KR20060042961A

KR20060042961A - 핵산의 고체상으로의 흡착

Info

Publication number: KR20060042961A
Application number: KR1020050013430A
Authority: KR
Inventors: 랄프 칠렌스키; 클라우스 가이슬러; 토마스 발터
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2004-02-20
Filing date: 2005-02-18
Publication date: 2006-05-15
Also published as: AU2005200670B2; CA2497493C; CA2497493A1; HK1084122A1; DE602005001331T2; DK1566437T3; ES2289611T3; EP1566437A1; DE602005001331D1; ATE364694T1; CN1680421A; JP2005230012A; AU2005200670A1; BRPI0500474B1; SG114738A1; KR100692941B1; EP1566437B1; BRPI0500474A; MXPA05001815A; PL1566437T3

Abstract

본 발명은 2-단계 과정을 이용해 핵산을 고체상으로 흡착, 즉 비-공유 결합시키는 방법에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 생물 표본으로부터 핵산을 단리하는 방법에 관한 것이다. 과정의 첫번째 단계에서, 분해는 무질서유발제를 함유하는 수성 분해 완충용액과 생물 표본과의 혼합 및 상기 혼합물의 인큐베이션에 의해 수행되며 ; 두번째 단계에서, 상기 혼합물 내 무질서유발제의 농도는 증가되며 상기 혼합물은 고체상과 접촉하여, 액체상에 있는 핵산이 고체상으로 흡착된다.

Description

핵산의 고체상으로의 흡착 {ADSORPTION OF NUCLEIC ACIDS TO A SOLID PHASE}

도 1 구아니디늄 티오시아네이트의 농도를 다양하게 하면서 시간 = 0 분에서 프로테이나제 K 의 활성 (0 분 수치). x 축은 구아니디늄 티오시아네이트의 몰 농도를 나타내며, y 축은 프로테이나제 K 의 활성을 [%] 로 나타낸 것이다.

도 2 구아니디늄 티오시아네이트의 농도를 다양하게 하면서 시간 = 15 분에서 프로테이나제 K 의 활성 (15 분 수치). x 축은 구아니디늄 티오시아네이트의 몰 농도를 나타내며, y 축은 프로테이나제 K 의 활성을 [%] 로 나타낸 것이다.

도 3 실시예 2 및 표 3 에 있어서, 혈액 ㎖ 당 ㎍ 으로 나타낸 DNA 의 수율. x 축은 각각의 실험을 나타내며, y 축은 혈액 ㎖ 당 ㎍ 으로 DNA 수율을 나타낸다. 또한 표준편차도 나타낸다.

도 4 실시예 3 및 표 5 에 있어서, 혈액 ㎖ 당 ㎍ 으로 나타낸 DNA 의 수율. x 축은 각각의 실험을 나타내며, y 축은 혈액 ㎖ 당 ㎍ 으로 DNA 수율을 나타낸다. 또한 표준편차도 나타낸다.

도 5 실시예 4 및 표 7 에 있어서, 혈액 ㎖ 당 ㎍ 으로 나타낸 DNA 의 수율. x 축은 각각의 실험을 나타내며, y 축은 혈액 ㎖ 당 ㎍ 으로 DNA 수율을 나타낸다. 또한 표준편차도 나타낸다.

본 발명은 핵산을 고체상으로 흡착, 즉 비-공유 결합시키는 방법에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 생물 표본으로부터 핵산을 단리하는 방법에 관한 것이다.

많은 생물 물질, 특히 핵산은 그것들의 자연 환경으로부터 그것들을 단리하는 것에 특별한 어려움이 존재한다. 한편 그것들은 흔히 매우 작은 농도로 존재하며, 반면에 그것들은 흔히 예를 들어 세포 분해 후에 많은 다른 고체 및 용해된 물질로 존재하는 것이 발견된다. 이는 특히, 특정 핵산을 검출 또는 핵산의 특정 특성을 검출하도록 하는 생물특이적 분석에서 그것들을 단리하거나 측정하는 것을 어렵게 한다. 그러한 생물특이적 분석은 연구 및 개발에서 진단 및 생물분석의 분야에서 주요한 역할을 한다. 생물특이적 분석의 예는 혼성화 분석, 면역 분석 및 수용체-리간드 분석이다. 혼성화 분석은 핵산 분석물 예를 들어 RNA 및 DNA 의 분자적 검출을 위해 특이적인 염기-짝짓기를 이용한다. 따라서, 뉴클레오티드 18 - 20 의 길이를 가지는 올리고뉴클레오티드 프로브는 예를 들어, 인간 게놈에서 선택된 상보 서열의 특이적 인지를 가능하게 할 수 있다. 2 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머의 선택적 결합을 수반하는 다른 분석은 US 4,683,195 에 기술된 중합효소 연쇄반응 (PCR) 이다. 이 방법은 다수의 싸이클에서 데스옥시뉴클레오티드 삼인산의 존재 하 열안정성 중합효소에 의해 특정 핵산 부위를 검출가능한 수준으로 선택적으로 증폭할 수 있게 한다.

