NO328019B1 - Fremgangsmate ved fastfase nukleinsyreisolering - Google Patents
Fremgangsmate ved fastfase nukleinsyreisolering Download PDFInfo
- Publication number
- NO328019B1 NO328019B1 NO19995566A NO995566A NO328019B1 NO 328019 B1 NO328019 B1 NO 328019B1 NO 19995566 A NO19995566 A NO 19995566A NO 995566 A NO995566 A NO 995566A NO 328019 B1 NO328019 B1 NO 328019B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- nucleic acid
- support material
- cells
- sample
- binding
- Prior art date
Links
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 123
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 123
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 123
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 107
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title claims description 19
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 title description 13
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 48
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 39
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 133
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 101
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 43
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 23
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 19
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 17
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 17
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 16
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 13
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 12
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 11
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 claims description 2
- 239000011236 particulate material Substances 0.000 claims description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 36
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 26
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 17
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 12
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 5
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 5
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 5
- 229940016590 sarkosyl Drugs 0.000 description 5
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 5
- KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M sodium lauroyl sarcosinate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC([O-])=O KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 3
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Inorganic materials [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M sodium iodide Chemical compound [Na+].[I-] FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 2
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010066717 Q beta Replicase Proteins 0.000 description 2
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 229920006158 high molecular weight polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000005660 hydrophilic surface Effects 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005661 hydrophobic surface Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M perchlorate Inorganic materials [O-]Cl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- -1 sheets Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 1
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 1
- 230000009946 DNA mutation Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical class NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 241000048858 Planktothrix agardhii NIVA-CYA 116 Species 0.000 description 1
- 241000048846 Planktothrix agardhii NIVA-CYA 29 Species 0.000 description 1
- 241000530775 Planktothrix mougeotii Species 0.000 description 1
- 241000048832 Planktothrix rubescens NIVA-CYA 1 Species 0.000 description 1
- 241000048829 Planktothrix rubescens NIVA-CYA 55 Species 0.000 description 1
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 1
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007998 bicine buffer Substances 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 238000009582 blood typing Methods 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010422 painting Methods 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000005464 sample preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 235000015424 sodium Nutrition 0.000 description 1
- 235000009518 sodium iodide Nutrition 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
- C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
- Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
- Mechanical Coupling Of Light Guides (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår isoleringen av nukleinsyrer, og spesielt en fremgangsmåte for å isolere nukleinsyre fra prokaryote eller eukaryote celler hvor fremgangsmåten omfatter de trekk som går frem av krav 1, og hvor fremgangsmåten kombinerer et fastfasecelleisoleringstrinn med et fastfase-DNA-isoleringstrinn.
Isoleringen av nukleinsyre er et viktig trinn i mange bio-kjemiske og diagnostiske prosedyrer. For eksempel er separasjonen av nukleinsyrer fra de komplekse blandinger hvor de ofte blir funnet, stadig nødvendig før andre studier og prosedyrer, for eksempel påvisning, kloning, sekvensering, amplifisering, hybridisering, cDNA-syntese, osv. kan bli foretatt. Tilstedeværelsen av store mengder cellulært eller annet forurensende materiale, for eksempel proteiner eller karbohydrater i slike sammensatte blandinger hindrer ofte mange av reaksjonene og teknikkene som benyttes i molekylær biologi. I tillegg kan DNA forurense RNA-preparater og vice versa. Således er det behov for isoleringsmetoder for nukleinsyrer fra komplekse blandinger som celler, vev, osv., ikke bare fra et preparativt synspunkt, men også i de mange fremgangsmåter som er i bruk i dag som avhenger av identifiseringen av DNA eller RNA, eksempelvis diagnose av mikrobielle infeksjoner, rettsvitenskap, vev- og blodtyp-ing, påvisning av genetiske variasjoner, osv..
Bruken av DNA- eller RNA-identifikasjon er nå bredt aksep-tert som en metode for å skjelne mellom forskjellige celler eller celletyper, eller mellom varianter av samme celletype inneholdende DNA-mutasjoner. Således kan HLA-typing som mer vanlig blir utført ved identifikasjon av karakteristiske overflategener ved å bruke antistoff alternativt blir benyttet ved identifikasjon av DNA som koder for slike an-tigener. Mikrobiell infeksjon eller forurensning kan bli identifisert med nukleinsyreanalyse for å påvise målorga-nismen i stedet for å avhenge av å påvise karakteriserende trekk av cellene av mikroorganismene, for eksempel morfolo-gisk eller biokjemisk. Genetiske variasjoner kan bli identifisert på lignende måte.
Generelt blir DNA eller RNA identifisert ved hybridisering til en eller flere oligonukleotider under stringensbeting-elser som er tilstrekkelige for å sikre et lavt nivå av ikke-spesifik binding. Vanligvis blir de hybridiserende nukleotider benyttet i par som primere i de forskjellige former av in vitro amplifikering som nå er tilgjengelig i hovedsak polymerasekjedereaksjonen (PCR), men også ligase amplifikeringsreaksjonen (LAR), den selvvedvarende sekvens-replikasjon (3SR) og Q-beta replikase amplifikeringssyste-rnet. Etter amplifikering kan DNA bli videre karakterisert ved sekvensering, for eksempel ved Sanger-metoden. Amplifikering og sekvensering kan bli kombinert.
Som nevnt ovenfor krever alle metoder generelt et initialt nukleinsyre-isoleringstrinn for å separere nukleinsyren fra materialer, for eksempel proteiner som kan innvirke på hy-bridiserings- og amplifikeringsteknikkene som blir brukt.
En rekke metoder er kjent for isoleringen av nukleinsyrer, men generelt avhenger disse av en kompleks serie av eks-traksjons- og vasketrinn og er tidskrevende og arbeidskre-vende å utføre.
Klassiske metoder for isoleringen av nukleinsyrer fra sammensatte utgangsmaterialer, så som blod eller blodprodukter eller vev involverer lysis av det biologiske materiale med en detergent eller kaotrop, eventuelt ved nærvær av pro-teinnedbrytende enzymer fulgt av flere ekstraksjoner med organisk oppløsningsmidler, for eksempel fenol og/eller kloroform, etanolutfelling, sentrifugeringer og dialyse av nukleinsyrene. Ikke bare er slike metoder tungvinte og tidskrevende å utføre, men det relativt store antall trinn som er nødvendig øker risikoen for nedbrytning, tap av materiale eller kryssforurensning av prøver hvor flere prøver samtidig blir behandlet.
Forbedringer i metoder for å isolere nukleinsyrer blir således kontinuerlig lett etter, og nylig har andre metoder blitt foreslått som baserer seg på anvendelsen av en fast fase. I US-A-5,234,809 blir det for eksempel beskrevet en fremgangsmåte hvor nukleinsyrer blir bundet til en fast fase i form av silikapartikler ved nærvær av et kaotropisk middel så som et guanidiniumsalt, og derved adskilt fra resten av prøven. WO 91/12079 beskriver en fremgangsmåte hvorved nukleinsyrer blir innfanget på overflaten av en fast fase ved utfelling. Generelt blir alkoholer og salter benyttet som utfellende midler.
Selv om slike metoder aksellererer nukleinsyreseparasjons-prosessen eksisterer det fremdeles et behov for fremgangsmåter som er raske og enkle å utføre, og som tillater godt utbytte og blir dannet uten tap og spesielt som lett kan tilpasses isolering av nukleinsyrer fra celler i blandinger eller miljø hvor de kan være til stede ved lave konsentrasjoner som et preparativt førstetrinn i å isolere nukleinsyrer fra målceller i nukleinsyrebaserte cellepåvisnings-prosedyrer. Spesielt selv om hybridiseringsbaserte teknikker så som PCR og andre nukleinsyrebaserte metoder for å påvise mikroorganismer tillater høy sensitivitetspåvisning av celler i prøver, prøvepreparater, osv. er konsentrasjo-nen av målcellene og nukleinsyreopprenskningen avgjørende faktorer for å oppnå høy sensitivitet og reproduserbarhet av metoden. For tiden blir celler vanligvis først isolert fra prøven med filtrering, sentrifugering eller affinitets-binding til antistoff festet til en fast fase. Etter cellekonsentrasjonen på denne måte blir DNA så renset fra de konsentrerte celler, ofte med klassiske fenol/kloroform-ekstraksjonsmetoder som forklart ovenfor, med deres med-følgende ulemper.
Fra en artikkel til A. Mezler et al., Mitt Gebiete Lebensm. Hyg., 1996, vol 87, s. 55-72 er det kjent en metode for å påvise enterovirus i vannprøver.
Artikler av T- Kristensen et al., Nucleic Acids Res. 1987, vol 15, s.5507-5516 og av S.A. Leadon og P.A. Cerutti, Anal. Biochem., 1982, vol 120, s. 282-288 er det kjent metoder for nukleinsyreisolering.
