguirse de cualquier forma conocida o conveniente. Por
ejemplo, puede conseguirse unión no específica de las células al
soporte mediante la selección apropiada del soporte sólido y de las
condiciones, por ejemplo la naturaleza química o física de la
superficie del soporte sólido, (por ejemplo hidrofobicidad o
carga), el pH o composición del medio de aislamiento etc. La
naturaleza de las células diana también puede jugar un papel, y se
ha demostrado, por ejemplo, que ciertas células hidrófobas pueden
unirse fácilmente no específicamente a superficies hidrófobas,
mientras que las células hidrófilas pueden unirse a superficies más
hidrófilas. También se ha observado que las células cargadas
negativamente tales como los linfocitos B, tienen un alto grado de
unión no específica a superficies débilmente cargadas
positivamente. Por lo tanto, pueden utilizarse soportes sólidos que
tengan superficies cargadas apropiadamente, para unir un tipo de
célula deseado. Pueden utilizarse soluciones de tampón apropiadas
etc., como medios para la etapa de aislamiento celular, para
obtener condiciones apropiadas para la unión celular, simplemente
poniendo en contacto el soporte sólido y la muestra en un medio
apropiado. Convenientemente, puede añadirse a la muestra, antes,
simultáneamente, o después de ponerla en contacto con el soporte
sólido, una solución de tampón de carga, osmolaridad etc.
apropiadas.
De forma ventajosa, puede obtenerse la unión no
específica de células, según la invención, mediante precipitación
de las células sobre el soporte utilizando un precipitante, por
ejemplo, poniendo en contacto las células con el soporte en
presencia de alcohol y sal, por ejemplo, mediante la adición a la
muestra de una solución de tampón que contenga alcohol y sal. La
utilización de alcohol y sal en los procedimientos de separación y
purificación tales como la precipitación, se realiza habitualmente,
y cualquier alcohol o sal utilizados en dichos procedimientos,
puede utilizarse según la presente invención. Así, el alcohol puede
convenientemente ser alcanol, y se ha encontrado que los alcanoles
inferiores como el isopropanol y el etanol, son adecuados. Otros
alcoholes adecuados incluyen el metanol y el
n-butanol.
La sal puede proporcionarse de cualquier fuente
conveniente, por ejemplo cloruro o acetato sódico o potásico, o
acetato amónico. Las concentraciones apropiadas de alcohol y sal
pueden determinarse según los sistemas y reactivos precisos
utilizados. Generalizando, se ha encontrado que la adición de 0,5 a
3 volúmenes de alcohol, por ejemplo 1 volumen, a la muestra, es
adecuado. Convenientemente, el alcohol puede utilizarse a
concentraciones de 50-100% (peso/volumen). Se ha
encontrado que la utilización de concentraciones de sal de, por
ejemplo 0,1 a 10,0 M, más particularmente 0,1 a 7,0 M, por ejemplo
0,1 a 3,0 M, es adecuada, y convenientemente puede incluirse la
sal, a las concentraciones anteriores, en la solución de alcohol. De
este modo, puede utilizarse la llamada "solución de tampón de
unión celular", conteniendo el alcohol y la sal a las
concentraciones deseadas. Alternativamente, la sal y el alcohol
pueden añadirse separadamente.
La utilización de alcohol como precipitante para
las células, según la invención, es ventajosa para utilizar el
método en procedimientos clínicos diagnósticos, ya que la
utilización de alcohol para conservar las muestras clínicas es
común. Así, las muestras de pacientes pueden sencillamente añadirse
a una solución de tampón de unión celular que contenga alcohol, y
de este modo las muestras se conservan y están listas para la
purificación de ácido nucleico.
Como alternativa a la precipitación con
sal/alcohol, pueden utilizarse otros precipitantes, por ejemplo
polietilen glicoles (PEGs) u otros polímeros de alto peso molecular
con propiedades similares, bien solos o en combinación con sal y/o
alcohol. La concentración de dichos polímeros puede variar
dependiendo del sistema preciso, por ejemplo polímero y tipo
celular, pero generalmente pueden utilizarse concentraciones entre 1
y 50% (peso/volumen), por ejemplo 2-30%.
Las células con actividad fagocítica pueden
capturarse mediante su capacidad de "unirse a" o
"tragarse" una partícula en fase sólida, por ejemplo bolas, y
pueden ser así fácilmente recolectadas. En este caso, las células
contenidas en la muestra necesitan sencillamente ponerse en contacto
o incubarse con la fase sólida bajo las condiciones apropiadas.
Este tipo de captura celular no es dependiente de unión
específica.
El soporte sólido puede también proporcionarse
con partes que ayudan en la unión no específica de células, por
ejemplo proteínas o fragmentos de proteínas o polipéptidos que se
unen no específicamente a las células. Así, por ejemplo, un soporte
sólido recubierto con, o transportando anticuerpos, se unirá a las
células no específicamente a través de los receptores Fc sobre la
superficie celular. Los métodos para inmovilizar anticuerpos y
otras proteínas o polipéptidos sobre soportes sólidos son bien
conocidos en la técnica.
Finalmente, como se mencionó antes, puede
obtenerse la unión no específica de las células a un soporte sólido
que tiene carga, superficie hidrófoba o hidrófila, mediante la
utilización de soluciones de tampón, frecuentemente en combinación
con sal, para alcanzar las condiciones de pH apropiadas para la
unión. Las soluciones de tampón y condiciones precisas variarán
dependiendo del tipo de célula, el soporte sólido etc.
Los diversos componentes se mezclan y
sencillamente se dejan estar durante un intervalo adecuado de tiempo
para permitir que las células se unan al soporte. El soporte puede
entonces retirarse de la solución por cualquier medio conveniente,
que dependerá por supuesto de la naturaleza del soporte, e incluye
todas las formas de retirada del soporte del sobrenadante de la
muestra, o viceversa, por ejemplo, centrifugación, decantación,
pipeteado etc.
Las condiciones durante este proceso no son
críticas, y se ha encontrado conveniente, por ejemplo, mezclar
sencillamente la muestra con la "solución de tampón de unión
celular", en presencia de una fase sólida, y dejarla estar a
temperatura ambiente, por ejemplo durante 5 a 30 minutos, por
ejemplo 20 minutos antes de separarlos. Como se mencionó antes, el
tiempo de reacción no es crítico y tan poco como 5 minutos puede ser
con frecuencia suficiente. Sin embargo, si fuera conveniente,
pueden utilizarse tiempos más largos, por ejemplo entre 20 minutos
y 3 horas, o incluso durante la noche. La mezcla puede hacerse por
cualquier medio conveniente, incluyendo por ejemplo, agitación
simple con agitador o vórtice. También, si se desea, pueden
utilizarse temperaturas mayores o menores, pero no son
necesarias.
