NO328019B1 - Fremgangsmate ved fastfase nukleinsyreisolering - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår isoleringen av nukleinsyrer, og spesielt en fremgangsmåte for å isolere nukleinsyre fra prokaryote eller eukaryote celler hvor fremgangsmåten omfatter de trekk som går frem av krav 1, og hvor fremgangsmåten kombinerer et fastfasecelleisoleringstrinn med et fastfase-DNA-isoleringstrinn.

Isoleringen av nukleinsyre er et viktig trinn i mange bio-kjemiske og diagnostiske prosedyrer. For eksempel er separasjonen av nukleinsyrer fra de komplekse blandinger hvor de ofte blir funnet, stadig nødvendig før andre studier og prosedyrer, for eksempel påvisning, kloning, sekvensering, amplifisering, hybridisering, cDNA-syntese, osv. kan bli foretatt. Tilstedeværelsen av store mengder cellulært eller annet forurensende materiale, for eksempel proteiner eller karbohydrater i slike sammensatte blandinger hindrer ofte mange av reaksjonene og teknikkene som benyttes i molekylær biologi. I tillegg kan DNA forurense RNA-preparater og vice versa. Således er det behov for isoleringsmetoder for nukleinsyrer fra komplekse blandinger som celler, vev, osv., ikke bare fra et preparativt synspunkt, men også i de mange fremgangsmåter som er i bruk i dag som avhenger av identifiseringen av DNA eller RNA, eksempelvis diagnose av mikrobielle infeksjoner, rettsvitenskap, vev- og blodtyp-ing, påvisning av genetiske variasjoner, osv..

Bruken av DNA- eller RNA-identifikasjon er nå bredt aksep-tert som en metode for å skjelne mellom forskjellige celler eller celletyper, eller mellom varianter av samme celletype inneholdende DNA-mutasjoner. Således kan HLA-typing som mer vanlig blir utført ved identifikasjon av karakteristiske overflategener ved å bruke antistoff alternativt blir benyttet ved identifikasjon av DNA som koder for slike an-tigener. Mikrobiell infeksjon eller forurensning kan bli identifisert med nukleinsyreanalyse for å påvise målorga-nismen i stedet for å avhenge av å påvise karakteriserende trekk av cellene av mikroorganismene, for eksempel morfolo-gisk eller biokjemisk. Genetiske variasjoner kan bli identifisert på lignende måte.

Generelt blir DNA eller RNA identifisert ved hybridisering til en eller flere oligonukleotider under stringensbeting-elser som er tilstrekkelige for å sikre et lavt nivå av ikke-spesifik binding. Vanligvis blir de hybridiserende nukleotider benyttet i par som primere i de forskjellige former av in vitro amplifikering som nå er tilgjengelig i hovedsak polymerasekjedereaksjonen (PCR), men også ligase amplifikeringsreaksjonen (LAR), den selvvedvarende sekvens-replikasjon (3SR) og Q-beta replikase amplifikeringssyste-rnet. Etter amplifikering kan DNA bli videre karakterisert ved sekvensering, for eksempel ved Sanger-metoden. Amplifikering og sekvensering kan bli kombinert.

Som nevnt ovenfor krever alle metoder generelt et initialt nukleinsyre-isoleringstrinn for å separere nukleinsyren fra materialer, for eksempel proteiner som kan innvirke på hy-bridiserings- og amplifikeringsteknikkene som blir brukt.

En rekke metoder er kjent for isoleringen av nukleinsyrer, men generelt avhenger disse av en kompleks serie av eks-traksjons- og vasketrinn og er tidskrevende og arbeidskre-vende å utføre.

Klassiske metoder for isoleringen av nukleinsyrer fra sammensatte utgangsmaterialer, så som blod eller blodprodukter eller vev involverer lysis av det biologiske materiale med en detergent eller kaotrop, eventuelt ved nærvær av pro-teinnedbrytende enzymer fulgt av flere ekstraksjoner med organisk oppløsningsmidler, for eksempel fenol og/eller kloroform, etanolutfelling, sentrifugeringer og dialyse av nukleinsyrene. Ikke bare er slike metoder tungvinte og tidskrevende å utføre, men det relativt store antall trinn som er nødvendig øker risikoen for nedbrytning, tap av materiale eller kryssforurensning av prøver hvor flere prøver samtidig blir behandlet.

Forbedringer i metoder for å isolere nukleinsyrer blir således kontinuerlig lett etter, og nylig har andre metoder blitt foreslått som baserer seg på anvendelsen av en fast fase. I US-A-5,234,809 blir det for eksempel beskrevet en fremgangsmåte hvor nukleinsyrer blir bundet til en fast fase i form av silikapartikler ved nærvær av et kaotropisk middel så som et guanidiniumsalt, og derved adskilt fra resten av prøven. WO 91/12079 beskriver en fremgangsmåte hvorved nukleinsyrer blir innfanget på overflaten av en fast fase ved utfelling. Generelt blir alkoholer og salter benyttet som utfellende midler.

Selv om slike metoder aksellererer nukleinsyreseparasjons-prosessen eksisterer det fremdeles et behov for fremgangsmåter som er raske og enkle å utføre, og som tillater godt utbytte og blir dannet uten tap og spesielt som lett kan tilpasses isolering av nukleinsyrer fra celler i blandinger eller miljø hvor de kan være til stede ved lave konsentrasjoner som et preparativt førstetrinn i å isolere nukleinsyrer fra målceller i nukleinsyrebaserte cellepåvisnings-prosedyrer. Spesielt selv om hybridiseringsbaserte teknikker så som PCR og andre nukleinsyrebaserte metoder for å påvise mikroorganismer tillater høy sensitivitetspåvisning av celler i prøver, prøvepreparater, osv. er konsentrasjo-nen av målcellene og nukleinsyreopprenskningen avgjørende faktorer for å oppnå høy sensitivitet og reproduserbarhet av metoden. For tiden blir celler vanligvis først isolert fra prøven med filtrering, sentrifugering eller affinitets-binding til antistoff festet til en fast fase. Etter cellekonsentrasjonen på denne måte blir DNA så renset fra de konsentrerte celler, ofte med klassiske fenol/kloroform-ekstraksjonsmetoder som forklart ovenfor, med deres med-følgende ulemper.

