ES2322841T3 - Aislamiento y purificacion magnetica de acidos nucleicos. - Google Patents
Aislamiento y purificacion magnetica de acidos nucleicos. Download PDFInfo
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Abstract
Un método para la unión de ácidos nucleicos a partículas de celulosa magnetizable o de un derivado de la celulosa magnetizable, en el que el componente magnético de la celulosa magnetizable o del derivado de la celulosa magnetizable es un compuesto magnético; y dicho método comprende: a) combinar la celulosa magnetizable o derivado de la celulosa magnetizable con una solución que contiene ácidos nucleicos, obteniendo así una combinación, y; b) ajustar las concentraciones de sal y polialquilenglicol de la combinación hasta concentraciones adecuadas para la unión de ácidos nucleicos a la celulosa magnetizable o derivado de la celulosa, en el que todos o una porción de los ácidos nucleicos de la solución se unen a la celulosa magnetizable o derivado de la celulosa, y en el que el derivado de la celulosa se selecciona de entre el grupo que consiste en celulosa-CM, celulosa-DEAE y combinaciones de las mismas; en el que la concentración adecuada de sal es entre 0,25 M y 5,0 M, y la concentración adecuada del polialquilenglicol es equivalente a una concentración de entre alrededor del 5% y el 15% de polietilenglicol.
Description
Aislamiento y purificación magnética de ácidos
nucleicos.
El aislamiento y purificación de ácidos
nucleicos de alta calidad son pasos críticos en los procedimientos
de biología molecular. Se han descrito una serie de métodos para el
aislamiento de DNA de cadena doble y sencilla a partir de fluidos
biológicos como la sangre humana, suero, células cultivadas, así
como tejidos vegetales, animales y humanos y otros especímenes. Se
han descrito muchos procedimientos diferentes. Véase, por ejemplo,
Taylor, J.I. et al., J. Chromatography A,
890:159-166 (2000); Ahn, S.C. et al.,
BioTechiques, 29:466-468 (2000); Scott Jr, D.L.
et al., Lett. Appl. Microl., 31:95-99 (2000);
Lin Z y Floros, J., BioTechniques, 29:460-466
(2000); Smith C.E. y York C.K., Patente Estadounidense Nº 6.027.945
(2000); Mrazek F. y Petrek M., Acta Univ. Palacki. Olomuc., Fac.
Med. 142:23-28 (1999); Hawkins T., Patente
Estadounidense Nº 5.898.071 (1999); Hawks T., Patente
Estadounidense Nº 5.705.628 (1998); Davies, MJ. et al., Anal.
Biochem. 262:92-94 (1998); Levison P.R. et
al., J. Chromatography A, 816:107-111 (1998);
Rudi K. et al., BioTechniques, 22:506-511
(1997); Kotsopoulos S.K., y Shuber A.P., BioTechniques,
20:198-200 (1996); Boom, W. R., et al.,
Patente Estadounidense Nº 5.234.809 (1993); Revé M.A., WO 91/12079
(1991); Sambrook, J. et al., en: MOLECULAR CLONING, A
LABORATORY MANUAL, 2ª EDICIÓN, 1.21-1.45 (1989),
Cold Spring Harbor Laboratory Press. La mayoría de estos
procedimientos son costosos en tiempo y dinero, y pesados. Además,
muchos de estos procedimientos involucran el uso de solventes
orgánicos peligrosos.
El método descrito en la presente invención,
utiliza partículas que poseen propiedades magnéticas o
paramagnéticas que están encapsuladas en un polímero como la
celulosa (celulosa magnetizable) o los derivados de celulosa.
Sorprendentemente, en presencia de ciertas sustancias químicas y
sales, formuladas como un tampón de unión, estas partículas pueden
adsorber ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos unidos a las
partículas se lavan entonces, con un tampón de lavado, para
eliminar cualquier material no deseado, y entonces el ácido nucleico
unido se eluye de las partículas mediante la adición de tampón de
elución o agua desionizada.
La celulosa magnetizable y los derivados de
celulosa magnetizable los suministra CORTEX BIOCHEM INC., San
Leandro, CA, bajo el nombre comercial MagaCell^{TM}. Pueden
también producirse utilizando el procedimiento descrito en
Pourfarzaneh et al, Methods Biochem. Anal.
28:267-295 (1982).
El tampón de unión generalmente contendrá altas
concentraciones de sales y de polialquilenglicol. Las
concentraciones de la combinación resultante se ajustan a
concentraciones adecuadas para la unión de los ácidos nucleicos a
la celulosa magnetizable o derivados de celulosa magnetizable.
También puede utilizarse el tampón de unión descrito como tampón de
lavado con ligeras modificaciones.
La presente invención también está relacionada
con un método para aislar ácidos nucleicos como DNA, RNA y PNA, a
partir de varias fuentes, incluyendo fluidos biológicos, tejidos,
células y lisados celulares bacterianos que contengan plásmidos,
etc. El método comprende la unión de los ácidos nucleicos, en
presencia de un tampón de unión, a la celulosa magnetizable o su
derivados, lavar los ácidos nucleicos unidos resultantes con un
tampón de lavado, y eluir los ácidos nucleicos con un tampón de
elución o agua.
Los métodos descritos aquí también son útiles
para el aislamiento tanto de polinucleótidos de doble cadena (ds)
como de cadena sencilla (ss) (por ejemplo, DNA, RNA, PNA)
virtualmente de cualquier tamaño y a partir de una amplia variedad
de orígenes.
Además, la presente invención proporciona un
equipo que comprende celulosa magnetizable o su derivados y un
tampón de unión que contiene una sal adecuada y polialquilenglicol a
concentraciones adecuadas para la unión de ácidos nucleicos a la
celulosa magnetizable o sus derivados. En algunas realizaciones, el
equipo también contendrá un tampón de lavado adecuado, un tampón de
elución y reactivos para lisar las células, tejidos o materiales de
otras fuentes para liberar los ácidos nucleicos.
La Patente Estadounidense Nº 5.898.071 (Hawkins)
describe métodos para preparar y modificar partículas magnéticas.
Los métodos descritos por Hawkins implican procedimientos más largos
que utilizan materiales peligrosos.