Otros componentes opcionales en la composición
de "unión celular" incluyen polímeros de alto peso molecular,
por ejemplo PEGs etc., detergentes débiles no cargados, por ejemplo
Triton X-100, NP-40 etc., DNAsas y
otras enzimas, siempre y cuando dejen a las células intactas.
Las composiciones de "unión celular"
preferidas pueden, por ejemplo, comprender:
- isopropanol, acetato amónico 0,75 M
- etanol al 75%, acetato amónico 0,75 M.
Aunque se prefiere la unión no específica de
células según la invención, también es posible utilizar soportes
sólidos que han sido modificados para permitir la captura selectiva
de las células deseadas que contienen el ácido nucleico. Así, por
ejemplo, pueden utilizarse soportes que llevan anticuerpos, u otras
proteínas de unión, por ejemplo lectinas, específicos para un tipo
celular deseado. Esto puede introducir un grado de selectividad al
aislamiento de ácido nucleico, ya que solo puede separarse ácido
nucleico de una fuente diana deseada, dentro de una mezcla
compleja. Así, por ejemplo, dicho soporte puede utilizarse para
separar y remover el tipo de célula diana deseada etc. de la
muestra.
La preparación de dichas matrices de captura
celular selectiva es bien conocida en la técnica, y está descrita
en la literatura.
El soporte sólido está constituido por
partículas y tiene forma de partículas.
Convenientemente, el soporte puede hacerse de
cristal, sílice, látex o un material polimérico. Los materiales
preferidos son los que presentan un área de superficie elevada para
unión de las células, y subsecuentemente, del ácido nucleico.
Dichos soportes tendrán generalmente una superficie irregular. Se
prefieren generalmente las bolas, debido a su mayor capacidad de
unión, particularmente bolas poliméricas.
Convenientemente, un soporte sólido en forma de
partículas utilizado según la invención comprenderá bolas
esféricas. El tamaño de las bolas no es crítico, pero éstas pueden
tener por ejemplo un tamaño del orden de al menos 1 y
preferiblemente 2 \mum de diámetro, y tener un diámetro máximo de
preferiblemente no más de 10 y más preferiblemente no más de 6
\mum. Por ejemplo, las bolas de 2,8 \mum y de 4,5 \mum han
demostrado funcionar bien.
Las partículas monodispersas, esto es, aquellas
que son sustancialmente uniformes de tamaño (por ejemplo, tamaño de
diámetro con una desviación estándar de menos del 5%), tienen la
ventaja de que proporcionan una reproducibilidad de reacción muy
uniforme. Las partículas de polímero monodisperso producidas
mediante la técnica descrita en la Patente
US-A-4336173 son especialmente
adecuadas.
Bolas de polímero no magnético adecuadas para
utilizar en el método de la invención están disponibles de Dyno
Particles AS (Lillestrom, Norway) así como de Qiagen, Pharmacia y
Serotec.
Sin embargo, para ayudar en la manipulación y en
la separación, se prefieren bolas magnéticas. El término
"magnético" como aquí se utiliza significa que el soporte es
capaz de tener un momento magnético impartido al mismo, cuando se
sitúa en un campo magnético, y de esta forma puede desplazarse bajo
la acción de ese campo. En otras palabras, un soporte que comprenda
partículas magnéticas puede retirarse fácilmente mediante agregación
magnética, que proporciona una forma rápida y sencilla de separar
las partículas después de las etapas de unión celular y de ácido
nucleico, y es, con mucho, un método menos riguroso que las técnicas
tradicionales tales como centrifugación, que genera fuerzas de
rozamiento que pueden romper las células o degradar los ácidos
nucleicos.
Así, utilizando el método de la invención, las
partículas magnéticas con las células pegadas pueden removerse
sobre una superficie adecuada mediante aplicación de un campo
magnético, por ejemplo, utilizando un imán permanente. Generalmente
es suficiente aplicar un imán a uno de los lados de un vaso que
contenga la mezcla de la muestra para agregar las partículas en la
pared del vaso, y verter fuera el resto de la muestra.
Las partículas supermagnéticas son especialmente
preferidas, por ejemplo las descritas por Sintef en el Documento
EP-A-106873, ya que pueden evitarse
la agregación y aglutinación magnéticas de las partículas,
asegurando así una extracción de ácido nucleico uniforme. Las bien
conocidas partículas magnéticas vendidas por Dynal AS (Oslo,
Noruega) como DYNABEDS, son particularmente adecuadas para
utilización en la presente invención.
Pueden prepararse bolas recubiertas
funcionalizadas para utilizar en la presente invención mediante
modificación de las bolas según las patentes de EE.UU. 4.336.173,
4.459.378 y 4.654.267. Así, pueden prepararse bolas, u otros
soportes, que tengan diferentes tipos de superficie funcionalizada,
por ejemplo, cargada positivamente o negativamente, hidrófila o
hidrófoba.
Diferentes células que exhiban diferentes grados
de unión no específica a diferentes superficies y soportes, pueden
ser ventajosas para "titular" la cantidad de soporte sólido
(por ejemplo el número de partículas), por unidad de volumen, para
optimizar las condiciones de unión celular, y para determinar el
área óptima de soporte, por ejemplo concentración de partículas
para un sistema dado.
Después de la unión celular, las células
aisladas o unidas al soporte se lisan para liberar su ácido
nucleico. Los método de lisis celular son bien conocidos en la
técnica y ampliamente descritos en la literatura, y puede
utilizarse cualquiera de los métodos conocidos. Diferentes métodos
pueden ser más apropiados para diferentes células, pero uno de los
siguientes métodos podría, por ejemplo, utilizarse: lisis por
detergente utilizando, por ejemplo, SDS, LiDS o sarcosil en
soluciones de tampón apropiadas; la utilización de caotropos tales
como Hidrocloruro de Guanidio (GHCl), Tiocianato de Guanidio (GTC),
yoduro sódico (NaI), perclorato etc.; disrupción mecánica, tal como
mediante prensa francesa, sonicación, pulverización con bolas de
cristal, alúmina o en nitrógeno líquido; lisis enzimática, por
ejemplo utilizando lisozima, proteinasas, pronasas o celulasas o
cualquier otra enzima de lisis disponible comercialmente; lisis de
células mediante infección por bacteriófago o virus; congelación
seca; choque osmótico; tratamiento en microondas; tratamiento
mediante temperatura, por ejemplo calentamiento o ebullición, o
congelación, por ejemplo, en hielo seco o nitrógeno líquido, y
descongelación; lisis alcalina. Como se mencionó antes, todos estos
métodos son técnicas estándar de lisis y son bien conocidos por los
expertos, y puede utilizarse uno cualquiera de dichos métodos o
combinación de métodos.