Fra en artikkel til A. Mezler et al., Mitt Gebiete Lebensm. Hyg., 1996, vol 87, s. 55-72 er det kjent en metode for å påvise enterovirus i vannprøver.

Artikler av T- Kristensen et al., Nucleic Acids Res. 1987, vol 15, s.5507-5516 og av S.A. Leadon og P.A. Cerutti, Anal. Biochem., 1982, vol 120, s. 282-288 er det kjent metoder for nukleinsyreisolering.

Fra DE Al 19520398 er det kjent en metode for deteksjon av nukleinsyrer ved bruk av kuler med antistoffer for å binde celler, og fra WO Al 9112079 er det kjent en metode for å isolere nukleinsyrer ved først å binde celler til kuler og så binde de frigitte plasmidene til et nytt sett kuler.

Det blir med dette beskrevet en ny tilnærming til dette problem som integrerer celleisolering og nukleinsyreopprenskning som et enkelt "trinn" ved å bruke samme fastfase for både celleabsorbsjonen og nukleinsyreopprenskning. Dette blir oppnådd ved å binde cellene til et fast støtte-materiale som et første trinn. Det samme faste støttema-teriale blir så benyttet under tilstander som lyserer de bundne celler og som tillater nukleinsyren å binde til støttematerialet.

På denne måten kan nukleinsyre bli isolert fra en prøve i en form som er egnet for amplifikering eller andre ned-strømsprosesser med en enkel og raskt utførbar prosedyre som tar mindre enn 45 minutter.

I et aspekt fremskaffer således foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å isolere nukleinsyrer fra en celleprøve hvor nevnte fremgangsmåte omfatter: (a) å binde celler i nevnte prøve til et fast støtte-materiale for å isolere celler fra prøven;

(b) lysere de isolerte celler, og

(c) binde nukleinsyrer frigjort fra nevnte lyserte celler til nevnte samme faste støttemateriale, og der-etter elvere nukleinsyren fra støttematerialet eller anvende nukleinsyren bundet til støttematerialet direkte i nukleinsyrebaserte påvisningsprosedyrer.

Nukleinsyren kan være DNA, RNA eller enhver naturlig fore-kommende eller syntetisk modifikasjon derav, samt kombina-sjoner av dette. Fortrinnsvis vil imidlertid nukleinsyren være DNA som kan være enkelt- eller dobbeltkjedet eller i enhver annen form, for eksempel lineær eller sirkulær.

Uttrykket "celle" blir benyttet heri til å inkludere alle prokaryote (innbefattende erkebakterie) og eukaryote celler og andre levedyktige organismer så som virus og mykoplasma og sub-cellulære komponenter så som organeller. Representative "celler" innbefatter således alle typer pattedyr og ikke-pattedyr dyreceller, planteceller, protoplaster, bakterier, protozoer og virus.

Prøven kan således være ethvert materiale som inneholder nukleinsyre inne i slike celler, innbefattende for eksempel matvarer og lignende produkter, kliniske og miljømessige prøver. Således kan prøven være en biologisk prøve som kan inneholde ethvert viralt eller cellulært materiale, innbefattende alle prokaryote eller eukaryote celler, virus, bakteriofager, mykoplasma, protoplaster og organeller. Slikt biologisk materiale kan således omfatte alle typer pattedyr og ikke-pattedyr animalske celler, planteceller, alger innbefattende blågrønne alger, sopp, bakterier, pro-tosoer, osv. Representative prøver innbefatter således fullblods og blodavledede produkter så som plasma, eller buffycoat, urin, feces, cerebrospinalvæske eller enhver annen kroppsvæske, vev, cellekulturer, cellesuspensjoner, osv., samt også miljømessige prøver så som jord, vann eller matvareprøver.

Prøven kan også innbefatte relativt rene eller delvis ren-sede utgangsmaterialer så som semirene preparater fremstilt med andre celleseparasjonsprosesser.

Binding av cellene til det faste støttematerialet kan bli oppnådd på enhver kjent eller passende måte. For eksempel kan ikke-spesifikk binding av cellene til støttematerialet bli oppnådd med passende valg av det faste støttemateriale og betingelser, for eksempel den kjemiske eller fysiske na-tur av overflaten av det faste støttemateriale (for eksempel hydrofobisitet eller ladning), pH eller sammensetning av isoleringsmediet, osv..Naturen av målcellene kan også spille en rolle, og det har for eksempel blitt vist at visse hydrofobe celler lett kan binde ikke-spesifikt til hydrofobe overflater, mens hydrofile celler kan binde til mer hydrofile overflater. Negativt ladede celler så som B-lymfocytter har også blitt observert å ha en høy grad av ikke-spesifikk binding til svak positiv ladede overflater. Således kan faste støttematerialer som har passende ladede overflater for binding av en ønsket celletype bli brukt. Passende buffere, osv. kan bli brukt som medier for celle-isoleringstrinnet for å oppnå betingelser som er passende for cellebinding enkelt ved å bringe det faste støttemate-riale og prøven i kontakt med hverandre i et passende medium. Passende kan en buffer med passende ladning, osmolari-tet, osv. bli tilsatt til prøven før, samtidig med eller etter kontakt med det faste støttemateriale.

Fordelaktig kan ikke-spesifikk binding av celler bli oppnådd i henhold til oppfinnelsen ved å felle ut cellene og støttematerialet ved å bruke et utfellingsmiddel, for eksempel ved å sette cellene i kontakt med støttematerialet ved nærvær av alkohol og salt, for eksempel ved å tilsette til prøven en buffer inneholdende alkohol og salt. Bruken av alkohol og salt ved separasjon og opprenskningsprose-dyrer så som utfelling er vanlig, og enhver egnet alkohol eller salt benyttet i slike fremgangsmåter kan bli brukt i henhold til foreliggende oppfinnelse. Således kan alkoholen passende være enhver alkohol, og lavere alkanoler så som isopropanol og etanol har blitt funnet å være egnet. Andre passende alkoholer innbefatter metanol og n-butanol.

