ES2356324T3 - Procedimiento y formulación para la extracción de ácidos nucleicos a partir de cualquier material de partida complejo. - Google Patents

Procedimiento y formulación para la extracción de ácidos nucleicos a partir de cualquier material de partida complejo. Download PDF

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Abstract

Procedimiento para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de materiales que contienen ácidos nucleicos, que comprende los pasos siguientes: · Digestión del material de partida con un tampón que no contiene componentes caotrópicos ni anticaotrópicos. · Adición de una mezcla formada por un alcohol y un detergente, ascendiendo la proporción del componente alcohólico en la mezcla de alcohol y detergente a entre 20 y 80%, y la proporción del detergente, a al menos 10%. · Unión de los ácidos nucleicos a una fase sólida. · Lavado de los ácidos nucleicos unidos con tampón de lavado. · Elución de los ácidos nucleicos unidos con un tampón de baja concentración salina o con agua.

Description

El objeto de la invención es un procedimiento universal y muy simplificado, así como una formulación, para aislar ácidos nucleicos a partir de los más diversos materiales de partida con contenido en ácidos nucleicos, el cual garantiza una muy alta calidad de los ácidos nucleicos que se han de aislar y permite aislar cantidades cuantitativas. 5
En condiciones clásicas, el aislamiento de ADN a partir de células y tejidos se lleva a cabo digiriendo los materiales de partida que contienen ácidos nucleicos en condiciones fuertemente desnaturalizantes y reductoras, en parte también mediante el uso de enzimas que degradan proteínas, purificando las fracciones de ácido nucleico expuestas mediante pasos de extracción con fenol/ cloroformo y obteniendo los ácidos nucleicos a partir de la fase acuosa por diálisis o precipitación en etanol (Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T., 1989, CSH, “Molecular Cloning”). 10
Estos “procedimientos clásicos” para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de células y, en particular, de tejidos consumen mucho tiempo (en parte más de 48 h), requieren un esfuerzo aparativo considerable y tampoco son realizables en condiciones reales de funcionamiento. Tales procedimientos suponen, además, un riesgo no despreciable para la salud debido a los agentes químicos usados, tales como fenol y cloroformo.
Diversos procedimientos alternativos para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de diferentes materiales 15 de partida biológicos permiten obviar la costosa extracción de ácidos nucleicos con fenol/ cloroformo perjudicial para la salud, así como reducir el tiempo invertido.
Todos estos procedimientos se basan en un procedimiento desarrollado y descrito por primera vez por Vogelstein y Gillespie (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 615-619) para la purificación preparativa y analítica de fragmentos de ADN a partir de geles de agarosa. El procedimiento combina la disolución de la agarosa que contiene la 20 banda de ADN que se ha de aislar en una solución saturada de una sal caotrópica (NaJ) con la unión del ADN a partículas de vidrio. El ADN fijado a las partículas de vidrio se lava a continuación con una solución de lavado (Tris HCl 20 mM [pH 7,2]; NaCl 200 mM; EDTA 2 mM; 50% v/v de etanol) y después se separa de las partículas de soporte.
Este procedimiento ha sufrido hasta la fecha una serie de modificaciones, y en la actualidad se usa para diferentes procedimientos de extracción y purificación de ácidos nucleicos de diferentes orígenes (Marko, M.A., 25 Chipperfield, R. y Birnboim, H.G., 1982, Anal. Biochem. 121, 382-387).
Hoy en día también existen a nivel mundial numerosos sistemas de reactivos, sobre todo para la purificación de fragmentos de ADN a partir de geles de agarosa y para el aislamiento de ADN plasmídico de lisados bacterianos, pero también para el aislamiento de ácidos nucleicos de cadena más larga (ADN genómico, ARN celular total) a partir de sangre, tejidos o también de cultivos celulares. 30
Todos estos kits disponibles en el mercado se basan en el principio bien conocido de la unión de ácidos nucleicos a soportes minerales en presencia de soluciones de diferentes sales caotrópicas, y usan como materiales de soporte suspensiones de vidrio en polvo finamente molido (por ejemplo vitrocerámica, BIO 101, La Jolla, CA), tierras de diatomeas (empresa Sigma) o también geles de sílice (Diagen, documento DE 4139664 A1).
