ES2321492T3 - Aislamiento y purificacion de acidos nucleicos. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para separar ácidos nucleicos de materiales que no son ácidos nucleicos en una disolución de ácidos nucleicos, que comprende: a) combinar celulosa con una disolución que contenga ácidos nucleicos y materiales que no son ácidos nucleicos para producir una primera combinación; b) ajustar la concentración de polietilenglicol a una concentración entre 5% y 15%, y la concentración de las sales a una concentración entre 0,25 M y 5,0 M, produciendo, con ello, una segunda combinación que comprende ácidos nucleicos unidos a la celulosa, y en la que los ácidos nucleicos se unen a la celulosa cuando los ácidos nucleicos están en un estado no agregado en la disolución; c) separar los ácidos nucleicos unidos a la celulosa de la segunda combinación; d) poner en contacto los ácidos nucleicos unidos a la celulosa separados en c) con un tampón de elución para liberar los ácidos nucleicos unidos de la celulosa y separarlos hacia el tampón de elución; y e) separar la celulosa del tampón de elución para proporcionar ácidos nucleicos que están sustancialmente exentos de los materiales que no son ácidos nucleicos, en el que las separaciones en la etapa c) y e) se realizan utilizando una centrífuga, una columna o de forma manual.
Description
Aislamiento y purificación de ácidos
nucleicos.
El aislamiento y la purificación de ácidos
nucleicos de alta calidad son etapas críticas en los procedimientos
de biología molecular. Se ha indicado una serie de procedimientos
para el aislamiento de ADN monocatenario y bicatenario a partir de
fluidos biológicos, tales como sangre, suero y células cultivadas
humanos, así como tejidos vegetales, animales y humanos, y otros
especímenes. Se han descrito muchos procedimientos diferentes
(Taylor, J.I., et al., J. Chromatography A,
890:159-166 (2000); Ahn, S.C., et al.,
Bio-Techniques, 29:466-468 (2000);
Scott Jr., D.L., et al., Lett. Appl. Microl.,
31:95-99 (2000); Lin, Z. y Floros, J.,
BioTechniques, 29:460-466 (2000); Smith, C.E. y
York, C.K., patente de EEUU nº 6.027.945 (2000); Mrázek, F. y
Petrek, M., Acta Univ. Palacki. Olomuc., Fac. Med.,
142:23-28 (1999); Hawkins, T., patente de EEUU nº
5.898.071 (1999); Su, X. y Corneau, A., Anal. Biochem.,
267:415-418 (1999); Hawkins, T., patente de EEUU nº
5.705.628 (1998); Davies, M.J., et al., Anal. Biochem.,
262:92-94 (1998); Levison, P.R., et al., J.
Chromatography A, 816:107-111 (1998); Rudi, K.,
et al., BioTechniques, 22:506-511 (1997);
Kotsopoulos, S.K. y Shuber, A.P., BioTechniques,
20:198-200 (1996); Boom, W. R., et al.,
patente de EEUU nº 5.234.809 (1993); Reeve, M.A., publicación PCT nº
WO 91/12079 (1991); Sambrook, J., et al., en:
MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2ª EDICIÓN, 1.21-1.45 (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Shih, T.Y. y Martin, M.A., Biochemistry, 13:3411-3418 (1974); Kothari, R.M. y Taylor, M. W., J. Chromatogr., 73:449-462 (1972); Astell, C. y Smith, M., J. Biol. Chem., 246:1944-1946 (1971); Weith, H.L., et al., Biochemistry, 9:4396-4401 (1970)). La mayoría de estos procedimientos consumen mucho tiempo, son tediosos y caros. Además, una serie de estos procedimientos implica el uso de disolventes orgánicos peligrosos. Por ejemplo, el procedimiento descrito por Astell y Smith (1971) requiere el acoplamiento covalente de oligodesoxirribonucleótidos a la celulosa. El procedimiento descrito por Kothari y Taylor (1972) se refiere a la celulosa y a diversos derivados de celulosa en el que se emplean uno o más disolventes orgánicos en diversas etapas del aislamiento de los ácidos nucleicos y todos requieren varios ciclos de purificación para aislar los ácidos nucleicos puros. Además, descubrieron que la aplicación de cada tipo de matriz disponible a menudo está limitada a un grupo específico de ácidos nucleicos.
MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2ª EDICIÓN, 1.21-1.45 (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Shih, T.Y. y Martin, M.A., Biochemistry, 13:3411-3418 (1974); Kothari, R.M. y Taylor, M. W., J. Chromatogr., 73:449-462 (1972); Astell, C. y Smith, M., J. Biol. Chem., 246:1944-1946 (1971); Weith, H.L., et al., Biochemistry, 9:4396-4401 (1970)). La mayoría de estos procedimientos consumen mucho tiempo, son tediosos y caros. Además, una serie de estos procedimientos implica el uso de disolventes orgánicos peligrosos. Por ejemplo, el procedimiento descrito por Astell y Smith (1971) requiere el acoplamiento covalente de oligodesoxirribonucleótidos a la celulosa. El procedimiento descrito por Kothari y Taylor (1972) se refiere a la celulosa y a diversos derivados de celulosa en el que se emplean uno o más disolventes orgánicos en diversas etapas del aislamiento de los ácidos nucleicos y todos requieren varios ciclos de purificación para aislar los ácidos nucleicos puros. Además, descubrieron que la aplicación de cada tipo de matriz disponible a menudo está limitada a un grupo específico de ácidos nucleicos.
Su y Comeau (1999) describen el aislamiento de
ácidos nucleicos utilizando celulosa y papel de filtro de celulosa.
