ES2617778T3 - Método para aislar un ácido nucleico diana que incluye ácidos nucleicos diana pequeños, con alto rendimiento - Google Patents
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Abstract
Un método para aislar un ácido nucleico diana que incluye ácidos nucleicos diana pequeños que tienen una longitud inferior a 500 nucleótidos a partir de una muestra, en donde el ácido nucleico diana comprende o consiste en ácidos nucleicos diana pequeños, comprendiendo dicho método al menos las siguientes etapas: a) unir al menos una porción del ácido nucleico diana que incluye ácidos nucleicos diana pequeños a una fase sólida de unión a ácido nucleico comprendida en una columna mediante el paso de la muestra a través de dicha columna de tal forma que el ácido nucleico diana que incluye ácidos nucleicos diana pequeños se une a la fase sólida de unión a ácido nucleico comprendida en la columna, b) llevar a cabo un tratamiento enzimático y/o químico sobre la fase sólida de unión a ácido nucleico mientras el ácido nucleico diana que incluye ácidos nucleicos diana pequeños están unidos a dicha fase sólida, c) recoger al menos una porción de los ácidos nucleicos diana pequeños liberados de la fase sólida durante dicho tratamiento de la etapa b) como flujo de salida, d) poner en contacto dicho flujo de salida que comprende ácidos nucleicos diana pequeños mezclados con una disolución de recuperación con una fase sólida de unión a ácido nucleico para unir los ácidos nucleicos diana pequeños contenidos a dicha fase sólida de unión a ácido nucleico, e) llevar a cabo una elución.
Description
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DESCRIPCION
Metodo para aislar un acido nucleico diana que incluye acidos nucleicos diana pequenos, con alto rendimiento
La presente invencion se refiere a un metodo para aislar un acido nucleico diana que incluye acidos nucleicos diana pequenos a partir de una muestra y en particular, proporciona medios para aislar eficientemente acidos nucleicos diana pequenos de una muestra con alto rendimiento.
El estudio de acidos nucleicos pequenos, en el orden de 1000 o 500 nucleotidos o menos, de varios tejidos, fluidos corporales y organismos es un area de extremo interes y promete continuar siendolo en el futuro. En particular, los acidos nucleicos pequenos incluyen, pero no estan limitados a, RNA pequenos tales como inter alia micro RNA (miRNA) y moleculas de RNA interferente pequeno, los cuales pueden tener un poderoso efecto en la expresion de un gen. Ademas, tambien son de interes otros RNA nucleares pequenos y nucleolares pequenos (p. ej. snRNA y sonRNA) implicados en el procesamiento de mRNA y rRNA asf como moleculas pequenas de DNA. Ademas, muestras especiales tales como p. ej. muestras que se han fijado con formalina y embebido en parafina (muestras FFPE), contienen a menudo como productos de degradacion acidos nucleicos que tienen una longitud de 1000 o 500 nucleotidos o menos, porque la preservacion respectiva puede comprometer la integridad del DNAy/o RNA.
Con el creciente interes en los respectivos acidos nucleicos pequenos, los procesos estandar de aislamiento se han modificado para facilitar el aislamiento de acidos nucleicos pequenos y en particular, para mejorar el rendimiento de acidos nucleicos pequenos. Los protocolos conocidos utilizados como estandar para aislar DNA o RNA, habitualmente no son ideales para aislar acidos nucleicos pequenos porque a menudo los acidos nucleicos pequenos no se capturan y se eluyen eficazmente durante el proceso de aislamiento utilizando los metodos estandar. Por lo tanto, los acidos nucleicos diana aislados a partir de muestras utilizando procedimientos estandar habitualmente no comprenden los acidos nucleicos diana pequenos en cantidades suficientes y por consiguiente no proporcionan rendimientos aceptables porque los acidos nucleicos pequenos no se unen o se pierden durante el proceso de aislamiento de acido nucleico. Por consiguiente, se necesitan tecnicas mejoradas para el aislamiento eficiente de acidos nucleicos diana pequenos solos o como una porcion de los acidos nucleicos diana totales aislados, tales como p. ej. RNA total o dNa total.
Los metodos que se han optimizado para el aislamiento de acidos nucleicos pequenos a menudo se basan en la extraccion de fenol y cloroformo y fraccionamiento gradual en alcohol. De acuerdo con una realizacion, el RNA se concentra en la fase acuosa y despues se afsla subsecuentemente a partir de la misma p. ej. mediante la adicion de al menos un alcohol y la union del RNA a una membrana. Aqrn, tambien es importante capturar eficientemente los RNA pequenos en el RNA total aislado.
Ademas, se han desarrollado metodos para aislar acidos nucleicos pequenos, tales como RNA pequenos, que involucran el uso de agentes caotropicos, concentraciones elevadas de alcohol y columnas de union de acidos nucleicos que comprenden p. ej. membranas de union a acidos nucleicos tales como una membrana de sflice.
El RNA total aislado con estos protocolos comprende RNA pequenos, si la muestra contema los respectivos RNA pequenos. Los respectivos protocolos de aislamiento basados en membranas son particularmente apropiados para aislar acidos nucleicos pequenos, ya sea solos o como una porcion del acido nucleico diana total, de varias muestras.
Existen/existfan kits comerciales disponibles para aislar RNA pequeno p. ej. de QUIAGEN (“miRNAeasy Mini Handbook”); Macherey-Nagel GmbH & Co. KG (“Aislamiento de RNA grande y pequeno, Manual del usuario, NucleoSpin® miRNA”); Roche Diagnostics GmbH (“Kit de aislamiento de miRNA super puro”); Ambion, Inc. (mirVana™ kit de aislamiento de miRNA); Invitrogen Inc. (“Purelink™ kit de aislamiento de miRNA”) y Norgen Biotek Corp. (“kit de purificacion de microRNA”).
Sin embargo, muchos procedimientos de aislamiento de acidos nucleicos que utilizan una fase solida basada en una columna para unir los acidos nucleicos (p. ej. una membrana de union a acidos nucleicos comprendida en una columna) involucran una o mas etapas de tratamiento que involucran una o mas disoluciones acuosas mientras el acido nucleico diana esta unido a la fase de union al acido nucleico (tambien llamadas p. ej. etapas de tratamiento “en membrana” o “en columna”). Ejemplos respectivos de etapas de tratamientos que se llevan a cabo mientras los acidos nucleicos estan unidos a la fase solida de union a acidos nucleicos incluyen, pero no estan limitadas a, etapas de digestion de protemas y etapas de digestion de nucleasas tales como p. ej. tratamientos de DNasa o RNasa. Se encontro que el rendimiento de las respectivas etapas de tratamiento disminuye el rendimiento de acidos nucleicos diana y en particular disminuye el rendimiento de acidos nucleicos diana pequenos porque dichos tratamientos tienen el efecto de que al menos una porcion de los acidos nucleicos diana unidos y en particular de los acidos nucleicos diana pequenos se liberan de la fase solida de union a acidos nucleicos durante dichas etapas de tratamiento. Por consiguiente, para evitar que los acidos nucleicos liberados se pierdan en las subsecuentes etapas de lavado o procesado, en la tecnica anterior se conocfa la aplicacion de p. ej. una disolucion caotropica (p. ej. una disolucion de lavado caotropica) que recupera las condiciones apropiadas de union despues de llevar a cabo el tratamiento, con el fin de restaurar la union de los acidos nucleicos diana potencialmente liberados a la fase de union de acidos nucleicos. Una etapa respectiva de restauracion se describe p. ej. en WO 98/59076 y se utiliza tambien en
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muchos kits de aislamiento de acidos nucleicos comercialmente disponibles.
Sin embargo, se encontro que a pesar de llevar a cabo una etapa respectiva de restauracion para restaurar la union de los acidos nucleicos diana potencialmente liberados a la fase solida de union de acidos nucleicos, los acidos nucleicos diana pequenos finalmente se perdfan durante el proceso de aislamiento. Particularmente, este es el caso cuando se afslan los acidos nucleicos utilizando una columna basada en una fase solida para unir los acidos nucleicos, p. ej. cuando se utilizan columnas que comprenden una membrana de union a acidos nucleicos. Por consiguiente, existe todavfa una necesidad de mejora con el fin de aumentar el rendimiento de los acidos nucleicos pequenos en el acido nucleico diana aislado.
Por consiguiente, el objetivo de la presente invencion es proporcionar un metodo para aislar al menos un acido nucleico diana que incluye o puede consistir en acidos nucleicos diana pequenos, en donde se aumenta el rendimiento de los acidos nucleicos diana pequenos.
Compendio de la invencion
La presente invencion se basa en la conclusion de que la aplicacion de un tampon de restauracion o de un tampon de lavado que mejora la union despues de llevar a cabo p. ej. un tratamiento enzimatico mientras los acidos nucleicos estan unidos a la fase solida de union de acidos nucleicos es insuficiente para volver a capturar, y por consiguiente aislar, con rendimiento aceptable los acidos nucleicos diana pequenos que se liberaron durante dicho tratamiento si se utiliza una fase solida de union a acido nucleico basada en una columna. Subsecuentemente, esto se explicara en base a la realizacion preferida, en donde una membrana de union a acido nucleico se utiliza como fase solida. Sin limitarse por la teona, se asume que al menos una porcion de los acidos nucleicos diana pequenos liberados durante el tratamiento en membrana se localiza por debajo de la membrana y/o muy por debajo de los poros de la membrana. Los respectivos acidos nucleicos diana pequenos “escapados” no se pueden volver a unir eficientemente mediante la aplicacion de un tampon de restauracion (o un tampon de lavado que mejora la union) porque no estan en contacto con el area de union a acido nucleico de la membrana y por lo tanto, se pierden en las subsecuentes etapas de procesamiento. Surgen problemas similares cuando se utilizan otras fases solidas de union a acido nucleico basadas en columnas, en particular si la fase solida de union a acido nucleico unicamente forma p. ej. una capa fina en la columna. La presente invencion ensena a recoger estos acidos nucleicos diana pequenos “escapados” y a unirlos a una fase solida de union a acido nucleico. De esta manera, tambien estos acidos nucleicos diana pequenos “escapados” (que se pierden cuando se llevan a cabo los metodos de la tecnica anterior) pueden capturarse eficientemente en el proceso de aislamiento del acido nucleico diana, aumentando de esta manera el rendimiento de los acidos nucleicos pequenos en el acido nucleico diana aislado. Por consiguiente, el metodo de acuerdo con la presente invencion permite el aislamiento de acidos nucleicos diana pequenos con rendimiento mejorado, y de esta manera proporciona considerables ventajas sobre los metodos conocidos en la tecnica anterior.
La invencion puede definirse mediante las reivindicaciones adjuntas.
De acuerdo con un primer aspecto, se proporciona un metodo para aislar al menos un acido nucleico diana que incluye acidos nucleicos diana pequenos que tienen una longitud inferior a 500 nucleotidos, de una muestra, en donde el acido nucleico diana comprende o consiste en acidos nucleicos diana pequenos y en donde dicho metodo comprende al menos las siguientes etapas
a) Unir al menos una porcion del acido nucleico diana que incluye acidos nucleicos diana pequenos, a una fase solida de union a acido nucleico comprendida en una columna mediante el paso de la muestra a traves de dicha columna de modo que el acido nucleico diana que incluye acidos nucleicos diana pequenos, se una a la fase solida de union a acido nucleico comprendida en la columna,
b) llevar a cabo un tratamiento que involucra una disolucion acuosa en la membrana mientras el acido nucleico diana que incluye acidos nucleicos diana pequenos, esta unido a dicha membrana,
c) pasar una disolucion de recuperacion a traves de dicha membrana y recoger el flujo de salida que comprende acidos nucleicos diana pequenos,
d) pasar dicho flujo de salida a traves de la membrana de la etapa a) para volver a unir los acidos nucleicos diana pequenos contenidos a dicha membrana,
e) eluir el acido nucleico diana, incluido el acido nucleico pequeno, de dicha membrana.
Tambien se describe el uso de una disolucion de recuperacion capaz de unir acidos nucleicos pequenos a una fase solida de union a acido nucleico comprendida en una columna, para volver a unir los acidos nucleicos pequenos que se liberaron de dicha fase solida de union a acido nucleico durante un tratamiento que previamente se llevo a cabo mientras los acidos nucleicos estaban unidos a dicha fase solida y que preferiblemente se recogieron como flujo de salida.
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Ademas se describe un kit para llevar a cabo los metodos de acuerdo con la presente invencion que comprende:
a) una fase solida de union a acido nucleico, preferiblemente una membrana, comprendida en una columna;
b) un tampon de union para unir un acido nucleico diana que incluye acidos nucleicos diana pequenos, a dicha fase solida de union a acido nucleico que comprende un agente caotropico y un alcohol;
c) una disolucion de recuperacion que comprende un agente caotropico en una concentracion de 0,5 M hasta el lfmite de saturacion y un alcohol en una concentracion de al menos 50%; y
d) instrucciones para llevar a cabo el metodo de acuerdo con la presente invencion.
Descripcion breve de las figuras
Las figuras 1 a 3 muestran la distribucion de tamanos de RNA aislados de tejido renal utilizando un Agilent Bio Analyzer. “+” indica el RNA que se aislo utilizando el metodo de acuerdo con la presente invencion y “-” indica el RNA que se aislo utilizando el metodo de referencia. La fraccion de RNA pequeno se marca con una flecha.
La figura 4 muestra el resultado de un ensayo de deteccion de miR16 despues del aislamiento de RNA llevando a cabo el metodo de acuerdo con la presente invencion, utilizando diferentes disoluciones de recuperacion, o el metodo de referencia, en donde no se utiliza ninguna disolucion de recuperacion respectiva. Como puede verse, los valores ct se reducen considerablemente con las disoluciones de recuperacion de acuerdo con la presente invencion, de esta manera se demuestra la mejora en el aislamiento del RNA pequeno.
La figura 5 muestra una fotograffa de un gel de agarosa cargado con RNA purificado con 5 kits diferentes (ver ejemplo 7). La flecha en el lado derecho indica los RNA pequenos.
La figura 6 es un diagrama que muestra los resultados de una PCR en tiempo real con mRNA cjun (ver ejemplo 7). El RNA se ha purificado de muestras FFPE derivadas de 3 tejidos de rata diferentes: 1. hepatico (embebido durante 2 meses), 2. renal (embebido durante 19 meses) y 3. pulmonar (embebido durante 8 meses).
La figura 7 es un diagrama que muestra el resultado de un analisis de microRNA con miR29a (ver ejemplo 7).
La figura 8a y la figura 8b representan el resultado de un analisis de PCR en tiempo real de DNA purificado con kits de diferentes proveedores (ver ejemplo 7). El DNA se ha purificado de muestras FFPE derivadas de 3 tejidos de rata diferentes: 1. hepatico (embebido durante 2 meses), 2. renal (embebido durante 19 meses) y 3. pulmonar (embebido durante 8 meses). Se han utilizado para todas las muestras los mismos volumenes patron en la figura 8a y las mismas concentraciones patron en la figura 8b.
Los diagramas en la figura 9a y la figura 9b muestran los resultados de un experimento de PCR en tiempo real para analizar RNA Madh7 (ver ejemplo 7). El RNA se ha purificado de muestras FFPE derivadas de 3 tejidos de rata diferentes: 1. hepatico (embebido durante 2 meses), 2. renal (embebido durante 19 meses) y 3. pulmonar (embebido durante 8 meses). Se han utilizado para todas las muestras los mismos volumenes patron en la figura 9a, y las mismas concentraciones patron en la figura 9b.