La Figura 1 es una electroforesis en gel de
agarosa que muestra DNA aislado de sangre total utilizando
Magacell^{TM} o el equipo Qiagen QIAamp DNA Mini Kit, y muestra
el DNA no degradado de alto peso molecular aislado mediante ambas
técnicas. El carril 1 es un marcador de DNA de 1 Kb; el carril 2 es
DNA control de timo de ternera; los carriles 3, 5, 7, 9 y 11 son
DNA aislados mediante el presente método; y los carriles 4, 6, 8, 10
y 12 son DNA aislados mediante QIAamp.
La Figura 2 es una electroforesis en gel de
agarosa de DNA plasmídico aislado de lisados celulares bacterianos,
utilizando MagaCell^{TM} o el equipo Qiagen QIAprep Miniprep Kit,
y muestra el aislamiento de dos DNA plasmídicos de diferente tamaño
de alta calidad mediante ambas técnicas. Los carriles 1 y 12 son
marcadores de DNA de 1 Kb; el carril 2 es DNA del plásmido control
PBA117; los carriles 3, 4, 6 y 7 son DNA de plásmido PBA117
aislados mediante MagaCell^{TM}; los carriles 5 y 8 son DNA del
plásmido PBA117 aislados mediante QIAprep Miniprep; los carriles 9
y 10 son DNA del plásmido PBA8 aislados mediante Magacell^{TM}; y
el carril 11 es DNA del plásmido PBA8 aislado mediante QIAprep
Miniprep.
La Figura 3 es una gráfica que ilustra la
cuantificación de RT-PCR a tiempo real del RNA Viral
MS2 aislado mediante MagaCell^{TM} o el equipo RNeasy Kit.
El presente método simplifica el aislamiento de
ácidos nucleicos a partir de varias fuentes al eliminar la
necesidad de centrifugación o de solventes orgánicos, incluyendo la
extracción con alcohol o los lavados, y produce ácidos nucleicos
listos para su subsiguiente caracterización y posterior procesado
mediante procedimientos como la PCR, secuenciación o transferencia.
Debido a las características únicas descritas aquí, el presente
método se adapta fácilmente a la automatización, incluyendo los
sistemas de cribado a gran escala.
De forma adicional, el óxido férrico, la
celulosa y los derivados de celulosa utilizados para la producción
de celulosa magnetizable en la presente invención están disponibles
comercialmente y son baratos. El método descrito aquí también evita
el procedimiento largo y el uso de materiales peligrosos
involucrados en la preparación y modificación de las partículas
magnéticas descritas en Hawkins, Patente Estadounidense Nº
5.898.071. Además, los presentes métodos eliminan la necesidad de
síntesis química de varios grupos funcionales necesarios en
Hawkins, en el que las partículas y micropartículas de celulosa con
un núcleo de óxido férrico no se unen al DNA en sus métodos. De
forma bastante sorprendente, la celulosa magnetizable y los métodos
descritos aquí son eficientes en el aislamiento de DNA y son
baratos, proporcionando una mejora significativa en el aislamiento
y la purificación de DNA frente a los métodos de Hawkins.
En los siguientes métodos, la celulosa
magnetizable o los derivados de celulosa magnetizable se unen a
ácidos nucleicos, en presencia de ciertas concentraciones de sal y
polialquilenglicol. De acuerdo con esto, la presente invención
proporciona en un aspecto, un método para un aislamiento simple y
rápido de ácidos nucleicos, como el DNA, RNA y PNA, a partir de
varias fuentes, incluyendo pero sin limitarse a los fluidos
corporales, varias soluciones, células, plantas, tejidos, lisados
celulares bacterianos que contienen plásmidos, etc. La invención
también describe el aislamiento de ácidos nucleicos según el tamaño.
A continuación se proporciona una descripción de la presente
invención con referencia a los ácidos nucleicos, ejemplificados por
el DNA. Debe entenderse que la presente invención también es útil
para la separación de RNA y PNA de una forma similar. Debido a que
los ácidos nucleicos pequeños requieren mayores concentraciones de
sal para una unión fuerte a las partículas de celulosa
magnetizable, la concentración de sal puede modificarse de forma
selectiva, lo que resulta en ácidos nucleicos unidos a la celulosa
magnetizable en base a su tamaño. La celulosa magnetizable que posee
DNA unido a ella puede, opcionalmente, lavarse con un tampón de
lavado adecuado antes de ponerse en contacto con un tampón de
elución adecuado, para eluir y separar el DNA de la celulosa
magnetizable. La separación de celulosa magnetizable del líquido
durante todos los pasos de aislamiento puede simplificarse mediante,
por ejemplo, la aplicación de un campo magnético para atraer hacia
abajo o hacia un lado las partículas de celulosa magnetizable.
En vista de lo anterior, la presente invención
proporciona en un aspecto, un método para la unión de ácidos
nucleicos a celulosa magnetizable que comprende:
a) combinar celulosa magnetizable con una
solución que contiene ácidos nucleicos, produciendo así una
combinación, y
b) ajustar las concentraciones de sal y
polialquilenglicol de la combinación a concentraciones adecuadas
para la unión de los ácidos nucleicos a la celulosa magnetizable,
en la que todos o una porción de los ácidos nucleicos en la
solución se unen a la celulosa magnetizable.
La cantidad de ácidos nucleicos que están unidos
a la celulosa magnetizable es la suficiente para evitar la
saturación de la superficie de la partícula de celulosa y al menos
estará unido un 60%, más preferiblemente un 80% y aún más
preferiblemente un 90% o más de los ácidos nucleicos en una solución
a la celulosa magnetizable. En muchos casos, la porción de ácidos
nucleicos unidos será del 100%. En algunas realizaciones, no
obstante, la unión selectiva de ácidos nucleicos de un tamaño
particular puede lograrse mediante la manipulación de las
concentraciones de sal y polialquilenglicol de forma que tan solo
entre el 5% y alrededor del 30% del contenido de ácido nucleico
total en una muestra esté unido a la celulosa magnetizable.
En los métodos de la presente invención, la
celulosa magnetizable puede comprarse en Cortex Biochem Inc., San
Leandro, CA. Alternativamente, las partículas pueden producirse
utilizando el procedimiento descrito por Pourfarzaneh et al,
Methods Biochem. Anal. 28, 267-295 (1982). El óxido
férrico, la celulosa y los derivados de celulosa utilizados para la
producción de celulosa magnetizable o derivados de celulosa
magnetizable también están disponibles comercialmente y son
baratos.