Convenientemente, puede obtenerse la lisis según
la presente invención, mediante utilización de caotropos y/o
detergentes. Por ejemplo, en el caso de células bacterianas, se ha
encontrado particularmente eficaz la combinación de un caotropo
con un detergente. Así, un ejemplo de agente de lisis adecuado
incluye un caotropo tal como GTC o GHCl y un detergente como SDS o
Sarkosyl. Los agentes de lisis pueden suministrarse en simple
solución acuosa, para formar la llamada "solución de tampón de
lisis". Puede utilizarse cualquier solución de tampón adecuada,
incluyendo por ejemplo Tris, Bicina, Tricina y soluciones de tampón
de fosfato. Alternativamente, los agentes de lisis pueden añadirse
separadamente. Las concentraciones adecuadas y las cantidades de
agentes de lisis variarán según el sistema preciso, la naturaleza
de las células, etc., y pueden determinarse apropiadamente, pero
pueden utilizarse concentraciones de, por ejemplo, 2 M a 7 M de
caotropos tales como GTC, GHCl, NaI o perclorato, 0,1 M a 1 M de
agentes alcalinos tales como NaOH, y 0,1 a 50% (peso/volumen), por
ejemplo, 0,5 a 15% de detergente. Así, un ejemplo de una solución de
tampón representativa adecuada incluye una solución acuosa de GTC 4
M, 1% (peso/volumen) de sarkosyl.
Para llevar a cabo el método de la invención,
las células aisladas, unidas a soporte, pueden convenientemente
removerse o separarse del resto de la muestra, concentrando o
enriqueciendo así las células. Así, la etapa de unión celular sirve
para enriquecer las células o para concentrarlas en un volumen más
pequeño que el de la muestra inicial. La lisis puede obtenerse
convenientemente mediante la adición de una solución de tampón de
lisis apropiada, que contenga los agentes de lisis deseados, o
sometiendo a las células aisladas a las condiciones de lisis
deseadas. Por ejemplo, en el caso de la simple adición de una
solución de tampón de lisis que contenga los agentes de lisis
apropiados, las células aisladas pueden simplemente incubarse en
presencia de la solución de tampón de lisis durante un intervalo
adecuado para permitir que la lisis tenga lugar. Diferentes
condiciones de incubación pueden ser apropiadas para diferentes
sistemas de lisis, y son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo,
para una solución de tampón de lisis que contenga detergente y/o
caotropo, la incubación puede tener lugar a temperatura ambiente o
a mayor temperatura, por ejemplo 37ºC o 65ºC. Del mismo modo, el
tiempo de incubación puede variarse desde unos pocos minutos, por
ejemplo 5 o 10 minutos, a horas, por ejemplo 1 a 2 horas. En el
caso de soluciones de tampón de lisis GTC/Sarkosyl y células
bacterianas, se ha encontrado apropiada la incubación a, por
ejemplo 65ºC durante 10-20 minutos, pero esto puede
por supuesto variarse según las necesidades. Para la lisis
enzimática, por ejemplo utilizando proteinasa K etc., pueden
requerirse tiempos más largos, por ejemplo durante la noche.
Después de la lisis, el ácido nucleico liberado
se une al mismo soporte al que están unidas las células. Esta unión
de ácido nucleico puede conseguirse de cualquier forma conocida en
la técnica de unir ácido nucleico a un soporte sólido.
Convenientemente, el ácido nucleico se une inespecíficamente al
soporte, es decir, independientemente de la secuencia. Así, por
ejemplo el ácido nucleico liberado puede precipitarse sobre el
soporte, utilizando uno cualquiera de los precipitantes para ácido
nucleico conocidos, por ejemplo alcoholes, combinaciones de
alcohol/sal, polietilenglicoles (PEGs) etc. La precipitación de
ácidos nucleicos de esta manera sobre bolas se describe por ejemplo
en le Documento WO 91/12079. Así, puede añadirse sal al soporte y el
ácido nucleico liberado en solución, seguido de la adición de
alcohol, con lo que se produce la precipitación del ácido nucleico.
Alternativamente, la sal y el alcohol pueden añadirse juntos, o
puede omitirse la sal. Como se describió antes en relación con la
etapa de unión celular, cualquier alcohol o sal adecuados puede
utilizarse, y las cantidades o concentraciones apropiadas puede
determinarse fácilmente.
Técnicas alternativas de unión inespecífica de
ácido nucleico incluyen la utilización de detergentes como se
describe en el Documento WO 96/18731 de Dynal AS (el procedimiento
denominado "DNA directo"), y la utilización de caotropos y una
fase sólida de unión a ácido nucleico tal como partículas de sílice
como describe Akzo N.V. en el Documento
EP-A-0389063.
La unión iónica del ácido nucleico al soporte
puede obtenerse mediante la utilización de un soporte sólido que
tenga una superficie cargada, por ejemplo un soporte recubierto de
poliaminas.
El soporte que se utilice en el método de la
invención también puede tener grupos funcionales para ayudar en la
unión específica o inespecífica del ácido nucleico, por ejemplo
proteínas de unión a DNA, por ejemplo cremalleras leucina o
histonas o tinciones intercalantes (por ejemplo bromuro de etidio o
Hoechst 42945), con los que puede recubrirse el soporte.
Del mismo modo, puede proporcionarse el soporte
con copartícipes de unión para ayudar a la captura selectiva de los
ácidos nucleicos. Por ejemplo, pueden utilizarse secuencias de DNA o
RNA complementarias, o proteínas de unión a DNA, o proteínas
virales que se unan a ácido nucleico viral. La adhesión de dichas
proteínas al soporte sólido puede obtenerse utilizando métodos bien
conocidos en la técnica.
Un método conveniente de precipitar el ácido
nucleico según la invención, es la adición de un precipitante, por
ejemplo alcohol, a la mezcla que contiene el soporte y las células
lisadas. Así, puede sencillamente añadirse un volumen apropiado de
alcohol, por ejemplo etanol al 100% o al 96%, a la mezcla, que se
incuba durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que el
ácido nucleico liberado se una al soporte. Las condiciones de
incubación para esta etapa no son críticas, y pueden sencillamente
comprender la incubación durante 5-10 minutos a
temperatura ambiente. Sin embargo, la cantidad de tiempo puede
variar, y la temperatura puede aumentarse según la elección.