Descripcion detallada de la invencion
Sorprendentemente, se encontro que el rendimiento de acidos nucleicos diana pequenos que tienen una longitud inferior a 500 nucleotidos puede aumentarse considerablemente en un metodo para aislar al menos un acido nucleico diana, incluido un acido nucleico diana pequeno, de una muestra, en donde el acido nucleico diana comprende o consiste en acidos nucleicos diana pequenos, cuando se llevan a cabo al menos las siguientes etapas:
a) Unir al menos una porcion del acido nucleico diana que incluye acidos nucleicos diana pequenos, a una fase solida de union de acido nucleico comprendida en una columna mediante el paso de la muestra a traves de dicha columna, de tal manera que el acido nucleico diana que incluye acidos nucleicos diana pequenos, se una a la fase solida de union a acido nucleico comprendida en la columna,
b) llevar a cabo un tratamiento enzimatico y/o qmmico en la fase solida de union a acido nucleico mientras el acido nucleico diana que incluye acidos nucleicos diana pequenos, esta unido a dicha fase solida,
c) recoger al menos una porcion de los acidos nucleicos diana pequenos librados de la fase solida durante dicho tratamiento de la etapa b) como flujo de salida,
d) poner en contacto dicho flujo de salida que comprende acidos nucleicos diana pequenos mezclados con una disolucion de recuperacion con una fase solida de union a acido nucleico para unir los acidos nucleicos diana pequenos contenidos a dicha fase solida de union a acido nucleico,
e) llevar a cabo una elucion.
Las etapas individuales del metodo de acuerdo con la presente invencion se explicaran con mas detalle a
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continuacion.
En la etapa a), el acido nucleico diana que incluye acidos nucleicos diana pequenos que se comprenden en la muestra, se une a la fase solida de union a acido nucleico comprendida en una columna cuando la muestra pasa a traves de dicha columna. Preferiblemente, se utiliza una membrana de union a acido nucleico como fase solida. En la tecnica precedente se conocen condiciones de union apropiadas para unir un acido nucleico diana que incluye acidos nucleicos diana pequenos, a una fase solida de union a acido nucleico, tal como una membrana, y se describen con mas detalle a continuacion. Las condiciones de union tambien dependen del acido nucleico diana que ha de aislarse (p. ej. RNA o DNA o ambos). Preferiblemente, se utilizan condiciones de union que permiten uniones fuertes, y por consiguiente eficientes, del acido nucleico diana que incluye acidos nucleicos diana pequenos, a la fase solida de union a acido nucleico con el fin de permitir el aislamiento del acido nucleico diana que incluye acidos nucleicos diana pequenos, con alto rendimiento. Para lograr condiciones de union apropiadas en la etapa a), la muestra puede mezclarse con una disolucion de union apropiada, tal como un tampon de union que establece las condiciones de union deseadas. Comunmente, la etapa a) se llevara a cabo despues de la lisis inicial de las muestras, en caso de que se procese una muestra que necesite lisis. Ademas, otras etapas de pre-tratamiento tambien pueden llevarse a cabo antes de la etapa a), p. ej. con el fin de clarificar el lisado, para eliminar acidos nucleicos no diana u otros contaminantes, para concentrar los acidos nucleicos diana y/o para pre-purificar los acidos nucleicos diana. En estos casos, la respectiva muestra pre-tratada o procesada se pasa como muestra a traves de la columna en la etapa a) y al menos los acidos nucleicos diana que incluye los acidos nucleicos diana pequenos, se unen a la fase solida de union a acido nucleico. En caso de que se utilice una disolucion de lisis qrnmica para la lisis, dicha disolucion de lisis tambien puede contribuir a establecer las condiciones de union apropiadas.
En la etapa b), un tratamiento enzimatico y/o qrnmico se lleva a cabo en la fase solida mientras el acido nucleico diana que incluye acidos nucleicos diana pequenos, esta unido a dicha fase solida, p. ej. un tratamiento en membrana, en caso de que se utilice una membrana como fase solida de union a acido nucleico. Comunmente se llevan a cabo respectivos tratamientos durante un procedimiento de aislamiento de acidos nucleicos e incluyen, pero no estan limitado a, tratamientos seleccionados del grupo que consiste en una etapa de digestion con nucleasa, p. ej. un tratamiento de DNasa o RNasa, una etapa de digestion de protemas, p. ej. un tratamiento con una enzima proteolftica para degradar contaminaciones proteicas que estuvieran unidas p. ej. a una membrana durante la etapa de union a) (ver p. ej. WO 2009/016110), un tratamiento de lipasa y una etapa de modificacion del acido nucleico diana. Los respectivos tratamientos habitualmente involucran el uso de una o mas disoluciones acuosas que tienen una composicion que permite o promueve llevar a cabo el tratamiento deseado. Sin embargo, dichas disolucion(es) acuosa(s) habitualmente no tiene(n) una composicion que permite o promueve la union del acido nucleico diana, y en particular de los acidos nucleicos diana pequenos, a dicha fase solida de union a acido nucleico. Particularmente, esto aplica cuando se lleva a cabo p. ej. un tratamiento enzimatico en membrana o en columna porque se deben establecer condiciones que permitan a la enzima estar activa. Por lo tanto, el tratamiento enzimatico o qrnmico llevado a cabo en la etapa b) habitualmente involucra condiciones que resultan en una libracion, al menos parcial, de los acidos nucleicos diana pequenos de la fase solida de union a acido nucleico. Por consiguiente, la adicion de la disolucion acuosa durante el tratamiento llevado a cabo en la etapa b) resulta en una liberacion parcial de los acidos nucleicos diana que se habfan unido en la etapa a) a la fase solida de union a acido nucleico. Cuanto mas pequeno sea el acido nucleico diana, mayor sera el riesgo de que dicho acido nucleico se disocie completamente de la fase solida de union a acido nucleico durante el tratamiento llevado a cabo en la etapa b). Como se discutio anteriormente, los acidos nucleicos diana respectivamente liberados (que habitualmente son pequenos en tamano) pueden localizarse sobre, dentro o debajo de la membrana (respectivamente, la fase solida de union a acido nucleico comprendida en la columna). En caso de que los acidos nucleicos diana liberados esten localizados p. ej. debajo de la membrana o muy por debajo los poros de la membrana, no pueden capturarse eficientemente mediante la aplicacion de una disolucion de restauracion o mediante el uso de un tampon de lavado que mejora la union. Por consiguiente, se pierden durante el procesamiento siguiente de la muestra, como es el caso en los metodos de acuerdo con la tecnica precedente.
Con el fin de capturar, y por consiguiente aislar, respectivamente acidos nucleicos diana pequenos “escapados” que no pueden volver a unirse mediante la restauracion de condiciones de union apropiadas, la presente invencion ensena a eliminar en la etapa c) los acidos nucleicos diana pequenos “escapados” de la fase solida de union a acido nucleico. Por consiguiente, en la etapa c) al menos una porcion de los acidos nucleicos diana pequenos que se libraron de la fase solida de union a acido nucleico durante dicho tratamiento de la etapa b) se recogen como flujo de salida. Preferiblemente, se recogen respectivamente la mayona o la totalidad de los acidos nucleicos diana pequenos “escapados”. Llevar a cabo dicha etapa c) de recoleccion es esencial, porque aumenta considerablemente el rendimiento de los acidos nucleicos diana pequenos en el acido nucleico diana aislado, como tambien se demuestra mediante los ejemplos. Por supuesto, de esta manera, tambien pueden recogerse eficientemente acidos nucleicos diana mas grandes que hayan podido liberarse durante la etapa b). Sin embargo, como se discute anteriormente, este problema ocurre con menos frecuencia con acidos nucleicos diana mas grandes porque los acidos nucleicos diana mas grandes habitualmente se unen con mas fuerza a la fase solida de union a acido nucleico que los acidos nucleicos diana mas pequenos. Sin embargo, si se liberan, tambien se recogen eficientemente mediante el metodo de acuerdo con la presente invencion.
En la etapa d), dicho flujo de salida que comprende acidos nucleicos diana pequenos mezclados con una disolucion
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de recuperacion (y opcionalmente disoluciones/qmmicos adicionales) se pone en contacto con una fase solida de union a acido nucleico para unir los acidos nucleicos diana pequenos contenidos a dicha fase solida. Mediante la mezcla de los acidos nucleicos diana pequenos con la disolucion de recuperacion de acuerdo con la presente invencion, se establecen las condiciones de union que permiten unir los acidos nucleicos diana pequenos recogidos a la fase solida. Preferiblemente, la fase solida de union a acido nucleico utilizada en la etapa d) para unir los acidos nucleicos diana pequenos es la misma fase solida de union a acido nucleico que se utiliza en la etapa a). En esta realizacion, el flujo de salida que comprende los acidos nucleicos diana pequenos mezclados con una disolucion de recuperacion se vuelve a aplicar a la fase solida de union a acido nucleico que se utilizo en la etapa a), de esta manera se vuelven a unir los acidos nucleicos diana pequenos a dicha fase solida y se reunen los acidos nucleicos diana pequenos con los acidos nucleicos diana que no se liberaron en la etapa b). Como se discute anteriormente, en la etapa a) se utiliza preferiblemente una membrana como fase solida de union a acido nucleico. Sin embargo, tambien esta dentro del alcance de la presente invencion utilizar una fase solida de union a acido nucleico diferente en la etapa d), tal como p. ej. partfculas magneticas de sflice, una fase solida de union a acido nucleico basada en columna diferente o el mismo tipo de membrana que se utilizo en la etapa a). Esta recuperacion de los acidos nucleicos diana pequenos “escapados” que se lleva a cabo en la etapa d) permite reducir considerablemente la perdida de acidos nucleicos diana pequenos y por consiguiente aumenta el rendimientos de los acidos nucleicos diana pequenos en el acido nucleico diana aislado.
En la etapa e) se llevan a cabo una o mas etapas de elucion. Alternativamente o adicionalmente, se describe que el acido nucleico diana tambien puede procesarse mientras esta unido a la fase solida, dependiendo de la aplicacion prevista aguas abajo, respectivamente, del uso previsto del acido nucleico diana. La elucion puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante la utilizacion de disoluciones clasicas de elucion tales como agua, tampones de elucion, tampones bajos en sales y en particular tampones biologicos. Preferiblemente, se utiliza una disolucion de elucion que no interfiere con las aplicaciones previstas aguas abajo. Sin embargo, tambien esta dentro del alcance de la presente invencion liberar y por consiguiente eluir si se desea los acidos nucleicos diana mediante otros medios de elucion, tales como p. ej. calentamiento. En el caso de que en la etapa d) se utilice una fase solida que difiera de la fase solida de union a acido nucleico utilizada en la etapa a), esta dentro del alcance de la presente invencion eluir el acido nucleico diana de la fase solida utilizada en la etapa a) y separadamente eluir los acidos nucleicos diana pequenos que se unieron a la fase solida utilizada en la etapa d) y combinar los respectivos eluidos. Tambien esta dentro del alcance de la presente invencion combinar las fases solidas antes de llevar a cabo la etapa de elucion. Ademas, tambien esta dentro del alcance de la presente invencion repetir la etapa de elucion con el fin de garantizar que todos los acidos nucleicos diana se liberan eficientemente de la fase de union a acido nucleico. Como se muestra mediante los ejemplos, el metodo de acuerdo con la presente invencion, que en contraste con la tecnica anterior lleva a cabo adicionalmente las etapas c) y d), aumenta considerablemente el rendimiento de los acidos nucleicos diana pequenos en el acido nucleico diana aislado cuando se utiliza un procedimiento de aislamiento de acido nucleico basado en columna.
Existen varias opciones para llevar a cabo las etapas c) y d) para capturar, y por consiguiente aislar, los acidos nucleicos diana pequenos “escapados”. Algunas realizaciones no limitantes se describen con mas detalle a continuacion.
De acuerdo con una realizacion, en la etapa c), se pasa a traves de la columna una disolucion de recuperacion que establece condiciones apropiadas para la union de acidos nucleicos pequenos a la fase solida de union a acido nucleico que se utilizo en la etapa a) y se recoge el flujo de salida que comprende los acidos nucleicos diana pequenos “escapados”. Dicho flujo de salida, que ya esta mezclado con la disolucion de recuperacion (y que puede opcionalmente mezclarse con ingredientes adicionales) se aplica en la etapa d) a la misma fase solida de union a acido nucleico que se utilizo en la etapa a). De esta manera, los acidos nucleicos diana pequenos “escapados” contenidos en el flujo de salida se unen a la fase solida que se utilizo en la etapa a) (y a la cual estan todavfa unidos los acidos nucleicos diana que no se liberaron durante el tratamiento en membrana llevado a cabo en la etapa b)). Se prefiere esta realizacion porque tiene varias ventajas. Primero, pasar una disolucion de recuperacion a traves de dicha columna, y por consiguiente a traves de la fase solida de union a acido nucleico en ella comprendida, establece, respectivamente, restablece las condiciones apropiadas para la union de acidos nucleicos pequenos a la fase solida de union a acido nucleico. De esta manera, se garantiza que los acidos nucleicos diana, y en particular los acidos nucleicos diana pequenos que se liberaron al menos parcialmente durante el tratamiento de la etapa b) pero que todavfa pueden volver a unirse a la fase solida, se vuelven a unir eficientemente a dicha fase solida porque la solucion de recuperacion restablece condiciones apropiadas de union. Segundo, los acidos nucleicos diana pequenos “escapados” que no pueden volver a unirse a la fase solida mediante el restablecimiento de las condiciones apropiadas de union se eliminan eficientemente, y por consiguiente se recogen como flujo de salida en la disolucion de recuperacion. Tercero, utilizar directamente la disolucion de recuperacion en la etapa c) para recoger los acidos nucleicos diana pequenos “escapados” tiene la ventaja de que los acidos nucleicos diana pequenos “escapados” se proporcionan directamente en una disolucion que proporciona condiciones de union apropiadas para volver a unir los acidos nucleicos diana pequenos “escapados” a la fase solida que se utilizo en la etapa a) para unir los acidos nucleicos diana que incluye los acidos nucleicos diana pequenos. De esta manera, los acidos nucleicos diana pequenos “escapados” pueden volver a reunirse con los acidos nucleicos diana que todavfa estan unidos a dicha fase solida y por consiguiente, todos los acidos nucleicos diana pueden procesarse juntos en las etapas de preparacion subsecuentes.
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De acuerdo con una realizacion adicional para recoger los acidos nucleicos diana escapados, el tratamiento enzimatico y/o qmmico llevado a cabo en la etapa b) comprende la utilizacion de una disolucion acuosa, y los acidos nucleicos diana pequenos “escapados” se guardan mediante la recoleccion del flujo de salida que comprende los acidos nucleicos pequenos diana y la disolucion acuosa que se utilizo para el tratamiento en la etapa b). En esta realizacion, la disolucion de recuperacion puede anadirse al flujo de salida despues de que sea recogido en la etapa c), y la mezcla obtenida, opcionalmente mezclada con aditivos adicionales, se pone en contacto en la etapa d) con una fase solida de union a acido nucleico, que preferiblemente es la fase solida de union a acido nucleico que se utilizo en la etapa a), como se describe anteriormente.