Tal y como se describe en la presente invención,
la unión de ácidos nucleicos a celulosa magnetizable o sus
derivados, y la eliminación de las proteínas adsorbidas de forma
inespecífica u otras sustancias, puede lograrse utilizando una
solución de sal y polialquilenglicol a ciertas concentraciones. Las
sales útiles en la presente invención se seleccionan de entre LiCl,
BaCl_{2}, MgCl_{2}, CsCl_{2}, CaCl_{2}, NaCl, KCl y KI.
Preferiblemente la sal es NaCl. De forma similar, una serie de
polialquilenglicoles son útiles en la presente invención, lo que
incluye por ejemplo, polietilenglicol y polipropilenglicol.
Preferiblemente, el polialquilenglicol es polietilenglicol. Los
reactivos de sal y polialquileno se utilizan en concentraciones que
facilitan la unión de ácidos nucleicos a las partículas
magnetizables cubiertas de celulosa y sus derivados. Las
concentraciones de sal de los tampones de unión y de lavado
dependerá de la sal a utilizar, y del entorno del que se aislarán y
purificarán los ácidos nucleicos. Generalmente, las concentraciones
de sal serán de alrededor de 0,25 M a alrededor de 5,0 M. Más
preferiblemente, la concentración de sal en los tampones de unión y
de lavado es de entre alrededor de 0,5 M y alrededor de 2,5 M. Aún
más preferiblemente, la concentración de sal es de entre alrededor
de 0,5 M y alrededor de 1,5 M. Más preferiblemente, la concentración
de sal del tampón de unión es de alrededor de 1,25 M y la
concentración de sal del tampón de lavado es de alrededor de 0,5 M.
De forma similar, la concentración de polialquileno dependerá del
polialquileno utilizado. El polietilenglicol está comercialmente
disponible de proveedores como Sigma Chemical Company (St. Louis,
Missouri, USA) y es útil en los pesos moleculares entre alrededor
de 1.000 y alrededor de 10.000, preferiblemente entre alrededor de
6.000 y alrededor de 8.000. Dependiendo del rango de peso del
polietilenglicol utilizado, se puede ajustar la concentración.
Generalmente, para los métodos en los que se utiliza un
polietilenglicol con un peso molecular medio de 8.000, la
concentración en los tampones de unión y de lavado se ajustará entre
alrededor del 5% y alrededor del 15%, preferiblemente alrededor del
10%.
La utilización de los tampones de unión y de
lavado descritos anteriormente, y en los siguientes ejemplos, evita
la utilización de solventes orgánicos, lo que incluye el alcohol
etílico utilizado normalmente en otros procedimientos de
aislamiento de DNA.
En la presente invención, la celulosa
magnetizable está en forma de partículas y preferiblemente posee un
contenido de óxido férrico de hasta el 90% en peso de la masa total
de la celulosa magnetizable. El componente magnético de la celulosa
magnetizable puede sustituirse por otros compuestos magnéticos como
el óxido ferroso u óxido de níquel, etc.
En un aspecto relacionado, la presente invención
proporciona un método para separar los ácidos nucleicos de los
materiales diferentes de los ácidos nucleicos, mediante la unión de
los ácidos nucleicos de una solución de ácidos nucleicos a celulosa
magnetizable, lo que comprende:
a) combinar la celulosa magnetizable con una
solución que contiene ácidos nucleicos y materiales diferentes de
los ácidos nucleicos para producir una primera combinación;
b) ajustar las concentraciones de sal y
polietilenglicol de la primera combinación a concentraciones
adecuadas para unir los ácidos nucleicos de la solución a la
celulosa magnetizable, produciendo una segunda combinación que
comprende los ácidos nucleicos unidos a la celulosa
magnetizable;
c) separar los ácidos nucleicos unidos a la
celulosa magnetizable de la segunda combinación;
d) poner en contacto los ácidos nucleicos unidos
a la celulosa magnetizable separados en c) con un tampón de elución
para liberar de la celulosa magnetizable los ácidos nucleicos unidos
y en el tampón de elución; y
e) separar la celulosa magnetizable del tampón
de elución para proporcionar ácidos nucleicos que están
prácticamente libres de materiales diferentes de los ácidos
nucleicos.
En general, los componentes utilizados en este
aspecto de la invención son los mismos que los descritos antes, y
los rangos preferibles para las concentraciones de sales y de
polietilenglicol son los mismos que los que se han proporcionado
antes. El tampón de elución es preferiblemente un tampón Tris con
EDTA. Más preferiblemente el tampón de elución es Tris 10 mM, pH
8,0 con EDTA 1 mM. También, como se ha referido anteriormente, este
aspecto de la invención puede utilizarse con una serie de ácidos
nucleicos que incluyen, por ejemplo, DNA, RNA, PNA o mezclas de los
mismos.
En una realización particularmente preferible de
este aspecto de la invención, los ácidos nucleicos unidos a las
partículas de celulosa magnetizable son de DNA y las partículas se
lavan con un tampón de lavado dejando el DNA unido a las partículas
de celulosa magnetizable. Más preferiblemente, el DNA unido a las
partículas de celulosa magnetizable se eluye con un tampón de
elución que libera el DNA unido a las partículas magnetizables, y
se aísla el DNA.
En otras realizaciones preferibles, los ácidos
nucleicos en solución son un lisado, preferiblemente preparado a
partir de células de origen humano, vegetal, animal, viral o
bacteriano. Así, en una aplicación, las células son animales, más
preferiblemente de humanos. En otra aplicación, las células son
vegetales. En otra aplicación, las células son de origen
bacteriano. En otra aplicación, las células son de origen viral.
Los ácidos nucleicos que se separan de los
materiales diferentes de los ácidos nucleicos (por ejemplo,
péptidos, proteínas, oligosacáridos, lignanos, productos naturales
de molécula pequeña y otros materiales normalmente de origen
natural) se obtienen generalmente en una pureza de al menos el 80%,
más preferiblemente de al menos el 90%, aún más preferiblemente al
menos el 95%, y más preferiblemente al menos del 99% o más. De
acuerdo con esto, los presentes métodos son adecuado para eliminar
al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 90%, aún más
preferiblemente al menos el 95%, y más preferiblemente al menos el
99% o más de los materiales diferentes de los ácidos nucleicos en
una muestra particular (por ejemplo, un lisado celular).