Fra DE Al 19520398 er det kjent en metode for deteksjon av nukleinsyrer ved bruk av kuler med antistoffer for å binde celler, og fra WO Al 9112079 er det kjent en metode for å isolere nukleinsyrer ved først å binde celler til kuler og så binde de frigitte plasmidene til et nytt sett kuler.
Det blir med dette beskrevet en ny tilnærming til dette problem som integrerer celleisolering og nukleinsyreopprenskning som et enkelt "trinn" ved å bruke samme fastfase for både celleabsorbsjonen og nukleinsyreopprenskning. Dette blir oppnådd ved å binde cellene til et fast støtte-materiale som et første trinn. Det samme faste støttema-teriale blir så benyttet under tilstander som lyserer de bundne celler og som tillater nukleinsyren å binde til støttematerialet.
På denne måten kan nukleinsyre bli isolert fra en prøve i en form som er egnet for amplifikering eller andre ned-strømsprosesser med en enkel og raskt utførbar prosedyre som tar mindre enn 45 minutter.
I et aspekt fremskaffer således foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å isolere nukleinsyrer fra en celleprøve hvor nevnte fremgangsmåte omfatter: (a) å binde celler i nevnte prøve til et fast støtte-materiale for å isolere celler fra prøven;
(b) lysere de isolerte celler, og
(c) binde nukleinsyrer frigjort fra nevnte lyserte celler til nevnte samme faste støttemateriale, og der-etter elvere nukleinsyren fra støttematerialet eller anvende nukleinsyren bundet til støttematerialet direkte i nukleinsyrebaserte påvisningsprosedyrer.
Nukleinsyren kan være DNA, RNA eller enhver naturlig fore-kommende eller syntetisk modifikasjon derav, samt kombina-sjoner av dette. Fortrinnsvis vil imidlertid nukleinsyren være DNA som kan være enkelt- eller dobbeltkjedet eller i enhver annen form, for eksempel lineær eller sirkulær.
Uttrykket "celle" blir benyttet heri til å inkludere alle prokaryote (innbefattende erkebakterie) og eukaryote celler og andre levedyktige organismer så som virus og mykoplasma og sub-cellulære komponenter så som organeller. Representative "celler" innbefatter således alle typer pattedyr og ikke-pattedyr dyreceller, planteceller, protoplaster, bakterier, protozoer og virus.
Prøven kan således være ethvert materiale som inneholder nukleinsyre inne i slike celler, innbefattende for eksempel matvarer og lignende produkter, kliniske og miljømessige prøver. Således kan prøven være en biologisk prøve som kan inneholde ethvert viralt eller cellulært materiale, innbefattende alle prokaryote eller eukaryote celler, virus, bakteriofager, mykoplasma, protoplaster og organeller. Slikt biologisk materiale kan således omfatte alle typer pattedyr og ikke-pattedyr animalske celler, planteceller, alger innbefattende blågrønne alger, sopp, bakterier, pro-tosoer, osv. Representative prøver innbefatter således fullblods og blodavledede produkter så som plasma, eller buffycoat, urin, feces, cerebrospinalvæske eller enhver annen kroppsvæske, vev, cellekulturer, cellesuspensjoner, osv., samt også miljømessige prøver så som jord, vann eller matvareprøver.
Prøven kan også innbefatte relativt rene eller delvis ren-sede utgangsmaterialer så som semirene preparater fremstilt med andre celleseparasjonsprosesser.
Binding av cellene til det faste støttematerialet kan bli oppnådd på enhver kjent eller passende måte. For eksempel kan ikke-spesifikk binding av cellene til støttematerialet bli oppnådd med passende valg av det faste støttemateriale og betingelser, for eksempel den kjemiske eller fysiske na-tur av overflaten av det faste støttemateriale (for eksempel hydrofobisitet eller ladning), pH eller sammensetning av isoleringsmediet, osv..Naturen av målcellene kan også spille en rolle, og det har for eksempel blitt vist at visse hydrofobe celler lett kan binde ikke-spesifikt til hydrofobe overflater, mens hydrofile celler kan binde til mer hydrofile overflater. Negativt ladede celler så som B-lymfocytter har også blitt observert å ha en høy grad av ikke-spesifikk binding til svak positiv ladede overflater. Således kan faste støttematerialer som har passende ladede overflater for binding av en ønsket celletype bli brukt. Passende buffere, osv. kan bli brukt som medier for celle-isoleringstrinnet for å oppnå betingelser som er passende for cellebinding enkelt ved å bringe det faste støttemate-riale og prøven i kontakt med hverandre i et passende medium. Passende kan en buffer med passende ladning, osmolari-tet, osv. bli tilsatt til prøven før, samtidig med eller etter kontakt med det faste støttemateriale.
Fordelaktig kan ikke-spesifikk binding av celler bli oppnådd i henhold til oppfinnelsen ved å felle ut cellene og støttematerialet ved å bruke et utfellingsmiddel, for eksempel ved å sette cellene i kontakt med støttematerialet ved nærvær av alkohol og salt, for eksempel ved å tilsette til prøven en buffer inneholdende alkohol og salt. Bruken av alkohol og salt ved separasjon og opprenskningsprose-dyrer så som utfelling er vanlig, og enhver egnet alkohol eller salt benyttet i slike fremgangsmåter kan bli brukt i henhold til foreliggende oppfinnelse. Således kan alkoholen passende være enhver alkohol, og lavere alkanoler så som isopropanol og etanol har blitt funnet å være egnet. Andre passende alkoholer innbefatter metanol og n-butanol.
Saltet kan stamme fra enhver passende kilde, for eksempel natrium- eller kaliumklorid eller ammoniumacetat. Passende konsentrasjoner av alkohol og salt kan bli bestemt i henhold til det nøyaktige system og de anvendte reagenser. Generelt angitt har tilsetning av 0,5 til 3 volumdeler alkohol, for eksempel 1 volumdel til prøven blitt funnet å være egnet. Passende kan alkoholen bli brukt ved konsentrasjoner på 50 - 100% (w/v). Bruken av saltkonsentrasjo-ner på for eksempel 0,1 - 10,0 M, mer spesielt 0,1 - 7,0 M, for eksempel 0,1 - 3,0 M har blitt funnet å være egnet, og passende kan saltet bli inkludert ved de ovennevnte konsentrasjoner i alkoholoppløsningen. Således kan en såkalt "cellebindende buffer" bli benyttet inneholdende alkoholen og saltet ved de ønskede konsentrasjoner. Alternativt kan saltet og alkoholen bli tilsatt separat.
Anvendelsen av alkohol som utfellende middel for cellene i henhold til oppfinnelsen er fordelaktig ved bruk av fremgangsmåten i kliniske diagnostiske prosedyrer fordi anvendelsen av alkohol for å konservere kliniske prøver er vanlig. Således kan pasientprøver enkelt bli tilsatt til en alkoholinneholdende cellebindende buffer hvorved prøvene blir konservert og gjort klar for opprenskning av nukleinsyrene .
Som et alternativ til utfelling med salt/alkohol kan andre utfellende midler bli brukt, for eksempel polyetylenglykoler (PEGs) eller andre høymolekylvektspolymere med lignende egenskaper, enten alene eller i kombinasjon med salt og/eller alkohol. Konsentrasjonene av slike polymere kan variere avhengig av det nøyaktige system, for eksempel po-lymer og celletype, mens generelt kan konsentrasjoner fra 1 til 50% (w/v), for eksempel fra 2 - 30% bli brukt.
Celler med fagosytisk aktivitet kan bli innfanget ut fra sin egenskap og "binde" eller "svelge" en partikulær fast fase, for eksempel kuler, og kan derved lett bli samlet opp. I dette tilfelle behøver den celleinneholdende prøve bare å bli satt i kontakt med eller inkubert med den faste fase under passende betingelser. Denne type celleinnfang-ning er ikke avhengig av spesifikk binding.
Det faste støttemateriale kan også bli utstyrt med enheter som assisterer den ikke-spesifikke binding av celler, for eksempel proteiner eller proteinfragmenter eller polypeptider som er bundet ikke-spesifikt av celler. Således vil for eksempel et fast støttemateriale belagt med, eller som bærer antistoff, binde celler ikke-spesifikt via Fc-resep-torer på celleoverflaten. Teknikker for å immobilisere antistoff og andre proteiner eller polypeptider på faste overflater er velkjent innen faget.
Til slutt som nevnt ovenfor kan ikke-spesifikk cellebinding til faste støttematerialer som har ladede hydrofobe eller hydrofile overflater bli oppnådd ved å bruke buffere, ofte i kombinasjon med salt for å oppnå pH-betingelser som er passende for binding. De nøyaktige buffere og betingelser vil variere avhengig av typen celle, fast støttemateriale, osv..