De acuerdo con una realizacion, una disolucion acuosa, p. ej. un tampon de reaccion, agua o un tampon de elucion se aplica a, y se pasa a traves de, la columna que comprende la fase solida de union a acido nucleico, que preferiblemente es una membrana. Los acidos nucleicos diana pequenos liberados se recogen entonces en dicha disolucion acuosa. Si se desea, puede llevarse a cabo un tratamiento enzimatico y/o qmmico de los respectivos acidos nucleicos diana pequenos recogidos, y tambien esta dentro del alcance de la presente invencion anadir composiciones/sustancias adicionales a los acidos nucleicos diana pequenos recogidos. Ademas, se puede llevar a cabo un tratamiento enzimatico y/o qmmico de los acidos nucleicos diana que todavfa estan unidos a la fase solida utilizada en la etapa a). Esta realizacion tiene la ventaja de que permite tratar los acidos nucleicos unidos (habitualmente mas grandes) de manera diferente a los acidos nucleicos diana pequenos pre-eluidos y recogidos.
De acuerdo con un aspecto, se proporciona un metodo para aislar de una muestra un acido nucleico diana que incluye acidos nucleicos diana pequenos que tienen una longitud inferior a 500 nucleotidos, en donde el acido nucleico diana comprende o consiste en acidos diana pequenos, dicho metodo comprende al menos las siguientes etapas
a) Unir al menos una porcion del acido nucleico diana, que incluye acidos nucleicos diana pequenos, a una membrana de union a acido nucleico mediante el paso de la muestra a traves de dicha membrana de tal forma que el acido nucleico diana, que incluye acidos nucleicos diana pequenos, se una a la membrana,
b) llevar a cabo un tratamiento que involucre una disolucion acuosa en la membrana mientras el acido nucleico diana, que incluye acidos nucleicos diana pequenos, esta unido a dicha membrana,
c) pasar una disolucion de recuperacion a traves de dicha membrana y recoger el flujo de salida que comprende acidos nucleicos diana pequenos,
d) pasar dicho flujo de salida a traves de dicha membrana de la etapa a) para volver a unir los acidos nucleicos diana pequenos contenidos a dicha membrana,
e) eluir el acido nucleico diana que incluye el acido nucleico diana pequeno de dicha membrana. Preferiblemente, se eluyen de la membrana los acidos nucleicos diana que incluyen los acidos nucleicos diana pequenos.
Cualquier metodo apropiado puede utilizarse en la etapa c) para recoger al menos una porcion de los acidos nucleicos diana pequenos como flujo de salida. Los metodos de recoleccion apropiados utilizados cuando se lleva a cabo un procedimiento de aislamiento de acido nucleico basado en columna incluyen, pero no estan limitados a, llevar a cabo una etapa de centrifugacion, aplicar una presion positiva o negativa con el fin de presionar o succionar los acidos nucleicos diana pequenos, que preferiblemente se comprenden en una disolucion de recuperacion o una disolucion acuosa como se describe anteriormente, en cualquier direccion a traves de la fase solida de union a acido nucleico comprendida en la columna, en donde dicha fase solida preferiblemente es una membrana.
La disolucion de recuperacion que se utiliza para volver a unir los acidos nucleicos diana pequenos “escapados” debena proporcionar, respectivamente, establecer, condiciones apropiadas para unir acidos nucleicos pequenos a la fase solida de union a acidos nucleicos utilizada en la etapa d). La disolucion de recuperacion tambien puede obtenerse mediante la mezcla de una o mas disoluciones y/o ingredientes. La disolucion de recuperacion puede proporcionar condiciones apropiadas para unir acidos nucleicos totales, que incluyen acidos nucleicos pequenos, a la fase solida de union a acidos nucleicos utilizada en la etapa d). En caso de que se deba aislar un acido nucleico diana espedfico, la disolucion de recuperacion puede proporcionar las condiciones apropiadas para unir preferiblemente el tipo deseado de acido nucleico diana (p. ej. RNA total que incluye RNA pequeno) a la fase solida de union a acido nucleico utilizada en la etapa d). Tambien puede proporcionar condiciones apropiadas para unir DNA (p. ej. DNA total, DNA genomico, DNA fragmentado y/o DNA de bajo peso molecular tal como DNA plasirndico) que incluye DNA pequeno a la fase solida de union a acido nucleico utilizada en la etapa d), en caso de que el acido nucleico diana deseado sea DNA. Las condiciones de union proporcionadas por la disolucion de recuperacion y/o la mezcla de la disolucion de recuperacion y el flujo de salida recogido en la etapa c) pueden ser las mismas o similares a las condiciones que se utilizan en la etapa a) para unir los acidos nucleicos diana, que incluyen los acidos nucleicos diana pequenos, a la fase solida de union a acidos nucleicos comprendida en la columna. Sin embargo, preferiblemente, la disolucion de recuperacion, respectivamente, las condiciones de union que se utilizan en la etapa d), son mas fuertes que las condiciones de union utilizadas en la etapa a). Preferiblemente, la disolucion de recuperacion, que tambien puede obtenerse mediante la mezcla de una o mas disoluciones o agentes qmmicos, comprende al menos un agente caotropico y/o al menos un alcohol.
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Puede utilizarse para ese proposito cualquier agente caotropico que causa desorden en una protema o acido nucleico mediante, por ejemplo, pero no limitado a, alterar la estructura secundaria, terciaria o cuaternaria de una protema o un acido nucleico mientras que deja la estructura primaria intacta. Preferiblemente, el agente caotropico se selecciona del grupo que consiste en hidrocloruro de guanidina, tiocianato de guanidina, isotiocianato de guanidina, tiocianato de sodio, yoduro de sodio, perclorato de sodio, tricloroacetato de sodio, trifluoracetato de sodio y urea. Preferiblemente, se utiliza una sal caotropica. En particular, se pueden utilizar como agente caotropico hidrocloruro de guanidina y/o tiocianato de guanidina.
La concentracion de al menos un agente caotropico en la disolucion de recuperacion y/o en la mezcla de union que se utiliza en la etapa d) puede estar en un rango de 0,05 M hasta el lfmite de saturacion. Los rangos de concentracion preferidos estan, dependiendo del agente caotropico que se use, en el rango aproximadamente de 0,1 M a 6 M, aproximadamente de 0,2 M a 4 M, aproximadamente de 0,5 M a 3 M, y preferiblemente se extienden en el rango aproximadamente de 0,8 M a 2 M.
Ademas, la disolucion de recuperacion y/o la mezcla de union que se utiliza en la etapa d) para unir los acidos nucleicos diana pequenos recogidos a la fase solida de union a acido nucleico puede comprender al menos un alcohol. Como alcohol, es preferible utilizar alcoholes con cadenas de ramificacion cortas o sin ramificaciones preferiblemente con uno a 5 atomos de carbono. Algunos ejemplos son metanol, etanol, propanol, isopropanol y butanol. Tambien pueden utilizarse mezclas de alcohol. Preferiblemente el alcohol se selecciona de isopropanol y etanol, cuando se afsla RNA como acido nucleico diana es particularmente apropiado el isopropanol. De acuerdo con una realizacion, el metodo de acuerdo con la presente invencion no involucra el uso de fenol y/o cloroformo para unir los acidos nucleicos. Sin embargo, se pueden utilizar el fenol y el cloroformo p. ej. para la preparacion de la muestra y/o la lisis de la muestra, p. ej. con el fin de obtener una fase acuosa que comprenda los acidos nucleicos diana, en particular RNA. P. ej. dicha fase acuosa tambien puede utilizarse como muestra en la etapa a) preferiblemente mezclada con un alcohol, para unir los acidos nucleicos diana a la membrana, como tambien se demuestra en los ejemplos.
Un alcohol puede comprenderse en la disolucion de recuperacion y/o en la mezcla de union utilizadas en la etapa d) en una concentracion de 10% v/v a 90% v/v. Para aislar un acido nucleico diana que incluye acidos nucleicos diana pequenos, es beneficioso utilizar una concentracion de alcohol de > 30% v/v, > 40% v/v, > 50% v/v, preferiblemente > 60% v/v, > 70% v/v. Preferiblemente, la concentracion del alcohol esta en un rango de aproximadamente 30% v/v a 90% v/v o aproximadamente 40% v/v a 85% v/v, mas preferiblemente en el rango de aproximadamente 60% v/v a 80% v/v.
En la etapa a), la union puede llevarse a cabo bajo las mismas o similares condiciones que se describieron anteriormente para la etapa d). Por consiguiente, las condiciones de union utilizadas en la etapa a) pueden tener una o mas de las siguientes caractensticas:
a) las condiciones son apropiadas para unir acidos nucleicos totales que incluyen acidos nucleicos pequenos a la fase solida de union a acido nucleico comprendida en la columna;
b) las condiciones son apropiadas para unir el RNA total que incluye RNA pequenos a la fase solida de union a acido nucleico comprendida en la columna;
c) las condiciones son apropiadas para unir DNA que incluye DNA pequenos a la fase solida de union a acido nucleico comprendida en la columna;
d) la union ocurre en la presencia de al menos un agente caotropico que se selecciona de un grupo que consiste en hidrocloruro de guanidina, tiocianato de guanidina, isotiocianato de guanidina, tiocianato de sodio, yoduro de sodio, perclorato de sodio, tricloroacetato de sodio, trifluoracetato de sodio y urea;
f) la union ocurre en la presencia de al menos un agente caotropico que se contiene en la mezcla de union en una concentracion seleccionada de 0,1 M hasta la concentracion lfmite de saturacion, preferiblemente 0,5 a 6 M, mas preferiblemente 0,5 a 4 M; y/o
g) la union ocurre en la presencia de al menos un alcohol que se selecciona del grupo que consiste en alcoholes descritos anteriormente para la etapa de union d).
Tambien se pueden utilizar aditivos adicionales en la mezcla de union de la etapa a) y/o etapa d). P. ej. se pueden utilizar aditivos que apoyen la lisis de la muestra, la degradacion de protemas y/o que preserven el acido nucleico diana en la mezcla de union. Los ejemplos incluyen, pero no estan limitados a, agentes quelantes, inhibidores, detergentes, agentes de tamponado, agentes estabilizadores, agentes alcalinos, inhibidores de nucleasas y beta- mercaptoetanol, en particular EDTA, EGTA, sales, tales como cloruro de sodio, sulfato de amonio, cloruro de amonio, LiCl u otras sustancias que promueven la union y/o la precipitacion de los acidos nucleicos. Los aditivos respectivos pueden comprenderse p. ej. en la solucion de recuperacion y/o la disolucion de union pero tambien pueden anadirse separadamente. Ademas, un tampon biologico puede utilizarse durante la union en la etapa a) y/o la etapa d) y por consiguiente, tambien puede comprenderse en la disolucion de recuperacion. Los ejemplos de los tampones respectivos incluyen, pero no estan limitados a, HEPES, MES, MOPS, TRIS, citrato de sodio, acetato de
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sodio y BIS-TRIS Propano.
El valor de pH utilizado durante la union en la etapa a) y o d) esta preferiblemente en un rango de 4 a 11, para el RNA preferiblemente en un rango de aproximadamente 5 a 8, lo mas preferiblemente de 5 a 7,5. Para DNA el valor de pH preferiblemente esta dentro del rango de aproximadamente 5 a 11, lo mas preferiblemente en el rango de aproximadamente 6 a 10. Cuando se afslan ambos tipos de acidos nucleicos como acido nucleico diana el pH preferiblemente esta dentro de un rango de aproximadamente entre 6 y 8. Preferiblemente, la solucion de recuperacion comprende un tampon que tampona el pH en los rangos descritos anteriormente. De acuerdo con una realizacion, el pH de la disolucion de recuperacion esta dentro del rango de aproximadamente pH 5 a 11, preferiblemente en el rango de aproximadamente 5,5 a 8; lo mas preferiblemente la disolucion de recuperacion tiene un pH en el rango de aproximadamente 5 a 7,5 o aproximadamente 7. En particular, los respectivos valores de pH son apropiados para aislar RNA como acido nucleico diana.
De acuerdo con una realizacion, una o mas etapas de lavado se llevan a cabo entre las etapas a) y b) y/o despues de la etapa d) mientras los acidos nucleicos diana estan unidos a la fase solida. Para este proposito se pueden utilizar disoluciones de lavado comunes. Se recomienda utilizar disoluciones de lavado que no resulten en una liberacion de los acidos nucleicos diana, que incluyen los acidos nucleicos diana pequenos, de la fase solida de union a acido nucleico. De acuerdo con una realizacion, la disolucion utilizada para lavar comprende al menos un agente caotropico, al menos un alcohol y/o al menos un componente de tamponado. Tambien puede comprender un detergente. Los agentes caotropicos que se pueden utilizar en las disoluciones de lavado incluyen, pero no estan limitadas a, hidrocloruro de guanidina, tiocianato de guanidina, isotiocianato de guanidina, y yoduro de sodio. Ademas, pueden utilizarse sales caotropicas que comprenden un anion caotropico seleccionado del grupo que consiste en tricloroacetato, perclorato y trifluoracetato. Son ejemplos de las respectivas sales caotropicas sales alcalinas como perclorato de sodio, tricloroacetato de sodio y trifluoracetato de sodio. Como alcoholes, pueden utilizarse para lavar, respectivamente, en la disolucion de lavado, alcoholes con ramificaciones de cadena corta o sin ramificaciones con preferiblemente de uno a 5 atomos de carbono. Algunos ejemplos son metanol, etanol, propanol, isopropanol y butanol. Preferiblemente se utilizan isopropanol y/o etanol.
De acuerdo con una realizacion, la disolucion de lavado comprende al menos 30% de alcohol y al menos 0,5 M de sal caotropica, preferiblemente al menos 2 M de sal caotropica. Ademas, la disolucion de lavado puede comprender un detergente. Preferiblemente, se utilizan como detergente detergentes ionicos y/o no ionicos. Preferiblemente, se utiliza un detergente no ionico en una concentracion de al menos 0,1%. Una respectiva disolucion de lavado es apropiada p. ej. para lavar RNA.
Una disolucion de lavado apropiada adicional que puede utilizarse alternativamente, o tambien ademas
(preferiblemente subsecuentemente), de las disoluciones de lavado descritas anteriormente comprende un alcohol y un tampon biologico. Anteriormente se describen alcoholes y tampones biologicos apropiados. Preferiblemente, isopropanol o etanol, lo mas preferiblemente se utiliza etanol para una segunda etapa de lavado. Preferiblemente, se utiliza etanol en una concentracion de al menos 30% v/v, preferiblemente al menos 50% v/v. El tampon biologico es preferiblemente Tris a un pH de aprox. 7 a 8. Sin embargo, tambien pueden utilizarse otros tampones tales como citrato de sodio y tambien otros valores de pH, dependiendo del acido nucleico diana aislado y de la muestra procesada.
Otra disolucion de lavado apropiada adicional que puede utilizarse alternativamente, o tambien ademas
(preferiblemente subsecuentemente), de las disoluciones de lavado descritas anteriormente tambien comprende uno o mas alcoholes y opcionalmente un tampon. Anteriormente se describen alcoholes y tampones biologicos apropiados. Preferiblemente, isopropanol o etanol, lo mas preferiblemente se utiliza etanol para una etapa de lavado alternativa. Preferiblemente, se utiliza etanol en una concentracion de al menos 50% v/v, preferiblemente al menos 70% o mas.
El termino “muestra” se utiliza en la presente memoria en un sentido amplio y pretende incluir una variedad de fuentes y composiciones que contienen acidos nucleicos. La muestra puede ser una muestra biologica pero el termino tambien incluye otras, p. ej. muestras artificiales que comprenden acidos nucleicos tales como p. ej. productos de PCR o composiciones que comprenden acidos nucleicos ya purificados que se supone p. ej. se van a concentrar aun mas y/o a purificar aun mas. Las muestras de ejemplo incluyen, pero no estan limitadas a, sangre; productos sangumeos; globulos rojos; globulos blancos; fraccion leucocitaria; frotis, incluidos, pero no limitados a, frotis bucales, frotis farmgeos, frotis vaginales, frotis uretrales, frotis cervicales, frotis farmgeos, frotis rectales, frotis de lesiones, frotis de abscesos, frotis nasofarmgeos, y similares; orina; esputos; saliva; semen; fluido linfatico; fluido amniotico; fluido cerebroespinal; efusiones peritoneales; efusiones pleurales; fluidos de quistes; fluidos sinoviales; humor vftreo; humor acuoso; fluido de bursa; lavados oculares; aspirados oculares; plasma; suero; lavado pulmonar; aspirados pulmonares; animal, incluidos tejidos humanos o vegetales, incluidos, pero no limitados a, tngado, bazo, rinon, pulmon, intestino, cerebro, corazon, musculo, pancreas, cultivos celulares asf como lisados, extractos, o materiales y fracciones obtenidos de las muestras descritas anteriormente o cualquier celula y microorganismo y virus que pueda presentarse en una muestra y similares. Los materiales obtenidos de escenarios clmicos o forenses que contienen acidos nucleicos tambien estan dentro del significado pretendido del termino “muestra”. Preferiblemente, la muestra es una muestra biologica derivada de un humano, animal, planta, bacteria u hongo. Preferiblemente, la muestra se selecciona de un grupo que consiste en celulas, tejido, bacteria, virus y
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fluidos corporales tales como por ejemplo, sangre, productos sangumeos, tales como la fraccion leucocitaria, plasma y suero, orina, fluido, esputos, heces, CSF y esperma, frotis epiteliales, biopsias, muestras de medula osea y muestras de tejido, preferiblemente muestras de tejido organico tales como pulmon, rinon o tngado. Ademas, un experto en la tecnica apreciara que lisados, extractos, o materiales procesados o porciones obtenidas de cualquiera de las muestras de ejemplo anteriores tambien estan dentro del alcance del termino “muestra”. Este en particular incluye, pero no esta limitado a, lisados de muestras, lisados clarificados, porciones de muestras pre-extrafdas que estan p. ej. enriquecidas en un cierto tipo de acido nucleico diana como es el caso p. ej. durante una extraccion de fenol/cloroformo en donde acidos nucleicos tales como RNA se concentran en la fase acuosa, acidos nucleicos purificados que se supone se van a purificar y/o concentrar aun mas y similares. El termino “muestra” tambien incluye muestras procesadas, tales como muestras preservadas, fijadas y/o estabilizadas. Se pueden utilizar como fijadores, tanto fijadores que establecen enlaces cruzados como fijadores que no establecen enlaces cruzados (algunos ejemplos comerciales no limitantes incluyen fijador de tejidos PAXgene o disolucion de carnoy). Ejemplos de estabilizadores disponibles comercialmente que pueden utilizarse para estabilizar la muestra incluyen, pero no estan limitados a, RNAlater, Allprotect Tissue, RNAprotect Cell, RNAprotect Saliva, RNAprotect Bacteria, PAXgene Blood RNA, PAXgene Blood DNA, PAXgene Bone Marrow RNA y QIAsafe.
En particular, el metodo de acuerdo con la presente invencion es util para aislar acidos nucleicos diana de muestras que contienen acidos nucleicos degradados o en riesgo, tales como p. ej. RNA degradado o DNA degradado. Ejemplos no limitantes de tales muestras incluyen muestras que contienen celulas que han sido preservadas, p. ej. fijadas con formalina y embebidas en parafina (muestras FFpE) u otras muestras que se han tratado con fijadores que establecen enlaces cruzados tales como p. ej. glutaraldetndo. P. ej. las muestras de biopsias de tumores se almacenan rutinariamente despues de los procedimientos quirurgicos mediante FFPE, lo cual puede poner en riesgo la integridad del DNA y/o el RNA. Los respectivos acidos nucleicos degradados a menudo tienen un tamano pequeno y por consiguiente son acidos nucleicos pequenos. El metodo descrito puede utilizarse ventajosamente para aislar acidos nucleicos diana que consisten en, o comprenden, acidos nucleicos diana pequenos. P. ej. la muestra puede ser una muestra que comprende acidos nucleicos pequenos tales como RNA no codificante (p. ej. snoRNA o miRNA) o DNA pequeno. Ademas, el acido nucleico diana puede consistir o puede comprender acidos nucleicos modificados o degradados. La modificacion o degradacion puede deberse p. ej. al tratamiento con conservador(es).
El termino “acido nucleico” como se utiliza en la presente memoria, se refiere en particular a un polfmero que comprende ribonucleosidos y/o desoxirribonucleosidos que estan unidos covalentemente, tfpicamente mediante enlaces fosfodiester entre subunidades, pero en algunos casos mediante fosforotioatos, metilfosfonatos, y similares. Los acidos nucleicos incluyen, pero no estan limitados a, gDNA; DNA circular; DNA de bajo peso molecular, DNA plasmfdico; DNA circulante; hnRNA; mRNA; RNA no codificante (ncRNA), que incluye, pero no se limita a, rRNA, tRNA, miRNA (micro RNA), si RNA (RNA pequeno de interferencia), snoRNA (RNA pequeno nucleolar), snRNA (RNA pequeno nuclear) y stRNA (RNA pequeno temporal); acidos nucleicos fragmentados o degradados; PNAs; acido nucleico obtenido de organulos subcelulares tales como mitocondrias o cloroplastos; y acido nucleico obtenido de microorganismos, parasitos, o virus de DNA o de RNA que pueden estar presentes en una muestra biologica. Tambien estan dentro del alcance de la invencion las secuencias de acido nucleico sinteticas que pueden incluir o no analogos de nucleotidos que se anaden o adicionan en una muestra biologica.
Los terminos “acido nucleico pequeno” y “acidos nucleicos pequenos” se refieren a acidos nucleicos que tienen una longitud inferior a 500 nt, inferior a 400 nt, inferior a 300 nt, inferior a 200 nt, inferior a 100 nt o inferior a 70 nt e incluyen, pero no estan limitados a, miRNA, siRNA y otros acidos nucleicos de interferencia cortos, snoRNA, snRNA, tRNA, piRNA, tnRNA, rRNA pequeno, hnRNA, acidos nucleicos circulantes, fragmentos de DNA genomico o RNA, acidos nucleicos degradados, ribozimas, RNA o DNA viral, acidos nucleicos de origen infeccioso, productos de amplificacion, acidos nucleicos modificados, acidos nucleicos plasirndicos u organulares y acidos nucleicos artificiales tales como oligonucleotidos.
El metodo de acuerdo con la presente invencion pertenece a un metodo para aislar al menos un acido nucleico diana. Los terminos “acido nucleico diana” y “acidos nucleicos diana” se utilizan en la presente memoria como sinonimos. Como resulta evidente a partir de los ejemplos descritos de muestras que pueden procesarse de acuerdo con el metodo de la presente invencion, una muestra puede comprender mas de un tipo de acido nucleico. Dependiendo del uso previsto, puede ser deseable aislar todos los tipos de acidos nucleicos de una muestra (p. ej. DNA y RNA que senan despues ambos abarcados por el termino acido nucleico diana o acidos nucleicos diana) o solo ciertos tipos o un cierto tipo de acido nucleico (p. ej. solo RNA pero no DNA o viceversa) o RNA y DNA en paralelo, p. ej. de una muestra, pero separadamente uno de otro. Todas estas variantes estan dentro del alcance de la presente invencion. El termino “acido nucleico diana pequeno” o “acidos nucleicos diana pequenos” (estos terminos tambien se utilizan como sinonimos) en particular se refiere a acidos nucleicos pequenos del tipo deseado diana, p. ej. RNA pequeno o DNA pequeno, o ambos RNA pequeno y DNA pequeno. Ademas, la expresion “un acido nucleico diana que incluye acidos nucleicos diana pequenos” no se refiere unicamente a un acido nucleico diana que comprende porciones de acidos nucleicos diana pequenos (tales como p. ej. RNA total o DNA total) sino que tambien se refiere a, y abarca, acidos nucleicos diana que consisten en acidos nucleicos diana pequenos y por consiguiente, que no comprenden acidos nucleicos mas grandes.
La muestra puede procesarse antes de llevar a cabo la etapa de union a). P. ej. la muestra se puede romper y/o lisar
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con el fin de liberar los acidos nucleicos contenidos en la muestra. El proceso utilizado depende de la muestra de la que se ha previsto aislar el acido nucleico diana e incluye, pero no esta limitada a, disrupcion mecanica, disrupcion qmmica, la adicion de enzimas proteolfticas, detergentes y similares para conseguir la disrupcion, respectivamente, lisis, de la muestra. El lisado tambien puede ser clarificado o procesado de otra manera antes de llevar a cabo la etapa de union a). En la tecnica anterior se conocen, y por consiguiente no necesitan describirse aqm, metodos apropiados de lisis/disrupcion y tampones de lisis. Ademas, se pueden llevar a cabo etapas de procesamiento adicionales, tales como p. ej. una o mas reducciones para eliminar acidos nucleicos no diana u otros componentes no deseados y/o los acidos nucleicos u otras biomoleculas contenidas en la muestra pueden modificarse antes de unir en la etapa a) el acido nucleico diana a la fase solida de union a acido nucleico basada en columna.
Ademas, si se procesan de acuerdo con el metodo de la presente invencion muestras especiales, tales como muestras embebidas, es preferible incluir etapas para liberar los acidos nucleicos y/o la muestra de la matriz de embebecimiento (p. ej. de la parafina). Ademas, en el caso de que se procesen de acuerdo con el metodo de la presente invencion muestras especiales, tales como muestras fijadas y fijadas con fijadores que establecen enlaces cruzados, tambien es preferible incluir etapas para liberar los acidos nucleicos de la muestra fijada y por consiguiente revertir p. ej. las modificaciones causadas por la etapa de fijado, en particular para eliminar los enlaces cruzados. P. ej., etapas adicionales, tales como etapas de calentamiento, pueden llevarse a cabo en el caso de que los acidos nucleicos contenidos en la muestra tengan p. ej. enlaces cruzados p. ej. como en el caso de las muestras FFPE. En la tecnica anterior se conocen metodos y etapas de procesamiento apropiados para conseguir ese resultado y obtener una muestra a partir de la cual el acido nucleico diana puede ser aislado y tambien se describen en p. ej. EP 10 001 995.9, PCT/EP2011/000920 y WO 2007/068764.
De acuerdo con una realizacion, la muestra comprende al menos un acido nucleico no diana y al menos un acido nucleico diana. De acuerdo con una realizacion, el metodo de acuerdo con las presentes invenciones comprende una etapa que elimina al menos una porcion de acido nucleico no diana. P. ej., el acido nucleico no diana puede eliminarse mediante la union de al menos una porcion del acido nucleico no diana a una fase solida en condiciones apropiadas y luego separar el acido nucleico no diana unido a la fase solida de la muestra restante que comprende el acido nucleico diana. Esto pude conseguirse p. ej. mediante la adicion de una fase solida apropiada bajo condiciones en donde mayoritariamente los acidos nucleicos no diana se unen a la fase solida. Se describen metodos apropiados para eliminar selectivamente un acido nucleico no diana de un acido nucleico diana en por ejemplo EP 0 880 537 y WO 95/21849.
Otros metodos incluyen p. ej. una extraccion de fenol/cloroformo p. ej. con el fin de concentrar el RNA en la fase acuosa, que se utiliza luego, preferiblemente mezclada con un alcohol, para unir el RNA a la membrana en la etapa
a). Otros metodos apropiados para separar acidos nucleicos diana de acidos nucleicos no diana, que en particular son utiles para separar DNA de RNA cuando se afsla el acido nucleico diana (o RNA y DNA en paralelo) de una muestra fijada, tal como una muestra FFPE, se describen en EP 10 001 995.5 y PCT/EP2011/000920.
Cuando se pretende aislar (solo) RNA como acido nucleico diana, el acido nucleico no diana es habitualmente DNA. En esta realizacion, preferiblemente se lleva a cabo una digestion DNasa en la etapa b) con el fin de eliminar, respectivamente, reducir, las contaminaciones de DNA. Ademas, cuando se pretende aislar DNA como acido nucleico diana, se puede llevar a cabo una digestion RNasa como etapa b) con el fin de eliminar, respectivamente, reducir, las contaminaciones de RNA. Cuando se utiliza una membrana como fase solida de union a acido nucleico, los respectivos tratamientos en membrana resultan en la liberacion de una considerable cantidad de los acidos nucleicos diana y en particular los acidos nucleicos diana pequenos. Como se describe anteriormente y en el ejemplo, el otro acido nucleico no diana tambien puede aislarse en paralelo.
De acuerdo con una realizacion, la muestra comprende al menos un acido nucleico diana y al menos una biomolecula no diana, como p. ej. protemas, lfpidos, carbohidratos o metabolitos. De acuerdo con una realizacion, el metodo de acuerdo con las presentes invenciones comprende una etapa que elimina al menos una porcion de las biomoleculas no diana. P. ej., la biomolecula no diana puede eliminarse mediante la union de al menos una porcion de la biomolecula no diana a una fase solida en condiciones apropiadas y luego separar la biomolecula no diana unida a la fase solida de la muestra restante que comprende el acido nucleico diana. Esto puede conseguirse p. ej. mediante la adicion de una fase solida apropiada bajo condiciones en donde mayoritariamente las biomoleculas no diana se unen a la fase solida. Otros metodos apropiados para separar acidos nucleicos diana de otras biomoleculas no diana, incluyen la eliminacion de las biomoleculas no diana mediante reacciones qrnmicas o enzimaticas, que tambien pueden hacerse en la membrana p. ej. durante la etapa b) (ver p. ej. DE 10 2007 035 250).
En la tecnica anterior se conocen, y por consiguiente no necesitan describirse en detalle, enzimas DNasa y RNasa apropiadas y otras enzimas que afectan a p. ej. biomoleculas no diana asf como tampones y soluciones que pueden utilizarse para llevar a cabo respectivamente un tratamiento enzimatico en la etapa b).
La presente invencion involucra en la etapa a) el uso de una fase solida de union a acido nucleico que se comprende en una columna. El termino “columna” como se usa en la presente memoria describe en particular un recipiente que tiene al menos dos aperturas. De esta manera, una disolucion y/o muestra puede pasar a traves de dicha columna. El termino “columna” en particular no implica ninguna restriccion con respecto a la forma del recipiente que puede ser p. ej. circular o angular y preferiblemente es cilmdrico. Sin embargo, tambien pueden utilizarse otras formas, en
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particular cuando se utilizan columnas multiples. La columna comprende la fase solida de union al acido nucleico. Dicha fase solida que se comprende en dicha columna debe permitir el paso de una disolucion, respectivamente, la muestra, cuando se aplique a la columna. Esto significa que si p. ej. se aplica a la columna una fuerza centnfuga, una disolucion y/o la muestra puede pasar a traves de la columna en la direccion de la fuerza centnfuga. Como se discute anteriormente, cuando se utiliza un procedimiento respectivo de aislamiento de acido nucleico basado en columna, habitualmente la muestra se pasa a traves de la columna, p. ej. ayudada mediante centrifugacion o vado, y los acidos nucleicos se unen a la fase solida de union a acido nucleico comprendida durante dicho paso. La columna puede utilizarse en formato individual o en un formato multiple. En la tecnica anterior se conocen bien tales columnas multiples que tienen un formato similar a las placas de pocillos multiples y comprenden una fase solida de union a acido nucleico tal como una membrana. Preferiblemente, la columna es una columna giratoria.
Como fase solida de union a acido nucleico, puede utilizarse cualquier fase solida que se utilice habitualmente en procesos de aislamiento de acido nucleico basados en columna. Preferiblemente, se utiliza en la etapa a) una membrana de union a acido nucleico, y por consiguiente una membrana que es capaz de unir acidos nucleicos. Las membranas apropiadas incluyen, pero no estan limitadas a, membranas hidrofflicas, membranas hidrofobicas y membranas que unen acidos nucleicos via intercambio ionico. Algunos ejemplos incluyen, pero no estan limitados a, membranas de sflice, membranas de fibra de vidrio, membranas de nylon, membranas de celulosa, tales como membranas de nitrocelulosa, membranas de celulosa modificada (p. ej. acetil- o hidroxi-), membranas de papel, en particular de papeles modificados. Preferiblemente, la membrana es porosa. Ademas, es preferible utilizar una membrana que comprende o que consiste en sflice. Una fase solida de union a acido nucleico adicional comprendida en una columna es un relleno de partfculas de union a acido nucleico, tales como partfculas de sflice, o una capa de un material de union a acido nucleico (p. ej. un gel de sflice). P. ej. las partfculas de sflice pueden colocarse como una capa sobre un filtro inerte o membrana, de esta manera se forma una fase solida de union a acido nucleico. Los problemas descritos anteriormente con respecto a la perdida de los acidos nucleicos diana y en particular la perdida de acidos nucleicos diana pequenos son mas importantes cuanto mas fina es la fase solida de union a acido nucleico. Dado que una capa fina de una fase solida de union a acido nucleico comprendida en una columna (similar a una membrana de union a acido nucleico) aumenta el riesgo de que acidos nucleicos diana pequenos liberados puedan escapar rapidamente y por consiguiente perderse durante el proceso de aislamiento de acido nucleico. Como se describe anteriormente, la presente invencion proporciona una solucion a ese problema y de esta manera permite aislar acidos nucleicos diana que incluyen acidos nucleicos diana pequenos con alto rendimiento. Por consiguiente, de acuerdo con una realizacion, la fase solida de union a acido nucleico comprendida en la columna tiene un altura total que es igual o menor que su anchura. P. ej. la fase solida de union a acido nucleico puede componerse de una capa de un material de union a acido nucleico y/o un relleno, respectivamente, capa de partfculas de union a acido nucleico, preferiblemente, partfculas de sflice, que se aplica como una pequena capa sobre una membrana o filtro. Se describen en detalle a continuacion materiales y partfculas apropiados de union a acido nucleico.
Se pueden utilizar medios apropiados para aligerar el paso de la muestra a traves de la fase solida de union a acido nucleico comprendida en la columna tales como p. ej. centrifugacion o la utilizacion de un aparato que genera diferencia de presiones que p. ej. presiona la muestra a traves de la columna, respectivamente, la fase solida de union a acido nucleico, o la aspira a traves de la fase solida de union a acido nucleico mediante la aplicacion de un vacfo. Los medios respectivos se conocen bien en la tecnica anterior, y por consiguiente no necesitan describirse mas en detalle aqrn.
Como fase solida de union a acido nucleico que puede utilizarse en la etapa d), puede utilizarse cualquier material capaz de unir acidos nucleicos y en particular acidos nucleicos diana pequenos e incluye una variedad de materiales que son capaces de unir acidos nucleicos bajo las condiciones apropiadas. Dicha fase solida utilizada en la etapa d) no ha de estar necesariamente basada en columna, aunque es preferible por la facilidad de manejo. Fases solidas a modo de ejemplo que pueden utilizarse en conjuncion con la presente invencion incluyen, pero no estan limitadas a, compuestos que comprenden sflice, incluidos, pero no limitados a, partfculas de sflice, dioxido de silicio, tierra de diatomeas, vidrio, alquil sflice, silicato de aluminio, y boro silicato; nitrocelulosa; papel diazotizado; hidroxiapatita (tambien referida como hidroxil apatita); nylon; oxidos de metal; circonita; alumina; soportes polimericos, soportes derivatizados de dietilaminoetil y trietilaminoetil, resinas de cromatograffa hidrofobicas (tales como fenil u octil Sepharosa) y similares. El termino fase solida no pretende implicar ninguna limitacion en relacion con su forma o diseno. Por consiguiente, el termino fase solida abarca materiales apropiados que son porosos o no porosos; permeables o impermeables; incluidos, pero no limitados a, membranas, filtros, laminas, partfculas, partfculas magneticas, cubiertas lfquidas, geles, polvos, fibras, y similares. De acuerdo con una realizacion, la superficie de la fase solida, tal como p. ej. la fase solida de sflice utilizada en la etapa d) o la fase de union a acido nucleico utilizada en la etapa a), no se modifica y p. ej. no se modifica con grupos funcionales. Como se describe anteriormente, es preferible que en la etapa d) se utilice una membrana de union a acido nucleico. Dicha membrana puede tener las mismas caractensticas descritas anteriormente para la membrana de union a acido nucleico que se utiliza en la etapa a). Aunque, en particular, es preferible que se utilice la misma membrana de union a acido nucleico que se utilizo en la etapa a) para volver a unir los acidos nucleicos diana pequenos “escapados” de dicha membrana en la etapa d).
Tambien esta dentro del alcance de la presente invencion llevar a cabo etapas intermedias adicionales a las descritas en la presente memoria. Sin embargo, de acuerdo con ciertas realizaciones, no se llevan a cabo etapas
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adicionales a las descritas en la presente memoria.
Ademas se describe la utilizacion de una disolucion de recuperacion capaz de unir acidos nucleicos pequenos a una membrana, para volver a unir acidos nucleicos pequenos recogidos que se liberaron de dicha membrana de union a acido nucleico durante un tratamiento en membrana. Como se discute anteriormente, los acidos nucleicos se recogen preferiblemente como flujo de salida con el fin de asegurar que acidos nucleicos pequenos que p. ej. se escurrieron debajo de la membrana tambien se recogen eficientemente y por consiguiente se recuperan. Anteriormente se han descrito los detalles de la disolucion de recuperacion y de las condiciones que resultan en la liberacion de los acidos nucleicos diana pequenos, referirse a la descripcion anterior.
Ademas se describe un kit para llevar a cabo los metodos de acuerdo con la presente invencion que comprende:
a) una fase solida de union a acido nucleico, preferiblemente una membrana, comprendida en una columna;
b) un tampon de union para unir un acido nucleico diana, que incluye acidos nucleicos diana pequenos, a dicha fase solida de union a acido nucleico, que comprende un agente caotropico y un alcohol;
c) una disolucion de recuperacion que comprende un agente caotropico en una concentracion de 0,1 M hasta el lfmite de saturacion, preferiblemente 0,5 M hasta el lfmite de saturacion y/o un alcohol en una concentracion de al menos 50%; y
d) instrucciones para llevar a cabo el metodo de acuerdo con la presente invencion.
Se describen anteriormente detalles de la disolucion de recuperacion, de la fase solida de union a acido nucleico, que preferiblemente es una membrana y del tampon de union asf como las ventajas asociadas, referirse a la descripcion anterior.
Ejemplos
Ejemplo 1: Aislamiento de acidos nucleicos pequenos de acuerdo con la presente invencion o el metodo de referencia
Se utilizaron muestras FFPE de rinon de rata (las muestras se almacenaron despues de la fijacion y la imbibicion durante dos meses a temperatura ambiente) y muestras FFPE derivadas de pulmon de rata (las muestras se almacenaron despues de la fijacion y la imbibicion durante 27 meses a temperatura ambiente). Se obtuvieron cortes que tienen un tamano de 10 pm de grosor mediante el uso de un microtomo. Se utilizo un corte por muestra. Todas las muestras se procesaron dos veces. Para el subsecuente aislamiento de RNA de los cortes FFPE obtenidos, se utilizaron componentes del kit RNeasy FFPE (QIAGEN) y el kit QIAamp FFPE (QIAGEN).
Para eliminar la parafina de las muestras, las muestras se incubaron durante una hora en 1 ml de heptano. Se anadio 50 pl de metanol, se mezclo, se centrifugo la muestra, se recogio el sobrenadante y se seco la muestra durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Los pellets de las muestras respectivamente derivados y desparafinados se mezclaron con 150 pl de un tampon de digestion de proteasa K (tampon PKD, QIAGEN) y ademas, se mezclaron con 10 pl de una disolucion proteasa K (> 600 mAU/ml). La mezcla se incubo durante 15 minutos a 56°C con agitacion a 1400 rpm. Las muestras se enfriaron en hielo durante 3 minutos y se centrifugaron durante 30 minutos para eliminar los componentes no disueltos. El pellet que contema DNA se descarto (dicho pellet que contema DNA puede opcionalmente utilizarse para aislar el DNA si se desea) y el sobrenadante se recogio para aislar el RNA contenido como acido nucleico diana. Con el fin de excluir variaciones atribuibles a los materiales de muestra utilizados, se combinaron los sobrenadantes recogidos, se mezclaron y se dividieron en alfcuotas de 150 pl.
Subsecuentemente, estas alfcuotas se incubaron durante 15 minutos a 80°C para eliminar los enlaces cruzados en el RNA (que resultan de la preservacion FFPE). Despues, se anadio 300 pl de un tampon de lisis caotropico (tampon RLT, QIAGEN), y la mezcla resultante se mezclo con 1.050 pl de etanol. La mezcla resultante se aplico a una membrana de sflice (columna RNeasy MinElute, QIAGEN) y se paso a traves de la membrana mediante centrifugacion durante 15 segundos a 10.000 rpm. La membrana a la cual se unieron los acidos nucleicos diana, se lavo mediante el paso a traves de la membrana de un tampon de lavado que contema un agente caotropico y etanol (RWT, QIAGEN). Despues, se aplico a la membrana 80 pl de una mezcla que comprendfa 10 pl DNasa I y 70 pl de un tampon de reaccion de DNAsa (tampon RDD, QIAGEN) y se incubo durante 15 minutos a temperatura ambiente con el fin de eliminar el DNA genomico restante.
Para aislar el RNA de acuerdo con el metodo de referencia tal y como se conoce en la tecnica anterior, un tampon de lavado, que comprende un agente caotropico y etanol (tampon RWT, QIAGEN) se anadio otra vez despues de llevar a cabo la digestion DNAsa en membrana para eliminar la disolucion de reaccion DNasa. El tampon de lavado RWT mejora, debido al agente caotropico comprendido y al alcohol, la union del RNA a la membrana. Despues, la membrana se lavo dos veces mediante la adicion y el paso a traves de la membrana de 500 pl de un tampon de lavado que contiene alcohol (RPE, QIAGEN). La membrana se seco mediante centrifugacion durante 5 minutos a
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14.000 rpm. El RNA se eluyo mediante centrifugacion despues de aplicar 30 pl de agua y llevar a cabo una etapa de incubacion de 1 minuto.
Para aislar el RNA de acuerdo con el metodo de la presente invencion, despues de llevar a cabo la digestion DNasa en membrana se aplico y se paso a traves de la membrana mediante centrifugacion una solucion de recuperacion que contiene entre 1 y 1,5 M GTC, 75% isopropanol, citrato de sodio pH7. El flujo de salida se recogio y se volvio a aplicar y a pasar a traves de la membrana mediante centrifugacion. De esta manera, en particular los acidos nucleicos diana pequenos que se liberaron de la membrana durante la digestion DNasa en membrana se unen de nuevo a la membrana y por consiguiente se recuperan. Despues, la membrana se lavo dos veces mediante la adicion y el paso a traves de la membrana de 500 pl de un tampon de lavado que contiene alcohol (RPE, QIAGEN). La membrana se seco mediante una etapa de centrifugacion durante 5 minutos a 14.000 rpm. El RNA se eluyo mediante centrifugacion despues de aplicar 30 pl de agua y de llevar a cabo una etapa de incubacion de 1 minuto.
La distribucion de tamanos del RNA aislado a partir de tejido renal se analizo mediante la utilizacion de un Agilent Bioanalyzer para demostrar las mejoras conseguidas con el metodo de acuerdo con la presente invencion. Se aplico la misma cantidad de RNA (en ng) (determinada mediante una medida de OD). Los resultados se muestran en la Fig. 1, en donde “+” indica el RNA que se aislo utilizando el metodo de acuerdo con la presente invencion y en donde “-“ indica el RNA que se aislo utilizando el metodo de referencia. Como puede verse, llevar a cabo las etapas esenciales de recoleccion y reaplicacion c) y d) de acuerdo con el metodo de la presente invencion resulta en un aumento considerable del RNA pequeno diana en el RNA aislado. Esto puede deducirse a partir de las bandas considerablemente mas oscuras en el rango de RNA pequenos que pueden detectarse en el RNA que se aislo de acuerdo con el metodo de la presente invencion (estas bandas se marcan mediante una flecha en la Fig. 1). Por consiguiente, en el RNA aislado con el metodo de acuerdo con la presente invencion se aumento considerablemente la cantidad de RNA pequeno comparado con el metodo de referencia. El RNA aislado con el metodo de referencia solo comprendfa una pequena cantidad de RNA pequeno y por consiguiente, se pueden detectar mas moleculas de RNA grande en la cantidad aplicada de RNA. Por lo tanto, este ejemplo muestra que el metodo de acuerdo con la presente invencion aumenta considerablemente el rendimiento de RNA pequenos en el RNA aislado. Para evitar la duda se enfatiza que la cantidad total de moleculas de RNA mas grande es basicamente identica cuando se lleva a cabo el metodo de acuerdo con la presente invencion o el metodo de referencia, como se confirmo mediante deteccion por RT-PCR de amplicones de mRNA mas largos.
Tambien se analizo el RNA aislado mediante la utilizacion de RT-PCR cuantitativa en tiempo real con el fin de analizar los efectos ventajosos del metodo de acuerdo con la presente invencion sobre el rendimiento de RNA pequenos espedficos.
Para este proposito, el RNA aislado se utilizo para determinar un amplicon de los micro-RNA miR29a y miR30b utilizando el ensayo TaqMan® MicroRNA ABI (Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En la reaccion de transcripcion reversa mediante la utilizacion del kit de transcripcion reversa TaqMan® MicroRNA y los cebadores correspondientes has-miR30 y has-miR29b (Applied Biosystems) se utilizaron 20 ng de RNA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La amplificacion de los amplicones miRNA utilizando los sistemas mencionados anteriormente se llevo a cabo mediante la utilizacion de 2 pl de cDNA (dilucion 1:20) en un sistema de amplificacion en tiempo real (Sistema de Deteccion de Secuencia ABI PRISM 7900HT, Compama ABI). Se determinaron los valores promedio (derivados de duplicados) de los valores ct observados y se resumen en la tabla 1.
Tabla 1: deteccion de miRNA llevando a cabo el aislamiento de RNA de acuerdo con la presente invencion o el metodo de referencia
- miR29a miR30b
- Rinon
- Volviendo a unir 24,45 24,14
- Sin volver a unir 26,61 26,06
- Pulmon
- Volviendo a unir 24,5 25,08
- Sin volver a unir 26,52 26,83
Los resultados muestran que utilizar el metodo de acuerdo con la presente invencion resulta en valores de ct que son considerablemente menores que los valores ct obtenidos a partir de las muestras correspondientes obtenidas mediante el metodo de referencia. Los valores menores de ct conseguidos con el metodo de acuerdo con la presente invencion pueden atribuirse al hecho de que el RNA aislado respectivamente comprende cantidades mas grandes de los miRNA detectados. Esto muestra que el RNA aislado de acuerdo con el metodo de la presente invencion comprende mas acidos nucleicos pequenos que el RNA aislado con el metodo de referencia. El metodo de acuerdo con la presente invencion mejora considerablemente el aislamiento de acidos nucleicos pequenos a partir de muestras biologicas porque se aumenta el rendimiento de acidos nucleicos diana pequenos. Como se muestra mediante el ejemplo de referencia, la simple adicion de un tampon de lavado, que comprende un agente caotropico y
etanol, que mejora la union de acidos nucleicos diana potencialmente liberados a la membrana (como se hace en la tecnica anterior) no es suficiente para volver a capturar eficientemente los acidos nucleicos diana pequenos. Como se discute anteriormente, esto se debe mas probablemente al hecho de que los acidos nucleicos diana pequenos liberados escapan de la superficie de union a acido nucleico de la membrana y por lo tanto, no pueden volverse a 5 capturar mediante los metodos de acuerdo con la tecnica anterior.
Ejemplo 2: Uso de diferentes concentraciones de agentes caotropicos en la disolucion de recuperacion
En este ejemplo se utilizaron muestras FFPE de rinon de rata. Las muestras FFPE se almacenaron despues de la fijacion y la imbibicion durante aproximadamente dos meses a temperatura ambiente. Se obtuvieron cortes de 10 pm de grosor de dichas muestras FFPE mediante la utilizacion de un microtomo. Se utilizo un corte por muestra. Todas 10 las muestras se procesaron dos veces. Para el aislamiento subsecuente de RNA a partir de los respectivos cortes FFPE, se utilizaron componentes del kit RNeasy FFPE (QIAGEN) y del kit QIAamp FFPE (QIAGEN).
El aislamiento de RNA de acuerdo con el metodo de la presente invencion y el metodo de referencia se hicieron como se describe en el ejemplo 1. Para volver a unir RNA pequenos “escapados” despues de llevar a cabo la digestion DNAsa en membrana, se utilizaron como disolucion de recuperacion tres composiciones diferentes. Las 15 disoluciones de recuperacion analizadas comprendfan 70% de etanol, citrato de sodio pH7 y
A) 1,16 M GTC
B) 1,5 M GTC
C) 1,8 M GTC.
La distribucion de los tamanos del RNA aislado a partir de la muestra renal se analizo utilizando un Agilent 20 Bioanalyzer. Similar al resultado mostrado en Fig. 1, se volvio a encontrar que la proporcion de RNA pequenos en el RNA total aislado con el metodo de referencia es considerablemente menor que en el RNA aislado con el metodo de acuerdo con la presente invencion. Por lo tanto, el RNA aislado de acuerdo con el metodo de la presente invencion comprendfa RNA pequenos con mayor rendimiento. Como tambien se demuestra en la Fig. 2, todas las disoluciones de recuperacion analizadas A) a C) eran apropiadas para volver a capturar eficientemente los acidos nucleicos diana 25 pequenos en donde el metodo de referencia, “-“, solo rendfa cantidades bajas de RNA pequeno.
Con el fin de analizar el efecto de las diferentes disoluciones de recuperacion analizadas sobre el aislamiento de los RNA pequenos, el RNA se analizo mediante la realizacion de una RT-PCR cuantitativa en tiempo real como se describe en el ejemplo 1. Para este proposito, el RNA aislado se utilizo para detectar un amplicon de los micro RNA miR29a y miR16 utilizando el ensayo TaqMan® MicroRNA ABI (Applied Biosystems) de acuerdo con las 30 instrucciones del fabricante.
Se determinaron los valores medios de los valores ct medidos (derivados de los duplicados) y se resumen en la tabla 2.
- Composicion miR16 miR29a
- Sin volver a unir
- - 28,56 27,78
- Volviendo a unir
- A 26,46 26,06
- Volviendo a unir
- B 25,64 25,60
- Volviendo a unir
- C 26,71 25,90
Los resultados muestran que los valores ct son considerablemente menores cuando se utiliza el RNA aislado de 35 acuerdo con el metodo de la presente invencion comprando con el RNA aislado mediante el metodo de referencia. Esto se debe al hecho de que el metodo de acuerdo con la presente invencion aumenta considerablemente el rendimiento de RNA pequenos en el RNA aislado. Como se muestra mediante los resultados, concentraciones diferentes de agentes caotropicos pueden utilizarse con exito en la disolucion de recuperacion.
Ejemplo 3: Idoneidad de diferentes alcoholes y diferentes concentraciones de alcohol en la disolucion de 40 recuperacion
En este ejemplo, se utilizaron muestras FFPE de rinon de rata (las muestras se almacenaron despues de la fijacion y la imbibicion durante dos meses a temperatura ambiente) y de pulmon de rata (las muestras se almacenaron despues de la fijacion durante aproximadamente 27 meses a temperatura ambiente). Se obtuvieron cortes que tienen un grosor de 10 pm mediante el uso de un microtomo; se utilizo un corte por muestra. Todas las muestras se 45 procesaron dos veces. Para el aislamiento subsecuente de RNA a partir de los cortes FFPE, se utilizaron componentes del kit RNeasy FFPE (QIAGEN) y el kit QIAamp FFPE (QIAGEN).
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El aislamiento de RNA utilizando el metodo de acuerdo con la presente invencion o el metodo de referencia se llevo a cabo como se describe en el ejemplo 1. Para capturar el RNA pequeno “escapado” despues de llevar a cabo el tratamiento DNAsa en membrana, se analizaron disoluciones de recuperacion que tienen cuatro composiciones diferentes. Las disoluciones de recuperacion comprendfan 1,5 M GTC, citrato de sodio pH7 y
A) 70% etanol
B) 75% etanol
C) 70% isopropanol
D) 75% isopropanol.
La distribucion de los tamanos del RNA aislado a partir de tejido renal se analizo utilizando un Agilent Bioanalyzer. Similar a los resultados mostrados en la Fig. 1 y Fig. 2, se encontro (ver Fig. 3) que se aumenta considerablemente la porcion de RNA pequenos en el RNA total aislado cuando se utiliza el metodo de acuerdo con la presente invencion. Todas las disoluciones de recuperacion analizadas fueron basicamente igual de efectivas para volver a capturar eficientemente los RNA pequenos en donde el metodo de referencia, “-“, unicamente rindio cantidades bajas de RNA pequeno.
Con el fin de analizar el efecto de las diferentes disoluciones de recuperacion sobre el aislamiento de RNA pequenos espedficos, el RNA aislado se analizo utilizando los metodos de RT-PCR cuantitativa en tiempo real descritos en el ejemplo 1. El RNA aislado se utilizo para determinar el amplicon de los micro-RNA miR29a mediante el uso del ensayo TaqMan® MicroRNA ABI (Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Se determinaron los valores medios de los valores ct medidos (derivados de los duplicados) y se resumen en la tabla 3.
Tabla 3: deteccion miR29a despues del aislamiento de RNA utilizando el metodo de acuerdo con la presente invencion o el metodo de referencia
- Composicion Rinon Pulmon
- Sin volver a unir
- - 26,61 26,42
- Volviendo a unir
- A 25,41 25,40
- Volviendo a unir
- B 24,66 25,15
- Volviendo a unir
- C 24,74 25,22
- Volviendo a unir
- D 24,45 24,50
De nuevo, los resultados muestran que la utilizacion del metodo de acuerdo con la presente invencion aumenta considerablemente el rendimiento de RNA pequenos en el RNA aislado como puede deducirse a partir de los valores ct menores. Pueden utilizarse diferentes alcoholes y concentraciones de alcohol en la disolucion de recuperacion.
Ejemplo 4: Aislamiento de acidos nucleicos pequenos de acuerdo con la presente invencion o el metodo de referencia a partir de muestras no fijadas
Para el aislamiento de RNA se utilizaron muestras de tejido pulmonar de ratas (las muestras se almacenaron despues de la extirpacion en RNAlater a -80°C) utilizando un tampon de lisis que comprende un agente caotropico. Todas las muestras se procesaron dos veces. Para el subsecuente aislamiento de RNA, se utilizaron componentes del kit RNeasy (QIAGEN) y del kit miRNeasy (QIAGEN).
Lisis basada en fenol - cloroformo
Se homogeneizaron cada 10 mg de pulmon de rata en 700 pl de un tampon de lisis a base de fenol (tampon QIAzol, QIAGEN) con una bola de acero de 5 mm durante 5 min a 25 Hz utilizando un molinillo de bolas (TissueLyser, QIAGEN). Despues, las muestras se incubaron durante 5 min a temperatura ambiente antes de anadir 140 pl de cloroformo. Despues de 2 minutos de incubacion a temperatura ambiente los lisados se centrifugaron durante 15 min a 12.000xg a 4°C. La fase superior se elimino y se mezclo con 525 pl de etanol. La mezcla resultante se aplico a una membrana de sflice (columna RNeasy Mini, QIAGEN) y se paso a traves de la membrana mediante centrifugacion durante 15 segundos a 13.000 rpm. La membrana a la cual los acidos nucleicos diana se unieron, se lavo mediante el paso a traves de la membrana de un tampon de lavado que contema un agente caotropico y etanol (RWT, QIAGEN).
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Lisis basada en un agente caotropico
Se homogeneizaron cada 10 mg de pulmon de rata en 350 |jl de un tampon de lisis (tampon RLT que incluye p- mercaptoetanol, QIAGEN) con una bola de acero de 5 mm durante 5 min a 25 Hz utilizando un molinillo de bolas (TissueLyser, QIAGEN). Despues, las muestras se centrifugaron durante 4 min a 14.000 rpm y el sobrenadante se mezclo con 525 jl de etanol. La mezcla resultante se aplico a una membrana de sflice (columna RNeasy Mini, QIAGEN) y se paso a traves de la membrana mediante centrifugacion durante 15 segundos a 10.000 rpm.
La membrana a la cual los acidos nucleicos diana se unieron, se lavo mediante el paso a traves de la membrana de un tampon de lavado que contema un agente caotropico y etanol (RWT, QIAGEN).
Procesamiento adicional detodas las muestras
Se aplico a la membrana 80 jl de una mezcla que comprende 10 jl DNAsa I y 70 jl de tampon de reaccion DNAsa (tampon RDD, QIAGEN) y se incubo durante 15 minutos a temperatura ambiente con el fin de eliminar el DNA genomico restante.
Para aislar el RNA de acuerdo con el metodo de referencia o de acuerdo con el metodo de la presente invencion, todas las etapas adicionales se hicieron como se describe en el ejemplo 1. El RNA se eluyo dos veces mediante centrifugacion despues de aplicar 50 jl de agua (lisis basada en fenol) o 40 jl de agua (lisis basada en agente caotropico) y llevar a cabo una etapa de incubacion durante 1 minuto.
Analisis de los eluidos
El RNA aislado se analizo utilizando metodos de RT-PCR cuantitativa en tiempo real descritos en el ejemplo 1. El RNA aislado se utilizo para determinar el amplicon de los micro-RNA miR29a mediante el uso del ensayo TaqMan® MicroRNA ABI (Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Los valores medios de los valores ct medidos (derivados de los duplicados) se determinaron y se resumen en la tabla 4.
Tabla 4: deteccion de miR29a despues del aislamiento de RNA utilizando el metodo de acuerdo con la presente invencion o el metodo de referencia a partir de muestras no fijadas.
- Lisis Valor ct
- Sin volver a unir
- Lisis basada en fenol 23,36
- Volviendo a unir
- Lisis basada en fenol 22,16
- Volviendo a unir
- Lisis basada en agente caotropico 26,38
- Volviendo a unir
- Lisis basada en agente caotropico 23,69
De nuevo, los resultados muestran que la utilizacion del metodo de acuerdo con la presente invencion aumenta considerablemente el rendimiento de los RNA pequenos en el RNA aislado, tambien en las muestras no fijadas, como puede deducirse a partir de los menores valores de Ct.
Ejemplo 5: Aislamiento de DNA pequeno utilizando el metodo de acuerdo con la presente invencion
Como muestras de DNA, se utilizaron un marcador de peso molecular de DNA de 10 bp y un marcador de peso molecular de DNA de 50 bp. Para el subsecuente aislamiento, se utilizaron componentes de los kits QIAamp MinElute (QIAGEN). Se mezclaron 2 jg del marcador de peso molecular de DNA de 10 bp y 5 jg del marcador de peso molecular de DNA de 50 bp con 180 jl de tampon de lisis (tampon ATL, QIAGEN). El DNA se purifico a partir de dicha muestra utilizando el metodo de referencia (con o sin un tratamiento en membrana del DNA) o el metodo de acuerdo con la presente invencion.
Para el metodo de referencia sin un tratamiento en membrana (muestra (a)), la mezcla de lisis de DNA se mezclo con 4 j de RNA (100 mg/ml) y se incubo durante 2 min a temperatura ambiente. Subsecuentemente, se anadio 200 jl de un tampon de union que comprende un agente caotropico (tampon AL, QIAGEN) y 200 jl de etanol. La mezcla resultante se aplico a, y se paso a traves de, una membrana de sflice (columna QIAamp MinElute, QIAGEN) mediante centrifugacion (1 min, 8.000 rpm). La membrana se lavo mediante el paso a traves de la membrana de 500 jl de un tampon de lavado que contiene alcohol y un agente caotropico (AW1, QIAGEN) y 500 jl de un tampon de lavado que contiene un alcohol (AW2). La membrana se seco mediante centrifugacion (1 min, 14.000 rpm). El DNA se eluyo mediante centrifugacion despues de aplicar un tampon de elucion (30 jl, ATE, QIAGEN) e incubar durante 1 min.
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En el metodo de referencia en donde se llevo a cabo un tratamiento en membrana del DNA (muestras b, c, e, f) y en el metodo de acuerdo con la presente invencion (muestras d, g), las mezclas que comprenden el tampon de lisis y la muestra de DNA se mezclaron con 200 pl de un tampon de union que comprende un agente caotropico (tampon AL, QIAGEN) y 200 pl de etanol. La mezcla resultante se aplico a, y se paso a traves de, una membrana de sflice (columna QlAamp MinElute, QIAGEN) mediante centrifugacion (1 min, 8.000 rpm).
Despues, se llevaron a cabo diferentes tratamientos en membrana, mientras el DNA estaba unido a la membrana. Algunas muestras se trataron con RNasa (muestras b, c, d) las otras se trataron con una proteasa (muestras e, f, g).
Para llevar a cabo el tratamiento RNasa en membrana, se aplicaron a la membrana 80 pl de una mezcla de RNasa, que consiste en 4 pl de RNasa A (100 mg/ml) y 76 pl de un tampon de reaccion RNasa (tampon RDD, QIAGEN) y se incubo durante 5 min a temperatura ambiente.
Para llevar a cabo el tratamiento proteasa en membrana, se aplicaron a la membrana 80 pl de una mezcla de proteasa, que consiste en 20 pl de proteasa K (>600 mAU/ml) y 60 pl de un tampon de reaccion de proteasa (tampon rDd, QIAGEN) y se incubo durante 15 min q 56°C.
Para las muestras procesadas de acuerdo con el metodo de referencia (muestras b, c, e, f), se pasaron a traves de la membrana 500 pl de un tampon que comprende un agente caotropico y etanol (tampon AW1, QIAGEN (muestras b, e) o tampon RWT, QIAGEN (muestras c, d)) y 500 pl de un tampon de lavado que contiene alcohol AW2 (QIAGEN). La membrana se seco mediante centrifugacion (1 min, 14.000 rpm). El DNA se eluyo mediante centrifugacion despues de aplicar un tampon de elucion (30 pl, ATE, QIAGEN) e incubar durante 1 min.
Para las muestras procesadas de acuerdo con el metodo de acuerdo con la presente invencion (muestras d y g), se aplico a y se paso a traves de la membrana mediante centrifugacion una disolucion de recuperacion (que comprende de 1 a 1,5 M GTC, 75% isopropanol, citrato de sodio pH7). El flujo de salida se volvio a aplicar a, y se paso a traves de, la membrana mediante centrifugacion con el fin de volver a unir las moleculas de DNA pequenas escapadas. Despues la membrana se lavo mediante el paso a traves de la membrana de 500 pl de un tampon de lavado que contiene alcohol (AW2). La membrana se seco mediante centrifugacion (1 min, 14.000 rpm). EL DNA se eluyo mediante centrifugacion despues de aplicar un tampon de elucion (30 pl ATE, QIAGEN) y de incubar durante 1 min.
El rendimiento del DNA aislado mediante los diferentes metodos analizados en el ejemplo 5 se determino a 260 nm. La tabla 5 muestra los valores medios de los duplicados.
Tabla 5: Rendimiento en DNA despues del aislamiento de DNA utilizando el metodo de acuerdo con la presente invencion o los metodos de referencia con y sin tratamiento en membrana del DNA.
- DNA
- Muestra Metodo de aislamiento de DNA Tratamiento en membrana Rendimiento (pg)
- Marcador de peso molecular de 10 bp
- a Referencia - 0,55
- b
- Referencia RNasa 0,08
- c
- Referencia RNasa 0,11
- d
- De acuerdo con la invencion RNasa 0,67
- e
- Referencia proteasa 0,28
- f
- Referencia proteasa 0,27
- g
- De acuerdo con la invencion proteasa 0,8
- Marcador de peso molecular de 50 bp
- a Referencia - 4,26
- b
- Referencia RNasa 0,66
- c
- Referencia RNasa 0,63
- d
- De acuerdo con la invencion RNasa 3,58
- e
- Referencia proteasa 1,00
- f
- Referencia proteasa 0,54
- g
- De acuerdo con la invencion proteasa 3,07
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30
35
40
Como se demuestra mediante la tabla 5, el metodo de acuerdo con la presente invencion aumenta considerablemente el rendimiento de DNA pequeno en los metodos de aislamiento de acido nucleico en donde se lleva a cabo un tratamiento en membrana.
Ejemplo 6: Idoneidad de los diferentes agentes caotropicos y diferentes agentes tampon en la disolucion de recuperacion.
Se utilizaron para el aislamiento de RNA muestras de tejido pulmonar de ratas (las muestras se almacenaron despues de la extirpacion en RNAlater a -80°C) utilizando un tampon de lisis que comprende un agente caotropico. Para el aislamiento subsecuente de RNA, se utilizaron componentes del kit RNeasy (QIAGEN) y del kit miRNeasy (QIAGEN).
Con el fin de proporcionar un material de partida homogeneo para la comparacion de diferentes disoluciones de recuperacion, se preparo un lisado conjunto a partir de tejido pulmonar de rata. Se anadieron 350 pl de un tampon de lisis (tampon rLt que incluye p-mercaptoetanol, QlAGEN) por cada 10 mg de tejido, y el material se homogeneizo utilizando un homogeneizador de tipo rotor estator. Despues de la homogenizacion el lisado conjunto se separo en alfcuotas de 350 pl de lisado y se utilizaron para todas las purificaciones subsecuentes de RNA. El lisado se mezclo con 525 pl de 96-100% etanol, se aplico a una membrana de sflice (columna RNeasy Mini, QIAGEN) y se paso a traves de la membrana por centrifugacion durante 15 segundos a 10.000 rpm.
Como referencia sin volver a unir (ver ref. en figura 4), la membrana, a la cual los acidos nucleicos diana se unieron, se lavo mediante el paso a traves de la membrana de un tampon de lavado que contiene un agente caotropico y etanol (RWT, QIAGEN). Se aplicaron a la membrana 80 pl de una mezcla que comprende 10 pl de DNAsa I y 70 pl de un tampon de reaccion de DNAsa (tampon RDD, QIAGEN) y se incubo durante 15 minutos a temperatura ambiente con el fin de eliminar el DNA genomico restante. Luego, la membrana fue de nuevo lavada mediante el paso a traves de la membrana de un tampon de lavado que contiene un agente caotropico y etanol (RTW, QIAGEN). Despues, la membrana se lavo dos veces mediante la adicion y el paso a traves de la membrana de 500 pl de un tampon de lavado que contiene alcohol (RPE, QIAGEN). La membrana se seco mediante centrifugacion durante 3 minutos a 14.000 rpm. El RNA se eluyo dos veces mediante centrifugacion despues de aplicar 40 pl de agua y llevar a cabo una etapa de incubacion durante 1 minuto.
Para aislar el RNA de acuerdo con el metodo de la presente invencion, la membrana a la cual se unieron los acidos nucleicos diana, se lavo mediante el paso a traves de la membrana de una disolucion de recuperacion que contiene un agente caotropico, un componente tamponador e isopropanol en diferentes composiciones (tabla 6). El flujo de salida se descarto. Se aplicaron a la membrana 80 pl de una mezcla que comprende 10 pl de DNAsa I y 70 pl de un tampon de reaccion de DNAsa (tampon RDD, QIAGEN) y se incubo durante 15 minutos a temperatura ambiente con el fin de eliminar el DNA genomico restante. Despues de llevar a cabo la etapa de digestion DNAsa en columna, una disolucion de recuperacion del mismo tipo se aplico a, y se paso a traves de, la membrana mediante centrifugacion. El flujo de salida se recogio, se volvio a aplicar y a pasar a traves de la membrana mediante centrifugacion. De esta manera, en particular los acidos nucleicos diana pequenos que se liberaron de la membrana durante la digestion DNasa en membrana se unen de nuevo a la membrana y por consiguiente se recuperan. Despues, el RNA se eluyo de la membrana como se describe anteriormente para el metodo de referencia. (Todas las muestras se procesaron dos veces).
Tabla 6: Composicion de diferentes disoluciones de recuperacion
- Disolucion de recuperacion
- Agente caotropico Componente tamponador Isopropanol
- A
- 1,25 M isotiocianato de guanidina 6,25 mM citrato de sodio pH 7 75%
- B
- 1,25 M isotiocianato de guanidina 6,25 mM Tris pH 7 75%
- C
- 1,25 M isotiocianato de guanidina 6,25 mM MOPS pH 7 75%
- D
- 1,25 M isotiocianato de guanidina 6,25 mM MES pH 7 75%
- E
- 1,75 M hidrocloruro de guanidina 6,25 mM MOPS pH 7 75%
- F
- 1,25 M hidrocloruro de guanidina 6,25 mM MOPS pH 7 75%
- G
- 0,2 M fluoracetato de sodio 20 mM Tris pH 8 80%
- H
- 0,2 M perclorato de sodio 20 mM Tris pH 8 80%
El RNA aislado se analizo utilizando metodos de RT-PCR cuantitativa en tiempo real descritos en el ejemplo 1. El RNA aislado se utilizo para determinar el amplicon del micro-RNA miR16 mediante el uso de miScript System (QIAGEN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
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Los valores medios de los valores ct medidos (derivados de los duplicados) se determinaron y se muestran en la figura 4. De nuevo, los resultados muestran que el uso del metodo de acuerdo con la presente invencion aumenta considerablemente el rendimiento de los RNA pequenos en el RNA aislado como puede deducirse de los valores ct menores. Pueden utilizarse diferentes agentes caotropicos y diferentes componentes tamponadores en la disolucion de recuperacion.
Ejemplo 7: Aislamiento de RNA y DNA utilizando el metodo de la presente invencion o utilizando metodos basados en protocolos de la tecnica anterior
Se utilizaron muestras FFPE derivadas a partir de hngado de rata (las muestras se almacenaron despues de la fijacion y la imbibicion en parafina durante aprox. 2 meses a temperatura ambiente), a partir de rinon de rata (correspondientemente almacenadas e embebidas durante aprox. 19 meses) y a partir de pulmon de rata (correspondientemente almacenadas e embebidas durante aprox. 8 meses). Se obtuvieron cortes de tejido que tienen un tamano de 10 pm de grosor mediante la aplicacion de un microtomo. Se utilizaron dos cortes por muestra. Todas las muestras se procesaron por triplicado. Para el aislamiento subsecuente del RNA y el DNA, se emplearon componentes del kit RNeasy FFPE (QIaGeN) y del kit Allprep DNA RNA FFPE (QIAGEN) utilizando el metodo de la presente invencion.
Alternativamente, para la comparacion se utilizaron metodos basados en protocolos de kits de la tecnica anterior. Se utilizaron los siguientes kits de diferentes proveedores:
- Kit de purificacion FFPE RNA/DNA (NORGEN)
- Kit de aislamiento de acido nucleico total optimizado para muestras FFPE RecoverAll™ (Ambion)
- Kit de extraccion de RNA FFPE QuickExtract™ (EPICENTRE)
- Aislamiento de RNA y DNA a partir de muestras FFPE (Macherey-Nagel)
Metodo de acuerdo con la presente invencion
Con el fin de eliminar la parafina de las muestras, las muestras se mezclaron mediante agitacion vorticial durante 10 segundos con 1 ml de xilol y se centrifugaron (2 min 20.000 rpm). El sobrenadante se elimino completamente. Luego la muestra se complemento con 1 ml de 96% etanol, se mezclo mediante agitacion vorticial durante 10 s y se centrifugaron como anteriormente. El sobrenadante se elimino completamente, y el pellet de la muestra se seco durante 10 minutos a 37°C.
Estos pellets de muestra desparafinados se mezclaron con 150 pl de un tampon de digestion de proteasa K (tampon PKD, QlAGEN) y, 10 pl de una disolucion de proteasa K (> 600 mAU/ml). La mezcla se incubo durante 15 minutos a 56°C con agitacion constante a 450 rpm. Las muestras se enfriaron en hielo durante 3 minutos y se centrifugaron durante 15 minutos a 20.000 g a temperatura ambiente. Los pellets que contienen DNA se utilizaron para aislar el DNA y el sobrenadante se recogio para aislar el RNA contenido.
Subsecuentemente, estos sobrenadantes que contienen RNA se incubaron durante 15 minutos a 80°C a 450 rpm en un agitador con control de temperatura. Despues, se anadio en cada caso 320 pl de un tampon de lisis caotropico (tampon RLT, QIAGEN), y la mezcla resultante se complemento con 1.120 pl de 96% etanol. Los reactivos se mezclaron mediante pipeteo y se aplicaron 700 pl a una membrana de sflice (columna RNeasy MinElute, QIAGEN). La muestra se paso a traves de la membrana mediante centrifugacion durante 15 segundos a 10.000 rpm y el flujo de salida se descarto. Por consiguiente el resto de la muestra se aplico a la membrana. La membrana a la cual los acidos nucleicos diana se unieron, se lavo mediante el paso a traves de la membrana de 350 pl de una disolucion de recuperacion, que consiste en una parte de 5 M GTC (+ 25 mM citrato de sodio) y tres partes de isopropanol, (denominada disolucion de recuperacion a continuacion) (15 s centrifugacion a 10.000 rpm). Despues, se aplico a la membrana una mezcla que comprende 10 pl de DNAsa I y 70 pl de un tampon de reaccion DNAsa (tampon RDD, QIAGEN) y se incubo durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Despues de llevar a cabo esta digestion DNasa en membrana, se aplicaron a ,y se pasaron a traves de, la membrana 500 pl de la disolucion de recuperacion mediante centrifugacion (15 s 10.000 rpm). El flujo de salida se recogio, se volvio a aplicar a y se paso a traves de la membrana mediante centrifugacion como se describe anteriormente. De esta manera, en particular los acidos nucleicos diana pequenos que se liberaron de la membrana durante la digestion DNasa en membrana se volvieron a unir a la membrana y por consiguiente se recuperaron. Subsecuentemente, la membrana se lavo dos veces mediante la adicion y el paso a traves de la membrana de 500 pl de un tampon de lavado que contiene alcohol (RPE, QIAGEN) mediante centrifugacion, como anteriormente. La membrana se seco mediante una etapa de centrifugacion durante 5 minutos a 14.000 rpm. El RNA total se eluyo mediante centrifugacion durante 1 min a maxima velocidad despues de aplicar 30 pl de agua libre de RNAsa e incubar durante 1 minuto.
Para el aislamiento de DNA, se anadieron a cada uno de los pellets de las muestras 180 pl de tampon ATL (QIAGEN) y 40 pl de proteasa K. Despues de la agitacion vorticial, las muestras se incubaron durante 1 h a 56°C
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con agitacion constante. Luego, las muestras se incubaron durante 2 h a 90°C sin agitacion. Se anadieron a la mezcla 4 pl de RNasa A (100 mg/ml), se mezclaron y se incubaron durante 2 min a temperatura ambiente. Las muestras se complementaron con 200 pl de tampon aL (QIAGEN) y se mezclaron. Se anadio 200 pl de 96% etanol y se mezclo inmediatamente. La mezcla se aplico a una columna QlAamp MinElute y se centrifugo durante 1 min a 8.000 g. El flujo de salida se descarto. Las muestras se complementaron con 700 pl de tampon AW1 (QIAGEN) y se centrifugaron durante 1 min a 8.000 g. El flujo de salida se descarto. Las muestras se complementaron con 700 pl del tampon AW2 (QIAGEN) y se centrifugaron como se describe anteriormente. El flujo de salida se descarto. Las muestras se complementaron con 700 pl de 96% etanol y se centrifugaron como se describe anteriormente. El flujo de salida se descarto. Para secar la membrana, las columnas se centrifugaron durante 5 min a 14.000 rpm con la tapa abierta. Se pipetearon 30 pl de tampon ATE (QIAGEN) directamente sobre la membrana de la columna seguidamente se incubaron a temperatura ambiente y se centrifugaron durante 1 min a 8.000 g. Se almacenaron 30 pl de los eluidos a -20°C hasta procedimientos adicionales.
Metodos basados en protocolos de la tecnica anterior
El kit de purificacion FPPE RNA/DNA (NORGEN) se utilizo para aislamiento de RNA y DNA total de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras se incubaron con proteasa K durante aprox. 2 h y 24 h a 50°C para RNA y DNA respectivamente, las muestras se lisaron completamente. Solo en el caso de RNA se anadieron 10 pl de p- mercaptoetanol por ml de disolucion de union. La digestion de DNA adicional se llevo a cabo con 10 unidades de DNasa I (QIAGEN). Despues de aplicar la DNasa en el correspondiente tampon de incubacion a la columna y la subsecuente centrifugacion, el flujo de salida se volvio a aplicar y se incubo durante 15 minutos.