En aún otro aspecto de la invención, se utilizan
los derivados de celulosa magnetizable. De acuerdo con esto, la
invención proporciona un método para unir ácidos nucleicos a
derivados de celulosa magnetizable, lo que comprende:
a) combinar los derivados de celulosa
magnetizable con una solución que contiene ácidos nucleicos,
produciendo de esta manera una combinación; y
b) ajustar las concentraciones de sal y
polialquilenglicol de la combinación a concentraciones adecuadas
para la unión de los ácidos nucleicos a los derivados de celulosa
magnetizable, en el que todos o una porción de los ácidos nucleicos
de la solución se unen a los derivados de celulosa magnetizable.
De nuevo, los componentes y cantidades
preferibles son esencialmente los mismos que los proporcionados
anteriormente. Los derivados de celulosa magnetizable se
seleccionan, en un grupo de realizaciones, de entre
celulosa-CM, celulosa-DEAE y
mezclas de los mismos. Además, este método así como el resto de
métodos de la presente invención encuentran una amplia aplicación
en la purificación de, por ejemplo, DNA, RNA, PNA o derivados de los
mismos.
En métodos relacionados, la presente invención
proporciona un método para separar los ácidos nucleicos de
materiales diferentes de los ácidos nucleicos, que comprende:
a) combinar los derivados de celulosa
magnetizable con una solución que contiene ácidos nucleicos y
materiales diferentes de los ácidos nucleicos para proporcionar una
primera combinación;
b) ajustar las concentraciones de sal y
polietilenglicol de la primera combinación a concentraciones
adecuadas para la unión de los ácidos nucleicos de la solución a
los derivados de celulosa magnetizable, produciendo una segunda
combinación que comprende los ácidos nucleicos unidos a los
derivados de celulosa magnetizable;
c) separar los ácidos nucleicos unidos a los
derivados de celulosa magnetizable de la segunda combinación;
d) poner en contacto los ácidos nucleicos unidos
a los derivados de la celulosa magnetizable separados en c) con un
tampón de elución para liberar al tampón de elución los derivados de
la celulosa magnetizable los ácidos nucleicos unidos; y
e) separar los derivados de la celulosa
magnetizable del tampón de elución para proporcionar ácidos
nucleicos que están prácticamente libres de materiales diferentes
de los ácidos nucleicos.
Las realizaciones preferibles para este aspecto
de la invención son aquellas que se han descrito anteriormente para
la utilización de celulosa magnetizable. También, como
anteriormente, los derivados de celulosa magnetizable se
seleccionan, en un grupo de realizaciones, de entre
celulosa-CM, celulosa-DEAE y mezclas
de los mismos.
La presente invención se ilustrará a
continuación mediante los siguientes ejemplos, que no son limitantes
en modo alguno.
\vskip1.000000\baselineskip
Las partículas magnetizables utilizadas en los
siguientes ejemplos fueron las partículas MagaCell o sus derivados
de Cortex Biochem Inc., San Leandro, CA, o se fabricaron mediante el
procedimiento descrito en Pourfarzaneh et al, Methods
Biochem. Anal. 28:267-295 (1982). Las partículas se
guardaron en agua desionizada, que contenía azida sódica al 0,02%,
a una concentración de 50 mg/mL. Todas las electroforesis en gel de
agarosa se realizaron utilizando el sistema E-Gel
(geles de al agarosa al 0,8%) de Invitrogen, Carlsbad, CA.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Una preparación de DNA de timo de ternera
(Sigma, St. Louis, MO, Número de Catálogo: D1501), utilizado como
control, se unió de forma reversible a las partículas
MagaCell^{TM} (celulosa magnetizable) en presencia del tampón de
unión. El DNA unido a las partículas de celulosa magnetizable se
separó y se lavó de materiales no deseados. El DNA se eluyó
entonces de las partículas.
1. En un tubo de 2 ml de microcentrífuga que
contiene 50 \mug (50 \mul de una solución de DNA de 1 mg/ml en
tampón TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM) se
añade 430 \mul del tampón de unión (PEG 8000 PM al 10%, NaCl 1,25
M) y 1 mg (20 \mul de una suspensión 50 mg/ml) de las partículas
MagaCell (Cortex Biochem, CA).
2. Se mezcla el contenido del tubo a temperatura
ambiente durante 10 minutos, utilizando un agitador rotativo.
3. Se sedimenta el DNA unido a las partículas de
MagaCell utilizando una gradilla magnética.
4. Se lavan las partículas con el Tampón de
lavado (PEG 8000 PM al 10%, NaCl 2,5 M). Repetir el paso de lavado
una vez más.
5. Se eluye el DNA de las partículas de MagaCell
utilizando el tampón de elución (agua desionizada o tampón TE
[Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM]).
La electroforesis en gel de agarosa del DNA
eluído mostró una banda de DNA única no degradada de alto peso
molecular (Figura 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
El ejemplo 1 descrito anteriormente se repitió
utilizando derivados de celulosa magnetizable. Éstos incluyen:
MagaCell^{TM}-CM y
MagaCell^{TM}-DEAE (ambos obtenidos de Cortex
Biochem, San Leandro, CA).
Los resultados obtenidos con los derivados de
MagaCell^{TM} fueron comparables con los obtenidos con
MagaCell^{TM}.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
El DNA de muestras de sangre total humana se
liberó utilizando proteinasa K y un tampón de lisis especialmente
formulado. El DNA se unió entonces a las partículas de MagaCell en
presencia del tampón de unión. El DNA unido a las partículas de
MagaCell se separó entonces de otros contaminantes y se lavó. El DNA
se eluyó de las partículas. Se utilizó el siguiente
procedimiento:
1. En un tubo de 2 ml de microcentrífuga, se
pipetean 20 \mul (400 \mug) de solución de proteinasa K en
Tris-HCl 10 mM, cloruro de calcio 1 mM, glicerol al
50%, pH 7,5.
3. Se añaden 200 \mul de tampón de lisis
(Tris-HCl 50 mM, EDTA 50 mM,
guanidina-HCl 6 M, urea 6 M, cloruro de calcio 10
mM, Tween-20 al 10%, pH 6,3).