De forskjellige komponenter blir blandet og enkelt tillatt å stå i et egnet tidsintervall for å tillate cellene å binde seg til støttematerialet. Støttematerialet kan så bli fjernet fra oppløsningen på enhver passende måte som selvfølgelig vil avhenge av naturen til støttematerialet og innbefatter alle former for fjerning av støttemateriale bort fra prøvesupernatanten eller vice versa, for eksempel sentrifugering, dekantering, pipettering, osv..
Betingelsene i løpet av denne prosess er ikke kritiske og det er for eksempel funnet passende enkelt å blande prøven med den "cellebindende buffer" i nærvær av en fast fase og tillate dette å stå ved romtemperatur for eksempel i 5 til 30 minutter, eksempelvis 20 minutter før separasjonen. Som nevnt ovenfor er reaksjonstiden ikke kritisk, og så lite som 5 minutter kan være nok. Imidlertid kan om nødvendig lengre perioder bli benyttet, for eksempel 20 minutter til 3 timer eller til og med over natten. Blanding kan bli foretatt på enhver passende måte, innbefattende for eksempel enkel agitasjon ved omrøring eller virvling. I tillegg kan om ønsket høyere eller lavere temperaturer bli brukt, men er ikke nødvendig.
Andre valgfrie komponenter i den "cellebindende" blanding innbefatter høymolekylvektspolymere, for eksempel PEGs, etc, svake uladede detergenter, for eksempel Triton X-100, NP-40, DNA(ser) og andre enzymer så lenge de etterlater cellene intakt.
Foretrukne "cellebindende" sammensetninger kan for eksempel omfatte:
isopropanol, 0,75 M ammoniumacetat
75% etanol, 0,75 M ammoniumacetat
Selv om ikke-spesifikk binding av celler er foretrukket i henhold til oppfinnelsen er det også mulig å bruke faste støttematerialer som har blitt modifisert for å tillate selektiv innfangning av ønskede celler inneholdende nukleinsyrene. Således kan for eksempel støttematerialer som bærer antistoff eller andre bindende proteiner, for eksempel lektiner som er spesifikke for en ønsket celletype bli brukt. Dette kan innføre en grad av selektivitet til isoleringen av nukleinsyren fordi kun nukleinsyrer fra en ønsket målkilde innen en sammensatt blanding kan bli utskilt. Således kan for eksempel et slikt støttemateriale bli brukt for å skille ut og fjerne den ønskede målcelletype, osv. fra prøven.
Fremstillingen av slike selektive celleinnfangningsmatriser er velkjent innen faget og beskrevet i litteraturen.
Det faste støttematerialet kan være ethvert av de velkjente støttematerialer eller matriser som for tiden blir mye brukt eller er foreslått for immobilisering, separasjon, osv.. Disse kan ta form av partikler, ark, géler, filtre, membraner, fibre, kapillærer eller mikrotiterstrimler, rør, plater eller brønner, osv..
Passende kan støttematerialet være laget av glass, silika, latex eller et polymert materiale. Foretrukket er materialer som presenterer et stort overflateareal for binding av cellene og derpå av nukleinsyrene. Slike støttematerialer vil generelt ha en uregelmessig overflate og kan for eksempel være porøse eller partikulære, for eksempel partikler, fibre, nett, sintre eller sikter. Partikulære materialer, for eksempel kuler er generelt foretrukket grunnet deres større bindingskapasitet, spesielt polymere kuler.
Passende vil et partikulært fast støttemateriale benyttet i henhold til foreliggende oppfinnelse omfatte sfæriske perler. Størrelsen av perlene er ikke kritisk, men de kan for eksempel være i en diameterstørrelsesorden på minst 1 og foretrukket minst 2 ^m, og ha en maksimal diameter på fortrinnsvis ikke mere enn 10, og mere foretrukket ikke mere enn 6 ^m. For eksempel har perler med diameter 2,8 og 4,5 vist seg å virke godt.
Monodisperse partikler, dvs. slike som i hovedsak er uni-forme av størrelse (for eksempel størrelse med et diameter-standardavvik på mindre enn 5%) har den fordel at de gir meget uniform reaksjonsreproduserbarhet. Monodisperse po-lymerpartikler fremstilt ved teknikken beskrevet i US-A-4336173 er spesielt egnet.
Ikke-magnetiske polymerkuler som er egnet for bruk i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er tilgjengelige fra Dyno Particles AS (Lillestrøm, Norge) så vel som fra Qiagen, Pharmacia og Serotec.
Imidlertid for å hjelpe manipulering og separasjon er magnetiske kuler foretrukket. Uttrykket "magnetisk" som benyttet heri betyr at støttematerialet er i stand til å ha et magnetisk moment lagt til seg når det plasseres i et magnetisk felt og er således forskyvbart under virkningen av dette felt. Med andre ord kan et støttemateriale som omfatter magnetiske partikler lett bli fjernet med magnetisk aggregering, noe som gir en rask, enkel og effektiv måte å separere partiklene på etter de celle- og nukleinsyrebindende trinn og er en mye mindre rigorøs metode enn tradisjonelle teknikker så som sentrifugering som danner skjærekrefter som kan ødelegge celler eller nedbryte nukleinsyrer .
Således ved å bruke fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan de magnetiske partikler med celler festet bli fjernet på en passende overflate ved tilføring av et magnetisk felt, for eksempel ved å bruke en permanent magnet. Det er vanligvis tilstrekkelig å tilføre en magnet til siden av kammeret som inneholder prøveblandingen for å aggregere partiklene til veggen av kammeret og å helle bort resten av prøven.
Spesielt foretrukket er superparamagnetiske partikler, for eksempel de beskrevet av Sintef i EP-A-106873 når magnetisk aggregering og klumpdannelse av partiklene under reaksjonen kan bli unngått, noe som sikrer uniform nukleinsyreekstrak-sjon. De velkjente magnetiske partikler solgt av Dynal AS
(Oslo, Norge) som DYNABEADS er spesielt egnet for bruk i foreliggende oppfinnelse.
Funksjonaliserte belagte partikler for bruk i foreliggende oppfinnelse kan bli fremstilt ved modifikasjon av perlene i henhold til US patenter 4,336,173, 4,459,378 og 4,654,267. Således kan perler eller andre støttematerialer bli fremstilt som har forskjellige typer funksjonaliserte overflater, for eksempel positivt eller negativt ladede, hydrofile eller hydrofobe.
Forskjellige celler oppviser forskjellige grader av ikke-spesifikk binding til forskjellige overflater og støttema-terialer, og det kan være fordelaktig å "titrere" mengden av det faste støttematerialet (for eksempel antallet partikler) pr. volumenhet for å optimalisere de cellebindende betingelser og bestemme det optimale støttearealet, for eksempel partikkelkonsentrasjonen for et gitt system.
Etter cellebinding blir de isolerte og støttemateriale-bundne celler lysert for å frigjøre sine nukleinsyrer. Metoder for cellelysis er velkjent innen faget og godt beskrevet i litteraturen, og enhver av de kjente metoder kan bli brukt. Forskjellige metoder kan være mer passende for forskjellige celler, men enhver av de følgende metoder kunne for eksempel bli brukt: detergentlysis, for eksempel SDS, LiDS eller sarkosyl i passende buffere; anvendelse av kaotroper så som Guanidium Hydroklorid (GHC1), Guanidium tiocyanat (GTC), natriumiodid (Nal), perklorat, osv., me-kanisk ødeleggelse så som med en fransk presse, ultralyd-behandling, maling med glassperler, aluminium eller i fly-tende nitrogen; enzymatisk lysis, for eksempel ved å bruke lysozym, proteinaser, pronaser eller cellulaser eller ethvert av de andre lysiske enzymer som er kommersielt tilgjengelige; lysis av celler med bakteriofag eller virus-infeksjon; frysetørking; osmotisk sjokk; mikrobølgebehand-ling; temperaturbehandling; for eksempel ved oppvarming eller koking eller frysing, for eksempel i tørris eller fly-tende nitrogen og tining; alkalisk lysis. Som nevnt ovenfor er alle slike metoder standard lysisteknikker og er velkjent innen faget, og enhver slik metode eller kombinasjon av metoder kan bli brukt.