Aunque no es necesario, puede ser conveniente
introducir una o más etapas de lavado al método de aislamiento de
la invención, por ejemplo después de la etapa de unión de ácido
nucleico. Puede utilizarse cualquier solución de tampón de lavado
convencional u otro medio. Generalizando, se prefieren soluciones de
tampón de fuerza iónica moderada, por ejemplo
Tris-HCl 10 mM, a pH 8,0 / NaCl 10 mM. Si se desea
pueden también utilizarse otros medios de lavado estándar, por
ejemplo, que contengan alcoholes, por ejemplo lavado con etanol al
70%.
La utilización de partículas magnéticas permite
etapas de lavado fáciles, sencillamente agregando las partículas,
removiendo el medio de unión a ácido nucleico, añadiendo la solución
de tampón de lavado y reagregando las partículas tantas veces como
se requiera.
Después del proceso de aislamiento de ácido
nucleico y de las etapas de lavado opcionales que puedan desearse,
el soporte, portando el ácido nucleico unido, puede transferirse,
por ejemplo resuspenderse o sumergirse, en cualquier medio
adecuado, por ejemplo agua o solución de tampón de baja fuerza
iónica. Dependiendo del soporte y de la naturaleza de cualquiera de
los procesamientos subsecuentes deseados, puede o no ser deseable
liberar el ácido nucleico del soporte.
En el caso de un soporte sólido en forma de
partículas, tal como bolas magnéticas o no magnéticas, éste puede
en muchos casos utilizarse directamente, por ejemplo en PCR u otras
amplificaciones, sin separar el ácido nucleico del soporte.
También, para muchos métodos de detección o identificación de DNA,
no es necesaria la separación, ya que, aunque el DNA pueda estar en
contacto al azar con la superficie de la bola, y unido en un número
de puntos mediante puentes de hidrógeno o iónicos u otras fuerzas,
generalmente habrá suficientes longitudes de DNA disponibles para
hibridación a oligonucleótidos, y para amplificación.
Sin embargo, si se desea, puede obtenerse la
separación del ácido nucleico fácilmente utilizando medios
conocidos, por ejemplo mediante calentamiento, por ejemplo a 65ºC
durante 5 a 10 minutos, después de lo cual el soporte puede
removerse del medio dejando al ácido nucleico en solución. Dicho
calentamiento se obtiene automáticamente en PCR durante la etapa de
desnaturalización del DNA que precede al programa de ciclos.
Si se desea remover el RNA del DNA, esto puede
conseguirse destruyendo el RNA antes de la etapa de separación del
DNA, por ejemplo, mediante adición de RNAsa o un álcali tal como
NaOH.
Una ventaja de la presente invención, es que es
rápida y sencilla de realizar, y con la combinación apropiada de
etapas de unión celular, lisis y unión de ácido nucleico,
proporciona un método que suministra ácido nucleico de forma fiable
y sencilla en un corto periodo de tiempo, en muchos casos, menos de
una hora, o incluso menos de 45 minutos. La simplicidad del método
permite un elevado manejo de muestras. Concomitantemente, la etapa
de unión celular da como resultado un enriquecimiento o
concentración de las células, mejorando de esta forma el proceso de
aislamiento de ácido nucleico.
La invención es ventajosamente adecuada para
automatización, particularmente si se utilizan partículas, y
especialmente partículas magnéticas, como soporte.
Como se mencionó antes, ventajosamente, el ácido
nucleico unido no necesita separarse o removerse del soporte antes
de llevar a cabo la etapa de detección, aunque esto puede
realizarse si se desea. Que el ácido nucleico sea o no separado
también dependerá del método particular que se utilice en la etapa
de unión de ácido nucleico. Así, ciertos procedimientos de unión de
ácido nucleico unirán al ácido nucleico más intensamente que otros.
En el caso de la unión de DNA utilizando detergentes (por ejemplo
mediante DNA directo), el ácido nucleico se separará del soporte
sólido cuando se introduzca una solución de tampón de separación u
otro medio apropiado. El ácido nucleico unido por medio de un
precipitante tal como alcohol o un caotropo, permanecerá unido más
intensamente y puede no separarse cuando se coloque en un medio de
solución de tampón, y puede requerir calor para separarse.
Así, el ácido nucleico unido al soporte puede
utilizarse directamente en un procedimiento de detección basado en
ácido nucleico, sencillamente mediante la resuspensión del soporte
en, o mediante la adición al soporte de, un medio apropiado para la
etapa de detección. El ácido nucleico puede, bien eluirse en el
medio, o como se mencionó antes, no es necesaria su elución.
Se conocen y están descritas en la literatura,
un número de técnicas diferentes para detectar ácidos nucleicos, y
cualquiera de ellas puede utilizarse según la presente invención. En
la más sencilla, el ácido nucleico puede detectarse mediante
hibridación a una sonda, y se han descrito muchísimos protocolos de
hibridación (véase, por ejemplo,
Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Srping Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY). Más comúnmente, la detección incluirá una etapa de hibridación in situ, y/o una etapa de amplificación in vitro, utilizando cualquiera de los métodos descritos en la literatura para esto. Así, como se ha mencionado, pueden utilizarse técnicas como LAR, 3SR y el sistema Q-beta-replicasa. Sin embargo, generalmente el método de elección será la PCR y sus diversas modificaciones, por ejemplo la utilización de cebadores anidados (véase por ejemplo Abramson y Myers, 1993, Current Opinion in Biotechnology, 4:41-47 para una revisión de las tecnologías de amplificación de ácido nucleico).
Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Srping Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY). Más comúnmente, la detección incluirá una etapa de hibridación in situ, y/o una etapa de amplificación in vitro, utilizando cualquiera de los métodos descritos en la literatura para esto. Así, como se ha mencionado, pueden utilizarse técnicas como LAR, 3SR y el sistema Q-beta-replicasa. Sin embargo, generalmente el método de elección será la PCR y sus diversas modificaciones, por ejemplo la utilización de cebadores anidados (véase por ejemplo Abramson y Myers, 1993, Current Opinion in Biotechnology, 4:41-47 para una revisión de las tecnologías de amplificación de ácido nucleico).
Otros métodos de detección pueden basarse en una
aproximación a la secuencia, por ejemplo, la aproximación por
minisecuenciación, como describen Syvänen y Söderlund, 1990,
Genomics, 8:684-692.