Saltet kan stamme fra enhver passende kilde, for eksempel natrium- eller kaliumklorid eller ammoniumacetat. Passende konsentrasjoner av alkohol og salt kan bli bestemt i henhold til det nøyaktige system og de anvendte reagenser. Generelt angitt har tilsetning av 0,5 til 3 volumdeler alkohol, for eksempel 1 volumdel til prøven blitt funnet å være egnet. Passende kan alkoholen bli brukt ved konsentrasjoner på 50 - 100% (w/v). Bruken av saltkonsentrasjo-ner på for eksempel 0,1 - 10,0 M, mer spesielt 0,1 - 7,0 M, for eksempel 0,1 - 3,0 M har blitt funnet å være egnet, og passende kan saltet bli inkludert ved de ovennevnte konsentrasjoner i alkoholoppløsningen. Således kan en såkalt "cellebindende buffer" bli benyttet inneholdende alkoholen og saltet ved de ønskede konsentrasjoner. Alternativt kan saltet og alkoholen bli tilsatt separat.

Anvendelsen av alkohol som utfellende middel for cellene i henhold til oppfinnelsen er fordelaktig ved bruk av fremgangsmåten i kliniske diagnostiske prosedyrer fordi anvendelsen av alkohol for å konservere kliniske prøver er vanlig. Således kan pasientprøver enkelt bli tilsatt til en alkoholinneholdende cellebindende buffer hvorved prøvene blir konservert og gjort klar for opprenskning av nukleinsyrene .

Som et alternativ til utfelling med salt/alkohol kan andre utfellende midler bli brukt, for eksempel polyetylenglykoler (PEGs) eller andre høymolekylvektspolymere med lignende egenskaper, enten alene eller i kombinasjon med salt og/eller alkohol. Konsentrasjonene av slike polymere kan variere avhengig av det nøyaktige system, for eksempel po-lymer og celletype, mens generelt kan konsentrasjoner fra 1 til 50% (w/v), for eksempel fra 2 - 30% bli brukt.

Celler med fagosytisk aktivitet kan bli innfanget ut fra sin egenskap og "binde" eller "svelge" en partikulær fast fase, for eksempel kuler, og kan derved lett bli samlet opp. I dette tilfelle behøver den celleinneholdende prøve bare å bli satt i kontakt med eller inkubert med den faste fase under passende betingelser. Denne type celleinnfang-ning er ikke avhengig av spesifikk binding.

Det faste støttemateriale kan også bli utstyrt med enheter som assisterer den ikke-spesifikke binding av celler, for eksempel proteiner eller proteinfragmenter eller polypeptider som er bundet ikke-spesifikt av celler. Således vil for eksempel et fast støttemateriale belagt med, eller som bærer antistoff, binde celler ikke-spesifikt via Fc-resep-torer på celleoverflaten. Teknikker for å immobilisere antistoff og andre proteiner eller polypeptider på faste overflater er velkjent innen faget.

Til slutt som nevnt ovenfor kan ikke-spesifikk cellebinding til faste støttematerialer som har ladede hydrofobe eller hydrofile overflater bli oppnådd ved å bruke buffere, ofte i kombinasjon med salt for å oppnå pH-betingelser som er passende for binding. De nøyaktige buffere og betingelser vil variere avhengig av typen celle, fast støttemateriale, osv..

De forskjellige komponenter blir blandet og enkelt tillatt å stå i et egnet tidsintervall for å tillate cellene å binde seg til støttematerialet. Støttematerialet kan så bli fjernet fra oppløsningen på enhver passende måte som selvfølgelig vil avhenge av naturen til støttematerialet og innbefatter alle former for fjerning av støttemateriale bort fra prøvesupernatanten eller vice versa, for eksempel sentrifugering, dekantering, pipettering, osv..

Betingelsene i løpet av denne prosess er ikke kritiske og det er for eksempel funnet passende enkelt å blande prøven med den "cellebindende buffer" i nærvær av en fast fase og tillate dette å stå ved romtemperatur for eksempel i 5 til 30 minutter, eksempelvis 20 minutter før separasjonen. Som nevnt ovenfor er reaksjonstiden ikke kritisk, og så lite som 5 minutter kan være nok. Imidlertid kan om nødvendig lengre perioder bli benyttet, for eksempel 20 minutter til 3 timer eller til og med over natten. Blanding kan bli foretatt på enhver passende måte, innbefattende for eksempel enkel agitasjon ved omrøring eller virvling. I tillegg kan om ønsket høyere eller lavere temperaturer bli brukt, men er ikke nødvendig.

Andre valgfrie komponenter i den "cellebindende" blanding innbefatter høymolekylvektspolymere, for eksempel PEGs, etc, svake uladede detergenter, for eksempel Triton X-100, NP-40, DNA(ser) og andre enzymer så lenge de etterlater cellene intakt.

Foretrukne "cellebindende" sammensetninger kan for eksempel omfatte:

isopropanol, 0,75 M ammoniumacetat

75% etanol, 0,75 M ammoniumacetat

Selv om ikke-spesifikk binding av celler er foretrukket i henhold til oppfinnelsen er det også mulig å bruke faste støttematerialer som har blitt modifisert for å tillate selektiv innfangning av ønskede celler inneholdende nukleinsyrene. Således kan for eksempel støttematerialer som bærer antistoff eller andre bindende proteiner, for eksempel lektiner som er spesifikke for en ønsket celletype bli brukt. Dette kan innføre en grad av selektivitet til isoleringen av nukleinsyren fordi kun nukleinsyrer fra en ønsket målkilde innen en sammensatt blanding kan bli utskilt. Således kan for eksempel et slikt støttemateriale bli brukt for å skille ut og fjerne den ønskede målcelletype, osv. fra prøven.

Fremstillingen av slike selektive celleinnfangningsmatriser er velkjent innen faget og beskrevet i litteraturen.

Det faste støttematerialet kan være ethvert av de velkjente støttematerialer eller matriser som for tiden blir mye brukt eller er foreslått for immobilisering, separasjon, osv.. Disse kan ta form av partikler, ark, géler, filtre, membraner, fibre, kapillærer eller mikrotiterstrimler, rør, plater eller brønner, osv..

Passende kan støttematerialet være laget av glass, silika, latex eller et polymert materiale. Foretrukket er materialer som presenterer et stort overflateareal for binding av cellene og derpå av nukleinsyrene. Slike støttematerialer vil generelt ha en uregelmessig overflate og kan for eksempel være porøse eller partikulære, for eksempel partikler, fibre, nett, sintre eller sikter. Partikulære materialer, for eksempel kuler er generelt foretrukket grunnet deres større bindingskapasitet, spesielt polymere kuler.

Passende vil et partikulært fast støttemateriale benyttet i henhold til foreliggende oppfinnelse omfatte sfæriske perler. Størrelsen av perlene er ikke kritisk, men de kan for eksempel være i en diameterstørrelsesorden på minst 1 og foretrukket minst 2 ^m, og ha en maksimal diameter på fortrinnsvis ikke mere enn 10, og mere foretrukket ikke mere enn 6 ^m. For eksempel har perler med diameter 2,8 og 4,5 vist seg å virke godt.

Monodisperse partikler, dvs. slike som i hovedsak er uni-forme av størrelse (for eksempel størrelse med et diameter-standardavvik på mindre enn 5%) har den fordel at de gir meget uniform reaksjonsreproduserbarhet. Monodisperse po-lymerpartikler fremstilt ved teknikken beskrevet i US-A-4336173 er spesielt egnet.

Ikke-magnetiske polymerkuler som er egnet for bruk i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er tilgjengelige fra Dyno Particles AS (Lillestrøm, Norge) så vel som fra Qiagen, Pharmacia og Serotec.

Imidlertid for å hjelpe manipulering og separasjon er magnetiske kuler foretrukket. Uttrykket "magnetisk" som benyttet heri betyr at støttematerialet er i stand til å ha et magnetisk moment lagt til seg når det plasseres i et magnetisk felt og er således forskyvbart under virkningen av dette felt. Med andre ord kan et støttemateriale som omfatter magnetiske partikler lett bli fjernet med magnetisk aggregering, noe som gir en rask, enkel og effektiv måte å separere partiklene på etter de celle- og nukleinsyrebindende trinn og er en mye mindre rigorøs metode enn tradisjonelle teknikker så som sentrifugering som danner skjærekrefter som kan ødelegge celler eller nedbryte nukleinsyrer .

Således ved å bruke fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan de magnetiske partikler med celler festet bli fjernet på en passende overflate ved tilføring av et magnetisk felt, for eksempel ved å bruke en permanent magnet. Det er vanligvis tilstrekkelig å tilføre en magnet til siden av kammeret som inneholder prøveblandingen for å aggregere partiklene til veggen av kammeret og å helle bort resten av prøven.

Spesielt foretrukket er superparamagnetiske partikler, for eksempel de beskrevet av Sintef i EP-A-106873 når magnetisk aggregering og klumpdannelse av partiklene under reaksjonen kan bli unngått, noe som sikrer uniform nukleinsyreekstrak-sjon. De velkjente magnetiske partikler solgt av Dynal AS

(Oslo, Norge) som DYNABEADS er spesielt egnet for bruk i foreliggende oppfinnelse.

Funksjonaliserte belagte partikler for bruk i foreliggende oppfinnelse kan bli fremstilt ved modifikasjon av perlene i henhold til US patenter 4,336,173, 4,459,378 og 4,654,267. Således kan perler eller andre støttematerialer bli fremstilt som har forskjellige typer funksjonaliserte overflater, for eksempel positivt eller negativt ladede, hydrofile eller hydrofobe.

Forskjellige celler oppviser forskjellige grader av ikke-spesifikk binding til forskjellige overflater og støttema-terialer, og det kan være fordelaktig å "titrere" mengden av det faste støttematerialet (for eksempel antallet partikler) pr. volumenhet for å optimalisere de cellebindende betingelser og bestemme det optimale støttearealet, for eksempel partikkelkonsentrasjonen for et gitt system.

Etter cellebinding blir de isolerte og støttemateriale-bundne celler lysert for å frigjøre sine nukleinsyrer. Metoder for cellelysis er velkjent innen faget og godt beskrevet i litteraturen, og enhver av de kjente metoder kan bli brukt. Forskjellige metoder kan være mer passende for forskjellige celler, men enhver av de følgende metoder kunne for eksempel bli brukt: detergentlysis, for eksempel SDS, LiDS eller sarkosyl i passende buffere; anvendelse av kaotroper så som Guanidium Hydroklorid (GHC1), Guanidium tiocyanat (GTC), natriumiodid (Nal), perklorat, osv., me-kanisk ødeleggelse så som med en fransk presse, ultralyd-behandling, maling med glassperler, aluminium eller i fly-tende nitrogen; enzymatisk lysis, for eksempel ved å bruke lysozym, proteinaser, pronaser eller cellulaser eller ethvert av de andre lysiske enzymer som er kommersielt tilgjengelige; lysis av celler med bakteriofag eller virus-infeksjon; frysetørking; osmotisk sjokk; mikrobølgebehand-ling; temperaturbehandling; for eksempel ved oppvarming eller koking eller frysing, for eksempel i tørris eller fly-tende nitrogen og tining; alkalisk lysis. Som nevnt ovenfor er alle slike metoder standard lysisteknikker og er velkjent innen faget, og enhver slik metode eller kombinasjon av metoder kan bli brukt.

Passende kan lysis oppnås i henhold til foreliggende oppfinnelse ved å bruke kaotroper og/eller detergenter. For eksempel i tilfelle med bakterielle celler har kombinasjo-nen av en kaotrop med en detergent blitt funnet å være spesielt effektiv. Et eksempelvis egnet lysismiddel innbefatter således en kaotrop så som en GTC eller GHC1 og en detergent så som SDS eller Sarkosyl. Lysismidlet kan bli tilført i enkel vandig oppløsning eller de kan bli inkludert i en bufferoppløsning for å danne en såkalt "lysisbuffer". Enhver passende buffer kan bli brukt, innbefattende for eksempel Tris, Bicine, Tricine og fosfatbufre. Alternativt kan lysismidlene bli tilsatt separat. Egnede konsentrasjoner og mengder av lysismidler ville variere i henhold til det nøyaktige system, naturen av cellene, osv, og kan bli enkelt bestemt, men konsentrasjoner på for eksempel 2M til 7M kaotrofer så som GTC GHC1, Nal eller perklorat kan bli brukt, 0,1M til IM alkaliske midler så som NaOH og 0,1 til 50% (w/v), for eksempel 0,5 til 15% detergent. Således innbefatter et eksempel på en egnet repre-sentativ lysisbuffer en vandig oppløsning på 4M GTC, 1%

(w/v) sarkosyl.

For å utføre fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan de isolerte støttematerialebundne celler passende bli fjernet eller separert fra det gjenværende av prøven for derved å konsentrere eller anrike cellene. På denne måten virker det cellebindende trinn til å anrike cellene eller å konsentrere dem i et mindre volum enn den opprinnelige prøve. Lysis kan så bli oppnådd ved å tilsette en egnet lysisbuffer inneholdende de ønskede lysismidler eller ved å utsette de isolerte celler for de ønskede lysisbetingelser. For eksempel i tilfelle med enkelt å tilsette en lysisbuffer inneholdende egnet lyserende midler kan de isolerte celler enkelt bli inkubert i nærvær av lysisbufferen i et passende intervall for å tillate lysis å finne sted. Forskjellige inkuberingsbetingelser kan være hensiktsmessige for forskjellige lysissystemer og er kjent innen faget. For eksempel, for en detergent og/eller kaotrop inneholdende lysisbuffer kan inkubering finne sted ved romtemperatur eller ved høyere temperaturer, for eksempel 37°C eller 65°C. Likeledes kan inkuberingstiden varieres fra ett par minutter, for eksempel 5 eller 10 minutter til timer, for eksempel 1 til 2 timer. I tilfellet med GTC/sarkosyl lysisbuffer og bakterielle celler har inkubering ved for eksempel 65°C i 10 til 20 minutter blitt funnet å være passende, men dette kan selvfølgelig varieres etter behov. For enzymatisk lysis som for eksempel bruker proteinase K, osv. kan lengre behandlingstid være nødvendig, for eksempel over natten.

Etter lysis blir de frigjorte nukleinsyrer bundet til samme støttemateriale til hvilket de lyserte celler er bundet. Denne nukleinsyrebinding kan bli oppnådd på enhver måte som er kjent innen faget for å binde nukleinsyrer til faste støttematerialer. Passende blir nukleinsyre bundet ikke-spesif ikt til støttematerialet, dvs. uavhengig av sekvens. Derfor kan for eksempel de frigjorte nukleinsyrer bli utfelt på støttematerialet ved å bruke enhver av de kjente utfellingsmidler for nukleinsyrer, for eksempel alkoholer, alkohol/saltkombinasjoner, polyetylenglykoler (PEGs), osv.. Utfelling av nukleinsyrer på kuler på denne måte er for eksempel beskrevet i WO 91/12079. På denne måten kan salt bli tilsatt til støttematerialet og frigjort nukleinsyre-oppløsning etterfulgt av tilsetning av alkohol som vil gjøre at nukleinsyren feller ut. Alternativt kan saltet og alkoholen bli tilsatt sammen eller saltet kan bli utelatt. Som beskrevet ovenfor, med hensyn til det cellebindende trinn kan enhver passende alkohol eller salt bli brukt, og passende mengder eller konsentrasjoner kan lett bli bestemt .

Alternative ikke-spesifikke nukleinsyrebindingsteknikker innbefatter bruken av detergenter som beskrevet i WO 96/18731 til Dynal AS (den såkalte "DNA Direct"-prosedyre) og bruken av kaotroper og en nukleinsyrebindende fast fase så som silikapartikler som beskrevet av Akzo N.V. i EP-A-0389063.

Ionisk binding av nukleinsyren til støttematerialet kan bli oppnådd ved å bruke et fast støttemateriale som har en la-det overflate, for eksempel et støttemateriale belagt med polyaminer.

Støttematerialet som blir brukt i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan også bære funksjonelle grupper som assisterer i den spesifikke eller ikke-spesifikke binding av nukleinsyrer, for eksempel DNA-bindende proteiner, eksempelvis leucin-glidelåser eller histoner eller interkaler-ende fargestoffer (for eksempel etidiumbromid eller Hoechst 42945) som kan bli lagt på støttematerialet.

Likeledes kan støttematerialet være utstyrt med bindingspartnere for å assistere i selektiv innfangning av nukleinsyrer. For eksempel kan komplementære DNA- eller RNA-se-kvenser eller DNA-bindende proteiner bli brukt eller virale proteiner som binder til virale nukleinsyrer. Festingen av slike proteiner til det faste støttematerialet kan bli oppnådd ved å bruke teknikker som er velkjent innen faget.

En passende metode å felle ut nukleinsyren i henhold til oppfinnelsen er ved å tilsette et utfellende middel, for eksempel alkohol til blandingen inneholdende støttemateri-ale og de lyserte celler. På denne måten kan et passende volum av alkohol, for eksempel 100% eller 96% etanol enkelt bli tilsatt til blandingen og inkubert over en tidsperiode som er tilstrekkelig til å tillate de frigjorte nukleinsyrer å bli bundet til støttematerialet. Inkuberingsbeting-elsene for dette trinn er ikke kritiske og kan enkelt omfatte å inkubere i 5 til 10 minutter ved romtemperatur. Imidlertid kan tidslengden variere og temperaturen valg-fritt økes.

Selv om det ikke er nødvendig kan det være passende å in-trodusere ett eller flere vasketrinn til isolasjonsmetoden ifølge oppfinnelsen, for eksempel etter det nukleinsyrebindende trinn. Enhver konvensjonell vaskebuffer eller annet medium kan bli brukt. Generelt angitt er lave til mo-derate ionestyrkebuffere foretrukket, for eksempel 10 mM Tris-HCl ved pH 8,0/10mM NaCl. Andre standard vaskemedier, for eksempel inneholdende alkoholer kan også bli benyttet, om ønsket, for eksempel vask med 70% etanol.

Bruken av magnetiske partikler tillater lette vasketrinn enkelt ved å aggregere partiklene, fjerne det nukleinsyrebindende medium, tilsette vaskemediet og reaggregere partiklene så mange ganger som nødvendig.

Etter nukleinsyreisoleringsprosessen og ethvert eventuelt vasketrinn som kan være ønsket, kan støttematerialet som bærer den bundne nukleinsyre bli overført, for eksempel re-suspendert eller neddykket i ethvert egnet medium, for eksempel vann eller buffer med lav ionestyrke. Avhengig av støttematerialet og naturen til enhver etterfølgende pro-sessering som er ønsket kan det, eller kan det ikke være gunstig å frigjøre nukleinsyren fra støttematerialet.

I tilfellet med et partikulært støttemateriale så som magnetiske eller ikke-magnetiske kuler kan dette i mange tilfeller bli brukt direkte, for eksempel i PCR eller andre amplifikeringer uten å eluere nukleinsyren fra støttemate-rialet. I tillegg er eluering ikke nødvendig for mange DNA påvisnings- eller identifikasjonsmetoder selv om DNA kan være tilfeldig kontakt med kuleoverflaten og være bundet ved et antall punkter med hydrogenbindinger eller ioniske eller andre krefter, vil det generelt være tilstrekkelige lengder av DNA tilgjengelig for hybridisering til oligonukleotider og for amplifikering.

Imidlertid om ønsket, kan eluering av nukleinsyren lett bli oppnådd ved å bruke kjente metoder, for eksempel ved oppvarming, eksempelvis til 65°C i 5 til 10 minutter, hvorpå støttematerialet kan bli fjernet fra mediet, noe som etterlater nukleinsyren i oppløsning. Slik oppvarming blir automatisk oppnådd i PCR med DNA denatureringstrinnet som går foran cykliseringsprogrammet.

Dersom det er ønskelig å fjerne RNA fra DNA kan dette bli oppnådd ved å ødelegge RNA før DNA separasjonstrinnet, for eksempel ved tilsetning av en RNAse eller en base så som NaOH.

En fordel ved foreliggende oppfinnelse er at den er rask og enkel å utføre, og med en passende kombinasjon av cellebinding, lysis og nukleinsyrebindingstrinn blir dette en fremgangsmåte som pålitelig og enkelt gir isolerte nukleinsyrer i en kort tidsperiode, i de fleste tilfeller mindre enn en time eller til og med mindre enn 45 minutter. En-kelheten av metoden tillater høyt behandlingstempo av prø-ver. Samtidig resulterer cellebindingstrinnet i en anrik-ning eller konsentrasjon av cellene og forbedrer derved nukleinsyreisoleringsprosessen.

Oppfinnelsen kan fordelaktig tilpasses automatisering, spesielt dersom partikler og spesielt magnetiske partikler blir brukt som støttemateriale.

Som nevnt ovenfor har fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen spesiell anvendbarhet som et preliminært førstetrinn for å fremstille nukleinsyrer til bruk i nukleinsyrebaserte påvisningsprosedyrer.

Således er et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse anvendelsen av nukleinsyreisoleringsmetoden som beskrevet ovenfor ved fremstilling av nukleinsyre for bruk i en nukleinsyrebasert målcellepåvisningsmetode som angitt i krav 16.

Betraktet alternativt fremskaffer dette aspekt av oppfinnelsen en fremgangsmåte for å påvise tilstedeværelse eller fravær av en målcelle i en prøve hvor nevnte fremgangsmåte omfatter: (a) å binde celler i nevnte prøve til et fast støttemate-riale for å isolere celler fra prøven; (b) lysere de isolerte celler; (c) binde nukleinsyre frigjort fra nevnte lyserte celler til nevnte samme faste støttemateriale; og (d) påvise tilstedeværelse eller fravær av nukleinsyrer som er karakteristiske for nevnte målceller inne i nevnte bundne nukleinsyre som angitt i krav 17.

Som nevnt ovenfor behøver fordelaktig den bundne nukleinsyre ikke å bli eluert eller fjernet fra støttematerialet før utførelse av påvisningstrinnet selv om dette om ønsket kan bli utført. Hvorvidt nukleinsyren blir eluert eller ikke kan også avhenge av den spesielle metode som ble benyttet i det nukleinsyrebindende trinn. Således vil visse nukleinsyrebindende fremgangsmåter binde nukleinsyren enda kraftigere enn andre. I tilfelle med DNA-binding som bruker detergenter (for eksempel med DNA Direct) vil nukleinsyren eluere fra det faste støttemateriale når en eluer-ingsbuffer eller annet passende medium blir innført. Nukleinsyre bundet ved hjelp av et utfellende middel, så som alkohol eller en kaotrop, vil forbli enda tettere bundet og behøver ikke eluere når den plasseres i et buffermedium og kan kreve oppvarming for å bli eluert.

Således kan den støttematerialebundne nukleinsyre bli benyttet direkte i en nukleinsyrebasert påvisningsprosedyre, spesielt dersom støttematerialet er partikulært, enkelt ved å resuspendere støttematerialet i eller tilsette til støt-tematerialet et medium som er passende for påvisningstrinnet. Enten kan nukleinsyren eluere i mediet eller som nevnt ovenfor er det ikke nødvendig for den å eluere.

Et antall forskjellige teknikker for å påvise nukleinsyrer er kjent og beskrevet i litteraturen og enhver av disse kan bli brukt i henhold til foreliggende oppfinnelse. Enklest kan nukleinsyren bli påvist med hybridisering til en probe og svært mange slike hybridiseringsmetoder har blitt beskrevet (se for eksempel Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY). Mest vanlig vil påvisning-en involvere et in situ hybridiseringstrinn og/eller et in vitro amplifikeringstrinn som bruker enhver av metodene beskrevet i litteraturen for dette. Som nevnt kan teknikker så som LAR, 3SR og Q-beta-replikasesystemet bli benyttet. Imidlertid vil PCR og dets forskjellige modifikasjoner, for eksempel bruken av nestede primere generelt være den valgte metode (se for eksempel Abramson og Myers, 1993, Current Opinion in Biotechnology, 4:41-47 for en oversikt av nukleinsyre amplifikeringsteknikker).

Andre påvisningsmetoder kan være basert på en sekvenser-ingstilnærming, for eksempel minisekvenseringsmetoden som beskrevet av Syvånen og Soderlund, 1990, Genomics, 8: 684-692.

I amplifikeringsteknikker så som PCR kan oppvarmingen som er nødvendig i det første trinn for å smelte DNA-dupleksen frigjøre det bundne DNA fra støttematerialet. Således i tilfellet med etterfølgende påvisningstrinn, så som PCR, kan den støttematerialbundne nukleinsyre bli tilsatt direkte til reaksjonsblandingen og nukleinsyren vil eluere i første trinn av påvisningsprosessen. Hele den isolerte støttematerialbundne nukleinsyreprøve oppnådd i henhold til oppfinnelsen kan bli brukt i påvisningstrinnet eller en alikot.

Resultatene av PCR eller andre påvisningstrinn kan bli vist eller visualisert på enhver måte som er beskrevet innen faget. For eksempel kan PCR eller andre amplifikasjonspro-sedyrer bli utført på en elektroforesegel, for eksempel en etidiumbromidfarget agarosegel ved å bruke kjente teknikker. Alternativt kan DIANA-systemet bli benyttet som er en modifikasjon av den nestede primerteknikk. I DIANA (De-tection of Immobilised Amplified Nucleic Acids) systemet (se Wahlberg et al., Mol. Cell Probes 4: 285 (1990), bærer det indre andre par av primere, henholdsvis anordninger for immobilisering for å tillate innfangning av amplifikert DNA, og en markør eller midler for festing av en markør for å tillate gjenkjennelse. Dette gir den doble fordel med redusert bakgrunnssignal og en rask og lett metode for å påvise det amplifikerte DNA.

Den amplifikerte nukleinsyre kan også bli påvist eller re-sultatet bekreftet ved sekvensering ved å bruke enhver av de mange forskjellige sekvenseringsteknikker som nå er tilgjengelige, for eksempel standard sekvensering, fastfase-sekvensering, cyklisk sekvensering, automatisk sekvensering og minisekvensering.

Fordelaktig har det nå blitt funnet at isolerte celler kan bli holdt i en "cellebindende" buffer i henhold til oppfinnelsen, for eksempel en salt/alkoholbuffer i minst én uke ved romtemperatur uten noe påviselig tap av følsomhet i et etterfølgende nukleinsyrepåvisningstrinn. Slik stabi-litet er en fordel i feltsituasjoner.

De forskjellige reaktanter og komponenter som er nødvendige for å utføre fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan passende bli forhandlet i form av sett.

I sin enkleste form kan et slikt sett for å isolere nukleinsyrer fra en prøve omfatte: (a) et fast støttemateriale; (b) eventuelt, innretninger for å binde celler til nevnte faste støttemateriale;

(c) innretninger for å lysere nevnte celler; og

(d) innretninger for å binde nukleinsyrer frigjort fra nevnte lyserte celler til nevnte samme faste støttemateri-ale .

De forskjellige innretninger (b), (c) og (d) kan være som beskrevet og diskutert ovenfor i relasjon til fremgangsmåten av oppfinnelsen.

En ytterligere valgfri komponent er (e), innretninger for å påvise tilstedeværelse eller fravær av nukleinsyre som er karakteristisk for en målcelle innenfor nevnte nukleinsyre-bånd. Som diskutert ovenfor kan slike innretninger innbefatte passende probe eller primer oligonukleotidsekvenser for bruk i hybridisering og/eller amplifikeringsbaserte påvisnings teknikker .

Eventuelt kan det ytterligere være inkludert i et slikt sett buffere, salter, polymere, enzymer, osv..

Oppfinnelsen vil nå bli beskrevet i større detalj i de føl-gende eksempler under henvisning til tegningene hvor: Figur 1 viser resultatene på EtBr-farget agarosegel-elek-troforese av separasjonen av PCR-amplifikeringsprodukter av DNA oppnådd i henhold til oppfinnelsen fra celler av 5 cya-nobakterielle arter. Spor 1 til 7 tilsvarer prøvene 1 til 7 som beskrevet i eksempel 1.

Eksempel 1

Materialer

Prøve 1; Planktothrix rubescens NIVA-CYA 1,

prøve 2; Planktothrix agardhii NIVA-CYA 29

prøve 3; Planktothrix rubescens NIVA-CYA 55

prøve 4; Planktothrix mougeotii NIA-CYA 56/1

prøve 5; Planktothrix agardhii NIVA-CYA 116

prøve 6; negativ kontroll på celle og DNA-opprensknings

reagenser; og

prøve 7: negativ kontroll på PCR-reagenser.

Celle og DNA isoleringsmetode:

0,5 ml vann inneholdende omtrent 10<5> celler som blandet med 20 ^1 kuler (1 ^g/ml) og 0,5 ml cellebindende buffer (isopropanol, 0,75 M NH4Ac) i et mikrosentrifugerør. Blandingen ble inkubert ved romtemperatur i 20 minutter og derpå ble røret plassert i en MPC-E-magnet (Dynal A.S.) i 2 minutter. Supernatanten ble forsiktig fjernet. 50 fil 4 M GTC, 1% sarkosyl ble tilsatt og inkubert ved 65°C i 10 minutter. Derpå ble 200 ^1 av 96% EtOH tilsatt og inkuber-ingen fortsatte i 5 minutter ved romtemperatur. Kulene ble tiltrukket til rørveggen med magneten og supernatanten ble fjernet. Komplekset ble vasket 2 ganger med 500 ^1 70% EtOH. All etanolen ble fjernet og 50 ^1 vann ble tilsatt. For å fjerne gjenværende etanol ble rørene inkubert ved 65°C i 10 minutter med et åpent lokk.

PCR- amplifikering:

Området mellom genene som koder for RuBisCo stor (Rbcl) og liten subenhet (Rbcs) ble amplifikert. Amplifikeringer ble foretatt ved å bruke GeneAmp 2400 PCR-systemet (Perkin Ei-mer) i 50 ^1 volumer inneholdende 10 pmol primere (CW)

5'CGTAGCTTCCGGTGGTATCCACGT3' og

(DF)5'GGGCARYTTCCACAKNGTCCA3', 200 \ M dNTP, 10 mM Tris-HCl (pH 8,8) 1,5 mM MgCl2, 50 mM KC1, 0,1% Triton X-100, 1U DynaZyme termostabil DNA-polymerase (Finnzymes Oy) og 5 ^1 av kule/DNA-oppløsningen. PCR-programmet som ble benyttet har et initialt denatureringstrinn ved 94°C i 4 minutter, derpå cyklisering med parametrene; 94°C i 30 sekunder, 40°C i 30 sekunder og 72°C i 2 minutter i 2 cykler, derpå 94°C i 30 sekunder, 60°C i 30 sekunder og 72°C i 2 minutter i 40 cykler. Til slutt ble et forlengelsestrinn i 7 minutter inkludert. Med DNA-sekvensering ble de amplifikerte frag-menter verifisert til å være området mellom RuBisCo store (Rbcl) og lille (Rbcs) subenhet.

Gel:

10 ^1 av de amplifikerte produkter fra hver av prøve 1 til 7 ble satt på en 1,5% EtBr-farget agarosegel i 30 minutter ved 100 volt. Molekylvektstandarden var <j)X 174 Haelll-spaltet DNA. Resultatene er vist i figur 1.

Resultater:

Figur 1 viser klart at cellene fra alle prøvene 1 til 5 kunne bli påvist. Basert på fremskaffede PCR-resultater som visualisert på den EtBr-fargede agarosegel, ble påvis-ningsgrensen beregnet til å være 10 til 100 celler/ml.

Claims (18)

1. Fremgangsmåte ved isolering av nukleinsyre fra en prøve av prokaryote eller eukaryote celler hvor nevnte fremgangsmåte omfatter: (a) å fremskaffe et fast støttemateriale og blande dette med celleprøven og tillate binding av celler i nevnte prøve til det faste støttematerialet for å isolere celler fra prøven; (b) lysere de isolerte celler; og (c) binde nukleinsyre frigjort fra nevnte lyserte celler til nevnte samme faste støttemateriale og enten (d) eluere nukleinsyre fra nevnte faste støttemateriale; eller (e) anvende den støttemiddelbundne nukleinsyre direkte i en nukleinsyre-basert påvisningsprosedyre.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor nevnte nukleinsyre er DNA.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller krav 2 hvor i trinn (a) cellene blir utfelt på støttematerialet ved å bruke et utfellingsmiddel.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3 hvor utfellingsmidlet omfatter alkohol og salt.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller krav 2 hvori trinn (a) cellene bindes til støttematerialet ved hjelp av cellebindende enheter anbrakt på eller i støttematerialet.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5 hvor nevnte cellebindende enheter tillater selektiv binding av målceller.

7. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-6 hvor det faste støttematerialet er et partikulært materiale.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7 hvor støttematerialet omfatter magnetiske kuler.

9. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 8, hvor cellene i trinn (b) blir lysert ved å bruke en detergens eller en kaotrop.

10. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-9 hvori trinn (c) nukleinsyren er bundet ikke-spesifikt til støtte-materialet .

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10 hvor nukleinsyren blir utfelt på støttematerialet ved å bruke et utfellingsmiddel.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11 hvor det utfellende middel omfatter alkohol og eventuelt salt og/eller en detergent .

13. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-9 hvori trinn (c) nukleinsyren binder til støttematerialet ved hjelp av bindingspartnere anbrakt på støttematerialet for å assistere med selektiv innfangning av nukleinsyrer.

14. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-13 hvor cellene bundet til støttematerialet blir adskilt fra resten av prøven for derved å konsentrere cellene.

15. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-14 hvor det faste støttematerialet er i form av partikler, og hvor i trinn A nevnte prøve blir blandet med nevnte partikulære støttemateriale og tillatt å stå i et passende tidsintervall for å tillate cellene å binde til støttematerialet hvorpå støttematerialet blir fjernet fra resten av prøven.

16. Anvendelse av nukleinsyre isoleringsmetode som angitt i ethvert av kravene 1-15 ved fremstilling av nukleinsyre for bruk i en nukleinsyrebasert målcellepåvisningsmetode.

17. Fremgangsmåte ved påvisning av tilstedeværelse eller fravær av en eukaryot eller prokaryot målcelle i en prøve hvor fremgangsmåten omfatter: (a) å fremskaffe et fast støttemateriale og blande dette med prøven og tillate binding av celler i nevnte prøve til det faste støttematerialet for å isolere celler fra prøven; (b) lysere de isolerte celler; (c) binde den frigjorte nukleinsyre fra nevnte lyserte celler til samme faste støttemateriale og; (d) påvise tilstedeværelse eller fravær av nukleinsyre som er karakteristisk for nevnte målceller innen nevnte bundende nukleinsyre.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 17 hvor nevnte påvisningstrinn (d) omfatter in situ hybridisering og/eller in vitro amplifikering og/eller nukleinsyresekvensering.