Passende kan lysis oppnås i henhold til foreliggende oppfinnelse ved å bruke kaotroper og/eller detergenter. For eksempel i tilfelle med bakterielle celler har kombinasjo-nen av en kaotrop med en detergent blitt funnet å være spesielt effektiv. Et eksempelvis egnet lysismiddel innbefatter således en kaotrop så som en GTC eller GHC1 og en detergent så som SDS eller Sarkosyl. Lysismidlet kan bli tilført i enkel vandig oppløsning eller de kan bli inkludert i en bufferoppløsning for å danne en såkalt "lysisbuffer". Enhver passende buffer kan bli brukt, innbefattende for eksempel Tris, Bicine, Tricine og fosfatbufre. Alternativt kan lysismidlene bli tilsatt separat. Egnede konsentrasjoner og mengder av lysismidler ville variere i henhold til det nøyaktige system, naturen av cellene, osv, og kan bli enkelt bestemt, men konsentrasjoner på for eksempel 2M til 7M kaotrofer så som GTC GHC1, Nal eller perklorat kan bli brukt, 0,1M til IM alkaliske midler så som NaOH og 0,1 til 50% (w/v), for eksempel 0,5 til 15% detergent. Således innbefatter et eksempel på en egnet repre-sentativ lysisbuffer en vandig oppløsning på 4M GTC, 1%
(w/v) sarkosyl.
For å utføre fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan de isolerte støttematerialebundne celler passende bli fjernet eller separert fra det gjenværende av prøven for derved å konsentrere eller anrike cellene. På denne måten virker det cellebindende trinn til å anrike cellene eller å konsentrere dem i et mindre volum enn den opprinnelige prøve. Lysis kan så bli oppnådd ved å tilsette en egnet lysisbuffer inneholdende de ønskede lysismidler eller ved å utsette de isolerte celler for de ønskede lysisbetingelser. For eksempel i tilfelle med enkelt å tilsette en lysisbuffer inneholdende egnet lyserende midler kan de isolerte celler enkelt bli inkubert i nærvær av lysisbufferen i et passende intervall for å tillate lysis å finne sted. Forskjellige inkuberingsbetingelser kan være hensiktsmessige for forskjellige lysissystemer og er kjent innen faget. For eksempel, for en detergent og/eller kaotrop inneholdende lysisbuffer kan inkubering finne sted ved romtemperatur eller ved høyere temperaturer, for eksempel 37°C eller 65°C. Likeledes kan inkuberingstiden varieres fra ett par minutter, for eksempel 5 eller 10 minutter til timer, for eksempel 1 til 2 timer. I tilfellet med GTC/sarkosyl lysisbuffer og bakterielle celler har inkubering ved for eksempel 65°C i 10 til 20 minutter blitt funnet å være passende, men dette kan selvfølgelig varieres etter behov. For enzymatisk lysis som for eksempel bruker proteinase K, osv. kan lengre behandlingstid være nødvendig, for eksempel over natten.
Etter lysis blir de frigjorte nukleinsyrer bundet til samme støttemateriale til hvilket de lyserte celler er bundet. Denne nukleinsyrebinding kan bli oppnådd på enhver måte som er kjent innen faget for å binde nukleinsyrer til faste støttematerialer. Passende blir nukleinsyre bundet ikke-spesif ikt til støttematerialet, dvs. uavhengig av sekvens. Derfor kan for eksempel de frigjorte nukleinsyrer bli utfelt på støttematerialet ved å bruke enhver av de kjente utfellingsmidler for nukleinsyrer, for eksempel alkoholer, alkohol/saltkombinasjoner, polyetylenglykoler (PEGs), osv.. Utfelling av nukleinsyrer på kuler på denne måte er for eksempel beskrevet i WO 91/12079. På denne måten kan salt bli tilsatt til støttematerialet og frigjort nukleinsyre-oppløsning etterfulgt av tilsetning av alkohol som vil gjøre at nukleinsyren feller ut. Alternativt kan saltet og alkoholen bli tilsatt sammen eller saltet kan bli utelatt. Som beskrevet ovenfor, med hensyn til det cellebindende trinn kan enhver passende alkohol eller salt bli brukt, og passende mengder eller konsentrasjoner kan lett bli bestemt .
Alternative ikke-spesifikke nukleinsyrebindingsteknikker innbefatter bruken av detergenter som beskrevet i WO 96/18731 til Dynal AS (den såkalte "DNA Direct"-prosedyre) og bruken av kaotroper og en nukleinsyrebindende fast fase så som silikapartikler som beskrevet av Akzo N.V. i EP-A-0389063.
Ionisk binding av nukleinsyren til støttematerialet kan bli oppnådd ved å bruke et fast støttemateriale som har en la-det overflate, for eksempel et støttemateriale belagt med polyaminer.
Støttematerialet som blir brukt i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan også bære funksjonelle grupper som assisterer i den spesifikke eller ikke-spesifikke binding av nukleinsyrer, for eksempel DNA-bindende proteiner, eksempelvis leucin-glidelåser eller histoner eller interkaler-ende fargestoffer (for eksempel etidiumbromid eller Hoechst 42945) som kan bli lagt på støttematerialet.
Likeledes kan støttematerialet være utstyrt med bindingspartnere for å assistere i selektiv innfangning av nukleinsyrer. For eksempel kan komplementære DNA- eller RNA-se-kvenser eller DNA-bindende proteiner bli brukt eller virale proteiner som binder til virale nukleinsyrer. Festingen av slike proteiner til det faste støttematerialet kan bli oppnådd ved å bruke teknikker som er velkjent innen faget.
En passende metode å felle ut nukleinsyren i henhold til oppfinnelsen er ved å tilsette et utfellende middel, for eksempel alkohol til blandingen inneholdende støttemateri-ale og de lyserte celler. På denne måten kan et passende volum av alkohol, for eksempel 100% eller 96% etanol enkelt bli tilsatt til blandingen og inkubert over en tidsperiode som er tilstrekkelig til å tillate de frigjorte nukleinsyrer å bli bundet til støttematerialet. Inkuberingsbeting-elsene for dette trinn er ikke kritiske og kan enkelt omfatte å inkubere i 5 til 10 minutter ved romtemperatur. Imidlertid kan tidslengden variere og temperaturen valg-fritt økes.
Selv om det ikke er nødvendig kan det være passende å in-trodusere ett eller flere vasketrinn til isolasjonsmetoden ifølge oppfinnelsen, for eksempel etter det nukleinsyrebindende trinn. Enhver konvensjonell vaskebuffer eller annet medium kan bli brukt. Generelt angitt er lave til mo-derate ionestyrkebuffere foretrukket, for eksempel 10 mM Tris-HCl ved pH 8,0/10mM NaCl. Andre standard vaskemedier, for eksempel inneholdende alkoholer kan også bli benyttet, om ønsket, for eksempel vask med 70% etanol.
Bruken av magnetiske partikler tillater lette vasketrinn enkelt ved å aggregere partiklene, fjerne det nukleinsyrebindende medium, tilsette vaskemediet og reaggregere partiklene så mange ganger som nødvendig.
Etter nukleinsyreisoleringsprosessen og ethvert eventuelt vasketrinn som kan være ønsket, kan støttematerialet som bærer den bundne nukleinsyre bli overført, for eksempel re-suspendert eller neddykket i ethvert egnet medium, for eksempel vann eller buffer med lav ionestyrke. Avhengig av støttematerialet og naturen til enhver etterfølgende pro-sessering som er ønsket kan det, eller kan det ikke være gunstig å frigjøre nukleinsyren fra støttematerialet.
I tilfellet med et partikulært støttemateriale så som magnetiske eller ikke-magnetiske kuler kan dette i mange tilfeller bli brukt direkte, for eksempel i PCR eller andre amplifikeringer uten å eluere nukleinsyren fra støttemate-rialet. I tillegg er eluering ikke nødvendig for mange DNA påvisnings- eller identifikasjonsmetoder selv om DNA kan være tilfeldig kontakt med kuleoverflaten og være bundet ved et antall punkter med hydrogenbindinger eller ioniske eller andre krefter, vil det generelt være tilstrekkelige lengder av DNA tilgjengelig for hybridisering til oligonukleotider og for amplifikering.
Imidlertid om ønsket, kan eluering av nukleinsyren lett bli oppnådd ved å bruke kjente metoder, for eksempel ved oppvarming, eksempelvis til 65°C i 5 til 10 minutter, hvorpå støttematerialet kan bli fjernet fra mediet, noe som etterlater nukleinsyren i oppløsning. Slik oppvarming blir automatisk oppnådd i PCR med DNA denatureringstrinnet som går foran cykliseringsprogrammet.
Dersom det er ønskelig å fjerne RNA fra DNA kan dette bli oppnådd ved å ødelegge RNA før DNA separasjonstrinnet, for eksempel ved tilsetning av en RNAse eller en base så som NaOH.
En fordel ved foreliggende oppfinnelse er at den er rask og enkel å utføre, og med en passende kombinasjon av cellebinding, lysis og nukleinsyrebindingstrinn blir dette en fremgangsmåte som pålitelig og enkelt gir isolerte nukleinsyrer i en kort tidsperiode, i de fleste tilfeller mindre enn en time eller til og med mindre enn 45 minutter. En-kelheten av metoden tillater høyt behandlingstempo av prø-ver. Samtidig resulterer cellebindingstrinnet i en anrik-ning eller konsentrasjon av cellene og forbedrer derved nukleinsyreisoleringsprosessen.