En las técnicas de amplificación tales como la
PCR, el calentamiento requerido en la primera etapa para disolver
el dúplex de DNA, puede liberar el DNA unido del soporte. Así, en el
caso de una etapa subsiguiente de detección, tal como PCR, el ácido
nucleico unido al soporte puede añadirse directamente a la mezcla de
reacción, y el ácido nucleico se eluirá en la primera etapa del
proceso de detección. La muestra completa, o una parte alícuota,
del ácido nucleico aislado unido al soporte, obtenido según la
invención, puede utilizarse en la etapa de detección.
El resultado de la PCR o de otra etapa de
detección puede detectarse o visualizarse por muchos medios, que
están descritos en la técnica. Por ejemplo, los productos de PCR u
otras amplificaciones, pueden resolverse en un gel de
electroforesis, por ejemplo en un gel de agarosa teñido con bromuro
de etidio, utilizando técnicas conocidas. Alternativamente, puede
utilizarse el sistema DIANA, que es una modificación de la técnica
de cebadores anidados. En el sistema DIANA (Detección de Ácidos
Nucleicos Amplificados Inmovilizados) (véase Wahlberg et al.,
Mol. Cell Probes 4:285 (1990)), el segundo par, interior, de
cebadores, lleva, respectivamente, medios para inmovilización, para
permitir la captura del DNA amplificado, y un marcador o medios para
pegarse a un marcador, para permitir el reconocimiento. Esto
proporciona la doble ventaja de una reducción en la señal de fondo,
y de un medio fácil y rápido para la detección del DNA
amplificado.
El ácido nucleico amplificado también puede
detectarse, o el resultado confirmarse, mediante secuenciación,
utilizando una de las muchas tecnologías de secuenciación diferentes
actualmente disponibles, por ejemplo secuenciación estándar,
secuenciación automática y minisecuenciación.
Ventajosamente, se ha encontrado que las células
aisladas pueden guardarse en una solución de tampón de "unión
celular", según la invención, por ejemplo, una solución de tampón
de sal/alcohol, durante al menos una semana a temperatura ambiente,
sin pérdida detectable de la sensibilidad en una etapa subsiguiente
de detección de ácido nucleico. Dicha estabilidad es una ventaja en
situaciones de trabajo.
Los diversos agentes reaccionantes y componentes
requeridos para realizar los métodos de la invención, pueden ser
suministrados convenientemente en forma de kit.
En su forma más simple, un kit para uso en el
método de la invención comprende:
- (a)
- un soporte sólido en partículas;
- (b)
- opcionalmente, medios para unir las células a dicho soporte sólido;
- (c)
- medios para lisar dichas células; y
- (d)
- medios para unir el ácido nucleico liberado de dichas células lisadas al mismo soporte sólido.
Los diversos medios, (b), (c) y (d) pueden ser
los descritos y discutidos anteriormente, en relación con el método
de la invención.
Otro componente opcional más es (e), medios para
detectar la presencia o ausencia de ácido nucleico característico
de una célula diana, dentro de dicho ácido nucleico unido. Como se
discutió antes, tales medios pueden incluir sondas o cebadores de
secuencias de oligonucleótidos apropiados, para utilizar en técnicas
de detección basada en hibridación y/o amplificación.
Opcionalmente, otros componentes incluidos en
tal kit pueden ser soluciones de tampón, sales, polímeros, enzimas
etc.
La invención se describirá ahora en más detalle
en los siguientes ejemplos no limitantes, con referencia a los
dibujos en los que:
La Figura 1 muestra los resultados de una
electroforesis en gel de agarosa teñido con bromuro de etidio, de
la separación de los productos de amplificación por PCR, de un DNA
obtenido según la invención de células de 5 especies de
cianobacterias. Las carreras 1 a 7 corresponden a las muestras 1 a 7
como se describe en el Ejemplo 1.
Muestra 1; Planktothrix rubescens
NIVA-CYA 1, muestra 2; Planktothrix agardhii
NIVA-CYA 29, muestra 3; Planktothrix
rubescens NIVA-CYA 55, muestra 4;
Planktothrix mougeotii NIVA-CYA 56/1, muestra
5; Planktothrix agardhii NIVA-CYA 116,
muestra 6; testigo negativo de reactivos para purificación celular y
de DNA y muestra 7; testigo negativo para reactivos de PCR.
Se mezclaron 0,5 ml de agua que contenía
aproximadamente 10^{5} células, con 20 \mul de bolas (1
\mug/ml) y 0,5 ml de solución de tampón de unión celular
(isopropanol, AcNH_{4} 0,75 M) en un tubo de microcentrífuga. La
mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos, y
después el tubo se colocó en un imán MPC-E (Dynal
A.S.) durante 2 minutos. El sobrenadante se removió cuidadosamente.
Se añadieron 50 \mul de GTC 4 M, sarkosyl al 1%, y se incubó a
65ºC durante 10 minutos. Después se añadieron 200 \mul de etanol
al 96% y la incubación continuó durante 5 minutos a temperatura
ambiente. Las bolas se atrajeron hacia la pared del tubo con el
imán, y se removió el sobrenadante. El complejo se lavó dos veces
con 500 \mul de etanol al 70%. Se removió todo el etanol, y se
añadieron 50 \mul de agua. Para remover el etanol residual los
tubos se incubaron a 65ºC durante 10 minutos con el tapón
abierto.
Se amplificó la región entre los genes que
codifican para las subunidades grande (Rbcl) y pequeña (Rbcs) de
RuBisCo.
Las amplificaciones se realizaron utilizando el
sistema GeneAmp 2400 PCR (Perkin Elmer), en un volumen de 50 \mul,
que contenía 10 pmol de los cebadores (CW)
5'CGTAGCTTCCGGTGGTATCCACGT3' y (DF)
5'GGG
CARYTTCCACAKNGTCCA3', dNTP 200 \muM, Tris-HCl (pH 8,8) 10 mM, Cl_{2}Mg 1,5 mM, ClK 50 mM, Tritón X-100 al 0,1%, 1 U de DNA polimerasa termoestable DynaZyme (Finnzymes Oy) y 5 \mul de solución DNA/bolas. El programa de PCR utilizado tenía una etapa inicial de desnaturalización a 94ºC durante 4 minutos, después ciclos, con los parámetros; 94ºC durante 30 segundos, 40ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 2 minutos por dos ciclos, después 94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 2 minutos por 40 ciclos. Finalmente, se incluyó una etapa de extensión durante 7 minutos. Se verificó mediante secuenciación de DNA, que los fragmentos amplificados contenían la región entre las subunidades de RuBisCo grande (Rbcl) y pequeña (Rbcs).