4. Se mezcla el contenido del tubo mediante un
pulso de vórtex de 15 seg.
5. Se incuba el contenido del tubo a 56ºC
durante 10 minutos.
6. Se retira el tubo de 56ºC, y se añaden 560
\mul del tampón de unión (PEG 8000 PM al 10%, NaCl 1,25 M),
seguido de 20 \mul (1 mg) de la suspensión MagaCell bien mezclada
(50 mg/ml en agua desionizada, que contiene azida sódica al
0,02%).
7. Se incuba el contenido del tubo durante 10
min. a temperatura ambiente, mientras se mezcla en un agitador
rotativo.
8. Se sedimenta el DNA unido a las partículas de
MagaCell utilizando una gradilla magnética.
9. Se aspira el sobrenadante y se lavan las
partículas añadiendo 1 ml del tampón de lavado (PEG 8000 PM al 10%,
NaCl 2,5 M), mezclando bien y se aspira el sobrenadante. Se repite
el paso de lavado una vez más.
10. Se añaden 500 \mul de tampón de elución
(Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM) o agua
desionizada, y se mezcla durante 10 min. como en el paso 7.
11. Se sedimentan las partículas y se recoge
cuidadosamente el sobrenadante que contiene el DNA purificado.
12. El DNA purificado está entonces listo para
un análisis posterior.
La electroforesis en gel de agarosa del DNA
aislado de las muestras de sangre total mediante el método de la
presente invención mostró una única banda de DNA no degradado de
alto peso molecular (Figura 1).
El posterior procesamiento del DNA aislado de
las muestras de sangre total mediante el método de la presente
invención indicó la idoneidad del DNA aislado para la aplicación de
PCR (Tablas 1 y 2).
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
El método descrito aquí es sencillo, rápido,
económico, y produce DNA purificado con alto rendimiento, comparable
o mejor que el obtenido utilizando el producto de aislamiento de
DNA del proveedor líder (Qiagen, Valencia, CA).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se procesó DNA de timo de ternera (Sigma, St.
Louis, MO, Número de Catálogo: D1501) y se analizó como en el
Ejemplo 1, con la excepción de que para el lavado de las partículas
de MagaCell con DNA unido (Paso 4) el tampón de lavado se modificó
para que contuviera PEG 8000 PM al 10% y NaCl 0,25 M.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se aisló y analizó DNA a partir de muestras de
sangre total como en el Ejemplo 3, con la excepción de que para el
lavado de las partículas de MagaCell con DNA unido (paso 9) el
tampón de lavado se modificó para que contuviera PEG 8000 PM al 10%
y NaCl 0,25 M.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Se aisló y analizó DNA como en el Ejemplo 3, a
partir de 200 \mul de muestras de capa leucoplaquetar (una
fracción de sangre total enriquecida con leucocitos, obtenida del
Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle,
WA).
WA).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Se aisló y analizó DNA como en el Ejemplo 5, a
partir de 200 \mul de muestras de capa leucoplaquetar (una
fracción de sangre total enriquecida con leucocitos, obtenida del
Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle,
WA).
WA).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Se aisló y analizó DNA como en el Ejemplo 3, a
partir de células cultivadas (máximo 2,5 x 10^{7} células)
suspendidas en 200 \mul de PBS (salina tamponada con fosfato).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
Se aisló y analizó DNA como en el Ejemplo 5, a
partir de células cultivadas (máximo 2,5 x 10^{7} células)
suspendidas de 200 \mul de PBS (salina tamponada con fosfato).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
Se liberó el DNA de las hojas de la planta
Arabidopsis (obtenidas del Departamento de Biología Vegetal,
Universidad De Davis, Davis, CA) utilizando Proteinasa K (PK) y un
tampón de lisis. El DNA se unió entonces a partículas de MagaCell
en presencia del tampón de unión. El DNA unido a las partículas de
MagaCell se separó y se lavó entonces de otros contaminantes. El
DNA se eluyó de las partículas. Se utilizó el siguiente
procedimiento:
1. Se colocan 25-100 mg de
tejido vegetal bien triturado en el fondo de un tubo de 2 ml de
microcentrífuga.
2. Se añaden 200 \mul del tampón de lisis A
(Tampón ATL, Qiagen, Valencia, CA, Número de Catálogo: 19076),
seguido de 20 \mul de la solución PK. Se mezcla suavemente
mediante un pulso de vórtex. Nota: Si es necesaria una preparación
de DNA libre de RNA, se añaden 10 \mul de una solución de reserva
de 40 mg/ml de RNasa A antes de la adición del tampón de lisis
vegetal.
3. Se incuba a 65ºC durante 15 minutos.
4. Se retira el tubo de los 65ºC.
5. Se centrifugar a máxima velocidad en una
microcentrífuga durante 5 min.
6. Se transfiere de forma suave el sobrenadante
a un tubo de 2 ml de microcentrífuga.
7. Se añaden 500 \mul del tampón de unión (PEG
8000 PM al 10%, NaCl 1,25 M), seguido de 20 \mul de las
partículas de MagaCell bien mezcladas (las partículas están
suspendidas de forma uniforme).
8. Se mezcla suavemente el tubo y se incuba
durante 10 min a temperatura ambiente, mientras se mezcla
(utilizando un agitador rotativo o mezclar manualmente).
9. Se sedimentan las partículas de DNA unidas a
MagaCell utilizando una gradilla magnética. Se aspira el
sobrenadante y se lavan las partículas como se describe en el paso
10.
10. Se añade 1 ml de tampón de lavado (PEG 8000
PM al 10%, NaCl 1M) al tubo del paso 9. Se mezcla bien, se
sedimentan las partículas en la gradilla magnética y se aspira el
sobrenadante.
11. Se repite el lavado una vez más siguiendo el
paso 10.
12. Se añaden 200 \mul del tampón de elución
(Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM) o agua desionizada y se mezcla
durante 10 min. como en el paso 8.
13. Se sedimentan las partículas y se transfiere
cuidadosamente el sobrenadante que contiene el DNA aislado a un
tubo limpio. El material está preparado para un posterior análisis.