Oppfinnelsen kan fordelaktig tilpasses automatisering, spesielt dersom partikler og spesielt magnetiske partikler blir brukt som støttemateriale.
Som nevnt ovenfor har fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen spesiell anvendbarhet som et preliminært førstetrinn for å fremstille nukleinsyrer til bruk i nukleinsyrebaserte påvisningsprosedyrer.
Således er et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse anvendelsen av nukleinsyreisoleringsmetoden som beskrevet ovenfor ved fremstilling av nukleinsyre for bruk i en nukleinsyrebasert målcellepåvisningsmetode som angitt i krav 16.
Betraktet alternativt fremskaffer dette aspekt av oppfinnelsen en fremgangsmåte for å påvise tilstedeværelse eller fravær av en målcelle i en prøve hvor nevnte fremgangsmåte omfatter: (a) å binde celler i nevnte prøve til et fast støttemate-riale for å isolere celler fra prøven; (b) lysere de isolerte celler; (c) binde nukleinsyre frigjort fra nevnte lyserte celler til nevnte samme faste støttemateriale; og (d) påvise tilstedeværelse eller fravær av nukleinsyrer som er karakteristiske for nevnte målceller inne i nevnte bundne nukleinsyre som angitt i krav 17.
Som nevnt ovenfor behøver fordelaktig den bundne nukleinsyre ikke å bli eluert eller fjernet fra støttematerialet før utførelse av påvisningstrinnet selv om dette om ønsket kan bli utført. Hvorvidt nukleinsyren blir eluert eller ikke kan også avhenge av den spesielle metode som ble benyttet i det nukleinsyrebindende trinn. Således vil visse nukleinsyrebindende fremgangsmåter binde nukleinsyren enda kraftigere enn andre. I tilfelle med DNA-binding som bruker detergenter (for eksempel med DNA Direct) vil nukleinsyren eluere fra det faste støttemateriale når en eluer-ingsbuffer eller annet passende medium blir innført. Nukleinsyre bundet ved hjelp av et utfellende middel, så som alkohol eller en kaotrop, vil forbli enda tettere bundet og behøver ikke eluere når den plasseres i et buffermedium og kan kreve oppvarming for å bli eluert.
Således kan den støttematerialebundne nukleinsyre bli benyttet direkte i en nukleinsyrebasert påvisningsprosedyre, spesielt dersom støttematerialet er partikulært, enkelt ved å resuspendere støttematerialet i eller tilsette til støt-tematerialet et medium som er passende for påvisningstrinnet. Enten kan nukleinsyren eluere i mediet eller som nevnt ovenfor er det ikke nødvendig for den å eluere.
Et antall forskjellige teknikker for å påvise nukleinsyrer er kjent og beskrevet i litteraturen og enhver av disse kan bli brukt i henhold til foreliggende oppfinnelse. Enklest kan nukleinsyren bli påvist med hybridisering til en probe og svært mange slike hybridiseringsmetoder har blitt beskrevet (se for eksempel Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY). Mest vanlig vil påvisning-en involvere et in situ hybridiseringstrinn og/eller et in vitro amplifikeringstrinn som bruker enhver av metodene beskrevet i litteraturen for dette. Som nevnt kan teknikker så som LAR, 3SR og Q-beta-replikasesystemet bli benyttet. Imidlertid vil PCR og dets forskjellige modifikasjoner, for eksempel bruken av nestede primere generelt være den valgte metode (se for eksempel Abramson og Myers, 1993, Current Opinion in Biotechnology, 4:41-47 for en oversikt av nukleinsyre amplifikeringsteknikker).
Andre påvisningsmetoder kan være basert på en sekvenser-ingstilnærming, for eksempel minisekvenseringsmetoden som beskrevet av Syvånen og Soderlund, 1990, Genomics, 8: 684-692.
I amplifikeringsteknikker så som PCR kan oppvarmingen som er nødvendig i det første trinn for å smelte DNA-dupleksen frigjøre det bundne DNA fra støttematerialet. Således i tilfellet med etterfølgende påvisningstrinn, så som PCR, kan den støttematerialbundne nukleinsyre bli tilsatt direkte til reaksjonsblandingen og nukleinsyren vil eluere i første trinn av påvisningsprosessen. Hele den isolerte støttematerialbundne nukleinsyreprøve oppnådd i henhold til oppfinnelsen kan bli brukt i påvisningstrinnet eller en alikot.
Resultatene av PCR eller andre påvisningstrinn kan bli vist eller visualisert på enhver måte som er beskrevet innen faget. For eksempel kan PCR eller andre amplifikasjonspro-sedyrer bli utført på en elektroforesegel, for eksempel en etidiumbromidfarget agarosegel ved å bruke kjente teknikker. Alternativt kan DIANA-systemet bli benyttet som er en modifikasjon av den nestede primerteknikk. I DIANA (De-tection of Immobilised Amplified Nucleic Acids) systemet (se Wahlberg et al., Mol. Cell Probes 4: 285 (1990), bærer det indre andre par av primere, henholdsvis anordninger for immobilisering for å tillate innfangning av amplifikert DNA, og en markør eller midler for festing av en markør for å tillate gjenkjennelse. Dette gir den doble fordel med redusert bakgrunnssignal og en rask og lett metode for å påvise det amplifikerte DNA.
Den amplifikerte nukleinsyre kan også bli påvist eller re-sultatet bekreftet ved sekvensering ved å bruke enhver av de mange forskjellige sekvenseringsteknikker som nå er tilgjengelige, for eksempel standard sekvensering, fastfase-sekvensering, cyklisk sekvensering, automatisk sekvensering og minisekvensering.
Fordelaktig har det nå blitt funnet at isolerte celler kan bli holdt i en "cellebindende" buffer i henhold til oppfinnelsen, for eksempel en salt/alkoholbuffer i minst én uke ved romtemperatur uten noe påviselig tap av følsomhet i et etterfølgende nukleinsyrepåvisningstrinn. Slik stabi-litet er en fordel i feltsituasjoner.
De forskjellige reaktanter og komponenter som er nødvendige for å utføre fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan passende bli forhandlet i form av sett.
I sin enkleste form kan et slikt sett for å isolere nukleinsyrer fra en prøve omfatte: (a) et fast støttemateriale; (b) eventuelt, innretninger for å binde celler til nevnte faste støttemateriale;
(c) innretninger for å lysere nevnte celler; og
(d) innretninger for å binde nukleinsyrer frigjort fra nevnte lyserte celler til nevnte samme faste støttemateri-ale .
De forskjellige innretninger (b), (c) og (d) kan være som beskrevet og diskutert ovenfor i relasjon til fremgangsmåten av oppfinnelsen.
En ytterligere valgfri komponent er (e), innretninger for å påvise tilstedeværelse eller fravær av nukleinsyre som er karakteristisk for en målcelle innenfor nevnte nukleinsyre-bånd. Som diskutert ovenfor kan slike innretninger innbefatte passende probe eller primer oligonukleotidsekvenser for bruk i hybridisering og/eller amplifikeringsbaserte påvisnings teknikker .
Eventuelt kan det ytterligere være inkludert i et slikt sett buffere, salter, polymere, enzymer, osv..
Oppfinnelsen vil nå bli beskrevet i større detalj i de føl-gende eksempler under henvisning til tegningene hvor: Figur 1 viser resultatene på EtBr-farget agarosegel-elek-troforese av separasjonen av PCR-amplifikeringsprodukter av DNA oppnådd i henhold til oppfinnelsen fra celler av 5 cya-nobakterielle arter. Spor 1 til 7 tilsvarer prøvene 1 til 7 som beskrevet i eksempel 1.
Eksempel 1
Materialer
Prøve 1; Planktothrix rubescens NIVA-CYA 1,
prøve 2; Planktothrix agardhii NIVA-CYA 29
prøve 3; Planktothrix rubescens NIVA-CYA 55
prøve 4; Planktothrix mougeotii NIA-CYA 56/1
prøve 5; Planktothrix agardhii NIVA-CYA 116
prøve 6; negativ kontroll på celle og DNA-opprensknings
reagenser; og
prøve 7: negativ kontroll på PCR-reagenser.