CARYTTCCACAKNGTCCA3', dNTP 200 \muM, Tris-HCl (pH 8,8) 10 mM, Cl_{2}Mg 1,5 mM, ClK 50 mM, Tritón X-100 al 0,1%, 1 U de DNA polimerasa termoestable DynaZyme (Finnzymes Oy) y 5 \mul de solución DNA/bolas. El programa de PCR utilizado tenía una etapa inicial de desnaturalización a 94ºC durante 4 minutos, después ciclos, con los parámetros; 94ºC durante 30 segundos, 40ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 2 minutos por dos ciclos, después 94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 2 minutos por 40 ciclos. Finalmente, se incluyó una etapa de extensión durante 7 minutos. Se verificó mediante secuenciación de DNA, que los fragmentos amplificados contenían la región entre las subunidades de RuBisCo grande (Rbcl) y pequeña (Rbcs).
Se resolvieron 10 \mul de los productos
amplificados de cada una de las muestras 1 a 7 en un gel de agarosa
al 1,5%, teñido con bromuro de etidio, durante 30 minutos a 100
voltios. El estándar de peso molecular era DNA de \varphiX 174
digerido con Hae III. Los resultados se muestran en la Figura 1.
La Figura 1 muestra claramente que las células
de todas las muestras 1 a 5 pudieron detectarse. El límite de
detección se estimó en 10-100 células/ml, en base a
los resultados de PCR obtenidos, tal como se visualizan en el gel de
agarosa teñido con bromuro de etidio.
Claims (15)
1. Un método para detectar la presencia o
ausencia de una célula diana eucariótica o procariótica en una
muestra, comprendiendo dicho método:
(a) proporcionar un soporte sólido en partículas
y mezclarlo con la muestra y permitir la unión de las células en
dicha muestra al soporte sólido, para aislar células de la
muestra;
(b) lisar las células aisladas;
(c) unir el ácido nucleico liberado de dichas
células lisadas al mismo dicho soporte sólido; y
(d) detectar la presencia o ausencia de ácido
nucleico característico de dichas células diana dentro de dicho
ácido nucleico unido.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
dicho ácido nucleico es DNA.
3. El método de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que en la etapa (a) las células
se precipitan sobre el soporte utilizando un precipitante.
4. El método de la reivindicación 3, en el que
el precipitante comprende alcohol y sal.
5. El método de la reivindicación 1 o de la
reivindicación 2, en el que en la etapa (a) las células se unen al
soporte en virtud de restos de unión celular proporcionados sobre o
en el soporte.
6. El método de la reivindicación 5 en el que
dichos restos de unión celular permiten la unión selectiva de
células diana.
7. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el soporte comprende bolas
magnéticas.
8. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que en la etapa (b), las células se
lisan utilizando un detergente, y/o un caotropo.
9. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que en la etapa (c) el ácido nucleico
se une inespecíficamente al soporte.
10. El método de la reivindicación 9, en el que
el ácido nucleico se precipita sobre el soporte utilizando un
precipitante.
11. El método de la reivindicación 10, en el que
el precipitante comprende alcohol, y opcionalmente sal, y/o un
detergente.
12. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que en la etapa (c) el ácido nucleico
se une al soporte en virtud de copartícipes de unión proporcionados
sobre el soporte, para ayudar a la captura selectiva de ácidos
nucleicos.
13. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en el que las células unidas al soporte se
separan del resto de la muestra, concentrando de esta forma las
células.
14. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, en el que en la etapa (a) dicha muestra se
mezcla con dicho soporte en forma de partículas, y se le permite
estar a temperatura ambiente durante un intervalo de tiempo adecuado
para permitir que las células se unan al soporte, después de lo
cual el soporte se retira del resto de la muestra.
15. El método de la reivindicación 1, en el que
dicha etapa de detección (d) comprende hibridación in situ,
y/o amplificación in vitro y/o secuenciación de ácido
nucleico.
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Families Citing this family (78)
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|---|---|---|---|---|
| GB9425138D0 (en) | 1994-12-12 | 1995-02-08 | Dynal As | Isolation of nucleic acid |
| EP2290099B1 (en) * | 1998-02-02 | 2012-10-10 | QIAGEN North American Holdings, Inc. | Processes for isolating, amplifying and characterizing DNA |
| US6387632B2 (en) * | 1998-06-11 | 2002-05-14 | Hitachi, Ltd. | Polynucleotide separation method and apparatus therefor |
| US6093370A (en) * | 1998-06-11 | 2000-07-25 | Hitachi, Ltd. | Polynucleotide separation method and apparatus therefor |
| EP1109899B1 (en) * | 1998-09-10 | 2007-02-21 | WHATMAN plc | Product and method for separation of a sample containing multiple sources of genetic material using a solid medium |
| US7790865B1 (en) * | 1999-02-02 | 2010-09-07 | Qiagen North American Holdings, Inc | Eluting reagents, methods and kits for isolating DNA |
| GB0001450D0 (en) | 2000-01-21 | 2000-03-08 | Genpoint As | Cell isolation method |
| GB0008787D0 (en) | 2000-04-10 | 2000-05-31 | Norsk Naeringsmiddelforskning | A method of cell detection |
| GB0013658D0 (en) | 2000-06-05 | 2000-07-26 | Dynal Asa | Nucleic acid isolation |
| AU2002215488B8 (en) * | 2000-06-21 | 2007-11-15 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Universal collection medium |
