BRPI0500474B1 - Métodos para isolar e para adsorção de um ácido nucléico a partir de uma amostra biológica - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS PARA ISOLAR E PARA ADSORÇÃO DE UM ÁCIDO NUCLÉICO A PARTIR DE UMA AMOSTRA BIOLÓGICA". A presente invenção refere-se a um método para adsorção, isto é, ligação não-covalentemente, de um ácido nucléico para uma fase sólida. Ainda, a presente invenção refere-se a um método para isolamento de um ácido nucléico de uma amostra biológica.

Muitas substâncias biológicas, especialmente ácidos nucléico, apresentam desafios especiais em termos de isolamento deles de seu ambiente natural. Por outro lado, elas estão muitas vezes presentes em concentrações muito baixas e, por outro lado, elas são muitas vezes encontradas na presença de muitas outras substâncias sólidas e dissolvidas, por exemplo, após lise de células. Isso as torna difíceis de isolar ou de medir, em particular em ensaios bioespecíficos que permitem a detecção de ácidos nucléi-cos específicos, ou a detecção de propriedades específicas de um ácido nucléico. Tais ensaios bioespecíficos desempenham um papel principal no campo de diagnóstico e bioanálise em pesquisa e desenvolvimento. Exemplos de ensaios bioespecíficos são ensaios de hibridização, imunoensaios e ensaios de receptor-ligante. Os ensaios de hibridização usam o emparelha-mento de base específico para detecção molecular de analitos de ácido nucléico, por exemplo, RNA e DNA. Desse modo, sondas de oligonucleotídeo com um comprimento de 18 a 20 nucleotídeos pode permitir o reconhecimento específico de uma seqüência complementar selecionada, por exemplo, no genoma humano. Um outro ensaio que confere a ligação seletiva de dois primers de oligonucleotídeo é a reação de cadeia de polimerase (PCR) descrita na US 4.683.195. Este método permite a amplificação seletiva de uma região de ácido nucléico específica a níveis detectáveis através de uma polimerase termoestável na presença de trifosfatos de desoxinucleotídeo em vários ciclos.

Conforme acima descrito, antes dos ácidos nucléicos serem analisados em um dos ensaios acima mencionados ou usados para outros processos, eles devem ser isolados ou purificados a partir de amostras biológicas contendo misturas complexas de componentes diferentes como, por exemplo, componentes proteináceos e não-proteináceos. Muitas vezes, para as primeiras etapas, processos são usados, os quais permitem o enriquecimento do componente de interesse, isto é, os ácidos nucléicos. Frequentemente, esses estão contidos em uma célula bacteriana, uma célula fúngica, uma partícula viral, ou a célula de um organismo mais complexo, tal como uma célula de sangue humano ou uma célula de planta. Ácidos nucléicos como um componente de interesse podem ser também chamados um "componente alvo".

Para liberar os conteúdos das ditas células ou partículas, elas podem ser tratadas com enzimas ou com agentes químicos para dissolver, degradar ou desnaturar as paredes celulares e membranas celulares de tais organismos. Este processo é geralmente referido como lise. A solução resultante contendo tal material lisado é referida como lisato. Um problema frequentemente encontrado durante a lise é que outras enzimas que degradam o componente alvo, por exemplo, desoxirribonucleases ou ribonucleases degradando ácidos nucléicos, entram em contato com o componente alvo durante a lise. Essas enzimas de degradação podem também estar presentes fora das células ou podem ter sido espacialmente separadas em compartimentos celulares diferentes antes da lise e entram em contato agora com o componente alvo. Outros componentes liberados durante este processo podem ser, por exemplo, endotoxinas que pertencem à família de lipopolissa-carídeos que são tóxicas para células e podem causar problemas para os produtos pretendidos para uso em terapia humana e animal.

Nas etapas seguintes da preparação da amostra que seguem a etapa de lise, os ácidos nucléicos são ainda enriquecidos. Os ácidos nucléicos são normalmente extraídos das misturas de lise complexas antes deles serem usados em um ensaio à base de sonda. Há vários métodos para a extração de ácidos nucléico. Métodos dependentes da seqüéncia ou bioes-pecíficos incluem, por exemplo, cnomatografia de afinidade ou hibridização para sondas imobilizadas. Métodos independentes da sequência ou físico-químicos incluem, por exemplo, extração líquido-líquido com fenol-clorofórmio, precipitação com etanol ou isopropanol puro, extração com pa- pel de filtro, extração com agentes de formação de micela como brometo de cetil-trimetil-amônio, ligação a corantes imobilizados, de intercalação, tal como derivados de acrídina, adsorção a substratos tal como sílica-gel ou terras diatomáceas, adsorção em partículas de vidro magneticamente atraentes (MGP) ou partículas de organossilano sob condições caotrópicas. Ligação direta dos ácidos nucléicos a um substrato tal como um material com uma superfície de sílica é preferida porque dentre outras razões os ácidos nucléicos não devem ser modificados e até mesmo ácidos nucléicos nativos podem ser ligados.

Partícularmente interessante para propósitos de extração é a adsorção de ácidos nucléicos em uma superfície de vidro, embora outras superfícies sejam possíveis. Ácidos nucléicos que são liberados, por exemplo, por meio de lise de célula e/ou lise de organelas celulares tal como mitocôndria, plastí-deos, núcleos ou outras organelas contendo ácido nucléico, podem ser purificados por meio de ligação a uma fase sólida tal como um substrato mineral, lavagem do dito substrato mineral com os ácidos nucléicos ligados e liberação dos ditos ácidos nucléicos do dito substrato mineral. A adsorção de ácidos nucléicos a partículas de vidro ou partículas de sílica na presença de sais caotrópicos é conhecida na técnica (Vo-gelstein, B. e Gillespie, D., Proc. Natl. Acad. Sei., USA 76 (1979) 615-619) e provê a base para a purificação cromatográfica e processos de separação para ácidos nucléico. Também conhecidos na técnica são métodos para isolar e purificar RNA e DNA de lisatos usando altas concentrações de sais caotrópicos, por exemplo, iodeto de sódio, perclorato de sódio e tiocianato de guanidina (Boom, R. e outros, J. Clin. Microbiol. 28 (1990) 495-503; Ya-mada, O. e outros, J. Viroi. Methods 27 (1990) 203-209). A purificação de DNA de plasmídeo de bactérias em pó de vidro na presença de perclorato de sódio é descrita em Marko, M.A. e outros, Anal. Biochem. 121 (1982) 382-387. Na DE 37 24 442, o isolamento de DNA de fago M13 de filamento simples em filtros de fibras de vidro através de precipitação de partículas de fago usando ácido acético e lise das partículas de fago com perclorato é descrito. Os ácidos nucléicos ligados aos filtros de fibra de vidro são lavados e então eluídos com um tampão de Tris/EDTA contendo metanol. Um procedimento similar para purificação de DNA de fagos lâmbda é descrito em Ja-kobi, R. e outros, Anal. Biochem. 175 {1988) 196-201.0 procedimento confere a ligação seletiva de ácidos nucléicos a superfícies de vidro em soluções de sal caotrópicas e separação dos ácidos nucléico dos contaminantes tal como agarose, proteínas ou resíduo celular. Para separar as partículas de vidro dos contaminantes, as partículas podem ser ou centrifugadas ou fluidos são retirados através de filtros de fibra de vidro. Esta é uma etapa limitante, no entanto, que previne que o procedimento seja usado para processar grandes quantidades de amostras. O uso de partículas magnéticas para imobilizar ácidos nucléicos após precipitação através do adição de sal e etanol é mais vantajoso e descrito, por exemplo, em: Alderton, R.P. e outros, Anal. Biochem. 201 (1992) 166-169 e WO 91/00212, Nesse procedimento, os ácidos nucléicos são a-glutinados junto com as partículas magnéticas. O aglutinato é separado do solvente original através da aplicação de um campo magnético e realização de uma etapa de lavagem. Após uma etapa de lavagem, os ácidos nucléicos são dissolvidos em um tampão Tris. Este procedimento tem uma desvantagem, no entanto, que a precipitação não é seletiva para ácidos nucléicos. Pelo contrário, uma variedade de substâncias sólidas e dissolvidas é aglutinada também. Como resultado, este procedimento não pode ser usado para remover quantidades significantes de quaisquer inibidores de reações enzi-máticas específicos que possam estar presentes. Vidro poroso, magnético, está também disponível no mercado, o qual contém partículas magnéticas em uma matriz de vidro poroso, particular, e é coberto com uma camada contendo estreptavidina. Este produto pode ser usado para isolar materiais biológicos, por exemplo, proteínas ou ácidos nucléicos, se eles forem modificados em uma etapa de preparação complexa de modo a se ligarem cova-lentemente à biotina. Adsorventes particulares magnetizáveis provaram ser muito eficientes e adequados para preparação de amostra automática. Pigmentos ferrimagnéticos e ferromagnéticos bem como superparamagnéticos são usados para este propósito. Os MGPs mais preferidos são aqueles descritos no WO 01/37291.