Si la muestra no se va a analizar el mismo día, se congela a -20ºC
hasta el momento del análisis.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
Se liberó el DNA a partir de hojas de la planta
Arabidopsis (obtenidas del Departamento de Biología Vegetal,
Universidad De Davis, Davis, CA) y se analizó como en el Ejemplo 10,
con la excepción de que para el lavado de las partículas de DNA
unidas a MagaCell (paso 10) el tampón de lavado se modificó para que
contuviera PEG 8000 PM al 10% y NaCl 0,25 M.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
12
Se liberó el DNA del tejido de aleta de pescado
(obtenido de Bodega Marine Lab, Universidad de Davis, Davis, CA)
utilizando Proteinasa K (PK) y dos tampones de lisis diferentes. El
DNA se unió entonces a las partículas de MagaCell en presencia del
tampón de unión. El DNA unido a las partículas de MagaCell se separó
y se lavó entonces del resto de contaminantes. El DNA se eluyó de
las partículas. Se utilizó el siguiente procedimiento:
1. Se colocan 5 mg de tejido de aleta de pescado
en el fondo de un tubo de 2 ml de microcentrífuga.
2. Se añaden 200 \mul del tampón de lisis A
(Tampón ATL, Qiagen, Valencia, CA, Número de Catálogo: 19076),
seguido de 20 \mul de la solución PK. Se mezcla suavemente
mediante un pulso de vórtex. Nota: Si es necesaria una preparación
de DNA libre de RNA, añadir 10 \mul de una solución de reserva de
40 mg/ml de RNasa A antes de la adición del tampón de lisis A.
3. Se incuba a 56ºC con mezclado ocasional
durante 1 hora.
4. Se retira el tubo de 56ºC.
5. Se añaden 200 \mul del tampón de lisis B
(Tris-HCl 50 mM, EDTA 50 mM,
Guanidina-HCl 6 M, Urea 6 M, cloruro de calcio 10
mM, Tween-20 al 10%, pH 6,3).
6. Se incuba a 70ºC durante 10 minutos, después
se retira el tubo de los 70ºC.
7. Se añaden 500 \mul del tampón de unión (PEG
8000 PM al 10%, NaCl 1,25 M) seguido de 20 \mul de las partículas
de MagaCell bien mezcladas (partículas suspendidas de forma
uniforme).
8. Se mezcla el tubo suavemente y se incuba
durante 10 min. a temperatura ambiente, mientras se mezcla
(utilizando un agitador rotativo o mediante mezclado manual).
9. Se sedimentan las partículas de MagaCell con
el DNA unido utilizando una gradilla magnética. Se aspira el
sobrenadante y se lavan las partículas como se describe en el paso
10.
10. Se añade 1 ml de tampón de lavado (PEG 8000
PM al 10%, NaCl 0,5 M) al tubo del paso 9. Se mezcla bien, se
sedimentan las partículas en la gradilla magnética y se aspira el
sobrenadante.
11. Se repite el lavado una vez más siguiendo el
paso 10.
12. Se añaden 200 \mul del tampón de elución
(Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM) o agua desionizada y se mezcla
durante 10 min. como en el paso 8.
13. Se sedimentan las partículas y se transfiere
cuidadosamente el sobrenadante que contiene el DNA aislado a un
nuevo tubo. El material está listo para su posterior análisis. Si la
muestra no se va a analizar durante el mismo día, congelar a -20ºC
hasta el momento del análisis.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
13
Se aisló DNA de tejido de aleta de pez (obtenido
de Bodega Marine Lab, Universidad de Davis, Davis, CA) y se analizó
como en el Ejemplo 12, con la excepción de que en el lavado de las
partículas de MagaCell con DNA unido (paso 10), el tampón de lavado
se modificó para que contuviera PEG 8000 PM al 10% y NaCl 0,25
M.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
14
El DNA plasmídico (PBA8 y PBA117, obtenidos de
Prozyme, San Leandro, CA) se liberó a partir de un cultivo de
células bacterianas (E. coli: XL1-Blue)
utilizando un procedimiento de lisis alcalina modificada.
Brevemente, las células bacterianas se sedimentaron por
centrifugación en un tubo de microcentrífuga. El botón se
resuspendió en un tampón de resuspensión. Las células se lisaron
entonces con hidróxido sódico que contiene SDS, seguido de una
neutralización con acetato potásico. El lisado celular se clarificó
entonces mediante centrifugación y el sobrenadante se utilizó para
el aislamiento del DNA plasmídico mediante la presente invención.
Así, el DNA plasmídico del sobrenadante se unió a partículas de
MagaCell en presencia de un tampón de unión especialmente
formulado. El DNA unido a las partículas de MagaCell se separó
entonces y se lavó de otros contaminantes. El DNA se eluyó de las
partículas. Se utilizó el siguiente procedimiento:
1. Se resuspenden las células bacterianas
sedimentadas en 150 \mul de tampón de resuspensión (Tris 50 mM,
EDTA 10 mM, pH 8,0 que contiene RNasa A 100 mg/ml, Sigma, St. Louis,
MO, número de catálogo: R4642) y se transfieren a un nuevo tubo de
microcentrífuga de 2 ml.
2. Se añaden 150 \mul de Solución A (hidróxido
sódico 0,2 M, SDS 1%). Se invierte suavemente el tubo
4-6 veces para mezclar, y hasta que la solución
aparezca viscosa y ligeramente clara.
3. Se añaden 150 \mul de Solución B (acetato
potásico 3 M, pH 5,5) y se invierte el tubo inmediatamente pero
suavemente 4-6 veces hasta que la solución aparezca
turbia.
4. Se centrifuga a elevada velocidad durante 10
min.
5. Se elimina suavemente el sobrenadante y se
transfiere a un nuevo tubo de microcentrífuga de 2 ml.
6. Se añaden 500 \mul del tampón de unión (PEG
8000 PM al 10%, NaCl 1,25 M) seguido de 20 \mul de las partículas
de MagaCell bien mezcladas (partículas suspendidas de forma
uniforme).
7. Se mezcla el tubo suavemente e incubarlo
durante 10 min. a temperatura ambiente, mientras se mezcla
(utilizando un agitador rotativo o mediante mezclado manual).
8. Se sedimentan las partículas de MagaCell con
el DNA unido utilizando una gradilla magnética. Se aspira el
sobrenadante y se lavan las partículas como se ha descrito en el
paso 9.