| PT102491B (pt) * | 2000-07-10 | 2003-02-28 | Inst Superior Tecnico | Processo para producao e purificacao de dna plasmidico |
| NZ511680A (en) * | 2001-05-14 | 2004-07-30 | Univ Waikato | Method for preparing nucleic acid or DNA samples and a DNA extraction process using thermophilic proteases |
| AU2008201675B2 (en) * | 2001-05-14 | 2012-06-07 | Zygem Corporation Limited | Thermostable Proteinases From Thermophilic Bacteria |
| DE10129815A1 (de) | 2001-06-24 | 2003-01-09 | Profos Ag | Verfahren zur Aufreinigung von Bakterienzellen und Zellbestandteilen |
| DE10230147A1 (de) | 2001-10-09 | 2004-01-15 | Profos Ag | Verfahren zur unspezifischen Anreicherung von Bakterienzellen |
| US20050032105A1 (en) * | 2001-10-12 | 2005-02-10 | Bair Robert Jackson | Compositions and methods for using a solid support to purify DNA |
| US7347976B2 (en) * | 2001-12-20 | 2008-03-25 | 3M Innovative Properties Company | Methods and devices for removal of organic molecules from biological mixtures using a hydrophilic solid support in a hydrophobic matrix |
| US7192560B2 (en) * | 2001-12-20 | 2007-03-20 | 3M Innovative Properties Company | Methods and devices for removal of organic molecules from biological mixtures using anion exchange |
| EP1466018B2 (en) | 2002-01-08 | 2015-08-12 | Roche Diagnostics GmbH | Use of silica material in an amplification reaction |
| CN1230531C (zh) * | 2002-12-09 | 2005-12-07 | 清华大学 | 从样品中分离细胞粒子的方法 |
| CN1223680C (zh) * | 2002-12-10 | 2005-10-19 | 清华大学 | 扩增靶细胞或病毒的核酸的方法 |
| CN100494399C (zh) * | 2003-06-30 | 2009-06-03 | 清华大学 | 一种基于dna芯片的基因分型方法及其应用 |
| DE602004026893D1 (de) * | 2003-09-12 | 2010-06-10 | Biocontrol Systems Inc | Rung und zum nachweis von mikroorganismen |
| EP1709197A4 (en) * | 2003-12-30 | 2007-07-04 | Sigma Aldrich Co | RAPID PREPARATION OF NUCLEIC ACIDS BY ENZYMATIC DEPENDENCE |
| JP4831725B2 (ja) * | 2004-02-13 | 2011-12-07 | 栄研化学株式会社 | 簡易的核酸抽出法 |
| US7419798B2 (en) | 2004-10-19 | 2008-09-02 | Zybac Llc | Rapid and sensitive detection of bacteria in blood products, urine, and other fluids |
| US20080305538A1 (en) * | 2004-10-19 | 2008-12-11 | Medical Innovations International, Inc. | Rapid and Sensitive Detection of Bacteria in Blood Products, Urine, and Other Fluids |
| DE102005002342A1 (de) | 2005-01-18 | 2006-07-20 | GEN-Institut für Angewandte Laboranalysen GmbH | Verfahren sowie Kit zur Sterilisierung von Mikroorganismen enthaltenden Flüssigkeiten |
| US20060166223A1 (en) * | 2005-01-26 | 2006-07-27 | Reed Michael W | DNA purification and analysis on nanoengineered surfaces |
| EP2322940B1 (en) * | 2005-03-10 | 2014-10-29 | Gen-Probe Incorporated | Systems amd methods to perform assays for detecting or quantifing analytes within samples |
| US20060223071A1 (en) * | 2005-04-01 | 2006-10-05 | Wisniewski Michele E | Methods, compositions, and kits for detecting nucleic acids in a single vessel |
| EP1712284B1 (en) * | 2005-04-15 | 2012-10-10 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Cell separation method using hydrophobic solid supports |
| US20060257907A1 (en) * | 2005-04-19 | 2006-11-16 | The Regents Of The University Of California | Packed bed for nucleic acid capture and amplification |
| JP2006311803A (ja) * | 2005-05-06 | 2006-11-16 | Hitachi High-Technologies Corp | 核酸精製方法、及び核酸精製器具 |
| KR100682945B1 (ko) * | 2005-05-24 | 2007-02-15 | 삼성전자주식회사 | 상 분리를 이용한 세포 분리 방법 및 키트 |
| US20070026435A1 (en) * | 2005-07-28 | 2007-02-01 | Polysciences, Inc. | Hydroxysilane functionalized magnetic particles and nucleic acid separation method |
| GB0525231D0 (en) * | 2005-12-12 | 2006-01-18 | Genpoint As | Method |
| CA2533052C (en) * | 2006-01-16 | 2016-02-09 | Yousef Haj-Ahmad | Isolating both free and protein associated dna |
| KR100829585B1 (ko) * | 2006-04-07 | 2008-05-14 | 삼성전자주식회사 | 표적 세포 분리 및 신속한 핵산 분리 방법 및 장치 |
| US7608399B2 (en) * | 2006-06-26 | 2009-10-27 | Blood Cell Storage, Inc. | Device and method for extraction and analysis of nucleic acids from biological samples |
| KR100790880B1 (ko) * | 2006-07-05 | 2008-01-02 | 삼성전자주식회사 | 자성 비드가 결합되어 있는 소수성 다공성 중합체가 벽면에결합되어 있는 마이크로채널 또는 마이크로챔버를포함하는 미세유동장치 및 그를 이용하는 방법 |
| US9328326B2 (en) * | 2006-08-10 | 2016-05-03 | Merck Patent Gmbh | Method for isolating cells |
| KR100917465B1 (ko) * | 2006-08-21 | 2009-09-14 | 삼성전자주식회사 | 비평면 형상의 고체 지지체를 이용하여 미생물을 분리하는방법 및 미생물분리 장치 |
| US20080044884A1 (en) * | 2006-08-21 | 2008-02-21 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Method and device for separating cells from a sample using a nonplanar solid substrate |
| US8158411B2 (en) | 2006-08-21 | 2012-04-17 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Method of separating microorganism using nonplanar solid substrate and device for separating microorganism using the same |
| US20080044880A1 (en) * | 2006-08-21 | 2008-02-21 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Method of and apparatus for separating microorganisms from sample using electrodialysis and microorganism capturing means |
| KR100862660B1 (ko) * | 2006-09-25 | 2008-10-10 | 삼성전자주식회사 | 단일 비드에 의한 핵산의 분리 및 정제 방법 및 장치 |
| US20080124777A1 (en) * | 2006-11-29 | 2008-05-29 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Method for releasing genetic material from solid phase |
| US20080131954A1 (en) * | 2006-11-30 | 2008-06-05 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Method of Separating Target DNA from Mixed DNA |
| JP2008167722A (ja) | 2007-01-15 | 2008-07-24 | Konica Minolta Medical & Graphic Inc | 磁性支持体上での加熱による核酸単離方法 |