Descubrieron que la celulosa asociada a fibrillas secundarias
(denominada SF-celulosa) puede utilizarse como
matriz de propósito general para aislar una amplia gama de ácidos
nucleicos. Sin embargo, su procedimiento implica una compleja etapa
de tratamiento y acondicionamiento para preparar las fibras de la
matriz de celulosa antes de su uso para el aislamiento de ácidos
nucleicos. Además, antes de la verdadera purificación de los ácidos
nucleicos requiere la preparación de un extracto bruto de ácidos
nucleicos a partir de la muestra hacia una disolución que contenga
detergentes o sales caotrópicas, y la retirada del precipitado
mediante una centrifugación a > 12000 x g durante 2 min. Este
procedimiento largo y complejo del procedimiento descrito por Su y
Comeau (1999), junto con la necesidad de diversos disolventes
orgánicos hace que sea una técnica laboriosa y prácticamente
imposible de automatizar. Otros documentos de la técnica anterior
pertinentes a la presente invención incluyen:
ZHANG Y.-P., et al.: "A
small-scale procedure for extracting nucleic acids
from woody plants infected with various phytopathogens for PCR
assay", JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS, AMSTERDAM, Países Bajos,
vol. 71, nº 1, 1998, pp. 45-50. Se describen
procedimientos para aislar y purificar ácidos nucleicos en las
solicitudes internacionales PCT nº WO97/08547A, WO01/62976A y
WO96/09379A. La patente de EEUU nº
US-A-6084091 también describe
procedimientos para aislar y purificar ácidos nucleicos.
El procedimiento descrito en la presente
invención emplea polímeros que tienen un grupo o grupos hidroxilo
vecinos, tales como partículas de celulosa o papel de filtro de
celulosa. De forma sorprendente, en presencia de ciertos productos
químicos y sales, formulados como un tampón de unión, estas
partículas o el papel de filtro pueden adsorber ácidos nucleicos.
Los ácidos nucleicos unidos a las partículas o el papel de filtro
entonces se lavan con un tampón de lavado para eliminar cualquier
material no deseado, y el ácido nucleico unido después se eluye de
las partículas o del papel de filtro añadiendo un tampón de elución
o agua desionizada.
El polvo de celulosa puede adquirirse, por
ejemplo, en Sigma, St. Louis, MO, o en Whatman Inc., Clifton, NJ. El
papel de filtro de celulosa puede adquirirse en Whatman Inc.,
Clifton, NJ, o en Schlecher & Schuell, Keene, NH.
El tampón de unión contendrá, en general, altas
concentraciones de sales y de polialquilenglicol. Las
concentraciones de la combinación resultante se ajustan a
concentraciones adecuadas para la unión de los ácidos nucleicos a la
celulosa. El tampón de unión descrito también puede utilizarse, con
ligeras modificaciones, como tampón de lavado.
La presente invención también se refiere a un
procedimiento para aislar ácidos nucleicos, tales como ADN, ARN y
ANP, a partir de diversas fuentes, incluyendo fluidos biológicos,
tejidos, células, etc. El procedimiento comprende la unión de ácidos
nucleicos, en presencia de un tampón de unión, a partículas de
celulosa o a un papel de filtro, el lavado de los ácidos nucleicos
unidos resultantes con un tampón de lavado, y la elución de los
ácidos nucleicos con un tampón de elución o agua desionizada.
El procedimiento descrito en la presente también
es útil para el aislamiento de polinucleótidos bicatenarios (bc) o
monocatenarios (mc) (por ejemplo, ADN, ARN, ANP) de casi cualquier
tamaño y procedentes de una amplia variedad de fuentes.
Además, la presente invención proporciona un kit
que comprende partículas de celulosa o papel de filtro de celulosa y
un tampón de unión que contiene una sal y un polialquilenglicol
adecuados a concentraciones adecuadas para la unión de ácidos
nucleicos sobre las partículas de celulosa o el papel de filtro de
celulosa. En algunas realizaciones, el kit también contendrá un
tampón de lavado adecuado, un tampón de elución adecuado y reactivos
adecuados para lisar células, tejidos o materiales procedentes de
diversas fuentes para liberar los ácidos nucleicos.
La figura 1 describe una electroforesis en gel
de agarosa de ADN aislado a partir de sangre completa como se
describe en el ejemplo 2.
El presente procedimiento simplifica el
aislamiento de ácidos nucleicos a partir de diversas fuentes
mediante la eliminación de la necesidad de purificar primero los
ácidos nucleicos hasta una forma semipurificada, antes de su
purificación final. En el presente procedimiento también se elimina
el uso de disolventes orgánicos, incluyendo el alcohol para la
extracción o los lavados. El presente procedimiento produce ácidos
nucleicos inmediatamente listos para la posterior caracterización y
procesamiento corriente abajo, tal como con procedimientos de PCR,
de secuenciación o de análisis de la transferencia. Debido a las
exclusivas características descritas en la presente, el presente
procedimiento puede adaptarse con facilidad a la automatización,
incluyendo los sistemas de selección de alta capacidad de
procesamiento.
Además, las partículas de celulosa y el papel de
filtro de celulosa utilizados en la presente invención están
disponibles en el mercado y son muy baratos. El procedimiento
descrito en la presente también evita el procedimiento globalmente
largo y la necesidad de preparar primero una preparación bruta de
los ácidos nucleicos o la modificación química (Su y Comeau (1999)).
Además, el presente procedimiento elimina la necesidad de
modificaciones químicas o del acoplamiento químico o de la adsorción
física de otros materiales sobre las partículas de celulosa o el
papel de filtro de celulosa, una necesidad en los procedimientos
descritos por Astell y Smith (1971) y por Kothari y taylor
(1972).
En los procedimientos que aparecen a
continuación, se descubrió que las partículas de celulosa o el papel
de filtro de celulosa se unen a los ácidos nucleicos en presencia de
ciertas concentraciones de sales y polialquilenglicol. Por
consiguiente, la presente invención proporciona, en un aspecto, un
procedimiento para el aislamiento sencillo y rápido de ácidos
nucleicos, tales como ADN, ARN y ANP, a partir de una diversidad de
fuentes, incluyendo, pero sin limitarse a fluidos corporales,
diversas disoluciones, células, plantas, tejidos, lisados de células
bacterianas que contienen plásmidos, etc. Además, la invención
descrita es para el aislamiento de ácidos nucleicos basándose en su
tamaño. A continuación se ofrece una descripción de la presente
invención haciendo referencia a los ácidos nucleicos ejemplificados
por el ADN. Debe entenderse que la presente invención también es
útil para la separación de ARN y ANP de una manera similar. Debido a
que los ácidos nucleicos pequeños requieren unas concentraciones de
sales mayores para su unión fuerte a las partículas (o polvo) de
celulosa o al papel de filtro de celulosa, la concentración de sales
pueden manipularse de forma selectiva para liberar los ácidos
nucleicos unidos a las partículas de celulosa o al papel de filtro
de celulosa basándose en su tamaño. Las partículas de celulosa o el
papel de filtro de celulosa que tengan ADN unido pueden lavarse,
opcionalmente, con un tampón de lavado adecuado antes de ponerse en
contacto con un tampón de elución adecuado, para eluir y separar el
ADN de las partículas de celulosa o del papel de filtro de celulosa.