Se emplearon para el aislamiento de RNA y DNA total - incluyendo digestion de DNA - el kit de aislamiento de acido nucleico total optimizado para muestras FFPE RecoverAll™ (Ambion), el kit de extraccion de RNA de FFPE QuickExtract™ (EPICENTRE) y el kit de aislamiento de RNA y RNA a partir de muestras FFPE (Macherey-Nagel) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.
Despues, los acidos nucleicos aislados con los diferentes protocolos se analizaron, entre otras cosas, con respecto a la calidad, la cantidad, las contaminaciones de DNA en el RNA aislado y en particular con respecto al rendimiento de los acidos nucleicos pequenos aislados. Los resultados se muestran en las Fig. 5 a 9.
Los resultados muestran que el metodo de acuerdo con la presente invencion permite el aislamiento paralelo pero separado de DNA y RNA a partir de la misma muestra. Aqm, el aislamiento del RNA y el DNAtoma aprox. 6 h en total. Por lo tanto, se puede llevar a cabo en una jornada laboral. Los acidos nucleicos aislados fueron de gran calidad. La contaminacion de DNA en el RNA aislado fue mucho menor comparada con los metodos de la tecnica anterior y el rendimiento del RNA pequeno aislado fue considerablemente mayor.
El protocolo de Epicentre es muy rapido (aprox. 1:10 h para RNA y DNA en total) y simple. Sin embargo, los “eluidos” obtenidos fueron lechosos, amarillentos y turbios. Ademas, la calidad del RNA aislado no fue aceptable y el contenido en acidos nucleicos pequenos fue muy bajo. El protocolo de Mechery-Nagel permite el aislamiento en paralelo de DNA y RNA a partir de la misma muestra. Sin embargo, el RNA aislado estaba mas degradado, lo que resulto en valores de ct de la RT-PCR mas elevados para el RNA analizado dentro de este ejemplo 7 en comparacion con el metodo de acuerdo con la presente invencion. El aislamiento de RNA y DNA toma aprox. 8:30 h en total, cuando se utiliza este protocolo. El protocolo de NORGEN requiere mucho tiempo (aprox. 5:20 h para el RNA y aprox. 26 h para el DNA en la forma analizada), como resultado de una etapa muy larga de digestion de proteasa K (aprox. 2 h y 24 h respectivamente). Ademas, los resultados muestran que la contaminacion de DNA en el RNA aislado es bastante elevada. Ademas, el rendimiento de RNA pequenos fue considerablemente menor. El protocolo de Ambion requiere mucho tiempo ya que la recuperacion del DNA requiere una etapa de digestion de proteasa de 16 horas lo que es conflictivo en los flujos de trabajo del laboratorio. Ademas, las contaminaciones de DNA en el RNA aislado fueron mas elevadas que con el metodo de acuerdo con la presente invencion y el contenido de RNA pequeno fue menor.
Analisis de MicroRNA
La distribucion de los tamanos del RNA aislado a partir de diferentes tejidos se analizo mediante la utilizacion de un Agilent Bioanalyzer para demostrar las mejoras conseguidas con el metodo de acuerdo con la presente invencion. Se aplico La misma cantidad de RNA (en ng) (determinada por una medida de OD). Los resultados para las muestras de tejido pulmonar (procesadas por triplicado) se muestran en la Fig. 5. Como puede verse, llevar a cabo el metodo de acuerdo con la presente invencion en comparacion con metodos basados en protocolos de kits de la tecnica anterior, resulto en un rendimiento mas elevado y mas fiable de RNA diana pequenos en el RNA aislado. Esto puede deducirse a partir de las bandas en el rango de los RNA pequenos. La flecha en la fig. 5 marca estas bandas.
Ademas, se debe enfatizar que el metodo de acuerdo con la presente invencion resulto con creces en el RNA aislado de pureza mas elevada. La fig. 6 muestra los resultados obtenidos con mRNA cjun cuantificado mediante PCR en tiempo real del RNA aislado con (+) y sin (-) transcripcion reversa (RT) respectivamente. Para todos los tejidos investigados, en el caso del metodo de acuerdo con la presente invencion (QIAGEN), las diferencias
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25
obtenidas (delta) en los valores ct representan con creces los valores mas elevados, lo que indica la menor contaminacion con DNAgenomico.
El RNA aislado se sometio a RT-PCR cuantitativa en tiempo real con el fin de analizar los efectos ventajosos del metodo de acuerdo con la presente invencion sobre el rendimiento de un RNA pequeno espedfico. Para este proposito, 20 ng de cada uno de los RNA totales aislados se utilizaron para detectar un amplicon del microRNA mi29a, de acuerdo con el procedimiento y dispositivos descritos en el ejemplo 1. Los valores medios (derivados de triplicados) de los valores ct medidos se determinaron y los resultados se muestran en la Fig. 7. Los resultados muestran que utilizar el metodo de acuerdo con la presente invencion lleva a valores de ct que son considerablemente menores que los valores ct de las muestras obtenidas mediante metodos basados en protocoles de kits de la tecnica anterior. Estos valores de ct menores conseguidos con el metodo de acuerdo con la presente invencion son atribuibles al hecho de que correspondientemente el RNA aislado total comprende cantidades mas grandes del microRNA miR29a. Otra vez de nuevo, estos resultados demuestran que el RNA total aislado de acuerdo con el metodo de la presente invencion comprende mas acidos nucleicos pequenos, p. ej. el rendimiento de los acidos nucleicos pequenos da partir de muestras biologicas aumenta. Los metodos basados en protocolos de los kits de la tecnica anterior son menos eficientes en volver a unir los acidos nucleicos diana pequenos que el metodo de acuerdo con la presente invencion.
El DNA aislado se sometio a PCR cuantitativa en tiempo real. Para prion 78 bp, los valores medios (derivados de triplicados) de los valores ct medidos se determinaron y se resumen en la figura 8a y b para volumenes iguales y concentraciones iguales respectivamente de las muestras de DNA utilizadas. Tambien para prion 78 bp los valores de ct son considerablemente menores utilizando el metodo de acuerdo con la presente invencion.
El RNA aislado se sometio adicionalmente a RT-PCR cuantitativa en tiempo real. Para Madh7, los valores medios (derivados de triplicados) de los valores ct medidos se determinaron y se resumen en la figura 9a y b para volumenes iguales y concentraciones iguales respectivamente de las muestras de RNA utilizadas. Los valores ct para el Madh7 son considerablemente menores utilizando el metodo de acuerdo con la presente invencion.
Claims (14)
- 5101520253035404550REIVINDICACIONES1. Un metodo para aislar un acido nucleico diana que incluye acidos nucleicos diana pequenos que tienen una longitud inferior a 500 nucleotidos a partir de una muestra, en donde el acido nucleico diana comprende o consiste en acidos nucleicos diana pequenos, comprendiendo dicho metodo al menos las siguientes etapas:a) unir al menos una porcion del acido nucleico diana que incluye acidos nucleicos diana pequenos a una fase solida de union a acido nucleico comprendida en una columna mediante el paso de la muestra a traves de dicha columna de tal forma que el acido nucleico diana que incluye acidos nucleicos diana pequenos se une a la fase solida de union a acido nucleico comprendida en la columna,b) llevar a cabo un tratamiento enzimatico y/o qmmico sobre la fase solida de union a acido nucleico mientras el acido nucleico diana que incluye acidos nucleicos diana pequenos estan unidos a dicha fase solida,c) recoger al menos una porcion de los acidos nucleicos diana pequenos liberados de la fase solida durante dicho tratamiento de la etapa b) como flujo de salida,d) poner en contacto dicho flujo de salida que comprende acidos nucleicos diana pequenos mezclados con una disolucion de recuperacion con una fase solida de union a acido nucleico para unir los acidos nucleicos diana pequenos contenidos a dicha fase solida de union a acido nucleico,e) llevar a cabo una elucion.
- 2. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde la fase solida de union a acido nucleico utilizada en la etapa a) es una membrana.
- 3. El metodo de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde en la etapa c) se pasa una disolucion de recuperacion a traves de dicha columna y se recoge el flujo de salida que comprende acidos nucleicos diana pequenos y la disolucion de recuperacion y se utiliza en la etapa d), preferiblemente para volver a unir los acidos nucleicos diana pequenos contenidos en el flujo de salida a la fase solida de union a acido nucleico utilizada en la etapa a).
- 4. Un metodo para aislar un acido nucleico diana que incluye acidos nucleicos diana pequenos que tienen una longitud inferior a 500 nucleotidos a partir de una muestra, en donde el acido nucleico diana comprende o consiste en acidos nucleicos diana pequenos, comprendiendo dicho metodo al menos las siguientes etapasa) unir al menos una porcion del acido nucleico diana que incluye acidos nucleicos diana pequenos a una membrana de union a acido nucleico mediante el paso de la muestra a traves de dicha membrana de tal forma que el acido nucleico diana que incluye acidos nucleicos diana pequenos se une a la membrana,b) llevar a cabo un tratamiento que involucra una disolucion acuosa sobre la membrana mientras el acido nucleico diana que incluye acidos nucleicos diana pequenos esta unido a dicha membrana,c) para una solucion de recuperacion a traves de dicha membrana y recoger el flujo de salida que comprende acidos nucleicos diana pequenos,d) pasar dicho flujo de salida a traves de la membrana de la etapa a) para volver a unir los acidos nucleicos diana pequenos contenidos a dicha membrana,e) eluir el acido nucleico diana incluido el acido nucleico diana pequeno de dicha membrana.
- 5. El metodo de acuerdo con una o mas de las reivindicaciones 1 a 4, en donde en la etapa b) se lleva a cabo un tratamiento enzimatico y/o qmmico que comprende la utilizacion de una disolucion acuosa y se selecciona del grupo que consiste en una etapa de digestion de nucleasa, una etapa de digestion de protemas, una etapa de digestion de lipasa y una etapa de modificacion de acido nucleico diana.
- 6. El metodo de acuerdo con una o mas de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el tratamiento llevado a cabo en la etapa b) involucra condiciones que resultan al menos en la liberacion parcial de los acidos nucleicos diana, en particular de los acidos nucleicos diana pequenos, de la fase solida de union a acido nucleico.
- 7. El metodo de acuerdo con una o mas de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la disolucion de recuperacion tiene una o mas de las siguientes caractensticas:a) proporciona condiciones apropiadas para unir acidos nucleicos pequenos a la fase solida de union a acido nucleico utilizada en la etapa d);b) proporciona condiciones de union mas fuertes para unir acidos nucleicos pequenos que las condiciones de union utilizadas en la etapa a);c) proporciona condiciones apropiadas para unir RNA pequeno a la fase solida de union de acido nucleico utilizada51015202530354045en la etapa d);d) proporciona condiciones apropiadas para unir DNA pequeno a la fase solida de union a acido nucleico utilizada en la etapa d);e) comprende al menos un agente caotropico y/o al menos un alcohol; y/of) comprende al menos un agente caotropico en una concentracion de 0,1 a 6 M, preferiblemente 0,5 a 6 M y/o al menos un alcohol seleccionado del grupo que consiste en etanol e isopropanol en una concentracion de al menos 50% v/v.y/oen donde las condiciones de union utilizadas en la etapa d) tienen una o mas de las siguientes caractensticas:a) son apropiadas para unir acidos nucleicos pequenos a la fase solida de union a acido nucleico utilizada en la etapa d);b) proporcionan condiciones de union mas fuertes para unir acidos nucleicos pequenos que las condiciones de union utilizadas en la etapa a);c) son apropiadas para unir RNA pequeno a la fase solida de union a acido nucleico utilizada en la etapa d);d) son apropiadas para unir DNA pequeno a la fase solida de union a acido nucleico utilizada en la etapa d);g) comprenden al menos un agente caotropico y/o al menos un alcohol; y/oh) comprenden al menos un agente caotropico en una concentracion de 0,1 a 6 M, preferiblemente 0,5 a 6 M y/o al menos un alcohol seleccionado del grupo que consiste en etanol e isopropanol en una concentracion de al menos 50% v/v.
- 8. El metodo de acuerdo con una o mas de las reivindicaciones 1 a 7, en donde en la etapa b) si el acido nucleico diana es RNA se lleva a cabo una digestion DNasa o si el acido nucleico diana es DNA se lleva a cabo una digestion de RNasa.
- 9. El metodo de acuerdo con una o mas de las reivindicaciones 1 a 8, en donde en la etapa a) la union se lleva a cabo bajo condiciones que tienen una o mas de las siguientes caractensticas:a) las condiciones son apropiadas para unir acidos nucleicos totales a la fase solida de union a acido nucleico;b) las condiciones son apropiadas para unir RNA total incluidos los RNA pequenos a la fase solida de union a acido nucleico;c) las condiciones son apropiadas para unir DNA total incluidos los DNA pequenos a la fase solida de union a acido nucleico; y/od) la union ocurre en la presencia de al menos un agente caotropico y/o al menos un alcohol.
- 10. El metodo de acuerdo con una o mas de las reivindicaciones precedentes 1 a 9, en donde la muestra se lisa o se procesa antes de o durante la etapa a).
- 11. El metodo de acuerdo con una o mas de las etapas precedentes 1 a 10, en donde la muestra comprende acidos nucleicos pequenos y/o acidos nucleicos degradados.
- 12. El metodo de acuerdo con una o mas de las reivindicaciones precedentes 1 a 11, en donde la muestra se selecciona de y/o se deriva de una muestra seleccionada del grupo que consiste en celulas, muestras clmicas, fluidos corporales, tejido, sangre, productos sangumeos, plantas, bacterias, virus, hongos, muestras de material humano y animal, muestras medioambientales, acidos nucleicos aislados, lisados, eluidos, muestras fijadas, muestras con enlaces entrecruzados y muestras FFPE.
- 13. El metodo de acuerdo con una o mas de las reivindicaciones precedentes 1 a 12, en donde los acidos nucleicos diana pequenos tienen una o mas de las siguientes caractensticas:a) tiene una longitud inferior a 300 nt, inferior a 250 nt, inferior a 200 nt, inferior a 100 nt o inferior a 70 nt;b) se selecciona de miRNA, siRNA, acidos nucleicos de interferencia cortos, snoRNA, snRNA, tRNA, piRNA, tnRNA, rRNA pequeno, hnRNA, acidos nucleicos circulantes, fragmentos de DNA genomico o RNA, acidos nucleicos degradados, ribozimas, RNA o DNA viral y acidos nucleicos de origen infeccioso.
- 14. El uso de una disolucion de recuperacion capaz de unir acidos nucleicos pequenos que tienen una longitudinferior a 500 nucleotidos a una membrana de union a acido nucleico, en el metodo de acuerdo con una o mas de las reivindicaciones 1 a 13 para volver a unir los acidos nucleicos pequenos recogidos que tienen una longitud inferior a 500 nucleotidos que se liberaron de dicha membrana de union a acido nucleico durante un tratamiento en membrana.5 15. El uso de acuerdo con la reivindicacion 14, en donde la disolucion de recuperacion tiene una o mas de lascaractensticas definidas en la reivindicacion 7.
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