| WO2008116221A1 (en) * | 2007-03-22 | 2008-09-25 | Advanced Liquid Logic, Inc. | Bead sorting on a droplet actuator |
| WO2008134470A2 (en) * | 2007-04-25 | 2008-11-06 | 3M Innovative Properties Company | Methods for nucleic acid amplification |
| US20100062421A1 (en) * | 2007-04-25 | 2010-03-11 | Wensheng Xia | Compositions, methods, and devices for isolating biological materials |
| WO2009117167A1 (en) * | 2008-01-02 | 2009-09-24 | Blood Cell Storage, Inc. | Devices and processes for nucleic acid extraction |
| FR2926560A1 (fr) * | 2008-01-21 | 2009-07-24 | Millipore Corp | Procede d'extraction et de purification d'acides nucleiques sur membrane |
| MX2010008820A (es) * | 2008-02-12 | 2010-09-07 | Novartis Ag | Metodo para aislar acidos nucleicos fetales o apoptoticos libres de celulas. |
| US7867713B2 (en) * | 2008-04-21 | 2011-01-11 | Lawrence Livermore National Security, Llc | Polymerase chain reaction system using magnetic beads for analyzing a sample that includes nucleic acid |
| AU2009313556A1 (en) * | 2008-11-04 | 2010-05-14 | Blood Cell Storage, Inc. | Nucleic acid extraction on curved glass surfaces |
| US8409801B2 (en) * | 2009-02-04 | 2013-04-02 | Covaris, Inc. | Method and apparatus for material separation using acoustic energy |
| WO2010089098A1 (de) | 2009-02-05 | 2010-08-12 | Deklatec Gmbh | Verfahren und mittel für die tuberkulose diagnostik |
| TWI407994B (zh) | 2009-10-22 | 2013-09-11 | Ind Tech Res Inst | 分離核酸的方法、試劑及套組 |
| GB2475226A (en) | 2009-11-03 | 2011-05-18 | Genetic Analysis As | Universal Prokaryote 16S ribosome PCR primer pair |
| US8202693B2 (en) * | 2009-11-24 | 2012-06-19 | Omega Bio-Tek, Inc. | Method of isolation of nucleic acids |
| GB201011152D0 (en) | 2010-07-02 | 2010-08-18 | Microsens Medtech Ltd | Capture of micro-organisms |
| DE102010031401A1 (de) * | 2010-07-15 | 2012-01-19 | Aj Innuscreen Gmbh | Verfahren zur Anreicherung von Bakterien, Viren sowie Zellen und zur nachfolgenden Nukleinsäureisolierung |
| US8945509B2 (en) | 2010-08-20 | 2015-02-03 | Life Technologies Corporation | Magnetic beads having surface glycoconjugates and use thereof |
| US10634588B2 (en) * | 2010-09-24 | 2020-04-28 | Qiagen Gmbh | Reagent for the disruption of cell material having a completely integrated internal standard |
| WO2012075508A2 (en) * | 2010-12-03 | 2012-06-07 | Blood Cell Storage, Inc. | Processes for isolating microorganisms |
| GB201021399D0 (en) | 2010-12-16 | 2011-01-26 | Genetic Analysis As | Oligonucleotide probe set and methods of microbiota profiling |
| GB201021397D0 (en) | 2010-12-16 | 2011-01-26 | Genetic Analysis As | Diagnosis of Crohn's disease |
| GB201102693D0 (en) | 2011-02-16 | 2011-03-30 | Genetic Analysis As | Method for identifying neonates at risk for necrotizing enterocolitis |
| WO2012159063A2 (en) | 2011-05-19 | 2012-11-22 | Blood Cell Strorage, Inc. | Gravity flow fluidic device for nucleic acid extraction |
| JP6325077B2 (ja) * | 2013-03-15 | 2018-05-16 | アボツト・モレキユラー・インコーポレイテツド | 核酸を抽出するための組成物および方法 |
| ES2727592T3 (es) * | 2015-12-30 | 2019-10-17 | Fund Gaiker | Método para la detección de cepas de Legionella spp. en muestras ambientales basadas en la amplificación isotérmica mediada por bucle (lamp), reactivo de detección y conjunto de cebadores |
| GB201617519D0 (en) | 2016-10-14 | 2016-11-30 | Genetic Analysis As | A companion diagnostic method for use in the treatment of irritable bowel syndrome with dietary interventions or faecal microbiota transplant |
| US11447811B2 (en) | 2017-07-17 | 2022-09-20 | smartDNA Pty Ltd | Method of diagnosing a dysbiosis |
| GB201712459D0 (en) | 2017-08-02 | 2017-09-13 | Norges Miljø-Og Biovitenskapelige Univ | Treatment or prevention of gastrointestinal dysbiosis |
| EP3749754A4 (en) | 2018-02-08 | 2021-10-20 | Applied Stemcell, Inc. | PROCEDURE FOR SCREENING VARIANTS OF A TARGET |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4001197A (en) | 1975-06-12 | 1977-01-04 | Sala Magnetics, Inc. | Magnetic separation method |
| US5077192A (en) | 1988-10-25 | 1991-12-31 | The General Hospital Corporation | Method of detecting antigenic, nucleic acid-containing macromolecular entities |
| NL8900725A (nl) | 1989-03-23 | 1990-10-16 | Az Univ Amsterdam | Werkwijze en combinatie van middelen voor het isoleren van nucleinezuur. |
| US5234809A (en) * | 1989-03-23 | 1993-08-10 | Akzo N.V. | Process for isolating nucleic acid |
| IE64040B1 (en) | 1989-06-15 | 1995-06-28 | Akzo Nv | Method for determining nucleic acid |
| JPH05504475A (ja) | 1989-11-30 | 1993-07-15 | ファルマシア バイオテック インコーポレイテッド | 細胞試料において特定の核酸配列を検出する方法 |
| GB9003253D0 (en) * | 1990-02-13 | 1990-04-11 | Amersham Int Plc | Precipitating polymers |
| DE4034036C2 (de) * | 1990-10-26 | 1994-03-03 | Diagen Inst Molekularbio | Vorrichtung und Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Zellsuspensionen |
| US5652141A (en) * | 1990-10-26 | 1997-07-29 | Oiagen Gmbh | Device and process for isolating nucleic acids from cell suspension |
| US5491068A (en) * | 1991-02-14 | 1996-02-13 | Vicam, L.P. | Assay method for detecting the presence of bacteria |
| GB9107124D0 (en) | 1991-04-05 | 1991-05-22 | Dynal As | Chemical process |
| GB9425138D0 (en) * | 1994-12-12 | 1995-02-08 | Dynal As | Isolation of nucleic acid |
| DE19520398B4 (de) | 1995-06-08 | 2009-04-16 | Roche Diagnostics Gmbh | Magnetisches Pigment |
| GB9518156D0 (en) * | 1995-09-06 | 1995-11-08 | Medical Res Council | Method of isolating cells |
-
1997
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