Purificação de um ácido nucléico por meio de adsorção do mesmo a um substrato tal como um substrato mineral na presença de alta concentração de sais é também aplicada a outras misturas complexas. Seus exemplos são conhecidos da pessoa versada na técnica de biologia molecular e incluem mistura de reação seguindo, por exemplo, síntese in vitro de ácidos nucléicos tal como PCR, digestões de enzima de restrição, reações de ligação, etc. Em Vogelstein, B. e Gillespie, D., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76 (1979) 615-619, por exemplo, um procedimento para ligação de ácidos nucléicos de géis de agarose na presença de iodeto de sódio a vidro duro moído é proposto. Uma outra aplicação para purificação de um ácido nucléico por meio de adsorção do mesmo a um substrato tal como um substrato mineral na presença de uma alta concentração de sais é a remoção de con-taminantes pirogênicos que podem ter co-purificado com o ácido nucléico. O mecanismo através do qual ácidos nucléico se ligam ao apoio mineral na presença de agentes caotrópicos não é completamente claro. É tomado como hipótese que a interação entre os ácidos nucléicos e o solvente é influenciada de modo que os ácidos nucléicos adsorvem para o apoio mineral e desnaturam. Na presença de altas concentrações de agentes cao-trópicos a reação é quase quantitativa. Os ácidos nucléicos adsorvidos podem ser eluídos através de aplicação ao apoio mineral de tampões de resistência tônica baixa. A US 5.808.041 descreve métodos para isolamento de ácidos nucléicos com comprimentos maiores do que cerca de 50 bases a partir de certas amostras biológicas. Um lisato aquoso contendo íons caotrópicos em uma concentração acima de 2M é produzido e os ácidos nucléicos são ad-sorvídos do lisato para material de síiica (também referido como "ligação"). Uma pasta fluida ou resina compreendendo material de síiica e sais caotrópicos é adicionada ao material biológico desse modo resultando em um procedimento de lise e ligação de uma etapa. Os métodos para líse de uma amostra biológica descritos no documento incluem lise de bactérias usando hidróxido alcalino e SDS, lise de M13 ou fagos lâmbda através de incubação dos fagos na presença de 2,8M de guanidínio, e lise de tecido fresco ou congelado através de incubação do tecido na presença de 2,8M de guanidínio. Adicionalmente, N-lauril-sarcosina é usado para auxiliara lise. A EP 0 389 063 e a EP 0 819 696 descrevem o método de purificação de um ácido nucléico através de mistura em um material de fase líquida contendo o ácido nucléico com uma substância caotrópica e uma fase sólida de ligação de ácido nucléico. Desse modo, os procedimentos descritos nos documentos também representam procedimentos de lise e ligação de uma etapa. Seguindo lise e ligação, a fase sólida com ácido nucléico ligado é separada da fase líquida. Seguindo uma etapa de lavagem o ácido nucléico é eluído da fase sólida. Os documentos descrevem um tampão de lise contendo cerca de 10M de tiocianato de guanidínio, cerca de 2% de Tri-ton-X100, cerca de 0,1 M de sal de Tris e cerca de 50 μΜ de EDTA. Um outro tampão de lise contém ainda 40% em peso em volume de sulfato de dex-trano. Um outro tampão de lise contém cerca de 10M de tiocianato de guanidínio e cerca de 50 μΜ de EDTA. Outros tampões de lise são descritos nos documentos que contêm como uma substância caotrópica iodeto de potássio ou iodeto de sódio em uma concentração de cerca de 3M, ou iodeto de potássio ou sódio em combinação com 1M ou 8M de uréia. Lise de uma amostra biológica é realizada por meio de incubação da amostra com um tampão de lise, com o que 50 partes em volume da amostra biológica são misturadas com 900 partes em volume de um tampão de lise e 40 partes em volume de material bruto de sílica. Como uma alternativa para uso de material bruto de sílica, outros procedimentos são descritos, com o que material de filtro de sílica é usado. A EP 0 658 164 descreve métodos para a purificação cromato-gráfica de ácidos nucléicos por meio de purificação cromatográfica. Particularmente, um procedimento de duas etapas compreendendo uma primeira etapa de lise e uma segunda etapa de lise é descrito. Na primeira etapa (lise), a amostra biológica é misturada com um agente caotrópico, com o que a concentração do agente caotrópico na mistura está entre cerca de 2M e cer- ca de 4M. Opcionalmente, a mistura contém adicionalmente feno!, clorofórmio ou éter. Opcionalmente, a mistura contém adicionalmente um detergente. Uma protease é adicionada e a mistura é incubada. Na segunda etapa (ligação), um álcool é adicionado e a mistura resultante é contatada com a fase sólida de ligação de ácido nucléico.

Os métodos do estado da técnica têm certas desvantagens. Desse modo, era objetivo da presente Invenção prover um método alternativo de preparação de uma amostra biológica contendo um ácido nucléico e adsorção da preparação do ácido nucléico em uma fase sólida. Era um outro objetivo da invenção superar a necessidade de álcool durante a etapa de adsorção uma vez que álcool é uma substância inflamável e então é desejado restringir seu uso.

No presente documento é compreendido que o termo "um ácido nucléico" significa pelo menos um ácido nucléico. Ainda, o termo "um ácido nucléico1' também indica uma mistura de ácidos nucléicos. Os termos "fase sólida" e "substrato" significam uma substância que é substancialmente insolúvel em uma solução aquosa e sobre a qual um ácido nucléico em uma solução aquosa de resistência iônica alta pode adsorver quando a substância é adicionada. Seus exemplos são partículas de mineral porosas e não-porosas tal como sílica, vidro, quartzo, zeólitos ou suas misturas. Também, o termo "substrato" compreende partículas magneticamente atraentes revestidas com sílica, vidro, quartzo ou zeólitos. Ainda, é compreendido que um substrato na forma de "pó" ou material em "pó" refere-se a material finamente dividido que, quando disperso em uma fase líquida tal como um composto orgânico líquido ou uma solução aquosa, produz uma suspensão. O termo "pó" ou material em "pó" pretende incluir comprimidos, onde o material em pó foi agregado, mas ainda dá uma suspensão quando combinado com uma fase líquida tai como uma solução aquosa. Ainda, é compreendido que os termos "resistência iônica alta" e "concentração alta" significam a resistência tônica ou concentração em uma solução aquosa que resulta de sais dissolvidos em concentrações iguais a ou maiores do que cerca de 1M. Preferidos são sais caotrópicos em concentrações de 1 a 10M.

Os inventores surpreendentemente verificaram que a realização de um procedimento de lise e ligação de duas etapas é vantajosa, com o que a lise da primeira etapa é realizada misturando a amostra biológica com um tampão de lise aquoso contendo um agente caotrópico e incubação da mistura; na segunda etapa, a concentração do agente caotrópico na mistura é aumentada e a mistura é contatada com uma fase sólida capaz de ligação de ácidos nucléicos, com o que o ácido nucléico na fase líquida é adsorvido para a fase sólida.

Uma primeira modalidade da invenção é então um método para adsorção de um ácido nucléico a partir de uma amostra biológica para uma fase sólida, compreendendo as etapas de (a) provisão de um tampão de lise aquoso que contém um agente caotrópico; (b) mistura do tampão de lise com a amostra biológica, com o que a concentração do agente caotrópico na mistura está entre 1M e 4M, e incubação da mistura; (c) dissolução de uma quantidade adicional de agente caotrópico na ou adição de uma solução a-quosa contendo agente caotrópico adicional à mistura da etapa (b), desse modo aumentando a concentração do agente caotrópico na mistura em mais de 0,5M; (d) contato da mistura da etapa (c) com a fase sólida, desse modo adsorvendo o ácido nucléico da mistura para a fase sólida.

Uma segunda modalidade da invenção é um método para isolar um ácido nucléico de uma amostra biológica, compreendendo as etapas de (a) provisão de um tampão de lise aquoso que contém um agente caotrópí-co; (b) mistura do tampão de lise com a amostra biológica, com o que a concentração do agente caotrópico na mistura está entre 1M e 4M, e incubação da mistura; (c) dissolução de uma quantidade adicional de agente caotrópico na ou adição de uma solução aquosa contendo agente caotrópico adicional à mistura da etapa (b), desse modo aumentando a concentração do agente caotrópico na mistura em mais do que 0,5M; (d) provisão de uma fase sólida e contato da mistura da etapa (c) com a fase sólida, desse modo adsorvendo o ácido nucléico da mistura para a fase sólida; (e) separação da fase sólida da fase líquida; (f) opcionalmente lavagem da fase sólida da etapa com um tampão de lavagem; (g) eluição do ácido nucléico da fase sólida, desse mo- do isolando o ácido nucléico; (h) opcionalmente precipitação do ácido nucléi-co da etapa (g) a partir do eluato e isolamento do ácido nucléico precipitado.

Muitos procedimentos para isolamento de ácidos nucléicos de seu ambiente natural foram propostos nos últimos anos através do uso de seu comportamento de ligação a substratos tal como superfícies de vidro. É comum usar agentes caotrópicos tal como, por exemplo, tiocianato de gua-nidina sob condições com muito sal. Uma alta concentração de agente cao-trópico muda as propriedades de massa de água (Cacace, M.G. e outros, Quarteríy Review ofBiophysics (1997) 30:241-277).

Certos íons em água vão tender a aumentar as interações hidro-fóbicas, enquanto outros íons vão diminuir as interações hidrofóbicas. Quais íons que têm uma tendência para a qual o efeito é descrito são chamados uma série Hofmeister. A série é como segue: Cátions: íons da esquerda são ditos ser "cosmotrópicos'' e aumentam a resistência de interações hidrofóbicas e então vão precipitar ou "retirar o sal" de proteínas em uma alta concentração. íons na direita são "caotrópicos" e tendem a enfraquecer as interações hidrofóbicas. A série Hofmeister explica porque a guanidina é um desnaturador de proteína. Ela enfraquece as interações fazendo com que as proteínas desnaturem. Em contraste, (NH4)2S04 vai dissociar em íons de NH4+ e SO42*. Ambos esses íons são cosmotrópicos, e 0 efeito de cada um é independente e aditivo. Isso faz do (NH^SC^ um precipitante versátil que é amplamente usado em procedimentos de purificação de proteína. NaCI está no meio da série, isto é, não é nem cosmo-trópico nem caotrópico.