9. Se añade 1 ml de tampón de lavado (PEG 8000
PM al 10%, NaCl 1 M) al tubo del paso 8. Se mezcla bien, se
sedimentan las partículas en la gradilla magnética y se aspira el
sobrenadante.
10. Se repite el lavado una vez más siguiendo el
paso 9.
11. Se añaden 200 \mul del tampón de elución
(Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM) o agua desionizada y se mezcla
durante 10 min. como en el paso 7.
12. Se sedimentar las partículas y se transfiere
cuidadosamente el sobrenadante que contiene el DNA aislado a un
nuevo tubo. El material está listo para su posterior análisis. Si la
muestra no se va a analizar durante el mismo día, congelar a -20ºC
hasta el momento del análisis.
La electroforesis en gel de agarosa de dos
muestras de DNA plasmídico diferentes aisladas de lisados celulares
bacterianos, utilizando el presente método de la invención, mostró
resultados comparables a los obtenidos mediante QIAprep Miniprep
(Qiagen, Valencia, CA), el proveedor líder de equipos de aislamiento
de DNA plasmídico (Figura 2).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
15
El DNA plasmídico (PBA8 y PBA117, obtenidos de
Prozyme, San Leandro, CA) se liberó a partir de un cultivo de
células bacterianas (E coli-XL1-Blue), se
aisló con una elevada pureza y se analizó como en el Ejemplo 14,
con la excepción de que para el lavado de las partículas de MagaCell
con DNA unido (paso 9) el tampón de lavado se modificó para que
contuviera PEG 8000 PM al 10% y NaCl 0,25 M.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
16
El RNA viral MS2 (1 x 10^{7} - 1 x 10^{8}
copias) se introdujo en tres muestras de suero diferentes. El RNA
de cada muestra se aisló entonces como en el Ejemplo 3. El RNA
purificado se cuantificó entonces mediante un ensayo de
RT-PCR de MS2 utilizando el siguiente esquema:
\vskip1.000000\baselineskip
Las mezclas de reacción se sometieron a un
termociclado en un Smart Cycler (Cepheid, Sunnyvale, CA) utilizando
las siguientes condiciones: 60ºC durante 30 minutos seguido de 95ºC
durante 120 segundos y 45 ciclos de 95ºC durante 15 segundos y 60ºC
durante 30 segundos con Optics en marcha.
El RNA viral MS2 es de Boehringer Mannheim,
Indianapolis, IN, número de catálogo: 165948 y MS2. Los cebadores y
sonda son de Oswel, Souhhampton, U.K. El equipo de PCR en RNA GenAmp
EZ rTth, Part Number: N808-0179 es de Perkin Elmer
y el SUPERase\bulletIn, un inhibidor de la RNasa, es de Ambion,
Austin, TX. La cuantificación del RNA viral MS2 aislado mediante el
método de la invención con el equipo de RT-PCR a
tiempo real RNeasy Mini Kit se muestra en la Figura 3.
Claims (20)
1. Un método para la unión de ácidos nucleicos a
partículas de celulosa magnetizable o de un derivado de la celulosa
magnetizable, en el que el componente magnético de la celulosa
magnetizable o del derivado de la celulosa magnetizable es un
compuesto magnético; y dicho método comprende:
a) combinar la celulosa magnetizable o derivado
de la celulosa magnetizable con una solución que contiene ácidos
nucleicos, obteniendo así una combinación, y;
b) ajustar las concentraciones de sal y
polialquilenglicol de la combinación hasta concentraciones adecuadas
para la unión de ácidos nucleicos a la celulosa magnetizable o
derivado de la celulosa, en el que todos o una porción de los
ácidos nucleicos de la solución se unen a la celulosa magnetizable o
derivado de la celulosa, y en el que el derivado de la celulosa se
selecciona de entre el grupo que consiste en
celulosa-CM, celulosa-DEAE y
combinaciones de las mismas; en el que la concentración adecuada de
sal es entre 0,25 M y 5,0 M, y la concentración adecuada del
polialquilenglicol es equivalente a una concentración de entre
alrededor del 5% y el 15% de polietilenglicol.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
el compuesto magnético es óxido férrico, óxido ferroso u óxido de
níquel.
3. El método de la reivindicación 1, en el que
el compuesto magnético es óxido férrico.
4. El método de cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 3, en el que los ácidos nucleicos son DNA y
el polialquilenglicol es polietilenglicol.
5. El método de la reivindicación 4, en el que
el polietilenglicol tiene un peso molecular de 8000, y en el que la
sal es cloruro sódico.
6. El método de cualquiera de las
reivindicaciones de 4 a 5, en el que la concentración de
polietilenglicol se ajusta a alrededor del 10% y en el que la
concentración de cloruro sódico se ajusta entre 0,5 M y 1,5 M.
7. El método de cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 3, en el que los ácidos nucleicos son RNA y
el polialquilenglicol es polietilenglicol.
8. El método de la reivindicación 1, en el que
la celulosa magnetizable o el derivado de celulosa magnetizable
contiene hasta un 90% en peso de óxido férrico magnético.
9. Un método para la separación de ácidos
nucleicos de materiales diferentes a los ácidos nucleicos en una
solución de ácidos nucleicos, que comprende:
a) combinar partículas de celulosa magnetizable
o de un derivado de la celulosa magnetizable con una solución que
contiene ácidos nucleicos y materiales diferentes a los ácidos
nucleicos para producir una primera combinación, en la que, el
derivado de la celulosa se selecciona de entre el grupo que consiste
en celulosa-CM, celulosa-DEAE y
combinaciones de las mismas y el componente magnético de la celulosa
magnetizable o del derivado de la celulosa magnetizable es un
compuesto magnético;
b) ajustar las concentraciones de sal y
polietilenglicol de la primera combinación hasta concentraciones
adecuadas para la unión de los ácidos nucleicos de la solución a la
celulosa magnetizable o derivado de la celulosa, dando lugar a una
segunda combinación que comprende ácidos nucleicos unidos a celulosa
magnetizable o a un derivado de la celulosa magnetizable, en la que
la concentración adecuada de la sal es de entre 0,25 M y 5,0 M, y
la concentración adecuada del polialquilenglicol es equivalente a
una concentración de polietilenglicol de alrededor de entre el 5% y
el 15%;
c) separar los ácidos nucleicos unidos a la
celulosa magnetizable o derivado de la celulosa magnetizable a
partir de la segunda combinación;
d) poner en contacto los ácidos nucleicos unidos
a la celulosa magnetizable o derivado de la celulosa magnetizable
separados en c) con un tampón de elución para liberar los ácidos
nucleicos unidos de la celulosa magnetizable o derivado de la
celulosa al tampón de elución; y
e) separar la celulosa magnetizable o derivado
de la celulosa del tampón de elución para proporcionar ácidos
nucleicos que están sustancialmente libres de materiales diferentes
de los ácidos nucleicos.
10. El método de la reivindicación 9, en el que
la separación de las partículas de celulosa magnetizable o derivado
de la celulosa del paso c) y e) se realiza de forma magnética.
11. El método de la reivindicación 10, en el que
los ácidos nucleicos unidos a las partículas de celulosa
magnetizable o derivado de la celulosa son DNA y se lavan con un
tampón de lavado, en el que el tampón de lavado elimina las
impurezas unidas a las partículas de celulosa magnetizable o
derivado de la celulosa dejando el DNA unido a las partículas de
celulosa magnetizable o derivado de la celulosa.
12. El método de la reivindicación 10, en el que
el DNA unido a las partículas de celulosa magnetizable o derivado
de la celulosa se eluye con un tampón de elución que libera el DNA
unido a las partículas magnetizables.
13. El método de la reivindicación 12, en el que
el DNA liberado por el tampón de elución se aísla.
14. El método de la reivindicación 9, en el que
el polietilenglicol tiene un peso molecular de 8000, y en el que la
sal es cloruro sódico.
15. El método de la reivindicación 14, en el que
la concentración adecuada de polietilenglicol es de alrededor del
10% y la concentración de cloruro sódico está entre 0,5 M y 1,5
M.
16. El método de la reivindicación 9, en el que
los ácidos nucleicos y los materiales diferentes a los ácidos
nucleicos se obtienen a partir de un lisado celular.
17. El método de la reivindicación 16, en el que
el lisado se obtiene a partir de células de origen humano, animal,
vegetal, vírico o bacteriano.
18. El método de cualquiera de las
reivindicaciones de 9 a 17, en el que el compuesto magnético es
óxido férrico, óxido ferroso u óxido de níquel.
19. El método de la reivindicación 18, en el que
el compuesto magnético es óxido férrico.
20. Un equipo para el aislamiento y purificación
de ácidos nucleicos, que comprende
a) partículas de celulosa magnetizable o de un
derivado de la celulosa magnetizable en el que el componente
magnético de la celulosa magnetizable o del derivado de la celulosa
magnetizable es un compuesto magnético; y
b) reactivos sal y polialquilenglicol a
concentraciones adecuadas para el aislamiento de ácidos nucleicos a
partir de varios orígenes, que se caracteriza porque la
concentración de la sal está entre 0,25 M y 5,0 M y la
concentración del polialquilenglicol es equivalente a una
concentración de polietilenglicol de entre alrededor del 5% y el
15%.
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Families Citing this family (24)
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|---|---|---|---|---|
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| US6855499B1 (en) | 2001-02-16 | 2005-02-15 | Cortex Biochem, Inc. | Magnetic isolation and purification of nucleic acids |
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| JP4284250B2 (ja) * | 2003-09-09 | 2009-06-24 | 富士フイルム株式会社 | 核酸分離精製方法 |
| WO2005026347A1 (en) | 2003-09-09 | 2005-03-24 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Method for isolating and purifying a nucleic acid |
| US20050106602A1 (en) | 2003-11-17 | 2005-05-19 | Hashem Akhavan-Tafti | Simplified methods for isolating nucleic acids from cellular materials |
| US8426126B2 (en) | 2004-03-18 | 2013-04-23 | Applied Biosystems, Llc | Modified surfaces as solid supports for nucleic acid purification |
| DE102007009347B4 (de) | 2007-02-27 | 2009-11-26 | Agowa Gmbh | Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren |
| EP2157181A1 (de) | 2008-08-13 | 2010-02-24 | AGOWA Gesellschaft für molekularbiologische Technologie mbH | Verfahren zur Isolation von Nukleinsäuren und Testkit |
| US8288520B2 (en) | 2008-10-27 | 2012-10-16 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Fast results hybrid capture assay and system |
| AU2010242867B2 (en) | 2009-05-01 | 2016-05-12 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | A non-target amplification method for detection of RNA splice-forms in a sample |
| WO2011032124A1 (en) | 2009-09-14 | 2011-03-17 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Compositions and methods for recovery of nucleic acids or proteins from tissue samples fixed in cytology media |
| CA2787924A1 (en) | 2010-01-29 | 2011-08-04 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Methods and compositions for sequence-specific purification and multiplex analysis of nucleic acids |
| US9605303B2 (en) | 2010-01-29 | 2017-03-28 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Method of determining and confirming the presence of an HPV in a sample |
| EP2572001A2 (en) | 2010-05-19 | 2013-03-27 | QIAGEN Gaithersburg, Inc. | Methods and compositions for sequence-specific purification and multiplex analysis of nucleic acids |
| WO2011149897A1 (en) | 2010-05-25 | 2011-12-01 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Fast results hybrid capture assay and associated strategically-truncated probes |
| CA2828224A1 (en) | 2011-02-24 | 2012-08-30 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Materials and methods for detection of hpv nucleic acids |
| DE102012012523B4 (de) | 2012-06-26 | 2015-02-12 | Magnamedics Gmbh | Reinigung von Nukleinsäuren |
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| WO2016077294A1 (en) | 2014-11-14 | 2016-05-19 | Corning Incorporated | Methods and kits for post-ivt rna purification |
| US20180135040A1 (en) | 2016-02-16 | 2018-05-17 | Life Magnetics, Inc. | Methods for separating nucleic acids with graphene coated magnetic beads |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8507706D0 (en) * | 1985-03-25 | 1985-05-01 | Genetics Int Inc | Magnetic nucleic acid sequences |
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| ATE167302T1 (de) * | 1989-08-04 | 1998-06-15 | Behringwerke Ag | Heterogene bindungstests |
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