Celle og DNA isoleringsmetode:
0,5 ml vann inneholdende omtrent 10<5> celler som blandet med 20 ^1 kuler (1 ^g/ml) og 0,5 ml cellebindende buffer (isopropanol, 0,75 M NH4Ac) i et mikrosentrifugerør. Blandingen ble inkubert ved romtemperatur i 20 minutter og derpå ble røret plassert i en MPC-E-magnet (Dynal A.S.) i 2 minutter. Supernatanten ble forsiktig fjernet. 50 fil 4 M GTC, 1% sarkosyl ble tilsatt og inkubert ved 65°C i 10 minutter. Derpå ble 200 ^1 av 96% EtOH tilsatt og inkuber-ingen fortsatte i 5 minutter ved romtemperatur. Kulene ble tiltrukket til rørveggen med magneten og supernatanten ble fjernet. Komplekset ble vasket 2 ganger med 500 ^1 70% EtOH. All etanolen ble fjernet og 50 ^1 vann ble tilsatt. For å fjerne gjenværende etanol ble rørene inkubert ved 65°C i 10 minutter med et åpent lokk.
PCR- amplifikering:
Området mellom genene som koder for RuBisCo stor (Rbcl) og liten subenhet (Rbcs) ble amplifikert. Amplifikeringer ble foretatt ved å bruke GeneAmp 2400 PCR-systemet (Perkin Ei-mer) i 50 ^1 volumer inneholdende 10 pmol primere (CW)
5'CGTAGCTTCCGGTGGTATCCACGT3' og
(DF)5'GGGCARYTTCCACAKNGTCCA3', 200 \ M dNTP, 10 mM Tris-HCl (pH 8,8) 1,5 mM MgCl2, 50 mM KC1, 0,1% Triton X-100, 1U DynaZyme termostabil DNA-polymerase (Finnzymes Oy) og 5 ^1 av kule/DNA-oppløsningen. PCR-programmet som ble benyttet har et initialt denatureringstrinn ved 94°C i 4 minutter, derpå cyklisering med parametrene; 94°C i 30 sekunder, 40°C i 30 sekunder og 72°C i 2 minutter i 2 cykler, derpå 94°C i 30 sekunder, 60°C i 30 sekunder og 72°C i 2 minutter i 40 cykler. Til slutt ble et forlengelsestrinn i 7 minutter inkludert. Med DNA-sekvensering ble de amplifikerte frag-menter verifisert til å være området mellom RuBisCo store (Rbcl) og lille (Rbcs) subenhet.
Gel:
10 ^1 av de amplifikerte produkter fra hver av prøve 1 til 7 ble satt på en 1,5% EtBr-farget agarosegel i 30 minutter ved 100 volt. Molekylvektstandarden var <j)X 174 Haelll-spaltet DNA. Resultatene er vist i figur 1.
Resultater:
Figur 1 viser klart at cellene fra alle prøvene 1 til 5 kunne bli påvist. Basert på fremskaffede PCR-resultater som visualisert på den EtBr-fargede agarosegel, ble påvis-ningsgrensen beregnet til å være 10 til 100 celler/ml.
Claims (18)
1. Fremgangsmåte ved isolering av nukleinsyre fra en prøve av prokaryote eller eukaryote celler hvor nevnte fremgangsmåte omfatter: (a) å fremskaffe et fast støttemateriale og blande dette med celleprøven og tillate binding av celler i nevnte prøve til det faste støttematerialet for å isolere celler fra prøven; (b) lysere de isolerte celler; og (c) binde nukleinsyre frigjort fra nevnte lyserte celler til nevnte samme faste støttemateriale og enten (d) eluere nukleinsyre fra nevnte faste støttemateriale; eller (e) anvende den støttemiddelbundne nukleinsyre direkte i en nukleinsyre-basert påvisningsprosedyre.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor nevnte nukleinsyre er DNA.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller krav 2 hvor i trinn (a) cellene blir utfelt på støttematerialet ved å bruke et utfellingsmiddel.
4. Fremgangsmåte ifølge krav 3 hvor utfellingsmidlet omfatter alkohol og salt.
5. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller krav 2 hvori trinn (a) cellene bindes til støttematerialet ved hjelp av cellebindende enheter anbrakt på eller i støttematerialet.
6. Fremgangsmåte ifølge krav 5 hvor nevnte cellebindende enheter tillater selektiv binding av målceller.
7. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-6 hvor det faste støttematerialet er et partikulært materiale.
8. Fremgangsmåte ifølge krav 7 hvor støttematerialet omfatter magnetiske kuler.
9. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 8, hvor cellene i trinn (b) blir lysert ved å bruke en detergens eller en kaotrop.
10. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-9 hvori trinn (c) nukleinsyren er bundet ikke-spesifikt til støtte-materialet .
11. Fremgangsmåte ifølge krav 10 hvor nukleinsyren blir utfelt på støttematerialet ved å bruke et utfellingsmiddel.
12. Fremgangsmåte ifølge krav 11 hvor det utfellende middel omfatter alkohol og eventuelt salt og/eller en detergent .
13. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-9 hvori trinn (c) nukleinsyren binder til støttematerialet ved hjelp av bindingspartnere anbrakt på støttematerialet for å assistere med selektiv innfangning av nukleinsyrer.
14. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-13 hvor cellene bundet til støttematerialet blir adskilt fra resten av prøven for derved å konsentrere cellene.
15. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-14 hvor det faste støttematerialet er i form av partikler, og hvor i trinn A nevnte prøve blir blandet med nevnte partikulære støttemateriale og tillatt å stå i et passende tidsintervall for å tillate cellene å binde til støttematerialet hvorpå støttematerialet blir fjernet fra resten av prøven.
16. Anvendelse av nukleinsyre isoleringsmetode som angitt i ethvert av kravene 1-15 ved fremstilling av nukleinsyre for bruk i en nukleinsyrebasert målcellepåvisningsmetode.
17. Fremgangsmåte ved påvisning av tilstedeværelse eller fravær av en eukaryot eller prokaryot målcelle i en prøve hvor fremgangsmåten omfatter: (a) å fremskaffe et fast støttemateriale og blande dette med prøven og tillate binding av celler i nevnte prøve til det faste støttematerialet for å isolere celler fra prøven; (b) lysere de isolerte celler; (c) binde den frigjorte nukleinsyre fra nevnte lyserte celler til samme faste støttemateriale og; (d) påvise tilstedeværelse eller fravær av nukleinsyre som er karakteristisk for nevnte målceller innen nevnte bundende nukleinsyre.