Foi verificado pelos inventores que para preparação de uma a-mostra biológica contendo um ácido nucléico e adsorção da preparação do ácido nucléico a uma fase sólida vantajosamente um método de lise e liga- ção de duas etapas é aplicado. Na primeira etapa (lise) a concentração do agente caotrópico é menor do que na segunda etapa (ligação). Durante a etapa de lise, isto que dizer na mistura da amostra biológica e do tampão de lise, a concentração preferida do agente caotrópico está entre 1M e 4M. Uma primeira modalidade preferida da invenção é então um método para adsorção de um ácido nucléico a partir de uma amostra biológica a uma fase sólida, compreendendo as etapas de (a) provisão de um tampão de lise a-quoso que contém um agente caotrópico; (b) mistura do tampão de lise com a amostra biológica, com o que a concentração do agente caotrópico na mistura está entre 1M e 4M, e incubação da mistura; (c) dissolução de uma quantidade adicional de agente caotrópico na ou adição de uma solução a-quosa contendo agente caotrópico adicional à mistura da etapa (b), desse modo aumentando a concentração do agente caotrópico na mistura em mais de 0,5M; (d) contato da mistura da etapa (c) com a fase sólida, desse modo adsorvendo o ácido nucléico da mistura para a fase sólida. É preferido que o agente caotrópico seja um sal caotrópico. É mais preferido que o agente caotrópico seja selecionado do grupo consistindo em cloridrato de guanidínio, tiocianato de guanidínio, isotiocianato de guanidínio, um iodeto alcalino e um perclorato alcalino. De preferência, o iodeto alcalino é Kl ou Nal. De preferência, o perclorato alcalino é NaCIC>4 ou KCI04. Misturas desses compostos bem como misturas desses compostos com uréia são também possíveis.

Dependendo do agente caotrópico usado, a sua concentração ótima na mistura da etapa (b) pode variar. Por exemplo, para se obter um efeito caotrópico comparável usando concentrações diferentes de cloridrato de guanidínio ou tiocianato de guanidínio na faixa indicada entre 1M e 4M devem ser selecionadas. O princípio de base desta diferença é que o sal de tiocianato de guanidínio quando dissolvido em água dissocia para resultar em dois íons caotrópicos, enquanto que cloridrato de guanidínio dissociado resulta em apenas um íon caotrópico. É então preferido que na mistura da etapa (b) a concentração do agente caotrópico esteja entre 1M e 2M. É mais preferido que na mistura da etapa (b) a concentração do agente caotrópico esteja entre 1,5M e 2M. É ainda mais preferido que na mistura da etapa (b) a concentração do agente caotrópico seja cerca de 2M. Dependendo do agente caotrópico usado, é também preferido que na mistura da etapa (b) a concentração do agente caotrópico esteja entre 2M e 4M. É mais preferido que na mistura da etapa (b) a concentração de agente caotrópico esteja entre 2,5M e 3M. É ainda mais preferido que na mistura da etapa (b) a concentração do agente caotrópico seja cerca de 3M.

Com relação a isso, é de compreensão geral do versado na técnica que a palavra "cerca de" em combinação com um valor numericamente quantificado significa que este valor pode ser submetido à variação, com o que o efeito técnico desejado que é descrito ou definido pelo valor permanece sem modificação. Geralmente, "cerca de" é compreendido implicar uma variação de 5%. Por exemplo, um valor de cerca de 100 compreende os valores entre 95 e 105. íons de guanidínio e tiocianato são classificados na série Hof-meister como tendo propriedades caotrópicas aumentadas sobre, por exemplo, cátions de potássio ou sódio, ou ânions de iodeto ou clorato, respectivamente. É então também preferido que na mistura da etapa (b) a concentração do agente caotrópico esteja entre 2M e 4M.

Na segunda etapa (ligação) a concentração do agente caotrópico na mistura é aumentada através da adição de mais agente caotrópico à mistura da etapa (b). Conforme indicado para a etapa (c), há vários modos de atingir o aumento desejado. É possível adicionar o agente caotrópico como matéria sólida à mistura da etapa (b) e dissolver o agente caotrópico. Alternativamente, uma solução aquosa do agente caotrópico é preparada e adicionada à mistura da etapa (b). De preferência, a solução aquosa contém ingredientes adicionais tal como sal de tampão, um detergente ou ambos. Um exemplo de tal solução aquosa é o tampão de ligação descrito nos E-xemplos 2,3 e 4. A concentração do agente caotrópico na mistura da etapa (c) é aumentada em mais de 0,5M. É mais preferido, no entanto, que a etapa (c) compreenda dissolução de uma quantidade adicional de agente caotrópico na ou adição de uma solução aquosa contendo agente caotrópico adicional à mistura da etapa (b), desse modo aumentando a concentração do agente caotrópico na mistura para um valor entre 1,5M e 10M. É notado que agente caotrópico adicional pode ser adicionado como uma matéria sólida à mistura da etapa (b) até que saturação na mistura seja atingida. Desse modo, é ainda preferido que a etapa (c) compreenda dissolução de uma quantidade adicional de agente caotrópico na mistura da etapa (b), desse modo saturando a mistura com o agente caotrópico. É preferido que na etapa (c) a concentração do agente caotrópico na mistura seja aumentada entre 0,5M e 6M. É mais preferido que na etapa (c) a concentração do agente caotrópico na mistura seja aumentada entre 0,5M e 4M. É ainda mais preferido que na etapa (c) a concentração do agente caotrópico na mistura seja aumentada entre 0,5M e 3M. É ainda mais preferido que na etapa (c) a concentração do agente caotrópico na mistura seja aumentada entre 0,5M e 2M. É ainda mais preferido que na etapa (c) a concentração do agente caotrópico na mistura seja aumentada entre 0,5M e 1,5M. É ainda mais preferido que na etapa (c) a concentração do agente caotrópico na mistura seja aumentada entre 0,5M e 1M.

Em detalhes, o procedimento para ligação de (pelo menos um) ácido nucléico (também referido como ácido nucléico alvo) a um substrato tal como, por exemplo, partículas de sílica, fibras de sílica, filtro de vidro ou partículas de vidro pode ser descrito como segue. De acordo com a invenção, ele é realizado na presença de sais caotrópicos com uma concentração entre 1,5M e 10M, e de preferência entre 2M e 6M. DNA ou RNA se liga a material com uma superfície de vidro sob essas condições, isto é, na presença de certas concentrações de um agente caotrópico. Para trazer o lisato em contato com o substrato, isto é, o material com uma afinidade para ácidos nucléicos, o lisato é misturado com o substrato e incubado por um período de tempo suficiente para a ligação acontecer. No caso do substrato ser um filtro compreendendo, por exemplo, vidro, sílica ou fibras de quartzo, o lisato (isto é, a mistura da etapa (c)) pode ser passado pelo filtro através de tração gravitacional, através de aplicação de pressão ou através de aplicação de sucção. Enquanto passando pelo filtro, o ácido nucléico na fase líquida entra em contato com a fase sólida e é adsor-vido nela. Especialistas são geralmente familiares com a duração da incubação da fase líquida e da fase sólida. A incubação pode ser otimizada através da determinação da quantidade de material biológico imobilizado na superfície em pontos de tempo diferentes. Tempos de incubação entre 10 segundos e 30 minutos podem ser apropriados para ácidos nucléicos. É ainda preferido usar nos procedimentos para ligação de um ácido nucléico a uma fase sólida ou para isolamento de um ácido nucléico de uma amostra biológica uma enzima com atividade proteolítica quando da lise de uma amostra biológica a fim de livrar os ácidos nucléicos. O termo "enzima com atividade proteolítica" é entendido compreender uma protease ou uma mistura de proteases para rapidamente degradar na amostra biológica as enzimas de degradação de ácido nucléico ou outras proteínas inde-sejadas. No presente contexto, o termo "protease" pretende significar qualquer hidrolase, peptidase, proteinase ou enzima tendo atividade proteolítica (isto é, hidrolases agindo nas ligações peptídeo) conforme compreendido na EC 3.4-3.11 e qualquer modificação delas, cuja modificação reteve a atividade da enzima. A enzima com atividade proteolítica pode ser isolada de tecido animal, tecido de planta, um microorganismo ou pode ser obtida através de meios recombinantes.