En el documento US 5,234,809 (Boom) se presenta un procedimiento para el aislamiento de ácidos nucleicos 35 factible para un gran número de aplicaciones diferentes. En él se describe un procedimiento para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de materiales de partida con contenido en ácidos nucleicos por incubación del material de partida con un tampón caotrópico y una fase sólida que se une a ADN. Los tampones caotrópicos realizan tanto la lisis del material de partida como la unión de los ácidos nucleicos a la fase sólida. El procedimiento es adecuado para aislar ácidos nucleicos a partir de cantidades de muestra pequeñas y, en la práctica, se usa especialmente en el campo del 40 aislamiento de ácidos nucleicos víricos.
Las modificaciones específicas de estos procedimientos están relacionadas con el uso de materiales de soporte novedosos que muestren ventajas de aplicación para planteamientos determinados (documento WO-A 95/34569).
En documentos de patente más recientes se da a conocer que para la adsorción de ácidos nucleicos a los 45 materiales silicatados usados y conocidos para el experto también se pueden usar muy eficazmente y con éxito las denominadas sales anticaotrópicas como componentes de sistemas de tampón de lisis/ de unión (documento EP 1135479 A). La ventaja de este procedimiento reside en que al suprimir el uso de sales caotrópicas, los sistemas de extracción suponen un riesgo claramente reducido para la salud. Sin embargo, para un aislamiento eficaz de ácidos nucleicos a partir de una muestra biológica compleja, especialmente a fin de obtener ácidos nucleicos con un 50 rendimiento lo más alto posible, de nuevo se necesitan en el tampón de lisis elevadas concentraciones salinas (> 1,5 M). Así, el documento da a conocer que los tampones de lisis usados contienen concentraciones salinas de 1,5 M a 3 M.
En la publicación para información de solicitud de patente DE 4321904 A se describe un procedimiento por medio del cual es posible efectuar un aislamiento eficaz de ácidos nucleicos cuando se combinan tampones caotrópicos de alta concentración salina con componentes alcohólicos. Los tampones de lisis descritos en el documento DE 55
4321904 A contienen siempre concentraciones salinas entre 4 M y 8 M, y como sales se usan especialmente hidrocloruro de guanidina, tiocianato de guanidina o yoduro potásico. Es conocido que estas sales provocan la lisis del material de partida, así como una potente inactivación de las enzimas nucleolíticas. Tras la lisis del material de partida se lleva a cabo la adición de un alcohol. El documento de patente da a conocer que la adición de los componentes alcohólicos al tampón de lisis con una alta concentración salina media una unión especialmente eficaz de los ácidos 5 nucleicos a los materiales de filtro silicatados usados. El inconveniente del uso de tampones de lisis con elevadas fuerzas iónicas de las sales caotrópicas es siempre el uso tan solo limitado y también ineficaz de enzimas proteolíticas adicionales para una digestión eficaz de las muestras biológicas complejas, puesto que estas mismas enzimas son dañadas por el efecto desnaturalizante de proteínas de los tampones caotrópicos. Además se requieren a continuación extensos pasos de lavado para eliminar las altas concentraciones salinas del material de adsorción usado. El experto 10 sabe que las sales caotrópicas ejercen un efecto fuertemente inhibidor sobre un gran número de aplicaciones posteriores.