18. Fremgangsmåte ifølge krav 17 hvor nevnte påvisningstrinn (d) omfatter in situ hybridisering og/eller in vitro amplifikering og/eller nukleinsyresekvensering.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB9709728.1A GB9709728D0 (en) | 1997-05-13 | 1997-05-13 | Single step method |
PCT/GB1998/001358 WO1998051693A1 (en) | 1997-05-13 | 1998-05-13 | Solid-phase nucleic acid isolation |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO995566D0 NO995566D0 (no) | 1999-11-12 |
NO995566L NO995566L (no) | 2000-01-11 |
NO328019B1 true NO328019B1 (no) | 2009-11-09 |
Family
ID=10812257
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO19995566A NO328019B1 (no) | 1997-05-13 | 1999-11-12 | Fremgangsmate ved fastfase nukleinsyreisolering |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6617105B1 (no) |
EP (1) | EP0988307B2 (no) |
JP (1) | JP4175670B2 (no) |
CN (1) | CN1187362C (no) |
AT (1) | ATE207494T1 (no) |
AU (1) | AU751324B2 (no) |
CA (1) | CA2289943C (no) |
DE (1) | DE69802191T3 (no) |
DK (1) | DK0988307T4 (no) |
ES (1) | ES2163865T5 (no) |
GB (1) | GB9709728D0 (no) |
NO (1) | NO328019B1 (no) |
PT (1) | PT988307E (no) |
WO (1) | WO1998051693A1 (no) |
Families Citing this family (78)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9425138D0 (en) * | 1994-12-12 | 1995-02-08 | Dynal As | Isolation of nucleic acid |
ATE396279T1 (de) * | 1998-02-02 | 2008-06-15 | Qiagen North American Holdings | Verfahren zur isolierung, amplifizierung und charakterisierung von dns |
US6387632B2 (en) | 1998-06-11 | 2002-05-14 | Hitachi, Ltd. | Polynucleotide separation method and apparatus therefor |
US6093370A (en) * | 1998-06-11 | 2000-07-25 | Hitachi, Ltd. | Polynucleotide separation method and apparatus therefor |
US6291179B1 (en) * | 1998-09-10 | 2001-09-18 | Whatman Plc | Product and method for separation of a sample containing multiple sources of genetic material using a solid medium |
US7790865B1 (en) * | 1999-02-02 | 2010-09-07 | Qiagen North American Holdings, Inc | Eluting reagents, methods and kits for isolating DNA |
GB0001450D0 (en) | 2000-01-21 | 2000-03-08 | Genpoint As | Cell isolation method |
GB0008787D0 (en) | 2000-04-10 | 2000-05-31 | Norsk Naeringsmiddelforskning | A method of cell detection |
GB0013658D0 (en) * | 2000-06-05 | 2000-07-26 | Dynal Asa | Nucleic acid isolation |
AU1548802A (en) * | 2000-06-21 | 2002-01-02 | Digene Corp | Universal collection medium |
PT102491B (pt) * | 2000-07-10 | 2003-02-28 | Inst Superior Tecnico | Processo para producao e purificacao de dna plasmidico |
AU2008201675B2 (en) * | 2001-05-14 | 2012-06-07 | Zygem Corporation Limited | Thermostable Proteinases From Thermophilic Bacteria |
NZ511680A (en) * | 2001-05-14 | 2004-07-30 | Univ Waikato | Method for preparing nucleic acid or DNA samples and a DNA extraction process using thermophilic proteases |
DE10129815A1 (de) | 2001-06-24 | 2003-01-09 | Profos Ag | Verfahren zur Aufreinigung von Bakterienzellen und Zellbestandteilen |
DE10230147A1 (de) * | 2001-10-09 | 2004-01-15 | Profos Ag | Verfahren zur unspezifischen Anreicherung von Bakterienzellen |
US20050032105A1 (en) * | 2001-10-12 | 2005-02-10 | Bair Robert Jackson | Compositions and methods for using a solid support to purify DNA |
US7192560B2 (en) * | 2001-12-20 | 2007-03-20 | 3M Innovative Properties Company | Methods and devices for removal of organic molecules from biological mixtures using anion exchange |
US7347976B2 (en) * | 2001-12-20 | 2008-03-25 | 3M Innovative Properties Company | Methods and devices for removal of organic molecules from biological mixtures using a hydrophilic solid support in a hydrophobic matrix |
WO2003057910A2 (en) | 2002-01-08 | 2003-07-17 | Roche Diagnostics Gmbh | Use of silica material in an amplification reaction |
CN1230531C (zh) * | 2002-12-09 | 2005-12-07 | 清华大学 | 从样品中分离细胞粒子的方法 |
CN1223680C (zh) * | 2002-12-10 | 2005-10-19 | 清华大学 | 扩增靶细胞或病毒的核酸的方法 |
CN100494399C (zh) | 2003-06-30 | 2009-06-03 | 清华大学 | 一种基于dna芯片的基因分型方法及其应用 |
NZ545469A (en) * | 2003-09-12 | 2009-11-27 | Biocontrol Systems Inc | Methods, compositions, and kits for the concentration and detection of microorganisms without a separate DNA extraction step |
JP2007516729A (ja) * | 2003-12-30 | 2007-06-28 | シグマ−アルドリッチ・カンパニー | 酵素消化による核酸の迅速な調製 |
JP4831725B2 (ja) * | 2004-02-13 | 2011-12-07 | 栄研化学株式会社 | 簡易的核酸抽出法 |
US7419798B2 (en) | 2004-10-19 | 2008-09-02 | Zybac Llc | Rapid and sensitive detection of bacteria in blood products, urine, and other fluids |
US20080305538A1 (en) * | 2004-10-19 | 2008-12-11 | Medical Innovations International, Inc. | Rapid and Sensitive Detection of Bacteria in Blood Products, Urine, and Other Fluids |
DE102005002342A1 (de) | 2005-01-18 | 2006-07-20 | GEN-Institut für Angewandte Laboranalysen GmbH | Verfahren sowie Kit zur Sterilisierung von Mikroorganismen enthaltenden Flüssigkeiten |
US20060166223A1 (en) * | 2005-01-26 | 2006-07-27 | Reed Michael W | DNA purification and analysis on nanoengineered surfaces |
US8615368B2 (en) * | 2005-03-10 | 2013-12-24 | Gen-Probe Incorporated | Method for determining the amount of an analyte in a sample |
US20060223071A1 (en) * | 2005-04-01 | 2006-10-05 | Wisniewski Michele E | Methods, compositions, and kits for detecting nucleic acids in a single vessel |
EP1712284B1 (en) * | 2005-04-15 | 2012-10-10 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Cell separation method using hydrophobic solid supports |
US20060257907A1 (en) * | 2005-04-19 | 2006-11-16 | The Regents Of The University Of California | Packed bed for nucleic acid capture and amplification |
JP2006311803A (ja) * | 2005-05-06 | 2006-11-16 | Hitachi High-Technologies Corp | 核酸精製方法、及び核酸精製器具 |
KR100682945B1 (ko) * | 2005-05-24 | 2007-02-15 | 삼성전자주식회사 | 상 분리를 이용한 세포 분리 방법 및 키트 |
US20070026435A1 (en) * | 2005-07-28 | 2007-02-01 | Polysciences, Inc. | Hydroxysilane functionalized magnetic particles and nucleic acid separation method |
GB0525231D0 (en) * | 2005-12-12 | 2006-01-18 | Genpoint As | Method |
CA2533052C (en) * | 2006-01-16 | 2016-02-09 | Yousef Haj-Ahmad | Isolating both free and protein associated dna |
KR100829585B1 (ko) * | 2006-04-07 | 2008-05-14 | 삼성전자주식회사 | 표적 세포 분리 및 신속한 핵산 분리 방법 및 장치 |
US7608399B2 (en) * | 2006-06-26 | 2009-10-27 | Blood Cell Storage, Inc. | Device and method for extraction and analysis of nucleic acids from biological samples |
KR100790880B1 (ko) * | 2006-07-05 | 2008-01-02 | 삼성전자주식회사 | 자성 비드가 결합되어 있는 소수성 다공성 중합체가 벽면에결합되어 있는 마이크로채널 또는 마이크로챔버를포함하는 미세유동장치 및 그를 이용하는 방법 |
WO2008017097A1 (en) * | 2006-08-10 | 2008-02-14 | Merck Patent Gmbh | Method for isolating cells |
US8158411B2 (en) * | 2006-08-21 | 2012-04-17 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Method of separating microorganism using nonplanar solid substrate and device for separating microorganism using the same |
KR100917465B1 (ko) * | 2006-08-21 | 2009-09-14 | 삼성전자주식회사 | 비평면 형상의 고체 지지체를 이용하여 미생물을 분리하는방법 및 미생물분리 장치 |
US20080044880A1 (en) * | 2006-08-21 | 2008-02-21 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Method of and apparatus for separating microorganisms from sample using electrodialysis and microorganism capturing means |
US20080070282A1 (en) | 2006-08-21 | 2008-03-20 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Method and device for obtaining or amplifying nucleic acid from a cell using a nonplanar solid substrate |
KR100862660B1 (ko) | 2006-09-25 | 2008-10-10 | 삼성전자주식회사 | 단일 비드에 의한 핵산의 분리 및 정제 방법 및 장치 |
US20080124777A1 (en) * | 2006-11-29 | 2008-05-29 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Method for releasing genetic material from solid phase |
US20080131954A1 (en) * | 2006-11-30 | 2008-06-05 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Method of Separating Target DNA from Mixed DNA |
JP2008167722A (ja) | 2007-01-15 | 2008-07-24 | Konica Minolta Medical & Graphic Inc | 磁性支持体上での加熱による核酸単離方法 |
US20100048410A1 (en) * | 2007-03-22 | 2010-02-25 | Advanced Liquid Logic, Inc. | Bead Sorting on a Droplet Actuator |
WO2008134470A2 (en) * | 2007-04-25 | 2008-11-06 | 3M Innovative Properties Company | Methods for nucleic acid amplification |
EP2140002A1 (en) * | 2007-04-25 | 2010-01-06 | 3M Innovative Properties Company | Compositions, methods, and devices for isolating biological materials |