Desse modo, é preferido que o tampão de lise da etapa (a) contenha uma enzima com atividade proteolítica. É mais preferido que a enzima com atividade proteolítica seja selecionada das proteases conforme compreendido na EC 3.4-3.11. É ainda mais preferido que a enzima com atividade proteolítica seja selecionada do grupo consistindo em Acromopeptidase, A-minopeptidase, Ancrod, Enzima de Conversão de Angiotensina, Bromelaína, Calpaína, Calpaína I, Calpaína II, Carboxipeptidase A, Carboxipeptidase B, Carboxípeptidase G, Carboxipeptidase P, Carboxipeptidase W, Carboxipeptidase Y, Caspase, Caspase 1, Caspase 2, Caspase 3, Caspase 4, Caspase 5, Caspase 6, Caspase 7, Caspase 8, Caspase 9, Caspase 10, Caspase 13, Catepsina B, Catepsina C, Catepsina D, Catepsina G, Catepsina H, Catepsi- na L, Quimiopapaína, Quimase, alfa-Quimiotripsina, Clostripaína, Colagena-se, Clr Complemento, CIs Complementeo, Fator D Complemento, Fator I Complemento, Cucumisina, Dipeptil peptidase IV, leucócito Elastase, Elasta-se pancreática, Endoproteinase Arg-C, Endoproteinase, Asp-N, Endoprotei-nase Glu-C, Endoproteinase Lys-C, Enterocinase, Fator Xa, Ficina, Furina, Granzima A, Granzima B, Protease de HIV, IGase, tecido de Calicreína, A-minopeptidase de Leucina, aminopeptidase de Leucina citosólica, aminopep-tidase de Leucina microssomal, Metaloprotease de matriz, Aminopeptidase de Metionina, Neutrase, Papaína, Pepsina, Plasmina, Prolidase, Pronase E, Antígeno Específico de Próstata, protease alcalofílica de Streptomyces gri-seus, Proteases de Aspergillus, Protease de Aspergillus saitoi, Protease de Aspergillus sojae, Protease alcalina de B. licheniformis, Alcalase de B. liche-niformis, Protease de Bacillus polymyxa, Protease de Bacillus sp., Protease de Bacillus sp. (Esperase), Protease de Rhizopus sp., Protease S., Protea-somes, Proteinase de Aspergillus oryzae, Proteinase 3, Proteinase A, Pro-teinase K, Proteína C, Aminopeptidase de piroglutamato, Renina, Rennina, Estreptocinase, Subtilisina, Termolisina, Trombina, Ativador de Plasminogê-nio de Tecido, Tripsina, Triptase e Urocinase. É ainda mais preferido que a enzima com atividade proteolítica seja selecionada do grupo consistindo em uma Caspase, Proteinase K, Pronase E, Protease de Bacillus sp. (Esperase) e Subtilisina. Uma mistura de pelo menos duas proteases diferentes conforme compreendido na EC 3.4-3.11 é também preferida. Com relação à seleção de uma protease, os especialistas são geralmente familiares com a otimização de tampões de lise. Conforme descrito no Exemplo 1, o versado na técnica vai testar a atividade proteolítica de uma protease selecionada em um tampão contendo um agente caotrópico em concentrações diferentes. Uma protease ativa sob as condições caotrópicas de uma mistura de acordo com a etapa (b) é de preferência selecionada. A otimização da duração da incubação com a protease bem como a otimização da temperatura de incubação podem ser realizadas pelo especialista. Como um parâmetro, o versado na técnica vai determinar a quantidade de ácido(s) nucléico(s) liberados da amostra biológica na fase líquida e capazes de ser ligados ao subs- trato. É muito preferido que o tampão de lise da etapa (a) contenha Proteinase K. De preferência, a atividade da proteinase K na mistura da etapa (b) está entre 0,1 U/ml e 10 U/ml. É mais preferido que a atividade de proteinase K na mistura da etapa (b) esteja entre 1 U/ml e 6 U/ml. É ainda mais preferido que a atividade da proteinase K na mistura da etapa (b) esteja entre 2 U/ml e 4 U/mí. É ainda mais preferido que a atividade da proteinase K na mistura da etapa (b) seja cerca de 3 U/ml. Com relação a isso, é compreendido que os valores de atividade citados da Proteinase K refletem valores de atividade determinados conforme descrito no Exemplo 1.

Quando da lise de uma amostra biológica a fim de liberar os ácidos nucléicos ou quando ligando o ácido nucléico à fase sólida é ainda preferido usar um detergente nos procedimentos, isto quer dizer, um detergente aniônico, catiônico, zwitteriônico ou não-iônico. Tais detergentes são bem conhecidos da pessoa versada na técnica. Em geral, um "detergente” é um ativo na superfície, também conhecido como tensoativo. Um detergente é capaz de diminuir a tensão da superfície do meio onde ele é dissolvido, e/ou a tensão de interface com outras fases, e, desse modo, é positivamente ad-sorvido no líquido/vapor e/ou outras interfaces. Desse modo, detergentes são moléculas antifáticas com domínios polares (solúvel em água) e não-polares (hidrofóbicos). Eles são capazes de ligação com moléculas hidrofó-bicas ou domínios moleculares para conferir solubilidade em água. Dependendo de suas características iônicas, um detergente pode ser categorizado como um detergente iônico, um detergente não-iônico e um detergente zwitteriônico. Detergentes iônicos podem ser ainda classificados ou em detergentes catiônicos tal como SDS (Dodecil sulfato de sódio), LiDS (Dodecil sulfato de lítio) ou Brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) e detergentes ani-ônicos tal como Ácido desoxicóllco ou Lauril sarcosina de sódio. Desse modo, esses são geralmente altamente desnaturantes de proteína. Detergentes não-iônicos tal como são menos desnaturantes de proteína. Isso é também verdadeiro para detergentes zwltteriônicos tal como CHAPS ou Sulfobetaína 14. Compostos zwitteriônicos também conhecidos como zwítterions, sais internos ou íons dipolares são compostos neutros tendo cargas elétricas unitárias formais de sinal oposto.

Desse modo, é preferido que o tampão de lise da etapa (a) contenha um detergente. É mais preferido que o tampão de lise da etapa (a) contenha um detergente aniônico, catiônico, zwitteriônico ou não-iônico. É ainda mais preferido que o detergente no tampão de lise da etapa (a) seja selecionado do grupo consistindo em Dodecil sulfato de sódio, Dodecil sulfato de lítio, Brometo de cetiltrimetílamônio, Ácido desoxicólico, Lauroil sarco-sína de sódio, Triton-X100, Tween 20, Octil beta-D-glucosídeo, Nonidet P40, CHAPS ou Sulfobetaína 14. No entanto, outros detergentes são possíveis. Em geral, quando usando a combinação de um agente caotrópico, um detergente e uma protease para lise de uma amostra biológica, o versado na técnica seleciona um detergente e sua concentração na mistura da etapa (b) na base que a atividade proteolítica é preservada.

De preferência, a fase sólida compreende um substrato mineral poroso e não-poroso selecionado do grupo consistindo em sílica-gel, fibras de vidro, fibras de quartzo e zeólitos. Também preferido, a fase sólida compreende um substrato mineral poroso e não-poroso selecionado do grupo consistindo em óxidos de metal e/ou óxidos mistos de metal, alumina, títânia, zircônia e materiais predominantemente consistindo em vidro. É também preferido que a fase sólida compreenda um substrato mineral com um tamanho de partícula de 0,1 μηη a 1.000 μιτη. É também preferido que a fase sólida compreenda materiais de apoio minerais porosos com um tamanho de poro de a partir de 2 a 1.000 nm. Com mais preferência, materiais de apoio porosos e não-porosos, especialmente zeólitos, estão na forma de embalagens soltas. Com mais preferência, a fase sólida consiste em folhas de filtro na forma de folhas de filtro de vidro, quartzo ou cerâmica, e/ou uma membrana contendo sílica-gel e/ou partículas ou fibras de apoios minerais e tecidos de quartzo ou lã de vidro. É também preferido que a fase sólida compreenda partículas magneticamente atraentes. Com mais preferência, as partículas magneticamente atraentes são revestidas com um substrato mineral selecionado do grupo consistindo em sílica-gel, vidro, quartzo e zeólitos.

Com mais preferência, o substrato compreende partículas de vidro magnéticas.