En el documento de modelo de utilidad DE 20207793 U se da a conocer otra opción para aislar ácidos nucleicos. El procedimiento describe la unión de ácidos nucleicos a minerales arcillosos en presencia de una sal de un catión polivalente. Se supone que el procedimiento se basa en la formación de un denominado puente catiónico entre el 15 ácido nucleico que se ha de aislar y los minerales arcillosos. La desorción de los ácidos nucleicos que se han de aislar no se lleva a cabo, como en los otros procedimientos conocidos, con agua o con un tampón de baja concentración salina, sino con un eluyente que contiene al menos un agente formador de complejos que es específico del catión polivalente usado en el tampón de unión. El inconveniente de la invención reside, en particular, en que los componentes formadores de complejos (EDTA; EGTA, etc.) con frecuencia inhiben fuertemente como ingredientes de tampones de 20 elución un gran número de aplicaciones posteriores. Aunque se supone, según se expone en el documento de modelo de utilidad, que el procedimiento se puede usar para la purificación de ácidos nucleicos sin el uso de sales caotrópicas, una serie de tampones de los ejemplos de realización contienen siempre sales caotrópicas (como, por ejemplo, sales de guanidina). Esto es válido para todos los ejemplos de realización que describen el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de muestras biológicas complejas. Parece, por lo tanto, que el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de muestras 25 complejas no se puede realizar sin sales caotrópicas.
El documento EP 0512767 A1 da a conocer un procedimiento para la purificación de ADN a partir de una solución, que comprende la unión del ADN a una superficie hidrófila mediante el uso de un disolvente orgánico hidrosoluble, componiéndose el disolvente orgánico hidrosoluble de 1% a 100% de etanol, de 1% a 100% de isopropanol y 1% a 100% de propanol. Como superficie hidrófila se eligen diatomeas Celite, polímeros de dióxido de silicio, silicato 30 de magnesio, compuestos de silicio-nitrógeno, silicatos de aluminio o dióxido de silicio.
El documento WO 02/04620 A2 describe un procedimiento para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de una solución, que comprende los pasos siguientes: a) Adsorción de los ácidos nucleicos contenidos en la solución en presencia de sales alcalinas y/o alcalinotérreas a una superficie con contenido en SiO2, b) dado el caso, lavado de los ácidos nucleicos adsorbidos a la superficie con contenido en SiO2 con un tampón de lavado con contenido en alcohol y 35 c) elución de los ácidos nucleicos con una solución acuosa y, dado el caso, aislamiento de los ácidos nucleicos, caracterizado porque en el paso a) la adsorción de los ácidos nucleicos a la superficie con contenido en SiO2 se lleva a cabo en presencia de sales alcalinas y/o alcalinotérreas 0,1 a 3 M y 37 a 70% en vol. de un alcohol alifático.
El documento DE 10253351 A1 describe un procedimiento para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de una solución por unión a una fase sólida, caracterizado porque la solución que contiene el ácido nucleico se ajusta con 40 aditivos de tal manera que contenga cationes monovalentes y polivalentes, así como un alcohol y, dado el caso, aditivos adicionales, después se pone en contacto con la fase sólida, a continuación se lava, dado el caso, el soporte y el ácido nucleico se separa de la fase sólida. Como componente salino polivalente se usa cloruro de magnesio, cloruro cálcico, cloruro de cinc y/o cloruro de manganeso, y como alcohol etanol o isopropanol.
El documento WO 01/10554 A2 describe un kit de reactivos para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de 45 una muestra que contiene compartimentos biológicos con contenido en ácido nucleico, caracterizado porque contiene a) partículas de carga negativa de un material polimérico, b) un reactivo I y c) una solución de proteinasa. El reactivo I del kit de reactivos de acuerdo con la invención contiene como detergente preferentemente dodecilsulfato sódico o bromuro de cetilamonio (CTAB), preferentemente en cada caso en una cantidad de 1 a 10%, respecto al volumen de reactivo. Como alcohol alifático está contenido en el reactivo I preferentemente etanol, ascendiendo la concentración a al menos 50 40% en vol. El reactivo I contiene, dado el caso, tampones y/o coadyuvantes habituales y adecuados adicionales. Como ejemplo de sustancias tamponadoras se menciona TRIS/HCl, y los coadyuvantes pueden ser, por ejemplo, formadores de complejos, tales como EDTA. El pH de los reactivos se ajusta con preferencia a aproximadamente el pH fisiológico. El documento WO 01/10554 A2 enseña que para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de muestras que contienen levaduras se ha de usar un reactivo que contiene un detergente y un alcohol conforme al reactivo I. 55
Los documentos DE 19856064 A1, DE 10253351 A1, DE 69908795 T2 y EP 0796327 B1 también constituyen el estado de la técnica. En ellos se describen procedimientos para el aislamiento de ácidos nucleicos en los que, sin embargo, no se usan componentes anticaotrópicos.