La separación de las partículas (polvo) de celulosa del líquido
durante todas las etapas de lavado y elución puede simplificarse,
por ejemplo, colocando el polvo de celulosa en una pequeña columna o
utilizando filtración al vacío o centrifugación. También pueden
utilizarse procedimientos similares para el papel de filtro de
celulosa.
A la vista de lo anterior, la presente invención
proporciona, en un aspecto, un procedimiento para unir ácidos
nucleicos a celulosa que comprende:
a) combinar la celulosa con una disolución que
contenga ácidos nucleicos, produciendo, con ello, una combinación,
y
b) ajustar las concentraciones de sales y
polialquilenglicol de la combinación a concentraciones adecuadas
para la unión de los ácidos nucleicos sobre la celulosa, por lo cual
todos o una porción de los ácidos nucleicos en la disolución se une
a la celulosa.
Los expertos en la técnica apreciarán que el
orden de combinación de los componentes (por ejemplo, los ácidos
nucleicos, la celulosa, las sales y el polialquilenglicol) puede
variarse con la condición de que las condiciones (por ejemplo, la
concentración de sales y polialquilenglicol) sean suficientes para
que el ácido nucleico se una a la celulosa. Por consiguiente, en
algunas realizaciones la celulosa se combina con una disolución que
tenga una cantidad predeterminada de sales y polialquilenglicol que
se selecciona para que proporcione las condiciones óptimas para la
unión de los ácidos nucleicos a la celulosa. Esta combinación de
celulosa/sales/polialquilenglicol entonces puede combinarse con una
mezcla que contenga ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos unidos
entonces pueden purificarse mediante un lavado con un tampón de
lavado adecuado y retirarse de la celulosa con un tampón de elución,
como se describe en detalle en los ejemplos.
Como alternativa, la celulosa puede añadirse
directamente a una combinación que contenga ácidos nucleicos con una
sal y polialquilenglicol a una concentración predeterminada, que se
selecciona para la unión de la celulosa a los ácidos nucleicos o
viceversa.
En cualquiera de los procedimientos, la cantidad
de ácidos nucleicos unidos a la celulosa dependerá, de forma típica,
de la cantidad de celulosa. Preferiblemente, la cantidad de celulosa
es suficiente para evitar la saturación de las partículas de
celulosa o de la superficie del papel de filtro de celulosa, y al
menos 60%, más preferiblemente 80% y aún más preferiblemente 90% o
más de los ácidos nucleicos en una disolución se unen a la celulosa.
En muchos casos, la porción de ácidos nucleicos unidos será de 100%.
Sin embargo, en algunas realizaciones puede lograrse la unión
selectiva de los ácidos nucleicos de un tamaño concreto mediante la
manipulación de las concentraciones de sales y polialquilenglicol,
de forma que sólo de aproximadamente 5% a aproximadamente 30% del
contenido total en ácidos nucleicos de la muestra se una a la
celulosa.
En los procedimientos de la presente invención,
el polvo de celulosa puede adquirirse, por ejemplo, en Sigma, St.
Louis, MO, o en Whatman, Inc., Clifton, NJ. El papel de filtro de
celulosa puede adquirirse en Whatman Inc., Clifton, NJ, o en
Schlecher & Schuell, Keene, NH.
Como se describe en la presente invención, la
unión de los ácidos nucleicos a las partículas de celulosa o al
papel de filtro de celulosa y la eliminación de las proteínas
adsorbidas de manera no específica u otras sustancias puede lograrse
utilizando una disolución de sales y polialquilenglicol a ciertas
concentraciones. Las sales útiles en la presente invención se
seleccionan de LiCl, BaCl_{2}, MgCl_{2}, CsCl, CaCl_{2}, NaCl,
KCl y KI. Preferiblemente, la sal es NaCl. De forma similar, una
diversidad de polialquilenglicoles es útil en la presente invención
e incluye, por ejemplo, polietilenglicol y polipropilenglicol.
Preferiblemente, el polialquilenglicol es polietilenglicol. Los
reactivos de sales y polialquilenglicol se utilizan en
concentraciones que facilitan la unión de los ácidos nucleicos a las
partículas de celulosa y al papel de filtro de celulosa. Las
concentraciones de sales en los tampones de unión y de lavado
dependerá de la sal utilizada y del entorno a partir del cual los
ácidos nucleicos han de aislarse y purificarse. En general, las
concentraciones de sales serán de aproximadamente 0,25 M a
aproximadamente 5,0 M. Más preferiblemente, la concentración de
sales en los tampones de unión y de lavado es de aproximadamente 0,5
M a aproximadamente 2,5 M. Aún más preferiblemente, la concentración
de sales es de aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 1,5 M. Lo más
preferiblemente, la concentración de sales del tampón de unión es de
aproximadamente 1,25 M, y la concentración de sales del tampón de
lavado es de aproximadamente 0,5 M. De forma similar, la
concentración del polialquilenglicol dependerá del polialquileno
utilizado. El polietilenglicol está disponible en el mercado en
proveedores tales como Sigma, St. Louis, Missouri, EEUU, y resulta
útil con unos pesos moleculares de aproximadamente 200 a
aproximadamente 10.000, preferiblemente de aproximadamente 1.000 a
aproximadamente 8.000, más preferiblemente de aproximadamente 6.000
a aproximadamente 8.000. Dependiendo del intervalo de peso del
polietilenglicol utilizado la concentración puede ajustarse. En
general, para los procedimientos en los que se utilice un
polietilenglicol que tenga un peso molecular medio de 8.000, la
concentración en los tampones de unión y lavado se ajustará de
aproximadamente 5% a aproximadamente 15%, preferiblemente a
aproximadamente 10%.
El uso de los tampones de unión y de lavado
descritos anteriormente y en los ejemplos que aparecen a
continuación evita el uso de disolventes orgánicos, incluyendo
alcohol etílico, que se emplean habitualmente con otros
procedimientos de aislamiento de ácidos nucleicos.
En la presente invención, la celulosa está en
forma de partículas o polvo o como papel de filtro.
En un aspecto relacionado, la presente invención
proporciona un procedimiento para separar ácidos nucleicos de
materiales que no son ácidos nucleicos mediante la unión de los
ácidos nucleicos, en una disolución de ácidos nucleicos, a la
celulosa, que comprende:
a) combinar la celulosa con una disolución que
contenga ácidos nucleicos y materiales que no son ácidos nucleicos
para producir una primera combinación;
b) ajustar las concentraciones de sales y de
polietilenglicol de la primera combinación a concentraciones
adecuadas para la unión de los ácidos nucleicos en la disolución a
la celulosa, produciendo una segunda combinación que comprende
ácidos nucleicos unidos a la celulosa;
c) separar los ácidos nucleicos unidos a la
celulosa de la segunda combinación;
d) poner en contacto los ácidos nucleicos unidos
a la celulosa separados en c) con un tampón de elución para liberar
los ácidos nucleicos unidos de la celulosa y separarlos hacia el
tampón de elución; y
e) separar la celulosa del tampón de elución
para proporcionar ácidos nucleicos que están sustancialmente exentos
de los materiales que no son ácidos nucleicos.
En general, los componentes utilizados en este
aspecto de la invención son los mismos que se han descrito
anteriormente, y los intervalos preferidos de concentraciones de
sales y polietilenglicol son los mismos que se han proporcionado
anteriormente. El tampón de elución es preferiblemente un tampón
Tris con EDTA. Más preferiblemente, el tampón de elución es Tris
aproximadamente 10 mM, pH 8,0, con EDTA aproximadamente 1 mM.
Además, como se indicó anteriormente, este aspecto de la invención
puede utilizarse con una diversidad de ácidos nucleicos incluyendo,
por ejemplo, ADN, ARN, ANP o sus mezclas.
En una realización particularmente preferida de
este aspecto de la invención, los ácidos nucleicos unidos a las
partículas de celulosa o al papel de filtro de celulosa son ADN y se
lavan con un tampón de lavado, en el que el tampón de lavado elimina
las impurezas unidas a las partículas de celulosa o al papel de
filtro de celulosa mientras que deja el ADN unido a las partículas o
al papel de filtro. Más preferiblemente, el ADN unido a las
partículas de celulosa o al papel de filtro de celulosa se eluye con
un tampón de elución que libera el ADN unido a las partículas o al
papel de filtro, y el ADN se aísla.
En otras realizaciones preferidas, los ácidos
nucleicos en disolución son un lisado, preferiblemente preparado a
partir de células de origen humano, vegetal, animal, vírico o
bacteriano. Por tanto, en una aplicación, las células son de un
animal, más preferiblemente de un ser humano. En otra aplicación,
las células son de vegetales. En otra aplicación, las células son de
origen bacteriano. En otra aplicación, las células son de origen
vírico.
Los ácidos nucleicos que se separan de los
materiales que no son ácidos nucleicos (por ejemplo, péptidos,
proteínas, oligosacáridos, lignanos, productos naturales de molécula
pequeña y otros materiales con un origen típico natural) se
obtienen, en general, con una pureza de al menos 50%, más
preferiblemente de al menos 80%, aún más preferiblemente de al menos
90% o 95%, y lo más preferiblemente de al menos 99% o más.
Por consiguiente, los presentes procedimientos
son adecuados para eliminar al menos 50%, más preferiblemente al
menos 80%, aún más preferiblemente al menos 90% o 95%, y lo más
preferiblemente al menos 99% o más de los materiales que no son
ácidos nucleicos en una muestra concreta (por ejemplo, un lisado
celular).
En otro aspecto de la invención, se emplean
polímeros y polisacáridos que tengan grupos hidroxilo vecinos, tales
como agarosa, Sepharose®, Superdex, Superose, Sephacryl® y dextrano,
denominados en la presente derivados de celulosa. Por consiguiente,
la invención proporciona un procedimiento para unir ácidos nucleicos
a derivados de celulosa, que comprende:
a) combinar los derivados de celulosa con una
disolución que contenga ácidos nucleicos, produciendo, con ello, una
combinación, y
b) ajustar las concentraciones de sales y
polialquilenglicol de la combinación a concentraciones adecuadas
para la unión de los ácidos nucleicos sobre los derivados de
celulosa, por lo cual todos o una porción de los ácidos nucleicos en
la disolución se une a los derivados de celulosa.
De nuevo, los componentes preferidos y sus
intervalos de concentración son fundamentalmente los mismos que los
proporcionados anteriormente. Los derivados de celulosa, en un grupo
de realizaciones, se seleccionan de polímeros que tengan grupos
hidroxilo vecinos, tales como agarosa, Sepharose®, Superdex,
Superose, Sephacryl® y dextrano, y sus mezclas. Además, este
procedimiento, así como los otros procedimientos de la presente
invención, tiene una amplia aplicación en la purificación, por
ejemplo, de ADN, ARN, ANP o sus combinaciones.
En procedimientos relacionados, la presente
invención proporciona un procedimiento para separar ácidos nucleicos
de materiales que no son ácidos nucleicos, que comprende:
a) combinar los derivados de celulosa con una
disolución que contenga ácidos nucleicos y materiales que no son
ácidos nucleicos para proporcionar una primera combinación;
b) ajustar las concentraciones de sales y de
polietilenglicol de la primera combinación a concentraciones
adecuadas para la unión de los ácidos nucleicos a los derivados de
celulosa, produciendo una segunda combinación que comprende ácidos
nucleicos unidos a los derivados de celulosa;
c) separar los ácidos nucleicos unidos a los
derivados de celulosa de la segunda combinación;
d) poner en contacto los ácidos nucleicos unidos
a los derivados de celulosa separados en c) con un tampón de elución
para liberar los ácidos nucleicos unidos de los derivados de
celulosa y separarlos hacia el tampón de elución; y
e) separar los derivados de celulosa del tampón
de elución para proporcionar ácidos nucleicos que están
sustancialmente exentos de los materiales que no son ácidos
nucleicos.
Las realizaciones preferidas para este aspecto
de la invención son las que se han descrito anteriormente para el
uso de la celulosa.
Además, tal como se describió anteriormente, los
derivados de celulosa, en un grupo de realizaciones, se seleccionan
de polímeros que contienen grupos hidroxilo vecinos, tales como
agarosa, Sepharose®, Superdex, Superose, Sephacryl® y dextrano, y
sus mezclas.
Las partículas de celulosa utilizadas en los
siguientes ejemplos fueron el polvo de celulosa de Sigma, St. Louis,
MO (nº de catálogo: C-6288), o de Whatman Inc.,
Clifton, NJ (nº de catálogo: 4021050). Los papeles de filtro de
celulosa (nº 3) se adquirieron en Whatman Inc., Clifton, NJ, y se
cortaron con una forma circular con un diámetro de aproximadamente
13 milímetros. El Sephadex® G-25 es de Pharmacia,
Piscataway, NJ (nº de catálogo:
17-0033-01).
Las partículas de celulosa, los papeles de
filtro de celulosa y el Sephadex® se lavaron con agua desionizada de
calidad molecular que contenía azida de sodio al 0,02% antes del
uso. Las partículas de celulosa y las partículas de Sephadex® se
conservaron en el mismo tampón a una concentración de 50 mg/ml. La
electroforesis en gel de agarosa se realizó utilizando el sistema
E-Gel (geles de agarosa al 0,8%) de Invitrogen,
Carlsbad, CA. Como procedimiento de referencia se utilizó el
mini-kit QIAamp DNA de Qiagen, Valencia, CA.
Una preparación de ADN de timo de ternera
(Sigma, MO, nº de catálogo: D1501), utilizada como control, se unió
de forma reversible a partículas de celulosa. El ADN unido a las
partículas de celulosa se separó y se lavó de los materiales no
deseados. Entonces el ADN se eluyó de las partículas. Se empleó el
siguiente procedimiento:
1. En un tubo de microcentrífuga de 2 ml que
contenía 50 \mug (50 \mul de una disolución de ADN 1 mg/ml en
tampón STE (Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM,
cloruro de sodio 500 mM)) se añaden 500 \mul del tampón de unión
(PEG al 10%, 8000 PM, NaCl 1,25 M) y 1 mg (20 \mul de una
suspensión 50 mg/ml) de las partículas de celulosa.
2. Se mezcla el contenido del tubo a temperatura
ambiente durante 10 minutos, utilizando un rotor de agitación por
volteo.
3. Se sedimenta el ADN unido a las partículas de
celulosa utilizando una microcentrífuga.
4. Se lavan las partículas con 1 ml de tampón de
lavado (PEG al 10%, 8000 PM, NaCl 2,5 M). Se repite la etapa de
lavado una vez más.
5. Se eluye el ADN de las partículas añadiendo
200-500 \mul del tampón de elución (agua
desionizada de calidad molecular o tampón TE
(Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM)), se mezcla
durante 10 minutos y se sedimentan las partículas como se describió
anteriormente. El ADN purificado se recupera en el sobrenadante y ya
está listo para su posterior análisis.
Los resultados se resumen en el tabla 1. El
rendimiento total del ADN después del procesamiento con las
partículas de celulosa es > 90%, y \geq 80% del ADN introducido
se recupera en la primera elución. Además, los altos valores de
260/280 (1,8-1,96) indican la buena calidad y la
alta pureza del ADN aislado.
Se liberó el ADN procedente de muestras de
sangre completa humana utilizando proteinasa K y un tampón de lisis
especialmente formulado. Entonces el ADN se unió a partículas de
celulosa en presencia de tampón de unión. El ADN unido a las
partículas de celulosa entonces se separó y se lavó de otros
contaminantes. El ADN se eluyó de las partículas. Se empleó el
siguiente procedimiento:
1. En un tubo de microcentrífuga de 2 ml se
pipetearon 20 \mul (400 \mug) de una disolución de proteinasa K
en Tris-HCl 10 mM, cloruro de calcio 1 mM, glicerol
al 50%, pH 7,5.
2. Se añaden 200 \mul de sangre completa
(tratada con heparina, citrato o EDTA).
3. Se añaden 200 \mul del tampón de lisis
(Tris-HCl 50 mM, EDTA 50 mM,
guanidina-HCl 6 M, urea 6 M, cloruro de calcio 10
mM, Tween-20 al 10%).
4. Se mezcla el contenido del tubo mediante
pulsos de vórtices durante 15 segundos.
5. Se incuba el contenido del tubo a 56ºC
durante 10 minutos.
6. Se retira el tubo de los 56ºC y se añaden 500
\mul del tampón de unión (PEG al 10%, 8000 PM, NaCl 1,25 M),
seguidos de 20 \mul (1 mg) de la suspensión de partículas de
celulosa bien mezclada.
7. Se incuba el contenido del tubo durante 10
min a temperatura ambiente mientras se mezcla con un rotor de
agitación por volteo.
8. Se sedimenta el ADN unido a las partículas
utilizando una microcentrífuga.
9. Se aspira el sobrenadante y se lavan las
partículas añadiendo 1 ml del tampón de lavado (PEG al 10%, 8000 PM,
NaCl 2,5 M), se mezcla bien y se aspira el sobrenadante. Se repite
la etapa de lavado una vez más.
10. Se añaden 200-500 \mul del
tampón de elución (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1
mM) o agua desionizada de calidad molecular y se mezcla como en la
etapa 7 anterior.
11. Se sedimentan las partículas utilizando una
microcentrífuga y se recoge con cuidado el sobrenadante que contiene
el ADN purificado.
12. El ADN purificado entonces está listo para
su posterior análisis.
Una electroforesis en gel de agarosa del ADN
aislado a partir de muestras de sangre completa mediante el
procedimiento de la presente invención mostró una única banda de ADN
no degradado de alto peso molecular (figura 1).
Se utilizó una capa circular de papel de filtro
Whatman como matriz para capturar el ADN en un tampón de unión
especialmente formulado. El ADN capturado se lavó con un tampón de
lavado para eliminar los materiales no deseados y el ADN purificado
entonces se eluyó del papel de filtro. Se empleó el siguiente
procedimiento:
1. Se corta una capa circular uniforme (diámetro
de 13 mm) del papel de filtro de celulosa y se coloca en un tubo de
microcentrífuga de 2 ml.
2. Se lava el papel de filtro primero con 2 ml
de agua desionizada de calidad molecular, seguidos de 2 ml del
tampón de unión (PEG al 10%, 8000 PM, NaCl 1,25 M).
3. Se añaden 500 \mul del tampón de unión al
tubo, seguidos de 50 \mul de una disolución de ADN de timo de
ternera 1 mg/ml en tampón STE (Tris-HCl 100 mM, pH
8,4, EDTA 1 mM, NaCl 500 mM).
4. Se incuba el tubo a temperatura ambiente
durante 10 minutos mientras se mezcla con un rotor de agitación por
volteo.
5. Se aspira la disolución (líquido) del
microtubo que contiene el papel de filtro y se lava el papel de
filtro dos veces, cada una con 1 ml de tampón de lavado (PEG al 10%,
8000 PM, NaCl 2,5 M).
6. Se añaden 200-500 \mul del
tampón de elución (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1
mM) o agua desionizada de calidad molecular. Se mezcla durante 10
minutos como en la etapa 4 anterior.
7. Se traslada con cuidado el ADN purificado (en
el tampón de elución) desde el microtubo que contiene el papel de
filtro hacia un tubo limpio. El ADN está listo para su posterior
procesamiento.
Los resultados aparecen en la tabla 2. Se
recuperó aproximadamente 25% del ADN introducido bajo las
condiciones utilizadas. Como se muestra en el ejemplo 4 a
continuación, si se aumenta el número de capas de papel de filtro se
aumenta la recuperación del ADN.
Se utilizaron una o tres capas circulares de
papel de filtro de celulosa como matriz en una columna para capturar
ADN en un tampón de unión especialmente formulado. El ADN capturado
se lavó con un tampón de lavado para eliminar los materiales no
deseados y el ADN purificado entonces se eluyó de la columna. Se
empleó el siguiente procedimiento:
1. Se cortan capas circulares uniformes del
papel de filtro como en el ejemplo 3 anterior, y se colocan 1 ó 3
capas al fondo de una columna (0,5 x 10 cm).
2. Se lavan el o los papeles de filtro en la
columna con 2 ml de agua desionizada de calidad molecular, seguidos
de 2 ml del tampón de unión (PEG al 10%, 8000 PM, NaCl 1,25 M). En
cada lavado simplemente se deja que el líquido drene de la columna
por gravedad.
3. Se añaden 500 \mul del tampón de unión a la
columna, seguidos de 50 \mul de una disolución de ADN de timo de
ternera 1 mg/ml en tampón STE (Tris-HCl 100 mM, pH
8,0, EDTA 1 mM, NaCl 500 mM).
4. Se deja que el líquido drene de la columna
por gravedad.
5. Se lavan los papeles de filtro en la columna
dos veces, cada una con 500 \mul del tampón de lavado (PEG al 10%,
8000 PM, NaCl 2,5 M).
6. Se añaden 200-500 \mul del
tampón de elución (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1
mM) o agua desionizada de calidad molecular. Se recoge el ADN
purificado, que está listo para su posterior análisis.
Los resultados se muestran en la tabla 2.
Utilizando una capa de papel de filtro se recuperó aproximadamente
75% del ADN introducido. Cuando se aumenta el número de capas a tres
se aumenta la recuperación del ADN hasta 100%. Nota: puede
utilizarse una bomba de vacío para facilitar la etapa de lavado.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó Sephadex® G-25 como
matriz para capturar ADN en un tampón de unión especialmente
formulado. El ADN capturado se lavó con un tampón de lavado para
eliminar los materiales no deseados y el ADN purificado entonces se
eluyó de la columna. Se utilizó el siguiente procedimiento:
1. Se prepara una suspensión 50 mg/ml de
Sephadex® G-25 en agua de calidad molecular que
contenía azida de sodio al 0,02%.
2. Se pipetean 1 mg (20 \mul), 5 mg (100
\mul) y 10 mg (200 \mul) de la suspensión de Sephadex®
G-25 en tres tubos de microcentrífuga
individuales.
3. Se añaden 500 \mul del tampón de unión (PEG
al 10%, 8000 PM, NaCl 1,25 M).
4. Se añaden 50 \mul de una disolución de ADN
de timo de ternera 1 mg/ml en tampón STE (Tris-HCl
100 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, NaCl 500 mM).
5. Se incuba durante 10 minutos a temperatura
ambiente, mientras se mezcla con un rotor de agitación por
volteo.
6. Se lavan las partículas de Sephadex® dos
veces, cada una con 1 ml del tampón de lavado (PEG al 10%, 8000 PM,
NaCl 2,5 M). Se utiliza una microcentrífuga para sedimentar las
partículas y aspirar el sobrenadante.
7. Se añaden 200-500 \mul del
tampón de elución (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1
mM) o agua desionizada de calidad molecular.
8. Se incuba durante 10 minutos a temperatura
ambiente como en la etapa 5 anterior.
9. Se sedimentan las partículas utilizando una
microcentrífuga.
10. Se traslada con cuidado el sobrenadante que
contiene el ADN purificado hacia un tubo limpio. El ADN está listo
para su posterior análisis.
Los resultados que aparecen en la tabla 3 son
comparables a los obtenidos con las partículas de celulosa bajo las
mismas condiciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó Sephadex® G-25
cargado en una columna como matriz para capturar ADN en un tampón de
unión especialmente formulado. El ADN capturado se lavó con un
tampón de lavado para eliminar los materiales no deseados y el ADN
purificado entonces se eluyó de la columna. Se empleó el siguiente
procedimiento:
1. Se prepara una suspensión 50 mg/ml de
Sephadex® G-25 en agua de calidad molecular que
contenía azida de sodio al 0,02%.
2. Se cargan dos columnas individuales (0,5 x 10
cm) con 1 mg (20 \mul) o 5 mg (100 \mul) de la suspensión de
Sephadex® G-25.
3. Se añaden 500 \mul del tampón de unión (PEG
al 10%, 8000 PM, NaCl 1,25 M).
4. Se añaden 50 \mul de una disolución de ADN
de timo de ternera 1 mg/ml en tampón STE (Tris-HCl
100 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, NaCl 500 mM).
5. Se incuba durante 10 minutos a temperatura
ambiente.
6. Se deja que el líquido drene de la columna
por gravedad.
7. Se lavan las partículas de Sephadex® en la
columna dos veces, cada una con 1 ml del tampón de lavado (PEG al
10%, 8000 PM, NaCl 2,5 M).
8. Se añaden 200-500 \mul del
tampón de elución (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1
mM) o agua desionizada de calidad molecular.
9. Se recoge el ADN purificado en un tubo
limpio.
10. El ADN está listo para su posterior
análisis.
Los resultados que aparecen en la tabla 4
indican que si se aumenta la cantidad de Sephadex®
G-25 en la columna se aumenta el rendimiento de
ADN.
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\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
Claims (16)
1. Un procedimiento para separar ácidos
nucleicos de materiales que no son ácidos nucleicos en una
disolución de ácidos nucleicos, que comprende:
a) combinar celulosa con una disolución que
contenga ácidos nucleicos y materiales que no son ácidos nucleicos
para producir una primera combinación;
b) ajustar la concentración de polietilenglicol
a una concentración entre 5% y 15%, y la concentración de las sales
a una concentración entre 0,25 M y 5,0 M, produciendo, con ello, una
segunda combinación que comprende ácidos nucleicos unidos a la
celulosa, y en la que los ácidos nucleicos se unen a la celulosa
cuando los ácidos nucleicos están en un estado no agregado en la
disolución;
c) separar los ácidos nucleicos unidos a la
celulosa de la segunda combinación;
d) poner en contacto los ácidos nucleicos unidos
a la celulosa separados en c) con un tampón de elución para liberar
los ácidos nucleicos unidos de la celulosa y separarlos hacia el
tampón de elución; y
e) separar la celulosa del tampón de elución
para proporcionar ácidos nucleicos que están sustancialmente exentos
de los materiales que no son ácidos nucleicos,
en el que las separaciones en la etapa c) y e)
se realizan utilizando una centrífuga, una columna o de forma
manual.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la celulosa está en forma de partículas.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la celulosa está en forma de papel de celulosa.
4. El procedimiento de las reivindicaciones 1, 2
y 3, en el que las separaciones en las etapas c) y e) se realizan
utilizando una centrífuga.
5. El procedimiento de las reivindicaciones 1, 2
y 3, en el que las separaciones en las etapas c) y e) se realizan
utilizando una columna.
6. El procedimiento de la reivindicación 3, en
el que las separaciones en las etapas c) y e) se realizan de forma
manual.
7. El procedimiento de las reivindicaciones
1-6, en el que los ácidos nucleicos unidos a la
celulosa son ADN y se lavan con un tampón de lavado, en el que el
tampón de lavado elimina las impurezas unidas a la celulosa pero
deja el ADN unido a la celulosa.
8. El procedimiento de las reivindicaciones
1-7, en el que los ácidos nucleicos unidos a la
celulosa son ADN y el ADN unido a la celulosa se eluye con un tampón
de elución que libera el ADN unido a la celulosa.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en
el que el ADN liberado por el tampón de elución se aísla.
10. El procedimiento de las reivindicaciones
1-10, en el que el polietilenglicol tiene un peso
molecular de aproximadamente 1000 a aproximadamente 8000, y en el
que la sal es cloruro de sodio.
11. El procedimiento de las reivindicaciones
1-10, en el que el polietilenglicol tiene un peso
molecular de aproximadamente 6000 a aproximadamente 8000, y en el
que la sal es cloruro de sodio.
12. El procedimiento de las reivindicaciones
1-11, en el que la concentración de sales ajustada
está entre 0,5 M y 2,5 M.
13. El procedimiento de las reivindicaciones
1-12, en el que los ácidos nucleicos y los
materiales que no son ácidos nucleicos se obtienen a partir de un
lisado celular.
14. El procedimiento de la reivindicación 13, en
el que el lisado se prepara a partir de células de origen humano,
animal, vegetal, vírico o bacteriano.
15. El procedimiento de las reivindicaciones
1-11, en el que la sal es cloruro de sodio y la
concentración ajustada de cloruro de sodio está entre 0,5 M y
aproximadamente 1,5 M.
16. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que los ácidos nucleicos que se van a separar no se han
purificado ni semipurificado antes de la separación.
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Families Citing this family (33)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040137449A1 (en) * | 2001-10-05 | 2004-07-15 | Nargessi R D | Magnetic isolation and purification of nucleic acids |
| US7148343B2 (en) * | 2001-10-12 | 2006-12-12 | Gentra Systems, Inc. | Compositions and methods for using a solid support to purify RNA |
| US7893228B2 (en) * | 2001-10-12 | 2011-02-22 | Qiagen North American Holdings, Inc. | Compositions and methods for using a solid support to purify RNA |
| US20050032105A1 (en) * | 2001-10-12 | 2005-02-10 | Bair Robert Jackson | Compositions and methods for using a solid support to purify DNA |
| ATE491790T1 (de) * | 2001-11-06 | 2011-01-15 | Promega Corp | Isolierung und reinigung von nucleinsäuren |
| JP3983125B2 (ja) * | 2002-07-19 | 2007-09-26 | 富士フイルム株式会社 | 核酸の分離精製方法 |
| US20050042660A1 (en) * | 2003-07-31 | 2005-02-24 | Hall Gerald Edward | Devices and methods for isolating RNA |
| KR20060129340A (ko) * | 2003-12-30 | 2006-12-15 | 시그마-알드리치컴퍼니 | 효소 소화에 의한 핵산의 신속한 제조 |
| US8426126B2 (en) | 2004-03-18 | 2013-04-23 | Applied Biosystems, Llc | Modified surfaces as solid supports for nucleic acid purification |
| US20060099605A1 (en) * | 2004-11-11 | 2006-05-11 | Hall Gerald E Jr | Devices and methods for isolating RNA |
| CA2586532C (en) * | 2004-11-05 | 2014-03-25 | Qiagen North American Holdings, Inc. | Compositions and methods for purifying nucleic acids from stabilization reagents |
| US20060223072A1 (en) * | 2005-03-31 | 2006-10-05 | Boyes Barry E | Methods of using a DNase I-like enzyme |
| US20060223073A1 (en) * | 2005-03-31 | 2006-10-05 | Boyes Barry E | Methods of using a DNase I-like enzyme |
| US20060270843A1 (en) * | 2005-05-26 | 2006-11-30 | Hall Gerald E Jr | Methods for isolation of nucleic acids |
| US20060269929A1 (en) * | 2005-05-26 | 2006-11-30 | Hall Gerald E Jr | Methods and kits for DNA purification on polymeric membranes at low ionic strength |
| US8679741B2 (en) | 2006-05-31 | 2014-03-25 | Sequenom, Inc. | Methods and compositions for the extraction and amplification of nucleic acid from a sample |
| WO2008150187A1 (fr) * | 2007-06-08 | 2008-12-11 | Jury Fedorovich Drygin | Utilisation du trichloracétate d'ammonium en tant que produit de dissociation de complexes naturels d'acides nucléiques et procédé d'extraction d'arn |
| WO2010088517A1 (en) * | 2009-01-30 | 2010-08-05 | The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Methods and systems for purifying transferring and/or manipulating nucleic acids |
| EP3211095B1 (en) | 2009-04-03 | 2019-01-02 | Sequenom, Inc. | Nucleic acid preparation compositions and methods |
| US8222397B2 (en) * | 2009-08-28 | 2012-07-17 | Promega Corporation | Methods of optimal purification of nucleic acids and kit for use in performing such methods |
| US8039613B2 (en) | 2009-08-28 | 2011-10-18 | Promega Corporation | Methods of purifying a nucleic acid and formulation and kit for use in performing such methods |
| TWI407994B (zh) | 2009-10-22 | 2013-09-11 | Ind Tech Res Inst | 分離核酸的方法、試劑及套組 |
| AU2010338349B2 (en) * | 2009-12-29 | 2015-03-05 | Global Life Sciences Solutions Usa Llc | Improvements to nucleic acid elution |
| HUE034870T2 (hu) | 2010-01-07 | 2018-03-28 | Bigtec Private Ltd | Eljárás nukleinsavak izolációjára és ennek készlete |
| DE102010036111B4 (de) | 2010-09-01 | 2013-08-29 | Bundesrepublik Deutschland (Bundesamt für Ausrüstung, Informationstechnik und Nutzung der Bundeswehr) | Vorbehandlungsverfahren zur Isolierung und Aufkonzentrierung von Nukleinsäuren aus einer Umweltprobe |
| US20120149088A1 (en) | 2010-11-30 | 2012-06-14 | Life Technologies Corporation | Alkylene glycols and polymers and copolymers thereof for direct isolation of nucleic acid from embedded samples |
| EP2976424B1 (en) | 2013-03-18 | 2018-10-03 | Qiagen GmbH | Stabilisation of biological samples |
| CA2930495C (en) * | 2013-12-02 | 2022-07-05 | Biocartis N.V. | Extraction of circulating nucleic acids |
| DE102014211221A1 (de) * | 2014-06-12 | 2015-12-17 | Robert Bosch Gmbh | Verfahren zur Anreicherung und/oder Aufreinigung von Nukleinsäuren |
| CN105734044A (zh) * | 2014-12-08 | 2016-07-06 | 苏州新波生物技术有限公司 | 用于核酸提取纯化的漂洗液 |
| TR201606310A2 (tr) | 2016-05-12 | 2017-11-21 | Akdeniz Ueniversitesi | Genomik dna izolasyon yöntemi ve kiti. |
| EP3528950A4 (en) * | 2016-10-24 | 2020-05-27 | Biomatrica, INC. | STABILIZATION OF NUCLEIC ACIDS ON PAPER |
| WO2018195594A1 (en) * | 2017-04-24 | 2018-11-01 | The University Of Queensland | Simple nucleic acid extraction |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8507706D0 (en) | 1985-03-25 | 1985-05-01 | Genetics Int Inc | Magnetic nucleic acid sequences |
| US4921805A (en) | 1987-07-29 | 1990-05-01 | Life Technologies, Inc. | Nucleic acid capture method |
| US5234809A (en) | 1989-03-23 | 1993-08-10 | Akzo N.V. | Process for isolating nucleic acid |
| JPH02289598A (ja) | 1989-04-28 | 1990-11-29 | Yamanouchi Pharmaceut Co Ltd | Ｍｓ―１１４４物質 |
| CA2022518A1 (en) | 1989-08-04 | 1991-02-05 | Richard P. Watts | Heterogeneous binding assays |
| JPH03101689A (ja) | 1989-09-14 | 1991-04-26 | Tosoh Corp | 核酸の抽出方法又は除去方法 |
| GB9003253D0 (en) | 1990-02-13 | 1990-04-11 | Amersham Int Plc | Precipitating polymers |
| US5564104A (en) | 1993-06-08 | 1996-10-08 | Cortex Biochem, Inc. | Methods of removing radioactively labled biological molecules from liquid radioactive waste |
| US6103127A (en) | 1993-06-08 | 2000-08-15 | Cortex Biochem, Inc. | Methods for removing hazardous organic molecules from liquid waste |
| JP3451667B2 (ja) | 1993-08-24 | 2003-09-29 | 東ソー株式会社 | 核酸抽出及び特定核酸配列の検出方法 |
| US5705628A (en) | 1994-09-20 | 1998-01-06 | Whitehead Institute For Biomedical Research | DNA purification and isolation using magnetic particles |
| DE19530132C2 (de) | 1995-08-16 | 1998-07-16 | Max Planck Gesellschaft | Verfahren zur Reinigung, Stabilisierung oder Isolierung von Nukleinsäuren aus biologischen Materialien |
| US5804684A (en) | 1995-08-24 | 1998-09-08 | The Theobald Smith Research Institute, Inc. | Method for isolating nucleic acids |
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