Uma modalidade adicional da invenção é um método para isolar um ácido nucléico de uma amostra biológica compreendendo as etapas de (a) provisão de um tampão de lise aquoso que contém um agente caotrópi-co; (b) mistura do tampão de lise com a amostra biológica, com o que a concentração do agente caotrópico na mistura está entre 1M e 4M, e incubação da mistura; (c) dissolução de uma quantidade adicional de agente caotrópico na ou adição de uma solução aquosa contendo agente caotrópico adicional na mistura da etapa (b), desse modo aumentando a concentração do agente caotrópico na mistura em mais de 0,5M; (d) provisão de uma fase sólida e contato da mistura da etapa (c) com a fase sólida, desse modo adsorvendo o ácido nucléico da mistura para a fase sólida; (e) separação da fase sólida da fase líquida; (f) opcionalmente lavagem da fase sólida da etapa com um tampão de lavagem; (g) eluição do ácido nucléico da fase sólida desse modo isolando o ácido nucléico; (h) opcionalmente precipitação do ácido nucléico da etapa (g) do eluato e isolamento do ácido nucléico precipitado. É preferido que a fase sólida compreenda um substrato mineral poroso e não-poroso selecionado do grupo consistindo em sílica-gel, fibras de vidro, fibras de quartzo e zeólitos. É também preferido que a fase sólida compreenda partículas de vidro magnéticas. É muito preferido que o agente caotrópico seja um sal caotrópico. É mais preferido que o agente caotrópico seja selecionado do grupo consistindo em cloridrato de guanidínio, tiocianato de guanidínio, isotiocianato de guanidínio, um iodeto alcalino e um perclorato alcalino. É também preferido que o tampão de lise da etapa (a) contenha uma enzima com atividade proteolítica e um detergente. É muito mais preferido que o tampão de lise da etapa (a) contenha uma enzima com atividade proteolítica. É ainda mais preferido que a enzima com atividade proteolítica seja selecionada das proteases conforme compreendido na EC 3.4-3.11. É ainda mais preferido que a enzima com atividade proteolítica seja selecionada do grupo consistindo em uma Caspase, Proteinase K, Pronase E, Protea- se de Bacillus sp. (Esperase) e Subtilisina. Uma mistura de pelo menos duas proteases diferentes conforme compreendido na EC 3.4-3.11 é também preferida. É também muito preferido que o tampão de lise da etapa (a) contenha um detergente aniônico, catiônico, zwitteriônico ou não-íôníco. É mais preferido que o detergente no tampão de lise da etapa (a) seja selecionado do grupo consistindo em Dodecil sulfato de sódio, Dodecil sulfato de lítio, Brometo de cetiltrimetilamônio, Ácido desoxicólico, Lauroil sarcosinato de sódio, Triton X-100, Tween 20, Octil beta-D-glicosidase, Nonidet P40, CHAPS ou Sulfobetaína 14. É preferido que o valor do pH da mistura da etapa (b) esteja entre 8,5 e 4. É mais preferido que o valor do pH da mistura da etapa (b) esteja entre 7,5 e 5. É ainda mais preferido que o valor do pH da mistura da etapa (b) esteja entre 7 e 6. É ainda mais preferido que o valor do pH da mistura da etapa (b) seja cerca de 6. É muito mais preferido que a mistura da etapa (b) contenha a amostra biológica, tiocianato de guanidina em uma concentração entre 1,5M e 3M, sal de tris em uma concentração entre 20 mM e 40 mM, Triton-X100 em uma concentração entre 5% e 20% volume em volume, e Proteinase K, com o que a atividade proteolítica da Proteinase K na mistura está entre 1 U/ml e 5 U/ml, e com o que o pH da mistura está entre 8,5 e 6,0. Com relação a isso, é compreendido que a atividade da Proteinase K é determinada conforme descrito no Exemplo 1. É mais preferido que a mistura da etapa (b) contenha a amostra biológica, tiocianato de guanidina em uma concentração entre 1,5M e 2,5M, sal de Tris em uma concentração entre 20 mM e 30 mM, Triton-X100 em uma concentração entre 5% e 15% em volume, e Proteinase K, com o que a atividade de Proteinase K na mistura está entre 2 U/ml e 4 U/ml, e com o que o pH da mistura está entre 8,5 e 6,0. É mais preferido que a mistura da etapa (b) contenha a amostra biológica, tiocianato de guanidínio em uma concentração de cerca de 2M, sal de Tris em uma concentração de cerca de 25 mM, Triton-X100 em uma concentração de cerca de 10% volume em volume, e Proteinase K, com o que a atividade proteolítica da Proteinase K na mistura é cerca de 3 U/ml e com o que o pH da mistura é cerca de 6. Ainda mais preferido é um pH de 6. Um exemplo dela é a mistura de lise (isto é, a mistura de acordo com a etapa (b)) usada no Experimento 4 do Exemplo 2. É também preferido que a mistura da etapa (b) contenha a a-mostra biológica, cloridrato de guanidínio em uma concentração de cerca de 2,7M, uréia em uma concentração de cerca de 5 mM, sal de Tris em uma concentração de cerca de 5 mM, Triton-X100 em uma concentração de cerca de 9% volume em volume, e Proteinase K, com o que a atividade proteolítica de Proteinase K na mistura é cerca de 3 U/ml, e com o que o pH da mistura está entre 4,4 e 6,5. É também preferido que a mistura da etapa (b) contenha a a-mostra biológica, cloridrato de guanidínio em uma concentração de cerca de 2,4M, uréia em uma concentração de cerca de 1,6 mM, sal de Tris em uma concentração de cerca de 85 mM, EDTA em uma concentração de cerca de 88 mM, NaCI em uma concentração de cerca de 8 mM, Triton-X100 em uma concentração de cerca de 9% volume em volume, e Proteinase K, com o que a atividade proteolítica da Proteinase K na mistura é cerca de 3 U/ml e com o que o pH da mistura está entre 4,4 e 6,5. É ainda preferido que a mistura da etapa (b) incluindo uma pro-tease seja incubada por uma certa quantidade de tempo e em condição ambiente que permita atividade proteolítica. É preferido que a mistura da etapa (b) seja incubada por 10 minutos a 30 minutos em uma temperatura entre 20° C e 75° C, com o que a mistura é agitada. O meio de agitação preferido é um misturador com rolo ou um termomisturador. Os termos "agitação" e "agitar" são compreendidos como mover o tubo de teste contendo a mistura da etapa (b) de modo a inverter o tubo de teste uma vez por segundo. Os termos também incluem movimentos tendo um efeito equivalente com relação a causar turbulência na mistura da etapa (b). O grau de agitação pode ser também influenciado pelo tamanho do(s) ácido(s) nucléico(s) a ser(em) isolado(s). Muita agitação pode levar a forças de cisalhamento resultando em restrição de tamanho das moléculas de ácido nucléíco na mistura. Desse modo, agitação mais lenta pode ser selecionada pelo especialista. É mais preferido que a mistura da etapa (b) seja incubada por 30 minutos em temperatura ambiente, com o que a mistura é agitada usando um misturador de rolo. É ainda mais preferido que a mistura da etapa (b) seja incubada por cerca de 10 a 20 minutos em uma temperatura entre 50° C e 75° C, com o que a mistura é agitada usando um termomisturador. É ainda mais preferido que a mistura da etapa (b) seja incubada por 10 minutos a 20 minutos por volta de 56° C, com o que a mistura é agitada usando um misturador de rolo ou um termomisturador. É ainda mais preferido que a mistura da etapa (b) seja incubada por 15 minutos a 56° C, com o que a mistura é agitada usando um misturador de rolo ou um termomisturador. É também muito mais preferido que a mistura da etapa (b) seja incubada por 10 minutos a 20 minutos por volta de 72° C, com o que a mistura é agitada u-sando um misturador de rolo ou um termomisturador. É ainda mais preferido que a mistura da etapa (b) seja incubada por 10 minutos a 72° C, com o que a mistura é agitada usando um misturador de rolo ou um termomisturador.

Após adsorção do(s) ácido(s) nucléico(s) da mistura da etapa (b) para a fase sólida, ácido(s) nucléico(s) ligado(s) é/são separado(s) da fase líquida. Isso pode ser conseguido em geral pela gravidade ou no caso conveniente de ácidos nucléicos ligados a partículas de vidro magnéticas através de separação do material ligado às partículas magnéticas através da aplicação de um campo magnético. Por exemplo, as partículas magnéticas podem ser puxadas para a parede do recipiente onde a incubação foi realizada. O líquido contendo os conteúdos da amostra que não foram ligados às partículas magnéticas pode então ser removido. O procedimento de remoção usado depende do tipo de recipiente onde a incubação foi realizada. E-tapas adequadas incluem remoção do líquido através do uso de pipeta ou aspiração.

No caso da fase sólida ser um filtro (tal como um filtro compreendendo fibras de quartzo ou vidro) a mistura da etapa (c) é de preferência passada pelo filtro. Separação da fase liquida da fase sólida é então realizada através de puxamento gravitacional, através da aplicação de pressão ou através da aplicação de sucção. A fase sólida com DNA ou RNA ligado pode ser então lavada. Esta etapa é opcional, dependendo da natureza e da quantidade de material desejado na amostra biológica bem como da pureza desejada do ácido nu-cléico isolado. Se uma etapa de lavagem for desejada, é preferido que a fase sólida seja lavada pelo menos uma vez, por exemplo, com uma mistura de 1-90% em volume por volume de um álcool, tal como álcool isopropílico ou etanol. Exemplos de soluções de lavagem são o "Tampão de Remoção de Inibidor" e o "Tampão de Lavagem" descritos no Exemplo 2(A). Em geral, uma solução de lavagem é usada, a qual não faz com que o(s) ácido(s) nu-cléico(s) seja(m) liberados da superfície da fase sólida, mas que retira com lavagem os contaminantes indesejados o máximo possível. Essa etapa de lavagem de preferência acontece através de incubação do material com o(s) ácido(s) nucléico(s) ligado(s) com a solução de lavagem. A fase sólida é de preferência ressuspensa durante esta etapa. No caso da fase sólida ser um filtro, é preferido que a solução de lavagem seja passada pelo filtro. A solução de lavagem contaminada é de preferência removida um pouco antes na etapa descrita acima para ligação dos ácidos nucléicos. É ainda mais preferido realizar duas etapas de lavagem consecutivas, com o que a primeira etapa de lavagem é realizada usando um tampão de remoção de inibidor e a segunda etapa de lavagem é realizada usando um tampão de lavagem. Um tampão de remoção de inibidor é caracterizado por conter um agente cao-trópico. Lavagem com o tampão de remoção de inibidor remove substâncias tóxicas ou inibidores que podem interferir com reações enzimáticas tal como, por exemplo, reações realizadas pela enzima de restrição ou polimerases. Lavagem com tampão de lavagem remove agente caotrópico residual dos ácidos nucléicos ligados. Após a última etapa de lavagem, o material pode ser seco rapidamente a vácuo, ou o fluido pode ser deixado para evaporar. Uma etapa de pré-tratamento usando acetona pode ser também realizada.

Em seguida, as condições podem ser revertidas, por exemplo, a concentração de sal é diminuída para eluir o DNA ou RNA ligado ao material. Tampões de eluição são conhecidos da DE 37 24 442 e Jakobi, R., e ou- tros, Anal. Biochem. 175 (1988) 196-201. Tampões de eluição com um teor de sal baixo são em particular tampões com um teor de menos do que 0,2M. De preferência, o tampão de eluição contém a substância Tris para propósitos de tamponamento, É muito preferido que o tampão de eluição seja uma solução aquosa contendo um sal de Tris, com o que a concentração do sal de Tris é 50 mM. Mais preferida é uma solução aquosa contendo um sal de Tris, com o que a concentração do sal de Tris é 50 mM e o pH está entre 6,5 e 8,5. Ainda mais preferido é um pH de 7,5. Também preferido, o tampão de eluição é água desmineralizada. A solução contendo DNA ou RNA purificado pode ser agora usada para outras reações. Opcionalmente, o(s) ácido(s) nucléico(s) pode(m) ser precipitado(s) da solução usando, por exemplo, eta-nol ou isopropanol. O precipitado pode ser também submetido a etapas de iavagem adicionais. Métodos deste tipo são bem-conhecidos dos versados na técnica e são descritos em detalhes em Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a Ed., CSHL Press, 2001. O(s) ácido(s) nucléico(s) alvo pode(m) ser detectado(s) e deter-minado(s). O método de purificação acima descrito é preferido, seguido por uma etapa de determinação ou detecção ou métodos de purificação seguidos por uma etapa de amplificação e determinação ou detecção. O ácido nucléico alvo ou ácidos nucléicos de interesse podem estar contidos em uma matriz de ácidos nucléicos não-alvo e podem ainda ser um componente em quantidade menor na dita mistura de ácidos nucléicos específicos. Métodos de detecção de DNA adequados são conhecidos do versado na técnica e são descritos em livros padrão como Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a Ed,, CSHL Press, 2001; e Ausubel e outros, Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley and Sons, NY, 1987.