WO2009117167A1 (en) * | 2008-01-02 | 2009-09-24 | Blood Cell Storage, Inc. | Devices and processes for nucleic acid extraction |
FR2926560A1 (fr) * | 2008-01-21 | 2009-07-24 | Millipore Corp | Procede d'extraction et de purification d'acides nucleiques sur membrane |
BRPI0908128A2 (pt) * | 2008-02-12 | 2015-08-04 | Novartis Ag | Método para isolamento de ácido nucleicos apoptóticos ou fetais livres de células |
US7867713B2 (en) * | 2008-04-21 | 2011-01-11 | Lawrence Livermore National Security, Llc | Polymerase chain reaction system using magnetic beads for analyzing a sample that includes nucleic acid |
CA2742598A1 (en) * | 2008-11-04 | 2010-05-14 | Blood Cell Storage, Inc. | Nucleic acid extraction on curved glass surfaces |
US8409801B2 (en) * | 2009-02-04 | 2013-04-02 | Covaris, Inc. | Method and apparatus for material separation using acoustic energy |
WO2010089098A1 (de) | 2009-02-05 | 2010-08-12 | Deklatec Gmbh | Verfahren und mittel für die tuberkulose diagnostik |
TWI407994B (zh) | 2009-10-22 | 2013-09-11 | Ind Tech Res Inst | 分離核酸的方法、試劑及套組 |
GB2475226A (en) | 2009-11-03 | 2011-05-18 | Genetic Analysis As | Universal Prokaryote 16S ribosome PCR primer pair |
US8202693B2 (en) * | 2009-11-24 | 2012-06-19 | Omega Bio-Tek, Inc. | Method of isolation of nucleic acids |
GB201011152D0 (en) * | 2010-07-02 | 2010-08-18 | Microsens Medtech Ltd | Capture of micro-organisms |
DE102010031401A1 (de) * | 2010-07-15 | 2012-01-19 | Aj Innuscreen Gmbh | Verfahren zur Anreicherung von Bakterien, Viren sowie Zellen und zur nachfolgenden Nukleinsäureisolierung |
WO2012024695A1 (en) * | 2010-08-20 | 2012-02-23 | Life Technologies Corporation | Magnetic beads having surface glycoconjugates and use thereof |
EP2619320B1 (de) * | 2010-09-24 | 2015-11-18 | Qiagen GmbH | Reagenz zum aufschluss von zellmaterial mit vollständig integriertem internem standard |
WO2012075508A2 (en) * | 2010-12-03 | 2012-06-07 | Blood Cell Storage, Inc. | Processes for isolating microorganisms |
GB201021399D0 (en) | 2010-12-16 | 2011-01-26 | Genetic Analysis As | Oligonucleotide probe set and methods of microbiota profiling |
GB201021397D0 (en) | 2010-12-16 | 2011-01-26 | Genetic Analysis As | Diagnosis of Crohn's disease |
GB201102693D0 (en) | 2011-02-16 | 2011-03-30 | Genetic Analysis As | Method for identifying neonates at risk for necrotizing enterocolitis |
US8629264B2 (en) | 2011-05-19 | 2014-01-14 | Blood Cell Storage, Inc. | Gravity flow fluidic device for nucleic acid extraction |
US9416356B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-08-16 | Abbott Molecular Inc. | Compositions and methods for nucleic acid extraction |
EP3187595B1 (en) * | 2015-12-30 | 2019-01-16 | Fundación Gaiker | Method for the detection of legionella spp. strains in environmental samples based on loop-mediated isothermal amplification (lamp), detection reagent and set of primers. |
GB201617519D0 (en) | 2016-10-14 | 2016-11-30 | Genetic Analysis As | A companion diagnostic method for use in the treatment of irritable bowel syndrome with dietary interventions or faecal microbiota transplant |
JP7317821B2 (ja) | 2017-07-17 | 2023-07-31 | スマートディーエヌエー ピーティーワイ エルティーディー | ディスバイオシスを診断する方法 |
GB201712459D0 (en) | 2017-08-02 | 2017-09-13 | Norges Miljø-Og Biovitenskapelige Univ | Treatment or prevention of gastrointestinal dysbiosis |
CN111712566A (zh) * | 2018-02-08 | 2020-09-25 | 应用干细胞有限公司 | 用于筛选靶基因变体的方法 |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4001197A (en) | 1975-06-12 | 1977-01-04 | Sala Magnetics, Inc. | Magnetic separation method |
US5077192A (en) | 1988-10-25 | 1991-12-31 | The General Hospital Corporation | Method of detecting antigenic, nucleic acid-containing macromolecular entities |
US5234809A (en) * | 1989-03-23 | 1993-08-10 | Akzo N.V. | Process for isolating nucleic acid |
NL8900725A (nl) | 1989-03-23 | 1990-10-16 | Az Univ Amsterdam | Werkwijze en combinatie van middelen voor het isoleren van nucleinezuur. |
IE64040B1 (en) | 1989-06-15 | 1995-06-28 | Akzo Nv | Method for determining nucleic acid |
ATE147792T1 (de) | 1989-11-30 | 1997-02-15 | Pharmacia Biotech Ab | Neues verfahren zum nachweis einer spezifischen nukleinsäuresequenz in einer zellprobe |
GB9003253D0 (en) * | 1990-02-13 | 1990-04-11 | Amersham Int Plc | Precipitating polymers |
US5652141A (en) * | 1990-10-26 | 1997-07-29 | Oiagen Gmbh | Device and process for isolating nucleic acids from cell suspension |
DE4034036C2 (de) | 1990-10-26 | 1994-03-03 | Diagen Inst Molekularbio | Vorrichtung und Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Zellsuspensionen |
US5491068A (en) * | 1991-02-14 | 1996-02-13 | Vicam, L.P. | Assay method for detecting the presence of bacteria |
GB9107124D0 (en) | 1991-04-05 | 1991-05-22 | Dynal As | Chemical process |
GB9425138D0 (en) * | 1994-12-12 | 1995-02-08 | Dynal As | Isolation of nucleic acid |
DE19520398B4 (de) | 1995-06-08 | 2009-04-16 | Roche Diagnostics Gmbh | Magnetisches Pigment |
GB9518156D0 (en) * | 1995-09-06 | 1995-11-08 | Medical Res Council | Method of isolating cells |
-
1997
- 1997-05-13 GB GBGB9709728.1A patent/GB9709728D0/en active Pending
-
1998
- 1998-05-13 AT AT98921592T patent/ATE207494T1/de active
- 1998-05-13 US US09/423,796 patent/US6617105B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-05-13 WO PCT/GB1998/001358 patent/WO1998051693A1/en active IP Right Grant
- 1998-05-13 DE DE69802191T patent/DE69802191T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-13 CA CA002289943A patent/CA2289943C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-05-13 AU AU74387/98A patent/AU751324B2/en not_active Ceased
- 1998-05-13 JP JP54892198A patent/JP4175670B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-05-13 CN CNB98806278XA patent/CN1187362C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-05-13 EP EP98921592A patent/EP0988307B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-13 ES ES98921592T patent/ES2163865T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-13 PT PT98921592T patent/PT988307E/pt unknown
- 1998-05-13 DK DK98921592T patent/DK0988307T4/da active
-
1999
- 1999-11-12 NO NO19995566A patent/NO328019B1/no not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-06-11 US US10/458,913 patent/US7560228B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE69802191T2 (de) | 2002-06-06 |
DK0988307T3 (da) | 2002-02-18 |
ATE207494T1 (de) | 2001-11-15 |
US20040072215A1 (en) | 2004-04-15 |
CA2289943A1 (en) | 1998-11-19 |
EP0988307A1 (en) | 2000-03-29 |
PT988307E (pt) | 2002-02-28 |
DK0988307T4 (da) | 2007-10-22 |
AU751324C (en) | 1998-12-08 |
AU751324B2 (en) | 2002-08-15 |
EP0988307B2 (en) | 2007-06-27 |
ES2163865T5 (es) | 2008-02-01 |
JP4175670B2 (ja) | 2008-11-05 |
NO995566L (no) | 2000-01-11 |
US7560228B2 (en) | 2009-07-14 |
DE69802191D1 (de) | 2001-11-29 |
WO1998051693A1 (en) | 1998-11-19 |
CN1187362C (zh) | 2005-02-02 |
DE69802191T3 (de) | 2008-02-07 |
NO995566D0 (no) | 1999-11-12 |
ES2163865T3 (es) | 2002-02-01 |
EP0988307B1 (en) | 2001-10-24 |
AU7438798A (en) | 1998-12-08 |
CA2289943C (en) | 2009-05-12 |
CN1260800A (zh) | 2000-07-19 |
JP2002507116A (ja) | 2002-03-05 |
GB9709728D0 (en) | 1997-07-02 |
US6617105B1 (en) | 2003-09-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU751324B2 (en) | Solid-phase nucleic acid isolation | |
US8202693B2 (en) | Method of isolation of nucleic acids | |
CA2207608C (en) | Isolation of nucleic acid | |
US6291248B1 (en) | Nucleic acid purification and process | |
AU2006212392B2 (en) | Method for isolating nucleic acids, the nucleic acids being immobilised on a matrix at an increased temperature | |
CA2410888C (en) | Nucleic acid isolation | |
US6582922B1 (en) | Method of extracting nucleic acids using particulate carrier | |
AU2001260507A1 (en) | Nucleic acid isolation | |
JP2006517225A (ja) | 核酸抽出のための生物学的試料の化学処理および該処理用のキット | |
JP3979996B2 (ja) | 固体支持体を使用してrnaを精製するための組成物および方法 | |
RU2766005C2 (ru) | Система очистки нуклеиновой кислоты с использованием одного буферного раствора для промывания и элюирования | |
CA2315257A1 (en) | Method for isolating short and long-chain nucleic acids |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |