ES2954252T3 - Matrices y dispositivos de recogida de muestras basados en proteínas - Google Patents

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Abstract

En el presente documento se proporcionan métodos y composiciones para aislar eficazmente ácidos nucleicos utilizando matrices de recogida de muestras basadas en proteínas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Matrices y dispositivos de recogida de muestras basados en proteínas
Antecedentes de la invención
La recuperación de ácidos nucleicos a partir de una matriz de recogida sólida o semisólida está ampliamente aceptada en el diagnóstico molecular. Entre los ejemplos habituales de matrices, se incluyen hisopos y sustratos de papel. La recuperación de ácidos nucleicos a partir de estos materiales puede ser complicada debido a la ineficacia de la extracción del material del sustrato y a la potencial interferencia de este con el pipeteado u otros dispositivos de manipulación de líquidos. Además, la presencia de una sustancia sólida en un instrumento puede desencadenar una señal de error, lo que da como resultado la anulación de la extracción u otro retraso.
Huh, et al., Analytical Biochemistry (1967) 19:150-156 divulga la separación del ADN desnaturalizado del natural con una columna de fibroína de seda. Holoubek et al., Analytical Biochemistry (1967) 18: 375-378 divulga la purificación de ADN en una columna de albúmina metilada. Ellem, J. Mol. Biol. (1966) 20:283-305 divulga la purificación de ARN con columnas de Kieselguhr de seroalbúmina bovina. El documento WO 99/61254 y Boom et al., J Clin Microbiol (1999); 37 , vol. 3:615-619 divulgan un procedimiento de aislamiento de ADN de sílice-tiocianato de guanidinio, que se basa en la unión selectiva tanto de ADN como de alfa-caseína bovina a partículas de sílice. Sin embargo, ninguno de estos documentos divulga el uso de una matriz basada en proteínas que forma un hisopo o una tira para recoger muestras y poner en contacto la matriz basada en proteínas con una solución en condiciones duras como se define en las reivindicaciones adjuntas para solubilizar la matriz basada en proteínas y disolver los ácidos nucleicos en solución.
La eficacia de la recuperación de ácidos nucleicos se puede potenciar mediante el uso de condiciones duras y/o tóxicas tales como fenol/cloroformo y, de hecho, esto se ha intentado con hisopos poliméricos. Sin embargo, los sustratos sólidos existentes no son solubles en guanidinio y otras soluciones caótropas más suaves.
Sumario de la invención
El alcance de la invención se define por las reivindicaciones adjuntas.
En el presente documento, se proporciona una matriz de recogida de muestras basada en proteínas que permite la recuperación eficaz de ácidos nucleicos, la compatibilidad con la instrumentación y el uso de tampones caotrópos (por ejemplo, basados en guanidinio).
En el presente documento, se proporcionan procedimientos y composiciones para recoger ácidos nucleicos a partir de una muestra biológica. En algunos modos de realización, se proporciona un kit que comprende: a) una matriz basada en proteínas configurada para recoger muestras y b) una solución que comprende caótropo 3,5-5 M, detergente del 3 % al 5 %, agente reductor 100-150 mM y tampón de citrato, manteniendo el pH de la solución en 6-6,5, en la que la matriz basada en proteínas forma un hisopo o un tira para recoger líquidos y es de seda; y en la que el caótropo es una sal de guanidinio; el detergente es un detergente no iónico y el agente reductor es ditiotreitol. En el presente documento, la matriz basada en proteínas que forma una tira se puede usar para recoger una muestra líquida (por ejemplo, sangre, hemoderivado, orina, saliva, mucosidad, etc.). También se divulga que la matriz basada en proteínas se humedece y se usa como una toallita para recoger muestras de una superficie (por ejemplo, en un contexto hospitalario o forense, o sobre la piel).
En algunos modos de realización, el kit comprende además botes de procesamiento, por ejemplo, para solubilizar la matriz basada en proteínas unida a la muestra. En algunos modos de realización, el kit comprende además tubos de filtro, perlas de vidrio magnéticas (PVM) u otros componentes para separar el analito de interés (por ejemplo, ácidos nucleicos). En algunos modos de realización, el kit incluye además tampón de lavado (o solución madre o componentes secos de tampón de lavado para rehidratar). En algunos modos de realización, el kit incluye además tampón de elución (o solución madre o componentes secos de tampón de elución para rehidratar). En algunos modos de realización, el kit incluye además proteinasa, por ejemplo, proteinasa K. En algunos modos de realización, el kit incluye además un recipiente para almacenar la matriz basada en proteínas unida a la muestra.
En algunos modos de realización, la matriz basada en proteínas incluye tela de seda. En algunos modos de realización, la matriz basada en proteínas se modifica, por ejemplo, para aumentar la afinidad por el analito, por ejemplo, con restos cargados positivamente, para unirse a los ácidos nucleicos.
En algunas realizaciones, el caótropo es una combinación de sales de guanidinio. En algunos modos de realización, el detergente no iónico es polidocanol o Tween. Además, se proporcionan procedimientos para recoger ácidos nucleicos en una muestra, el procedimiento comprende poner en contacto la muestra que contiene ácidos nucleicos en una matriz basada en proteínas que forma un hisopo o una tira para recoger líquidos, recogiendo de este modo el analito, colocar la matriz basada en proteínas en un recipiente para el almacenamiento, y poner en contacto la matriz basada en proteínas con una solución que comprende caótropo 3,5-5 M, detergente del 3 % al 5 %, agente reductor 100-150 mM y tampón de citrato, manteniendo el pH de la solución en 6-6,5, solubilizando de este modo la matriz basada en proteínas en la solución, en la que la matriz basada en proteínas es seda y en la que el caótropo es una sal de guanidinio, el detergente es un detergente no iónico y el agente reductor es ditiotreitol. En el presente documento, el procedimiento incluye colocar la matriz basada en proteínas unida a la muestra en un recipiente para su almacenamiento. En algunos modos de realización, la matriz basada en proteínas se modifica, por ejemplo, para incrementar la afinidad por el analito, por ejemplo, con restos cargados positivamente para unirse a ácidos nucleicos o con restos de anticuerpos para unirse a dianas proteicas específicas.
En algunos modos de realización, la matriz basada en proteínas se sumerge en la solución durante al menos 5 minutos, por ejemplo, 10-180 minutos, 20-60 minutos, etc. En algunos modos de realización, la solución y la matriz basada en proteínas se calientan, por ejemplo, a 30-60 °C, para acelerar la disolución de la matriz. En algunos modos de realización, el caótropo es una combinación de sales de guanidinio. En algunos modos de realización, el detergente no iónico es polidocanol o Tween. En algunos modos de realización, el procedimiento incluye, además, poner en contacto la solución con un tubo de filtro o perlas de vidrio magnéticas (PVM), lavar el tubo de filtro o las PVM con tampón de lavado y eluir los ácidos nucleicos del tubo de filtro o las PVM con tampón de elución, aislando de este modo los ácidos nucleicos de la muestra. En algunos modos de realización, la muestra es una muestra líquida, por ejemplo, sangre, hemoderivado, orina, saliva, mucosidad, etc. También se divulga que la matriz basada en proteínas se humedece y se usa como una toallita para recoger muestras de una superficie (por ejemplo, en un contexto hospitalario o forense, o sobre la piel).
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra tres tubos, cada uno de los cuales contiene una tira de matriz basada en proteínas (seda) en una solución diferente.
La figura 2 muestra el efecto de la solución caótropa (tiocianato de guanidina 4 M) en la matriz basada en proteínas.
La figura 3 muestra el efecto de la solución de proteinasa K en la matriz basada en proteínas.
La figura 4 muestra el efecto de una mezcla 50-50 de solución caótropa y proteinasa K (concentración final de tiocianato de guanidina 2 M).
Descripción detallada de la invención
Introducción
En el presente documento, se proporciona una matriz de recogida de muestras basada en proteínas que permite la recuperación eficaz de ácidos nucleicos, la compatibilidad con la instrumentación y el uso de soluciones caótropas (por ejemplo, basadas en guanidinio). La matriz basada en proteínas se puede usar para recoger muestras y unirse a los ácidos nucleicos en la muestra. Los ácidos nucleicos no necesitan ser eluidos o eliminados de otro modo de la matriz, porque la matriz basada en proteínas se disuelve en solución caótropa. Lo anterior da como resultado una recuperación eficaz de los ácidos nucleicos. La proteína disuelta (solubilizada) tampoco interferirá con el pipeteado o con el instrumento de detección. La matriz también se puede formar convenientemente en una variedad de conformaciones dependiendo del uso previsto. Por ejemplo, se puede usar una tira para recoger muestras líquidas (por ejemplo, nanogotas de sangre o saliva), se puede usar un hisopo para recoger muestras celulares (por ejemplo, bucales o cervicales), o se puede usar una toallita para someter a prueba superficies en busca de la presencia de microbios o ácidos nucleicos de cualquier fuente (por ejemplo, en un contexto hospitalario o forense).
La matriz basada en proteínas se puede usar como una etapa inicial de captura de ácido nucleico y se puede combinar con etapas adicionales de purificación de ácidos nucleicos, por ejemplo, usando soportes sólidos. De forma alternativa, la solución de ácidos nucleicos-proteínas solubilizada se puede usar directamente en ensayos de detección.
Definiciones
El término "matriz basada en proteínas" o "sustrato basado en proteínas" se refiere a una sustancia que se compone principalmente de proteínas que se pueden usar para capturar componentes de una muestra biológica, que incluye ácidos nucleicos, proteínas, etc. presentes en la muestra, manteniéndose a la vez insoluble en agua y líquidos fisiológicos. Sin embargo, la matriz basada en proteínas se puede solubilizar (degradar o dispersar) en condiciones caótropas como se describe en el presente documento. Entre las proteínas que se pueden usar en una matriz basada en proteínas, se incluyen aquellas que permanecen insolubles en agua y en condiciones fisiológicas de la muestra, e idealmente se pueden formar en múltiples formatos (tira plana, pocillo, localización del conjunto, hisopo fibroso o toallita), y resultan bien tolerados en contacto con la piel o las mucosas. Entre los ejemplos se incluyen, pero no se limitan a, seda, queratina, colágeno, albúmina, proteínas de la leche y combinaciones de cualquier número de los mismos. Entre los componentes no proteicos de una matriz basada en proteínas, se pueden incluir materiales que mejoran la adsorción, el direccionamiento específico o la estabilización de los analitos deseados o para mejorar las propiedades mecánicas de la matriz.
El término "soporte sólido (o semisólido)" se usa en el presente documento para indicar una superficie o cuerpo inerte en el que se puede inmovilizar un agente, tal como un ácido nucleico. Entre los ejemplos no limitantes, se incluyen vidrio, sílice, plástico, nitrocelulosa, membranas, chips y partículas (por ejemplo, partículas de vidrio magnéticas, o PVM).
El término "en solución", por ejemplo, en referencia a un soporte sólido en solución, puede indicar que el soporte sólido está expuesto a una solución (por ejemplo, en contacto con reactivos en solución) o que los propios soportes sólidos están en solución (por ejemplo, perlas o partículas suspendidas en líquido). El término se usa para distinguir una situación donde, en realidad, una matriz se solubiliza, disuelve o degrada en un líquido y una situación donde las partículas permanecen intactas pero suspendidas en la solución.
Los términos "receptáculo", "bote", "tubo", "pocillo", "cámara", "microcámara", etc., se refieren a un recipiente que puede albergar componentes secos y/o líquidos, una matriz, reactivos o un ensayo. Si el receptáculo está en un kit y alberga una matriz que porta muestra, reactivos o una reacción de amplificación, se puede cerrar o sellar para evitar la contaminación o evaporación. Si el receptáculo se usa para un ensayo, puede estar abierto o ser accesible, al menos durante la configuración del ensayo.
El término "inmovilizar", "que inmoviliza", "capturar", "que captura", "unir" o "que une", en el contexto de una matriz o soporte sólido que se une a ácidos nucleicos, se refiere a unión no covalente. La inmovilización puede incluir la absorción, donde la muestra se retiene en el interior de los huecos en la matriz basada en proteínas, y/o adsorción, donde los componentes de la muestra son atraídos a la superficie de la matriz basada en proteínas. Típicamente, la muestra se seca o se captura en una matriz basada en proteínas descrita en el presente documento, de modo que los ácidos nucleicos se adhieran a la matriz. Las proteínas naturales adecuadas para la construcción de una matriz basada en proteínas pueden tener una afinidad limitada por el analito de interés, de modo que la proteína natural se pueda enlazar o mezclar con una proteína o secuencia polipeptídica diferente que tenga una mayor afinidad (por ejemplo, aminoácidos cargados positivamente que atraen los ácidos nucleicos cargados negativamente). Dichas proteínas mezcladas se pueden producir de forma recombinante o se pueden modificar mediante hidrólisis parcial para alterar el punto isoeléctrico. Una proteína también se puede modificar mediante la introducción de un resto estructural o químico para incrementar la retención del analito deseado. Entre las modificaciones, se incluyen restos de anticuerpos, haptenos, tiol, amina y ácido carboxílico.
Los términos "ácido nucleico", "polinucleótido" y "oligonucleótido" se refieren a polímeros de nucleótidos (por ejemplo, ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos) e incluyen ácidos nucleicos naturales (adenosina, guanidina, citosina, uracilo y timidina), no naturales y modificados. El término no está limitado por la longitud (por ejemplo, número de monómeros) del polímero. Un ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario y, en general, contendrá enlaces fosfodiéster 5'-3', aunque, en algunos casos, los análogos nucleotídicos pueden tener otros enlaces. Los monómeros típicamente se denominan nucleótidos. El término "nucleótido no natural" o "nucleótido modificado" se refiere a un nucleótido que contiene una base nitrogenada, glúcido o grupo fosfato modificado, o que incorpora un resto no natural en su estructura. Los ejemplos de nucleótidos no naturales incluyen didesoxinucleótidos, nucleótidos biotinilados, aminados, desaminados, alquilados, bencilados y marcados con fluoróforo.
El término "cebador" se refiere a un ácido nucleico corto (un oligonucleótido) que actúa como un punto de iniciación de la síntesis de hebras de polinucleótido por una ácido nucleico polimerasa en condiciones adecuadas. Las reacciones de síntesis y amplificación de polinucleótidos típicamente incluyen un tampón apropiado, dNTP y/o rNTP, y uno o más cofactores opcionales, y se llevan a cabo a una temperatura adecuada. Un cebador incluye típicamente al menos una región hibridada a la diana que es al menos sustancialmente complementaria a la secuencia diana (por ejemplo, que tiene 0, 1, 2 o 3 emparejamientos erróneos). Esta región típicamente es de aproximadamente 8 a aproximadamente 40 nucleótidos de longitud, por ejemplo, 12-25 nucleótidos. El término "sonda" se refiere a cualquier molécula que se pueda unir selectivamente a una biomolécula diana específicamente deseada. Por ejemplo, una sonda puede ser un ácido nucleico que tenga una secuencia complementaria a una secuencia de ácido nucleico de interés.
Las palabras "complementario" o "complementariedad" se refieren a la capacidad de un ácido nucleico en un polinucleótido de formar un par de bases con otro ácido nucleico en un segundo polinucleótido. Por ejemplo, la secuencia A-G-T (A-G-U para ARN) es complementaria a la secuencia T-C-A (U-C-A para ARN). La complementariedad puede ser parcial, en la que solo algunos de los ácidos nucleicos coinciden de acuerdo con el emparejamiento de bases, o completa, donde todos los ácidos nucleicos coinciden de acuerdo con el emparejamiento de bases. Una sonda o cebador se considera "específico para" una secuencia diana si es al menos parcialmente complementario a la secuencia diana. Dependiendo de las condiciones, el grado de complementariedad a la secuencia diana es típicamente mayor para un ácido nucleico más corto tal como un cebador (por ejemplo, más de un 80 %, 90 %, 95 % o mayor) que para una secuencia más larga.
Los términos "idéntico" o "porcentaje de identidad", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos, o dos o más polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de nucleótidos, o aminoácidos, que son iguales (por ejemplo, aproximadamente un 60 % de identidad, por ejemplo, al menos cualquiera de un 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mayor identidad en una región especificada, cuando se compara y alinea para una máxima correspondencia en un margen de comparación o región designada) como se mide usando un algoritmo de comparación de secuencias BLAST o BLAST 2.0 con parámetros predeterminados, o por alineación manual e inspección visual. Véase, por ejemplo, el sitio web del NCBI en ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. Se dice entonces que dichas secuencias son "sustancialmente idénticas". El porcentaje de identidad típicamente se determina sobre secuencias óptimamente alineadas, de modo que la definición se aplica a secuencias que tienen deleciones y/o adiciones, así como a las que tienen sustituciones. Los algoritmos usados comúnmente en la técnica consideran los huecos y similares. Típicamente, la identidad existe en una región que comprende una secuencia que es al menos aproximadamente 8-25 aminoácidos o nucleótidos de longitud, o en una región que es de 50-100 aminoácidos o nucleótidos de longitud, o en toda la longitud de la secuencia de referencia.
El término "kit" se refiere a cualquier manufactura (por ejemplo, un envase o un recipiente) que incluye al menos un reactivo, tal como una solución o tampón para capturar, etiquetar/convertir, amplificar o detectar ARN o ADN como se describe en el presente documento.
El término "muestra" o "muestra biológica" se refiere a cualquier composición que contiene o que se sospecha que contiene ácido nucleico. El término incluye componentes purificados o separados de células, tejidos o sangre, por ejemplo, ADN, ARN, proteínas, porciones libres de células o lisados celulares. En el contexto del dispositivo divulgado actualmente, la muestra es líquida, por ejemplo, sangre o un componente sanguíneo (plasma o suero), orina, semen, saliva, esputo, moco, semen, lágrima, linfa, líquido cefalorraquídeo, enjuague bucal/de garganta, lavado broncoalveolar, material lavado de un hisopo, etc. Las muestras también pueden incluir constituyentes y componentes de cultivos in vitro de células obtenidas de un individuo, incluyendo líneas celulares. La muestra de líquido también se puede procesar parcialmente de una muestra obtenida directamente de un individuo, por ejemplo, lisado celular o sangre deficitaria en glóbulos sanguíneos.
En el contexto de la presente divulgación, el término "líquido no unido" o "muestra no unida" se refiere a líquido y otros componentes (por ejemplo, material proteínico o restos celulares) que no está unido al soporte sólido o PVM, por ejemplo, líquido empobrecido en ácidos nucleicos u otra diana. El líquido no unido todavía puede incluir una cantidad residual de ácidos nucleicos o diana.
Una muestra o un valor de "control" se refiere a un valor que sirve como referencia, normalmente una referencia conocida, para su comparación con una muestra de prueba o condiciones de prueba. Por ejemplo, se puede preparar un control para las condiciones de reacción. Por ejemplo, un control positivo en cuanto a la presencia de ácido nucleico podría incluir cebadores o sondas que detectarán una secuencia que se sabe que está presente en la muestra (por ejemplo, un gen constitutivo tal como beta-actina, beta-globina, DHFR o succinato deshidrogenasa, o un polinucleótido añadido conocido, por ejemplo, que tenga una longitud designada). Un ejemplo de un control negativo es uno libre de ácidos nucleicos o uno que incluye cebadores o sondas específicos para una secuencia que no estaría presente en la muestra, por ejemplo, de una especie diferente. Un control también puede representar un valor promedio o un intervalo recabado de una serie de pruebas o resultados. Un experto entenderá que la selección de control positivo y negativo dependerá del ensayo particular, por ejemplo, de modo que el control sea apropiado para el tipo de célula y organismo. Un experto en la técnica reconocerá que se pueden diseñar controles para evaluar cualquier número de parámetros, por ejemplo, la solubilidad de proteínas, la estabilidad de ácidos nucleicos, el rendimiento de ácidos nucleicos, etc. Los controles también son valiosos para determinar la importancia de los datos. Por ejemplo, si los valores para un parámetro dado son ampliamente variables en los controles, la variación en las muestras de prueba no se considerará significativa.
A menos que se defina de otro modo, los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica. Véanse, por ejemplo, Lackie, DICTIONARY OF CELL AND MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier (4.a ed. 2007); Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, N.Y. 1989). Se pretende que el término "un" o "una" signifique "uno/a o más". Se pretende que los términos "comprender", "comprende" y "que comprende", cuando preceden a la mención de una etapa o un elemento, signifiquen que la adición de otras etapas o elementos es opcional y no se excluye.
Muestras que contienen ácidos nucleicos
Las muestras para la amplificación de ácido nucleico se pueden obtener de cualquier fuente que se sospeche que contiene ácido nucleico. En algunos modos de realización, la muestra es una muestra líquida, por ejemplo, orina, saliva, sangre o una fracción de sangre (por ejemplo, plasma o suero), cultivo celular, lágrimas, semen, linfa, leche, fluido placentario, mucosidad y líquidos de origen no animal. En algunos modos de realización, la muestra se acumula en un hisopo o toallita, por ejemplo, tejido mucoso, muestra bucal, muestra vaginal o cervical, piel o muestra procedente de un instrumento o toallita de superficie. Las muestras pueden ser celulares o no celulares.
En una muestra que incluye células, las células se pueden separar (por ejemplo, usando filtración o centrifugación basada en tamaño), dejando, de este modo, ácidos nucleicos libres de células (ANlc), incluyendo ácidos nucleicos en exosomas, microvesículas, partículas víricas o aquellos que circulan libremente. De forma alternativa, las células se pueden lisar para obtener ácidos nucleicos celulares, ya sea en presencia de matriz de recogida de muestras basada en proteínas o bien antes de la adición del lisado celular a la matriz de recogida de muestras basada en proteínas.
Solución para solubilizar matriz basada en proteínas
Las matrices basadas en proteínas descritas en el presente documento conservan su estructura y se unen a ácidos nucleicos en agua y líquidos fisiológicamente aceptables, aunque pierden estructura y se pueden solubilizar en soluciones altamente caótropas. La concentración de caótropos en solución puede ser de 2 M o mayor, por ejemplo, de aproximadamente 3-8 M, 3-6 M, 3,5-5,5 M, 3,5-5 M, 3 M, 4 M, 5 M, 6 M, 7 M u 8 M (por ejemplo, como máximo, el límite de solubilidad). Los caótropos actúan rompiendo las membranas, desnaturalizando las proteínas y disociándolas de los ácidos nucleicos e inhibiendo la actividad de las nucleasas. Entre los caótropos apropiados, se incluyen tiocianato de guanidina, clorhidrato de guanidina, isocianato de guanidina, carbonato de guanidina, urea, yoduro de sodio, perclorato de sodio, tricloroacetato de sodio, tiourea y combinaciones de cualquier número de los mismos.
La solución solubilizante puede incluir otros componentes, tales como detergente, agente reductor, quelante y/o tampón. La solución puede comprender una solución de aproximadamente 3 a 6 M de caótropo, con aproximadamente del 0,5 % al 10 % de detergente, aproximadamente 25-500 mM de agente reductor y un tampón que mantenga el pH de la solución entre aproximadamente 3,5 y 8. En algunos modos de realización, la solución comprende aproximadamente de 3,5 a 5 M de caótropo, del 3 % al 5 % de detergente, de 100 a 150 mM de agente reductor y tampón de citrato a un pH de 6-6,5, con una concentración de citrato que oscila entre 10 y 500 mM, por ejemplo, de 30 a 200 mM. En algunos modos de realización, el tampón de citrato comprende citrato de sodio 30 mM y ácido cítrico 0,48 mM.
Entre los detergentes apropiados, se incluyen detergentes no iónicos (por ejemplo, polidocanol, Tween 20, Tween 80, Triton X100, Igepal, NP-40) y detergentes iónicos (por ejemplo, sarcosinas, polioxietilensorbitán, dodecilsulfato de sodio (SDS), dodecilsulfato de litio (LDS) , taurodesoxicolato de sodio (NaTDC), NaTC, glicocolato de sodio (NaGC), desoxicolato de sodio (NaDC), colato de sodio, NaABS, N-lauroilsarcosina (NLS)), sales y combinaciones de cualquier número de los mismos. El detergente puede estar presente en solución en aproximadamente el 0,5­ 10 %, por ejemplo, del 2 % al 5 %, del 3 % al 6 %, aproximadamente el 1 %, el 2 %, el 3 %, el 4 %, el 5 %, el 6 %, el 7 %, el 8 %, el 9 % o el 10 %.
Los agentes reductores rompen los enlaces disulfuro y la estructura de la proteína e inactivan las nucleasas. Entre los agentes reductores apropiados, se incluyen ditiotreitol (DTT), 2-mercaptoetanol, 2-mercaptoetilamina, 2-aminoetanotiol, tris(carboxietil)fosfina (TCEP) y combinaciones de cualquier número de los mismos. El agente reductor puede estar presente en solución a de 25 a 500 mM, por ejemplo, de 50 a 300 mM, de 80 a 200 mM, de 100 a 150 mM o aproximadamente a 100 mM, 130 mM, 150 mM o 200 mM.
Se puede usar un tampón apropiado para mantener el pH de la solución en aproximadamente de 3,5 a 8, por ejemplo, de aproximadamente 5 a 7 o de aproximadamente 6 a 6,5. Entre los tampones que se pueden usar como se describe en el presente documento, se incluye un sistema tampón de citrato, por ejemplo, incluyendo ácido cítrico y citrato de sodio. Entre los tampones apropiados adicionales, se incluyen tris(hidroximetil)aminometano (Tris), ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), ácido N,N-bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanosulfónico (BES), ácido 1,3-bis (tris(hidroximetil)metilamino)propano (Bis-Tris), ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES), ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS), N,N-bis(2-hidroxietil) glicina (bicina), N-[tris(hidroximetil)metil]glicina (tricina), ácido N-2-acetamido-2-iminodiacético (ADA), ácido N-(2-acetamido)-2-aminoetanosulfónico (ACES), ácido piperazina-1,4-bis(2-etanosulfónico) (PIPES), bicarbonato, fosfato, EDTA y combinaciones de cualquier número los mismos. El citrato de sodio y el EDTA también pueden actuar como quelantes. Un experto en la técnica apreciará que la concentración de tampón puede variar dependiendo de la selección de tampón y tipo de muestra, y que el pH se puede ajustar usando un ácido o base compatible.
Aislamiento y detección de ácidos nucleicos
Son conocidos procedimientos para aislar ácidos nucleicos de muestras biológicas, por ejemplo, como se describe en Sambrook, y están disponibles comercialmente varios kits (por ejemplo, kit de aislamiento de ADN para células y tejidos, kit de aislamiento de ADN para sangre de mamífero, kit de aislamiento de ADN de FFPET de alta pureza, kit de aislamiento de ARN de alta pureza, kit de ácido nucleico vírico de alta pureza y kit de aislamiento de ácidos nucleicos totales MagNA Pure LC, disponibles de Roche). En algunos modos de realización, los ácidos nucleicos y la matriz basada en proteínas solubilizada, como se describe en el presente documento, se pueden usar como entrada para un procedimiento de aislamiento de ácidos nucleicos de modo que el ácido nucleico se separe de las proteínas y otros componentes.
En algunos modos de realización, el aislamiento de ácidos nucleicos implica el uso de un filtro, por ejemplo, un filtro de fibra de vidrio, por ejemplo, en un tubo de filtro. En algunos modos de realización, el aislamiento de ácidos nucleicos implica el uso de un soporte sólido o semisólido, por ejemplo, una partícula (por ejemplo, micropartículas o perlas). En cualquier caso, los ácidos nucleicos se inmovilizan sobre el filtro o las micropartículas, mientras que otros componentes no se unen o se unen con menor afinidad que los ácidos nucleicos.
En algunos modos de realización, la micropartícula es una partícula de vidrio magnética (PVM). Las PVM comprenden vidrio que se une de forma no covalente a ácidos nucleicos, y al menos un núcleo magnético (por ejemplo, una dispersión de núcleos magnéticos) que responde a un campo magnético. El vidrio no es necesariamente sílice pura, aunque la sílice puede ser un componente. Las PVM son lo suficientemente pequeñas como para pipetearse en una punta de pipeta estándar y formar una suspensión, típicamente de 0,5-15 um. Las PVM son aproximadamente esféricas en promedio, y pueden ser porosas o no porosas. El núcleo magnético puede ser ferromagnético o paramagnético (solo magnetizado en presencia de un campo magnético). Las PVM adecuadas se describen con más detalle, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.° 6255477 y 6545143.
El componente de vidrio del filtro o la PVM típicamente está basado en sílice, por ejemplo, óxido de silicio y vidrio en polvo, alquil-sílice, silicato de aluminio o sílice activada con NH2. En algunos modos de realización, el vidrio comprende al menos un óxido metálico (por ejemplo, SiO2, B2O3, AhO3, K2O, CaO y/o ZnO). El ácido nucleico se une al vidrio en solución caótropa. Como se indica anteriormente, las soluciones caótropas pueden incluir tiocianato de guanidinio (GuSCN), clorhidrato de guanindina, urea, yoduro de sodio, perclorato de sodio, ion de tiocianato, ion de yodo, ion de perclorato, ion de nitrato, ion de bromo, ion de acetato, ion de cloro, ion de flúor o ion de azufre, o combinaciones de los mismos. En algunos modos de realización, el caótropo está en solución a aproximadamente 1-10 M, por ejemplo, 2-8 o 4-6 M, para permitir la unión del ácido nucleico.
Las soluciones de lavado se pueden usar para eliminar los componentes no unidos, por ejemplo, proteínas, sales, etc. La solución de lavado debe retener los ácidos nucleicos unidos al soporte sólido, lo que se puede lograr, por ejemplo, usando un lavado a un pH ácido o manteniendo la concentración del caótropo.
Típicamente, los ácidos nucleicos se eluyen de cualquier soporte sólido antes del análisis, aunque las PVM son compatibles con algunos ensayos (por ejemplo, la detección de una sonda marcada hibridada a ácido nucleico en la PVM, PCR o cuando se produce la elución como parte del ensayo, tal como transferencia de Southern). Los tampones de elución interfieren con la interacción no covalente (por ejemplo, asociativa o iónica) del ácido nucleico con la PVM, por ejemplo, agua, tampón con pH >7 o con menor concentración de caótropo o fuerza iónica que la usada para unir ácidos nucleicos a las PVM, y/o temperatura elevada, como apreciará un experto en la técnica.
La muestra de ácido nucleico purificado se puede usar para la detección, por ejemplo, usando secuenciación de nueva generación, micromatrices (ARN o ADN), transferencia de Southern o Northern, o amplificación de ácido nucleico, por ejemplo, usando cualquier procedimiento dependiente de cebador. Se pueden usar procedimientos basados en a Dn para la amplificación y detección, por ejemplo, PCR. En algunos modos de realización, se usa PCR ultrarrápida o cuantitativa (RTPCR o qPCR). La qPCR permite la detección y medición fiables de productos generados durante cada ciclo del procedimiento de PCR. Dichas técnicas son bien conocidas de la técnica, y los kits y reactivos están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Roche Molecular Systems, Life Technologies, Bio-Rad, etc. Véase, por ejemplo, Pfaffl (2010) Methods: The ongoing evolution of qP¿R vol. 50; PCR Strategies (Innis et al., 1995, Academic Press, San Diego, CA) en el capítulo 14; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., Academic Press, NY, 1990).
En algunos modos de realización, se lleva a cabo una etapa de transcripción inversa preliminar para preparar ADNc complementario al ARN en la muestra (también denominada RT-PCR, que no se debe confundir con PCR en tiempo real). A continuación, el ADNc se puede usar como molde para la PCR. Véase, por ejemplo, Hierro et al. (2006) 72:7148. El término "qRT-PCR" como se usa en el presente documento se refiere a retrotranscripción seguida de PCR cuantitativa. Se pueden llevar a cabo ambas reacciones en un único tubo sin interrupción, por ejemplo, para añadir reactivos. Por ejemplo, se puede usar un cebador de poliT para retrotranscribir todos los ARNm en una muestra con una cola de poliA, o se puede diseñar un cebador que sea específico para un transcrito diana particular que se retrotranscribirá en ADNc. También se pueden usar procedimientos adicionales de amplificación basados en ARN, por ejemplo, amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA) o amplificación mediada por transcripción (TMA).
Los dispositivos de detección son conocidos en la técnica y se pueden seleccionar según sea apropiado para los marcadores seleccionados. Los dispositivos de detección apropiados para la PCR cuantitativa incluyen los sistemas cobas® y Light Cycler® (Roche), los sistemas de PCR ultrarrápida PRISM 7000 y 7300 (Applied Biosystems), etc.
Kits
En algunos modos de realización, los reactivos y materiales para llevar a cabo los procedimientos actualmente divulgados se incluyen en un kit.
En algunos modos de realización, el kit para capturar ácidos nucleicos comprende una matriz basada en proteínas. En algunos modos de realización, la matriz basada en proteínas se forma en una tira o un hisopo.
En algunos modos de realización, la matriz basada en proteínas consiste esencialmente en una proteína seleccionada de la seda.
En algunos modos de realización, la matriz basada en proteínas se esteriliza y se sella. En algunos modos de realización, la matriz basada en proteínas se forma en una tira y se encierra en una cubierta no proteica (por ejemplo, papel, cartón, plástico, etc.) con un área expuesta para agregar la muestra.
El kit puede incluir además una solución que comprende aproximadamente de 3 a 6 M de caótropo, aproximadamente del 0,5 % al 10 % de detergente, aproximadamente de 50 a 500 mM de agente reductor y un tampón que mantiene el pH de la solución entre aproximadamente 3,5 y 8 o entre 5 y 8. En algunos modos de realización, la solución comprende sal de guanidinio de 3,5 a 5,5 M. En algunos modos de realización, la solución comprende del 3 % al 5 % de detergente, por ejemplo, un detergente no iónico. En algunos modos de realización, la solución comprende de 100 a 150 mM de agente reductor. En algunos modos de realización, la solución comprende tampón citrato a un pH de entre 6 y 6,5. En algunos modos de realización, la solución comprende un quelante. En algunos modos de realización, la solución se proporciona en forma concentrada (por ejemplo, 5x o 10x) y, una vez diluida, tiene las concentraciones indicadas anteriormente.
En algunos modos de realización, el kit comprende además componentes para aislar los ácidos nucleicos de las proteínas solubilizadas. En algunos modos de realización, dichos componentes incluyen partículas de vidrio magnéticas (PVM) o microesferas. En algunos modos de realización, dichos componentes incluyen tubos de filtro. En algunos modos de realización, dichos componentes incluyen además tampón de lavado y/o tampón de elución. En algunos modos de realización, el tampón de lavado y/o el tampón de elución se proporciona en forma concentrada y se diluye antes de su uso.
En algunos modos de realización, el kit incluye además al menos un control, por ejemplo, una matriz basada en proteínas que alberga fragmentos de ácido nucleico de tamaño y concentración conocidos. En algunos modos de realización, el kit incluye además material fungible, por ejemplo, placas o tubos para la captura y/o separación de ácidos nucleicos, tubos para la recogida de muestras, etc. En algunos modos de realización, el kit incluye recipientes para almacenar la matriz basada en proteínas antes del procesamiento/solubilización. En algunos modos de realización, el kit incluye además instrucciones de uso, referencia a un sitio web, o software.
Ejemplo
Ejemplo 1: Evaluación de la seda como matriz de recogida de muestras basada en proteínas
La tela de seda se adquirió de Jo Ann Fabrics y se cortó en tiras pequeñas. Se añadió una tira a cada uno de los tres tubos de ensayo (figura 1). Se sometieron a prueba tres tampones diferentes para determinar la capacidad de solubilizar la seda, permitiendo de este modo que se pipeteara y procesara para el aislamiento posterior de ácidos nucleicos.
El tubo 1 contenía 1 ml de tampón (tiocianato de guanidinio 4 M, citrato de sodio 30 mM, ditiotreitol (DTT) 129,6 mM, polidocanol al 4 %, ácido cítrico 0,48 mM, pH 6,2). El tubo 2 contenía 0,5 ml de solución de proteinasa K (Tris-HCl 10 mM, pH, EDTA 1 mM, CaCh 5 Mm, Ca-EDTA 5 mM, glicerina al 50 %, 1 mg/ml de proteinasa K). El tubo 3 contenía 0,5 ml de tampón y 0,5 ml de solución de proteinasa K.
Los tubos se incubaron a 55 °C durante 30 minutos, se enfriaron y se fotografiaron.
Como se muestra en la figura 2, la seda se rompió significativamente con pérdida de integridad en la tela tejida en el tubo 1. Había fibras mínimas visibles en suspensión. La figura 3 muestra que la proteinasa K no presentó ningún efecto detectable en el tubo 2. La figura 4 muestra que los tampones combinados dieron como resultado alguna alteración de la tela de seda.
Los resultados indican que se puede usar una matriz basada en proteínas para la recogida de muestras y se puede solubilizar eficazmente en un tampón caótropo.
Ejemplo 3: Uso de matriz basada en proteínas en hisopos
Los hisopos se usan ampliamente tanto en diagnóstico molecular como en aplicaciones moleculares forenses. Los hisopos se usan para retener físicamente muestras biológicas de superficies, que incluyen la piel humana en el caso de pruebas de MRSA o CT/NG, o superficies inertes en el caso de la toma de muestras de la escena de un crimen para la realización de análisis posteriores de identificación humana. Típicamente, los hisopos están hechos de composiciones celulósicas, fibrosas, hiladas o tejidas, soportadas en un núcleo de plástico polimérico cilíndrico y, como tales, no se disuelven en líquidos de preparación de muestras convencionales, que incluye el tiocianato de guanidinio. Un hisopo producido con el material fibroso hecho de materiales proteínicos tejidos o hilados, tales como la seda, todavía presenta todas las propiedades deseables de una cabeza de hisopo celulósico en cuanto a su capacidad para tomar muestras biológicas de la piel o superficies inertes. El hisopo puede recoger y conservar muestras biológicas para análisis moleculares posteriores.
Dicho hisopo puede recoger eficazmente material biológico de una superficie, y el análisis subsiguiente se potencia a través de un incremento en la eficacia de la extracción y la recuperación del material biológico a partir del hisopo proteínico cuando se suspende en un líquido de extracción. La eficacia de extracción y recuperación de una muestra biológica a partir de un hisopo convencional nunca es completa, debido al volumen del líquido de extracción que queda retenido dentro de la cabeza del hisopo y alrededor de esta.
La cabeza del hisopo basado en proteínas (por ejemplo, seda) se puede disolver dejando un núcleo sólido. De forma alternativa, el núcleo sólido se puede construir a partir de un material proteínico similar, de modo que todo el hisopo se pueda disolver y permita la transferencia de la muestra biológica suspendida sin interferencia mecánica por parte del núcleo sólido, por ejemplo, con una pipeta de transferencia.
Ejemplo 4: Uso de matriz basada en proteínas en una tela tejida
El concepto se puede extender más allá de los hisopos a otros formatos, que incluyen sustratos tejidos, tales como telas. Una almohadilla de tela de seda tejida puede capturar y liberar muestras biológicas de manera análoga a la cabeza del hisopo descrita anteriormente. Se podrían configurar de muchas formas, que incluyen filtros, como se usan en el muestreo de aire. Dicho material de filtro soluble proporciona acceso a una mayor cantidad de materiales biológicos capturados cuando se trata con la sal caótropa. Esto se puede usar para la monitorización de aire en busca de agentes de guerra biológica, por ejemplo.

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Un kit para aislar ácidos nucleicos de una muestra, el kit comprende:
a) una matriz basada en proteínas configurada para recoger muestras, y
b) una solución que comprende de 3,5 a 5 M de caótropo, del 3 % al 5 % de detergente, de 100 a 150 mM de agente reductor y tampón de citrato, que mantiene el pH de la solución entre 6 y 6,5,
en el que la matriz basada en proteínas forma un hisopo o una tira para recoger líquido y es de seda, y en el que el caótropo es una sal de guanidinio, el detergente es un detergente no iónico y el agente reductor es ditiotreitol.
2. El kit de la reivindicación 1, que comprende además botes de procesamiento.
3. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que comprende además tubos de filtro o perlas de vidrio magnéticas (PVM).
4. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende además tampón de lavado y tampón de elución.
5. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende además un recipiente para almacenar la muestra y la matriz basada en proteínas.
6. Un procedimiento para recoger los ácidos nucleicos en una muestra, el procedimiento comprende: poner en contacto una muestra que contiene ácidos nucleicos en una matriz basada en proteínas que forma un hisopo o una tira para recoger líquido, recogiendo de este modo ácidos nucleicos,
colocar la matriz basada en proteínas en un recipiente para su almacenamiento, y
poner en contacto la matriz basada en proteínas con una solución que comprende de 3,5 a 5 M de caótropo, del 3 % al 5 % de detergente, de 100 a 150 mM de agente reductor y tampón de citrato que mantiene el pH de la solución entre 6 y 6,5, solubilizando de este modo la matriz basada en proteínas en la solución,
en el que la matriz basada en proteínas es seda, y
en el que el caótropo es una sal de guanidinio, el detergente es un detergente no iónico y el agente reductor es ditiotreitol.
7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la matriz basada en proteínas se sumerge en la solución durante al menos 10 minutos.
8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 6-7, que comprende además poner en contacto la solución con un tubo de filtro o con perlas de vidrio magnéticas (PVM), lavar el tubo de filtro o PVM con tampón de lavado, y eluir los ácidos nucleicos del tubo de filtro o PVM con tampón de elución, aislando de este modo los ácidos nucleicos de la muestra.
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