Podem ainda haver etapas de purificação adicionais antes da etapa de detecção de DNA ser realizada como, por exemplo, uma etapa de precipitação. Os métodos de detecção podem incluir, mas não estão limitados à ligação ou intercalação de corantes específicos tal como brometo de etídio que intercala no DNA de filamento duplo e muda sua fluorescência em seguida. O DNA purificado pode ser também separado através de métodos eletroforéticos, opcionalmente após uma digestão de restrição e visualizado em seguida. Existem também ensaios baseados em sonda que exploram a hibridização de oligonucleotídeo para seqüências específicas e detecção subseqüente do híbrido. É também possível seqüenciar o DNA após etapas adicionais conhecidas do versado na técnica. Outros métodos aplicam uma diversidade de seqüências de DNA a um chip de silício ao qual sondas específicas são ligadas e produzem um sinal quando uma sequência complementar se liga. A invenção também compreende a mistura de componentes não-proteináceos e proteináceos compreendendo ácidos nucléicos com o que os ácidos nucléicos compreendem DNA ou RNA ou ambos. A invenção também compreende amostras biológicas, a partir das quais ácidos nucléicos são purificados, compreendendo vírus ou células bacterianas, bem como células isoladas de organismos multicelulares tal como, por exemplo, células humanas e animais tal como leucócitos e compostos químicos moleculares inferiores e superiores imunologicamente ativos tal como haptenos, antígenos, anticorpos e ácidos nucléicos, plasma sanguíneo, fluido cerebral, esputo, fezes, espécimes de biópsia, medula-óssea, enxágües orais, soro sangüíneo, tecidos, urina ou suas misturas. A presente invenção também compreende amostras biológicas tal como um fluido de um corpo de humano ou animal; de preferência a amostra biológica é sangue integral, plasma sangüíneo, soro sangüíneo ou urina. A amostra de sangue integral é de preferência sangue de EDTA, sangue de heparina ou citrato. O plasma sangüíneo é de preferência EDTA, plasma de sangue de heparina ou citrato. Em uma modalidade da invenção, a amostra biológica compreende células bacterianas, células eucariôticas, vírus ou suas misturas. É também preferido que a mistura de ácidos nucléicos e material proteináceo compreenda ácido desoxirribonucléico (DNA) ou ácido ribonu-cléico (RNA) ou ambos, de preferência o DNA ou RNA ou ambos é derivado de um vírus ou um (pelo menos um) microorganismo. O vírus pode ser vírus da hepatite A (HAV), vírus da hepatite B (HBV), vírus da hepatite C (HCV), o vírus da imunodeficiência humana (HIV), o vírus papiloma humano (HPV) ou parvovírus B19. É também preferido que um componente de ácido nucléico alvo e outros ácidos nucléicos sejam purificados essencialmente conforme acima descrito. Então o componente do ácido nucléico alvo é ainda manipulado e detectado, isto é, ele é amplificado com a reação de cadeia de polimerase que especificamente amplifica as seqüências alvo para quantidades detectá-veis. Outras reações de amplificação possíveis são a Reação de Cadeia li-gase (LCR, Wu, D.Y. e Wallace, R.B., Genomics 4 (1989) 560-569, e Ba-rany, F. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88 (1991) 189-193); Reação de Cadeia de Ligase de Polimerase (Barany, F., PCR Methods andAppIic. 1 (1991) 5-16; GAP-LCR (WO 90/01069); Repair Chain Reaction (EP 0 439 182), 3SR (Kwoh, D.Y. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86 (1989) 1173-1177; Gua-telli, J.C. e outros, Proc. Nati. Acad. Sei. USA 87 (1990) 1874-1878; WO 92/08800) e NASBA (US 5.130.238). Ainda há amplificação de deslocamento de filamento (SDA), amplificação mediada por transcrição (TMA) e amplificação Q-beta (para uma revisão vide, por exemplo, Whelen, A.C. e Persing, D.H., Annu. Rev. Microbiol. 50 (1996) 349-373; Abramson, R.D. e Myers, T.W., Curr. Opin. Biotechnol. 4 (1993) 41-47).

Particularmente preferido é o método de detecção TaqMan® descrito no WO 92/02638 e patentes U.S. correspondentes US 5.210.015; US 5.804.375; US 5.487.972. Esse método explora a atividade de exonucle-ase de uma polimerase para gerar um sinal. Em detalhes, o componente de ácido nucléico alvo é detectado através de um processo compreendendo contato da amostra com um oligonucleotideo contendo de uma sequência complementar a uma região do componente de ácido nucléico alvo e um oligonucleotideo rotulado contendo de uma seqüência complementar a uma segunda região do mesmo filamento da seqüência de componente do ácido nucléico alvo, mas não incluindo a seqüência de ácido nucléico definida pelo primeiro oligonucleotideo, para criar uma mistura de dúplexes durante condições de hibridização, onde os dúplexes compreendem o ácido nucléico alvo anelado ao primeiro oligonucleotideo e ao oligonucleotideo rotulado de modo que a extremidade 3' do primeiro oligonucleotídeo está adjacente à extremidade 5' do oligonucleotídeo rotulado. Então esta mistura é tratada com uma polimerase de ácido nucléico dependente de molde tendo uma atividade de nuclease 5' a 3' sob condições suficientes para permitir a atividade de nucle-ase 5' a 3' da polimerase para clivar o olíogonucleotídeo anelado, rotulado e liberar os fragmentos rotulados. O sinal gerado pela hidrólise do oligonucleo-tídeo rotulado é detectado e/ou medido. A tecnologia TaqMan® elimina a necessidade de um complexo de reação ligado de fase sólida ser formado e tornado detectável. Em termos mais gerais, um procedimento para a purificação de um componente de ácido nucléico alvo seguido pela etapa de detecção é descrito, onde a reação de amplificação e/ou detecção é uma fase de solução homogênea.

Os exemplos, referências e figuras que seguem são providos para auxiliar na compreensão da presente invenção, o verdadeiro escopo é descrito nas reivindicações apensas. É compreendido que modificações podem ser feitas nos procedimentos conforme descrito sem se afastar do espírito da invenção.

Descrição das Figuras Figura 1 - Atividade de Proteinase K a t=0 min em relação a concentrações variáveis de tiocianato de guanidínio (valores de 0 minuto). O eixo x indica a concentração molar de tiocianato de guanidínio, o eixo y indica a atividade de Proteinase K em [%].

Figura 2 - Atividade de Proteinase K a t=15 min em relação a concentrações variáveis de tiocianato de guanidínio (valores de 15 minutos). O eixo x indica a concentração molar de tiocianato de guanidínio, o eixo y indica a atividade de Proteinase K em [%].

Figura 3 - Rendimento de DNA em pg por ml de sangue, de a-cordo com o Exemplo 2 e Tabela 3. O eixo x indica o respectivo experimento, o eixo y indica o rendimento do DNA em pg por ml de sangue. Também indicados são os desvios padrão.

Figura 4 - Rendimento de DNA em pg por ml de sangue, de a-cordo com o Exemplo 3 e Tabela 5. O eixo x indica o respectivo experimen- to, o eixo y indica o rendimento do DNA em pg por ml de sangue. Também indicados são os desvios padrão.

Figura 5 - Rendimento de DNA em pg por ml de sangue, de a-cordo com o Exemplo 4 e Tabela 7. O eixo x indica o respectivo experimento, o eixo y indica o rendimento do DNA em pg por ml de sangue. Também indicados são os desvios padrão.

Exemplo 1 (A) Incubação de Proteinase K na presença de um agente caotrópico 10 pl de 20 mg/ml de uma solução de estoque de Proteinase K (Roche Diagnostics GmbH, Mannheimm, catálogo N° 745723; 90 mg dissolvidos em 4,5 mi de água) foram misturados com um tampão caotrópico contendo 50 mM de Tris-HCI pH 6,0, DTT 1%, Triton-X100 20% e tiocianato de guanidínio x M; x=0,1, 2, 3, 4, 5, 6). Diretamente após mistura, a atividade da Proteinase K foi medida em uma primeira alíquota {10 pl) da mistura u-sando o ensaio descrito abaixo (valor de atividade 0 minuto). 15 minutos a-pós mistura, a atividade da Proteinase K foi medida em uma segunda alíquota (10 pl) da mistura usando o ensaio descrito abaixo (valor de atividade de 15 minutos).

(B) Ensaio para determinar a atividade de Proteinase K 10 μΙ de Proteinase K em tampão caotrópico (vide acima, (A)) foram misturados com tampão de ensaio, isto quer dizer, 980 μΙ de Trietano-lamína 0,2M, 0,05% (peso por volume) PEG 6000, cloreto de cálcio 0,1M e 10 pl de uma solução de substrato 200 mM. O substrato era Suc-Ala-Ala-Ala-p-Nítroanilída. O tampão de ensaio foi provido em um cadinho. Imediatamente após mistura, o cadinho foi posto em um Fotômetro. As medições (absorção) foram feitas a cada 15 minutos a 25° C. A atividade de Proteinase K no tampão de ensaio foi calculada a partir da cinética conforme indicado por uma mudança na absorção a 405 nm, A Tabela 1 lista os valores de 0 minuto da atividade de Proteinase K na presença de tiocianato de guanidínio nas concentrações diferentes dadas em (A). A Tabela 2 lista os valores de 15 minutos da atividade de Proteinase K na presença de tiocianato de guanidínio nas concentrações dife- rentes dadas em (A) bem como o valor de controle (nenhum agente caotró-pico presente). Os valores são expressos em relação ao valor de atividade de 0 minuto de Proteinase K no tampão de controle sem agente caotrópico (vide (A)), correspondendo a 0,5 U/ml; este valor foi ajustado como 100%. Os dados da Tabela 1 e Tabela 2 são graficamente representados na Figura 1 e Figura 2.

Exemplo 2 (A) Reaaentes a) Solução estoque de Proteinase K: Proteinase K recombinante, grau PCR, 50 U/ml b) Tampão de Use: tiocianato de guanidina 4M, 50 mM de Tris- HCI, Triton-X100 20%, pH 6,0 c) Tampão de Ligação: tiocianato de guanidina 4M, 50 mM de Tris-HCI, Triton-X100 20%, pH 6,0 d) Tampão de Remoção de Inibidor: cloridrato de guanidínio 5M, tris-HCI 20 mM, etanol 38%, pH 6,6 e) Tampão de Lavagem: NaCI 20 mM, Tris-HCI 2 mM, etanol 80%, pH 7,5 f) Tampão de Eluição: Tris-HCI 50 mM, pH 8,2 g) Etanol (100%) Adicionalmente necessário: Colunas giratórias comercialmente disponíveis contendo uma membrana de sílica, por exemplo, NucleoSpin Blood L, distribuídas pela Machery & Nagel.

(BI Experimento 1: procedimento de uma etapa sem tratamento de Proteina-se K 1. pipetar 1.000 pl de sangue EDTA em um tubo Falcon de 15 ml 2. adicionar 1.000 μΙ de Tampão de Lise, vortexar suavemente 3. incubar por 15 minutos à temperatura ambiente em um misturador de rolo, agitar 4. pôr uma coluna giratória em um tubo Falcon novo 5. transferir a mistura das etapas 1-2 (cerca de 2.000 μΙ) para a coluna giratória 6. centifugar por 3 minutos a 1.900x x g 7. adicionar 1.000 μΙ de Tampão de Remoção de Inibidor 8. centrifugar por 2 minutos a 4.500 x g 9. adicionar 2.000 μΙ de Tampão de Lavagem 10. centrifugar por 10 minutos a 4.500 x g 11. descartar o fluxo e pôr a coluna de filtro em um tubo Falcon novo 12. eluir com 300 μΙ de Tampão de Eluição preaquecido (70° C) 13. incubar por 5 minutos à temperatura ambiente 14. centrifugar por 2 minutos a 4.500 x g 15. medição do OD do eluato a 260,280 e 320 nm (C) Experimento 2: procedimento de uma etapa incluindo tratamento de Pro-teinase K 1. pipetar 125 μΙ de Proteinase K em um tubo Falcon de 15 ml 2. adicionar 1.000 μΙ de sangue EDTA, vortexar suavemente 3. adicionar 1.000 μΙ de Tampão de Lise, vortexar suavemente 4. incubar e agitar a 56° C por 15 minutos (por exemplo, usando um termomisturador), agitar 5. pôr uma coluna giratória em um tubo Falcon novo 6. transferir a mistura das etapas 1-3 (cerca de 2.125 μΙ) para a coluna giratória 7. centifugar por 3 minutos a 1.900x x g 8. adicionar 1.000 μΙ de Tampão de Remoção de Inibidor 9. centrifugar por 2 minutos a 4.500 x g 10. adicionar 2.000 μΙ de Tampão de Lavagem 11. centrifugar por 10 minutos a 4.500 x g 12. descartar o fluxo e pôr a coluna de filtro em um tubo Falcon novo 13. eluir com 300 μΙ de Tampão de Eluição preaquecido (70° C) 14. incubar por 5 minutos à temperatura ambiente 15. centrifugar por 2 minutos a 4.500 x g 16. medição do OD do eluato a 260,280 e 320 nm (Dl Experimento 3: procedimento de duas etapas incluindo etanol 1. pipetar 125 μΙ de Proteinase K em um tubo Falcon de 15 ml 2. adicionar 1.000 μΙ de sangue EDTA, vortexar suavemente 3. adicionar 1.000 μΙ de Tampão de Lise, vortexar suavemente 4. incubar e agitar a 56° C por 15 minutos (por exemplo, usando um termomisturador), agitar 5. adicionar 1.000 μΙ de Etanol, vortexar suavemente 6. pôr uma coluna giratória em um tubo Falcon novo 7. transferir a mistura das etapas 1-5 (cerca de 3.125 μΙ) para a coluna giratória 8. centifugar por 3 minutos a 1.900x x g 9. adicionar 1.000 μΙ de Tampão de Remoção de Inibidor 10. centrifugar por 2 minutos a 4.500 x g 11. adicionar 2.000 μΙ de Tampão de Lavagem 12. centrifugar por 10 minutos a 4.500 x g 13. descartar o fluxo e pôr a coluna de filtro em um tubo Falcon novo 14. eluir com 300 μΙ de Tampão de Eluição preaquecido (70° C) 15. incubar por 5 minutos à temperatura ambiente 16. centrifugar por 2 minutos a 4.500 x g 17. medição do OD do eluato a 260,280 e 320 nm (E) Experimento 4: procedimento de duas etapas incluindo Tampão de Ligação 1. pipetar 125 μΙ de Proteinase K em um tubo Falcon de 15 ml 2. adicionar 1.000 μΙ de sangue EDTA, vortexar suavemente 3. adicionar 1.000 μΙ de Tampão de Lise, vortexar suavemente 4. incubar e agitar a 56° C por 15 minutos (por exemplo, usando um termomisturador), agitar 5. adicionar 1.000 μΙ de tampão de ligação, vortexar suavemente 6. pôr uma coluna giratória em um tubo Falcon novo 7. transferir a mistura das etapas 1-5 (cerca de 3.125 μΙ) para a coluna giratória 8. centifugar por 3 minutos a 1.900x x g 9. adicionar 1.000 μΙ de Tampão de Remoção de Inibidor 10. centrifugar por 2 minutos a 4.500 x g 11. adicionar 2.000 μΙ de Tampão de Lavagem 12. centrifugar por 10 minutos a 4.500 x g 13. descartar o fluxo e pôr a coluna de filtro em um tubo Falcon novo 14. eluir com 300 μΙ de Tampão de Eluição preaquecido (70° C) 15. incubar por 5 minutos à temperatura ambiente 16. centrifugar por 2 minutos a 4.500 x g 17. medição do OD do eluato a 260,280 e 320 nm (a) e (b) indicam dados de experimentos em réplica (vide Tabela 3) Com relação à pureza do DNA, uma razão de 260 nm/280 nm (incluindo correção de 320 nm) de 1,8 ± 0,1 é considerada como sendo aceitável. Os dados mostram que o método de acordo com a invenção, isto quer dizer, o método do Experimento 4 produz igualmente puro (se não um DNA de pureza maior) comparado com o método do Experimento 3.

Exemplo 3 (A) Reaoentes a) Tampão de Lise/Tampão de Ligação, tiocianato de guanidínio caotrópico (7M [tampão de lise]/4M [tampão de ligação], Tris-HCI 50 mM, Triton-X100 20%, pH 6,0) b) Tampão de Remoção de Inibidor (HCI de guanidínio 5M, Tris-HCI 20 mM, etanol 38%, pH 6,6) c) Tampão de lavagem (NaCI 20mM, Tris-HCI 2mM, etanol 80%, pH 7,5) d) Tampão de Eluição (Tris 50mM, pH 8,1) e) Etanol (absoluto) Adicionalmente necessário: Colunas de filtro de fibra de vidro (com membrana de sílica, por exemplo, NucleoSpin Blood L, comercialmente disponível da Macherey-Nagel) (B) Experimento 5. procedimento de uma etapa: Tampão de Lise: 7M. sem nenhum tampão de ligação 1.000 μΙ de sangue EDTA foram pipetados em um tubo Falcon de 15 ml, 1.000 μΙ de Tampão de Use (7M) foram adicionados e o tubo foi vortexado. A mistura foi incubada por 15 minutos a 56° C em um termomistu-rador. Um novo tubo Falcon com uma coluna de filtro de fibra de vidro foi provido e a preparação da amostra integral (cerca de 2.000 μΙ; concentração caotrópica 3,5M) foi transferida para a coluna de filtro. Após centrifugação a 1.900 x g por 3 minutos, 1.000 μΙ de Tampão de Remoção de Inibidor foram transferidos para a coluna, seguido por uma outra etapa de centrifugação a 4.200 g x g por 2 minutos. Após isso, 2.000 μΙ de Tampão de Lavagem foram transferidos para a coluna, seguido por centrifugação a 4.200 x g por 10 minutos. O fluxo foi descartado e a coluna de filtro foi posta em um novo tubo Falcon. Ácidos nucléicos ligados foram eluídos usando 500 μΙ de Tampão de Eluição preaquecido (70° C). O Tampão de Eluição foi transferido para a coluna e incubado por 5 minutos à temperatura ambiente. Após centrifugação a 4.200 x g por 2 minutos, o fluxo foi analisado através de medição da densidade óptica a 230,260,280 e 320 nm.

(C) Experimento 6, procedimento de duas etapas: Tampão de Lise: 7M, Tampão de Ligação: 4M 1.000 μΙ de sangue EDTA foram pipetados em um tubo Falcon de 15 ml, 1.000 μΙ de Tampão de Lise (7M) foram adicionados e o tubo foi vortexado. A mistura foi incubada por 15 minutos a 56° C em um termomistu-rador. 500 μ! de Tampão de Ligação (4M) foram adicionados misturados a-través de vórtex. Um novo tubo Falcon com uma coluna de filtro de fibra de vidro foi provido e a preparação da amostra integral (cerca de 2.500 μΙ; concentração caotrópica 4,5M) foi transferida para a coluna de filtro. Após centrifugação a 1.900 x g por 3 minutos, 1.000 μΙ de Tampão de Remoção de Inibidor foram transferidos para a coluna, seguido por uma outra etapa de centrifugação a 4.200 x g por 2 minutos. Após isso, 2.000 μΙ de Tampão de La- vagem foram transferidos para a coluna, seguido por centrifugação a 4.200 x g por 10 minutos. O fluxo foi descartado e a coluna de filtro foi posta em um novo tubo Falcon. Ácidos nucléicos ligados foram eluídos usando 500 pl de Tampão de Eluição preaquecido (70° C). O Tampão de Eluição foi transferido para a coluna e incubado por 5 minutos à temperatura ambiente. Após centrifugação a 4.200 x g por 2 minutos, o fluxo foi analisado através de medição da densidade óptica a 230,260,280 e 320 nm.