El análisis del estado de la técnica ilustra de forma convincente que existen numerosas opciones para unir ácidos nucleicos a materiales de soporte sólidos, en especial a materiales de soporte minerales basados en silicio, 60
lavarlos a continuación y volver a separar los ácidos nucleicos del material de soporte. Igualmente queda claro que para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de muestras biológicas complejas también se pueden usar numerosos sistemas de tampones de lisis diferentes. Los sistemas de tampones de lisis descritos también contienen siempre los componentes esenciales para la unión necesaria de los ácidos nucleicos que se han de aislar a los materiales de soporte correspondientes preferidos, realizando las sales caotrópicas seleccionadas para la unión de los ácidos 5 nucleicos también al mismo tiempo la lisis del material de partida. Las concentraciones salinas usadas en los tampones de lisis se encuentran siempre en el intervalo de alta concentración salina. Esto también es válido para el documento de modelo de utilidad DE 20207793 U, si bien, como se expone en él explícitamente, la unión de ácidos nucleicos debería efectuarse usando cationes polivalentes y aprovechando minerales arcillosos a bajas concentraciones de las sales polivalentes. Las concentraciones de las sales guanidinio descritas en este documento de modelo de utilidad para el 10 aislamiento son las altas concentraciones salinas conocidas para el experto.
Por lo tanto, la invención se ha propuesto el objetivo de eliminar los inconvenientes de las soluciones descritas en el estado de la técnica.
El objetivo se ha alcanzado mediante un procedimiento y una formulación para el aislamiento y la purificación de ácidos nucleicos a partir de muestras complejas de acuerdo con las características de las reivindicaciones, que se 15 puede usar de forma universal independientemente del material de partida del que se trate y que se debe poder realizar en el tampón de lisis sin las altas concentraciones salinas, siempre necesarias hasta ahora para la unión de los ácidos nucleicos a los materiales de soporte.
El procedimiento de acuerdo con la invención comprende los pasos siguientes:
1. La digestión de la muestra se lleva a cabo con un tampón conocido en sí sin componentes caotrópicos o 20 anticaotrópicos.
2. A continuación, la preparación de lisis se pone en contacto con una mezcla formada por un alcohol y un detergente, ascendiendo la proporción del componente alcohólico en la mezcla de alcohol y detergente a entre 20 y 80%, y después esta mezcla se pone en contacto con una fase sólida que se une a ácidos nucleicos.
3. La fase sólida se lava después, dado el caso, con un tampón de lavado conocido en sí. 25
4. El ácido nucleico unido se separa de la fase sólida con un tampón de baja concentración salina o con agua.
Sorprendentemente se ha constatado que la combinación de tampones conocidos en sí para la digestión proteolítica de muestras biológicas (tejido, sangre total, etc.), compuestos, por ejemplo, por SDS, Tris HCl y EDTA con un componente alcohólico o un detergente, permite unir, tras la lisis del material de partida, un ácido nucleico de la muestra a un material de filtro mineral de fibras de vidrio. El ácido nucleico unido al material de filtro se puede lavar con 30 un tampón de lavado conocido en sí, secar a continuación brevemente y, tras la adición de agua o Tris HCl 10 mM, volver a separar del material de fibras de vidrio.
Como detergente no iónico se puede usar Tween-20; Tween-80; Triton X-100, etc. (dado el caso a una concentración elevada de al menos 10%) o una mezcla de detergente/ alcohol (de nuevo a una concentración elevada de detergente). 35
Esto significa que, al contrario que los mecanismos y estrategias de solución metódicas descritas hasta ahora, la adsorción de ácidos nucleicos a materiales de soporte minerales conocidos en principio también se puede llevar a cabo sin sales. De este modo es posible realizar la digestión de muestras biológicas complejas con un tampón de lisis sencillo y, sobre todo, de uso universal sin los componentes de alta concentración salina, necesarios hasta la fecha.
Cuando se han de usar mayores cantidades de materiales de partida para el aislamiento de ácidos nucleicos, 40 se aprecia, sin embargo, que la pureza de los ácidos nucleicos que se han de aislar, medida como relación 260:280, con frecuencia no es suficiente en el caso de la combinación del tampón de lisis descrito con un componente de tampón de unión alcohólico.
No obstante, sorprendentemente se puede lograr un notable aumento de la pureza del ácido nucleico si se añade al componente alcohólico una sal de un catión polivalente, preferentemente divalente. Las concentraciones 45 salinas necesarias para ello, sin embargo, no se encuentran en el intervalo de alta concentración salina, como es conocido para el experto por el estado de la técnica y como se ha descrito siempre hasta ahora. Preferentemente se usa cloruro de magnesio, puesto que MgCl2 no es caotrópico ni anticaotrópico.
El procedimiento de acuerdo con la invención, basado en la combinación de un tampón de lisis sin sales, las cuales serían necesarias para la unión del ácido nucleico a un material de soporte, con un tampón de unión basado en 50 un componente alcohólico y un componente salino de un catión divalente, permite aislar ácidos nucleicos de alta calidad a partir de cualquier material de partida. Además, debido a la reducida concentración salina usada, el procedimiento permite reducir los pasos de lavado que eran necesarios hasta ahora, lo que supone una clara reducción del denominado tiempo de manipulación.
El procedimiento es altamente eficaz y muestra que también los rendimientos de los ácidos nucleicos que se han de aislar son al menos equiparables a los de los procedimientos y kits que se han estado usando hasta ahora a nivel mundial. Si se añade al tampón de unión un componente de detergente, esta combinación hace que los rendimientos de los ácidos nucleicos que se han de aislar sean aún mayores. Cuando se han de asilar ácidos nucleicos de, por ejemplo, muestras de sangre total, la adición de un detergente al tampón de unión provoca adicionalmente una 5 notable reducción de la adsorción inespecífica de hemoglobina al material de fibras de vidrio usado. Este efecto repercute asimismo positivamente en el proceso de extracción, puesto que es conocido que, especialmente en procedimientos para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de muestras de sangre total, se requieren múltiples pasos de lavado para eliminar la hemoglobina del material de soporte.
Puesto que los tampones de lisis usados en el procedimiento de acuerdo con la invención no contienen ningún 10 componente que permita la adsorción de ácidos nucleicos, también es posible, por ejemplo, realizar los procesos de filtración previos necesarios con los mismos materiales de filtro que se vayan a usar al final para la adsorción de los ácidos nucleicos. Esto constituye una enorme simplificación tecnológica del procedimiento. Así, por ejemplo, tras la lisis de una muestra vegetal, el lisado se puede centrifugar a través de una matriz filtrante de fibras de vidrio como componente de una columna de centrifugación, para eliminar materiales vegetales no lisados y componentes 15 inhibidores. A continuación se añade al filtrado el tampón de unión y se transfiere a otra columna de centrifugación con una matriz de fibras de vidrio. Los ácidos nucleicos se unen a las fibras de la matriz de fibras de vidrio, se lavan con un tampón de lavado con contenido en alcohol y los ácidos nucleicos unidos se eluyen finalmente de la matriz de fibras de vidrio tras añadir, por ejemplo, agua.
Lo mismo es válido también para muestras biológicas complejas tales como muestras de heces o, 20 eventualmente, sangre total. Con los sistemas y procedimientos conocidos hasta ahora, que también contienen en el tampón de lisis los componentes salinos necesarios para la adsorción de los ácidos nucleicos, no se puede realizar una simplificación de este tipo.
El procedimiento de acuerdo con la invención muestra sorprendentemente otro efecto nuevo muy esencial. Se sabe que los materiales de soporte usados para el aislamiento y la purificación (en combinación con los tampones 25 conocidos de alta concentración salina y, dado el caso, alcoholes) son vidrio, cerámicas, cuarzo, geles de sílice, Aerosil, tierras de diatomeas, etc.. Estos materiales pueden ser porosos y no porosos. Como suspensiones, o también como fibras, geles, lana o esteras pueden formar parte de, por ejemplo, unidades de centrifugación (columnas filtrantes de centrifugación), etc. El experto también sabe que la unión de polianiones, como, por ejemplo ADN, puede producirse a superficies funcionales negativas. Este conocimiento básico constituye la base científica para el uso de fases sólidas 30 negativas o potencialmente negativas para la unión de ácidos nucleicos con los tampones conocidos de alta concentración salina.
Sorprendentemente, la combinación descrita en el procedimiento de acuerdo con la invención de un tampón de lisis para digerir la muestra biológica con la adición siguiente de un tampón de unión, formado por un alcohol, una sal de un catión divalente y un detergente, muestra que los materiales de soporte que se han de usar no tienen que cumplir 35 ningún tipo de requisitos específicos para que los ácidos nucleicos se unan eficazmente. Además de la posibilidad de usar materiales de soporte conocidos en sí (especialmente con cargas funcionales negativas), se han podido usar materiales de soporte física/ químicamente totalmente diferentes para el aislamiento y la purificación de ácidos nucleicos. A modo de ejemplo son de mencionar:
Membranas de nilón de carga positiva, membranas de polisulfona, membranas de polietersulfona, membranas 40 de PVDF, membranas de polímeros acrílicos, membranas de intercambio iónico, fritas de polietileno e incluso simples papeles de filtro, materiales de fibras de vidrio (por ejemplo filtros de papel). Esto también resulta muy sorprendente puesto que muchas de las membranas descritas presentan superficies neutras químicamente inertes y en realidad se usan en la práctica para filtraciones aprovechando que no presentan ninguna afinidad de unión por biomoléculas.
Para la unión de los ácidos nucleicos mediante el procedimiento descrito también son adecuadas las partículas 45 (por ejemplo, partículas de óxido de hierro magnéticas funcionalizadas, partículas de silicato etc.).
La unión y la desorción final de los ácidos nucleicos a y de estos materiales de soporte totalmente diferentes se pueden efectuar en las mismas condiciones de tampón de lisis/de unión.
Esta observación permite concluir que se trata de un mecanismo completamente novedoso por medio del cual se realiza el proceso de aislamiento y purificación de ácidos nucleicos. 50
Cabe señalar que la posibilidad de usar los más diversos materiales de soporte permitirá realizar desarrollos de productos completamente nuevos en el campo del aislamiento y la purificación de ácidos nucleicos. La combinación razonable de tampón de lisis/de unión con materiales de soporte específicos ofrece ahora la posibilidad de desarrollar estrategias de solución completamente nuevas para el aislamiento de ácidos nucleicos. Esto resulta tanto más interesante en cuanto que los procedimientos para la preparación molecular de muestras son cada vez más esenciales 55 en el contexto del diagnóstico molecular, que se desarrolla a gran velocidad, en prácticamente todos los ámbitos de nuestra vida.
La invención se explicará con más detalle a continuación mediante ejemplos de realización.
Ejemplos de realización
Ejemplo 1: Aislamiento de ADN genómico a partir de muestras de tejido usando diferentes materiales de soporte sólidos
En un recipiente de reacción de 1,5 ml se incubaron durante 30 min a 50ºC bajo agitación continua y con la adición de 25 µl de proteinasa K (20 mg/ml) aproximadamente 5 mg de material tisular (hígado de cerdo) en, 5 respectivamente, 400 µl de tampón de lisis (SDS; Tris HCl, pH 8,0, EDTA). Tras la lisis del material de partida, la preparación de lisis se centrifugó durante 1 min a velocidad máxima para separar los componentes no lisados. A continuación se añadieron al sobrenadante 400 µl de tampón de unión (50% isopropanol, 10% Tween 20, MgCl2 0,5 M) y se mezclaron. La preparación se transfirió después a filtros de centrifugación comerciales que contenían diferentes membranas y se centrifugó a través de las membranas. Se usaron las membranas siguientes: 10
1. Membrana de fibras de vidrio (empresa Filtrak)
2. Tissue Quartz (empresa Pall)
3. Membrana de intercambio iónico (intercambio catiónico; empresa Pall)
4. Membrana de polisulfona (no cargada; empresa Pall)
5. Membrana de polímero acrílico (no cargada; empresa Pall) 15
6. Papel de filtro (13 µm; empresa Roth)
El filtrado se desechó y la columna de centrifugación se lavó una vez con 800 µl de tampón de lavado (NaCl 50 mM; Tris HCl 10 mM; EDTA 1 mM; 70% v/v de etanol).
Después de eliminar el etanol en un breve paso de centrifugación (12.000 rpm durante 2 min) se llevó a cabo la elución del ácido nucleico por adición de 200 µl de un tampón de elución (Tris HCl 10 mM; pH 8,5) y centrifugación 20 durante 1 min a 10.000 rpm.
A continuación se efectuó la medición espectrofotométrica del ADN.
En la tabla siguiente se representan los resultados. Se realizaron en cada caso 3 extracciones y, después de la medición, se calculó la media de los valores medidos.
Membrana
Rendimiento Relación 260:280
Membrana de fibras de vidrio (empresa Filtrak)
23 µg 1,92
Tissue Quartz (empresa Pall)
22 µg 1,77
Membrana de intercambio iónico (intercambio catiónico; empresa Pall)
14 µg 1,97
Membrana de polisulfona (no cargada; empresa Pall)
17 µg 2,00
Membrana de polímero acrílico (no cargada; empresa Pall)
20 µg 1,87
Papel de filtro (13 µm; empresa Roth)
11 µg 1,94
25
Los resultados demuestran que el aislamiento de ácidos nucleicos también se puede realizar muy eficazmente y con una alta pureza con diferentes materiales de soporte y que no sólo son adecuados los materiales silicatados clásicos usados hasta ahora. Los resultados demuestran asimismo que también se obtiene una alta pureza de los ácidos nucleicos con un solo paso de lavado.
Ejemplo 2: 30
A aproximadamente 50 mg de tejido hepático (ratón) se añadieron por preparación 400 µl de tampón de lisis sin componentes caotrópicos ni anticaotrópicos y con 1% de SDS; EDTA 10 mM y Tris HCl 50 mM, así como 25 µl de proteinasa K, y se lisaron a 50ºC.
Tras la lisis se llevó a cabo la adición de 400 µl de una mezcla de alcohol/ detergente (50% isopropanol/ 40% Tween 20) como tampón de unión. La preparación de lisis y el tampón de unión se mezclaron a conciencia mediante una 35 pipeta.
Las muestras se transfirieron a una columna de centrifugación con material filtrante de fibras de vidrio y se centrifugaron a 10.000 x g durante 1 min. El filtrado se desechó.
A continuación se lavó dos veces con un tampón de lavado con contenido en etanol (70% de etanol, cloruro sódico; Tris HCl).
La columna se secó por centrifugación a 10.000 x g durante 2 min. 5
El ADN se eluyó por adición de 200 µl de un tampón de elución (Tris HCl 10 mM); se centrifugó a 5.000 x g durante 1 min.
A continuación se midió el ADN aislado por espectrofotometría.
Resultado
Muestra
Relación A260:A280 Rendimiento total de ADN
1
1,87 77 µg
2
1,84 74 µg
3
1,86 73 µg
4
1,88 78 µg
5
1,83 72 µg
10
Conclusión:
El procedimiento demuestra claramente que es posible aislar cantidades cuantitativas de ácidos nucleicos mediante el uso de un material de soporte mineral conocido para el experto (fibras de vidrio) aun sin el uso de las denominadas sales caotrópicas o anticaotrópica. Todos los procedimientos de extracción conocidos para el experto en los que se unen ácidos nucleicos a una fase mineral sólida necesitan las sales indicadas. 15
Definiciones
Componentes caotrópicos:
Sustancias que destruyen la estructura regular del agua líquida, basada en la formación de enlaces de tipo puentes de hidrógeno, impidiendo la formación de las estructuras de jaula de H2O necesarias para la solvatación. Ejemplos de componentes caotrópicos son tiocianatos, yoduros o percloratos. Provocan la desnaturalización de 20 proteínas, el aumento de la solubilidad de sustancias apolares en agua, así como la destrucción de interacciones hidrófobas.
Componentes anticaotrópicos:
Sustancias que intensifican la estructura regular del agua líquida, basada en la formación de enlaces de tipo puentes de hidrógeno. Ejemplos de componentes anticaotrópicos son sales de amonio, de sodio o de potasio. No 25 provocan la desnaturalización, sino la intensificación de fuerzas hidrófobas y la intensificación de interacciones hidrófobas.
Componente alcohólico:
Los componentes alcohólicos en el sentido de la invención son todos los alcoholes hidrosolubles, tales como metanol, etanol, propanol, isopropanol, etilenglicol, polietilenglicol o glicerol. 30

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de materiales que contienen ácidos nucleicos, que comprende los pasos siguientes:
    · Digestión del material de partida con un tampón que no contiene componentes caotrópicos ni anticaotrópicos.
    · Adición de una mezcla formada por un alcohol y un detergente, ascendiendo la proporción del componente 5 alcohólico en la mezcla de alcohol y detergente a entre 20 y 80%, y la proporción del detergente, a al menos 10%.
    · Unión de los ácidos nucleicos a una fase sólida.
    · Lavado de los ácidos nucleicos unidos con tampón de lavado.
    · Elución de los ácidos nucleicos unidos con un tampón de baja concentración salina o con agua.
  2. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la proporción del componente alcohólico en la 10 mezcla formada por el alcohol y el detergente asciende a entre 45 y 55%.
  3. 3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque se trata de un detergente no iónico.
  4. 4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque como alcohol se usan alcoholes hidrosolubles, tales como metanol, etanol, propanol, isopropanol, etilenglicol, polietilenglicol o glicerol.
  5. 5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el tampón para la digestión 15 proteolítica de muestras biológicas comprende SDS, Tris HCl y EDTA.
  6. 6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque como fase sólida se usa cualquier material de soporte.
  7. 7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque como fase sólida se usan tanto superficies funcionales negativas conocidas, como membranas de nilón de carga positiva, membranas de polisulfona, membranas 20 de polietersulfona, membranas de PVDF, membranas de polímeros acrílicos, membranas de intercambio iónico, fritas de polietileno o simples papeles de filtro, materiales de fibras de vidrio, así como partículas de óxido de hierro magnéticas o partículas de silicato.
  8. 8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque para la filtración previa y la adsorción final de los ácidos nucleicos se usa el mismo material de filtro. 25
  9. 9. Formulación para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de materiales que contienen ácidos nucleicos, que comprende
    · al menos un tampón para la digestión proteolítica de muestras biológicas que no contiene componentes caotrópicos ni anticaotrópicos,
    · al menos una mezcla formada por un alcohol y un detergente, en la que la proporción del componente 30 alcohólico en la mezcla formada por el alcohol y el detergente asciende a entre 20 y 80%, y la proporción del detergente, a al menos 10%,
    · al menos una fase sólida,
    · tampón de lavado y de elución.
  10. 10. Formulación según la reivindicación 9, caracterizada porque la proporción del componente alcohólico en la 35 mezcla formada por el alcohol y el detergente asciende a entre 45 y 55%.
  11. 11. Formulación según la reivindicación 9 ó 10, caracterizada porque se trata de un detergente no iónico.
  12. 12. Formulación según una de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizada porque el componente alcohólico comprende adicionalmente al menos una sal con un catión polivalente.
  13. 13. Formulación según la reivindicación 12, caracterizada porque en el caso de la sal con un catión polivalente se 40 trata de una sal con un catión de doble carga positiva.
  14. 14. Formulación según la reivindicación 12 ó 13, caracterizada porque la concentración del catión polivalente no supera 1,5 mol/l.
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