Exemplo 4 (A) Reaaentes a) Tampão de Lise/Tampão de Ligação, tiocianato de guanidínio caotrópico (7M [tampão de lise]/5M [tampão de ligação], Tris-HCI 50 mM, Triton-X100 20%, pH 6,0) b) Tampão de Remoção de Inibidor (HCI de guanidínio 5M, Tris-HCI 20 mM, etanol 38%, pH 6,6) c) Tampão de Lavagem (NaCI 20mM, Tris-HCI 2mM, etanol 80%, pH 7,5) d) Tampão de Eluição (Tris 50mM, pH 8,1) e) Etanol (absoluto) Adicionalmente necessário: Colunas de filtro de fibra de vidro (com membrana de sílica, por exemplo, NucleoSpin Blood L, comercialmente disponível da Macherey-Nagel) (B) Experimento 7. procedimento de uma etapa: Tampão de Lise: 7M, sem nenhum tampão de ligação 1.000 μΙ de sangue EDTA foram pipetados em um tubo Falcon de 15 ml, 1,000 μΙ de Tampão de Lise (7M) foram adicionados e o tubo foi vortexado. A mistura foi incubada por 15 minutos a 56° C em um termomistu-rador. Um novo tubo Falcon com uma coluna de filtro de fibra de vidro foi provido e a preparação da amostra integral (cerca de 2.000 μΙ; concentração caotrópica 3,5M) foi transferida para a coluna de filtro. Após centrifugação a 1.900 x g por 3 minutos, 1.000 μΙ de Tampão de Remoção de Inibidor foram transferidos para a coluna, seguido por uma outra etapa de centrifugação a 4.200 x g por 2 minutos. Após isso, 2.000 μΙ de Tampão de Lavagem foram transferidos para a coluna, seguido por centrifugação a 4.200 x g por 10 minutos. O fluxo foi descartado e a coluna de filtro foi posta em um novo tubo Falcon. Ácidos nucléicos ligados foram eluídos usando 500 μΙ de Tampão de Eluição preaquecido (70° C). O Tampão de Eluição foi transferido para a coluna e incubado por 5 minutos à temperatura ambiente. Após centrifugação a 4.200 x g por 2 minutos, o fluxo foi analisado através de medição da densidade óptica a 230,260,280 e 320 nm.

(Cl Experimento 8. procedimento de duas etapas: Tampão de Lise: 5M. Tampão de Ligação: 4M 1.000 μΙ de sangue EDTA foram pipetados em um tubo Falcon de 15 ml, 1.000 μΙ de Tampão de Lise (5M) foram adicionados e o tubo foi vortexado. A mistura foi incubada por 15 minutos a 56° C em um termomistu-rador. 500 μΙ de Tampão de Ligação (4M) foram adicionados misturados a-través de vórtex. Um novo tubo Falcon com uma coluna de filtro de fibra de vidro foi provido e a preparação da amostra integral (cerca de 2.500 μΙ; concentração caotrópica 3,5M) foi transferida para a coluna de filtro. Após centrifugação a 1.900 x g por 3 minutos, 1.000 μΙ de Tampão de Remoção de Ini- bidor foram transferidos para a coluna, seguido por uma outra etapa de cen-trifugação a 4.200 x g por 2 minutos. Após isso, 2.000 pl de Tampão de Lavagem foram transferidos para a coluna, seguido por centrifugação a 4.200 x g por 10 minutos. O fluxo foi descartado e a coluna de filtro foi posta em um novo tubo Falcon. Ácidos nucléicos ligados foram eluídos usando 500 pl de Tampão de Eluição preaquecido (70° C). O Tampão de Eluição foi transferido para a coluna e incubado por 5 minutos à temperatura ambiente. Após centrifugação a 4.200 x g por 2 minutos, o fluxo foi analisado através de medição da densidade óptica a 230,260,280 e 320 nm.

LISTA DE REFERÊNCIAS

Claims (17)

1. Método para adsorção de um ácido nucléico a partir de uma amostra biológica a uma fase sólida, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de (a) provisão de um tampão de lise aquoso que contém um agente caotrópico; (b) mistura do tampão de lise com a amostra biológica, com o que a concentração do agente caotrópico na mistura está entre 1M e 4M e incubação da mistura; (c) dissolução de uma quantidade adicional de agente caotrópico em ou adição de uma solução aquosa contendo agente caotrópico adicional à mistura da etapa (b), desse modo aumentando a concentração do agente caotrópico na mistura em mais de 0,5M; (d) contato da mistura da etapa <c) com a fase sólida, desse modo adsorvendo o ácido nucléico da mistura para a fase sólida, em que o tampão de lise da etapa (a) contém um detergente.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente caotrópico é selecionado do grupo consistindo em clo-ridrato de guanidínio, tiocianato de guanidínio, isotiocianato de guanidínio, um iodeto alcalino e um perclorato alcalino.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o tampão de lise da etapa (a) contém uma enzima com atividade proteolítica.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a enzima com atividade proteolítica é selecionada do grupo consistindo em uma Caspa se, Proteínase K, Pronase E, Protease de Bacillus sp. (Esperase) e Subtilisina.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o detergente no tampão de lise da etapa (a) é selecionado do grupo consistindo em Dodecíl sulfato de sódio, Dodecil sulfato de lítio, Brometo de cetitrimetílamônio, Ácido desoxicóiieo, Lauril sar-cosinato de sódio, Triton X-100, Tween 20, Octil beta-D-glicosídeo, Nonidet Ρ40, CHAPS ou Sulfobetaína 14.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a fase sólida compreende um substrato mineral poroso ou não-poroso selecionado do grupo consistindo em sílica-gel, fibras de vidro, fibras de quartzo e zeólitos.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a fase sólida compreende partículas de vidro magnéticas.

8. Método para isolar um ácido nucléico de uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de (a) provisão de um tampão de lise aquoso que contém um agente caotrópico; (b) mistura do tampão de lise com a amostra biológica, com o que a concentração do agente caotrópico na mistura está entre 1M e 4M e incubação das misturas; (c) dissolução de uma quantidade adicional de agente caotrópico na ou adição de uma solução aquosa contendo agente caotrópico adicional à mistura da etapa (b), desse modo aumentando a concentração do agente caotrópico na mistura em mais de 0,5M; (d) provisão de uma fase sólida e contato da mistura da etapa (c) com a fase sólida, desse modo adsorvendo o ácido nucléico da mistura para a fase sólida; (e) separação da fase sólida da fase líquida; (f) opcionalmente lavagem da fase sólida da etapa (e) com um tampão de lavagem; (g) eluição do ácido nucléico da fase sólida, desse modo isolando o ácido nucléico; (h) opcionalmente precipitação do ácido nucléico da etapa (g) a partir do eluato e isolamento do ácido nucléico precipitado, em que o tampão de lise da etapa (a) contém uma enzima com atividade proteolítica e um detergente.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o agente caotrópico é selecionado do grupo consistindo em clo-ridrato de guanidínio, tiocianato de guanidínio, isotiocianato de guanidínio, um iodeto alcalino e um perclorato alcalino.

10. Método de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que a enzima com atividade proteolítica é selecionada do grupo consistindo em uma Caspase, Proteinase K, Pronase E, Protease de Bacil-lus sp. (Esperase) e Subtilisina e o detergente é selecionado do grupo consistindo em Dodecil sulfato de sódio, Dodecil sulfato de lítio, Brometo de ce-tiltrimetilamônio, Ácido desoxicólico, Lauril sarcosinato de sódio, Triton X-100, Tween 20, Octil beta-D-glicosídeo, Nonidet P40, CHAPS e Sulfobetaína 14.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a mistura da etapa (b) contém a amostra biológica, tiocianato de guanidínio em uma concentração de cerca de 2M, sal de Tris em uma concentração de cerca de 25 mM, Triton-X100 em uma concentração de cerca de 10% em volume por volume, e Proteinase K, com o que a atividade proteolítica da Proteinase K na mistura é cerca de 3 U/ml, e com o que o pH da mistura é cerca de 6.

12. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a mistura da etapa (b) contém a amostra biológica, cloridrato de guanidínio em uma concentração de cerca de 2,7M, uréia em uma concentração de cerca de 5 mM, sal de Tris em uma concentração de cerca de 5 mM, Triton-X100 em uma concentração de cerca de 9% em volume por volume e Proteinase K, com o que a atividade proteolítica da Proteinase K na mistura é cerca de 3 U/ml e com o que o pH da mistura está entre 4,4 e 6,5.

13. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a mistura da etapa (b) contém a amostra biológica, cloridrato de guanidínio em uma concentração de cerca de 2,4M, uréia em uma concentração de cerca de 1,6 mM, sal de Tris em uma concentração de cerca de 85 mM, EDTA em uma concentração de cerca de 88 mM, NaCI em uma concentração de cerca de 8 mM, Triton-X100 em uma concentração de cer- ca de 9% em volume por volume e Proteinase K, com o que a atividade pro-teolítica da Proteinase K na mistura é cerca de 3 U/ml e com o que o pH da mistura está entre 4,4 e 6,5.

14. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a mistura da etapa (b) é incubada por de 10 minutos a 30 minutos a uma temperatura entre cerca de 20° C e 75° C, com o que a mistura é agitada.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 14, caracterizado pelo fato de que a fase sólida compreende um substrato mineral poroso ou não-poroso selecionado do grupo consistindo em sílica-gel, fibras de vidro, fibras de quartzo e zeólitos.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 14, caracterizado pelo fato de que a fase sólida compreende partículas de vidro magnéticas.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 16, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica compreende células bacterianas, células eucarióticas, vírus ou suas misturas.