상기에 기술한 바와 같이, 핵산이 상기-언급한 분석 중 하나로 분석되거나 또는 다른 방법에 이용되기 전에, 그것들은 예를 들어 단백질성 및 비-단백질성 성분과 같은 다른 성분의 복잡한 혼합물을 함유하고 있는 생물 표본으로부터 단리 또는 정제되야만 한다. 흔히, 첫 단계에서, 관심 성분, 즉 핵산의 농축을 가능하게 하는 방법이 이용된다. 종종, 이것들은 박테리아 세포, 진균 세포, 바이러스 입자 또는 인간의 혈액 세포 또는 식물 세포와 같은 더 복잡한 개체의 세포내에 함유되어 있다. 관심 성분으로서의 핵산을 "표적 성분" 으로 부를 수도 있다.

상기 세포 또는 입자의 내용물을 방출시키기 위해, 그것들을 효소 또는 화학 물질로 처리하여 상기 개체의 세포벽 및 세포막을 용해, 분해 또는 변성시킬 수 있다. 상기 방법을 보통 분해라고 한다. 상기 분해된 물질을 함유하고 있는 생성 용액을 분해물이라고 한다. 흔히 분해 동안에 부딪히는 문제는, 표적 성분을 분해시키는 다른 효소, 예를 들어 핵산을 분해시키는 데스옥시리보뉴클레아제 또는 리보뉴클레아제가 분해 동안에 표적 성분과 접촉한다는 것이다. 상기 분해 효소는 또한 세포의 외부에 존재하거나 분해 전에 다른 세포의 구분 내에서 공간적으로 분리되어 있다가, 표적 성분과 접촉하게 될 수 있다. 상기 과정 동안에 방출되는 다른 성분은 예를 들어 세포에 독성이며, 인간 또는 동물 치료에 이용되려고 하는 생성물에 대해 문제를 유발할 수 있는 리포폴리사카라이드 패밀리에 속하는 내독소일 수 있다.

분해 단계에 뒤따르는 표본 제조의 다음 단계에서, 핵산은 더 농축될 수 있 다. 핵산은 보통 그것이 프로브-기재 분석에 이용되기 전에 복잡한 분해 혼합물로부터 추출된다. 핵산의 추출 방법은 여러 가지가 있다. 서열-의존성 또는 생물특이적 방법은 예를 들어, 친화도 크로마토그래피 또는 고정화된 프로브로의 혼성화를 포함한다. 서열-비의존성 또는 물리-화학적 방법은 예를 들어, 페놀-클로로포름으로 액체-액체 추출, 순수 에탄올 또는 이소프로판올로 침전, 여과지로 추출, 세틸-트리메틸-암모늄-브로마이드와 같은 미셀-형성제로 추출, 아크리딘 유도체와 같은 고정화된 삽입성 염료에 결합, 실리카 겔 또는 이원자 토양과 같은 기질에 흡착, 무질서유발 조건하에 자기 흡인성 유리 입자 (MGP) 또는 유기 실란 입자에 흡착하는 것을 포함한다. 다른 이유들 중에서 핵산은 변형되어서는 안되며, 자연 핵산이 결합될 수도 있기 때문에, 실리카 표면을 가진 물질과 같은 기질에 핵산을 직접 결합시키는 것이 바람직하다.

특히 추출 목적을 위해 중요한 것은 다른 표면이 가능하다 하더라도 핵산을 유리 표면에 흡착하는 것이다.

예를 들어 세포 분해 및/또는 미토콘드리아, 색소체, 핵 또는 다른 핵산-함유 세포 내 기관과 같은 세포 내 기관의 분해 방법에 의해 유리된 핵산을 미네랄 기질과 같은 고체상에 결합시키고, 결합된 핵산과 함께 상기 미네랄 기질을 세척하고, 상기 미네랄 기질로부터 상기 핵산을 유리시키는 방법에 의해 정제할 수 있다.

무질서유발염의 존재 시 유리 입자 또는 실리카 입자로의 핵산의 흡착은 당 분야에 공지되어 있으며 (Vogelstein, B., 및 Gillespie, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 615-619) 핵산에 대한 크로마토그래픽 정제 및 분리 방법에 대 한 기본을 제공한다. 고농도의 무질서유발염 예를 들어 요오드화나트륨, 과염소산나트륨 및 티오시안산구아니딘을 이용해 분해물로부터 RNA 및 DNA 를 단리 및 정제하는 방법도 당 분야에 공지되어 있다 (Boom, R. 등, J. Clin. Microbiol. 28 (1990) 495-503 ; Yamada, O. 등, J. Virol. Methods 27 (1990) 203-209). 과염소산나트륨의 존재 하 유리 분 상의 박테리아로부터의 플라스미드 DNA 의 정제는 [Marko, M.A. 등, Anal. Biochem. 121 (1982) 382-387] 에 기술되어 있다. DE 37 24 442 에, 아세트산을 이용해 파지 입자를 침전시키고 과염소산으로 파지 입자를 분해함으로써, 유리 섬유 필터 상의 단일-쇄 M13 파지 DNA 를 단리하는 것이 기술되어 있다. 유리 섬유 필터에 결합되어 있는 핵산을 세척한 다음 메탄올-함유 트리스/EDTA 완충용액으로 용출시킨다. 람다 파지로부터 DNA 를 정제하는 유사한 과정이 [Jakobi, R. 등, Anal. Biochem. 175 (1988) 196-201] 에 기술되어 있다. 상기 과정은 무질서유발염 용액 내에서 유리 표면으로의 핵산의 선택적 결합 및 아가로스, 단백질 또는 세포 잔류물과 같은 오염 물질로부터 핵산의 분리를 수반한다. 오염 물질로부터 유리 입자를 분리하기 위해, 입자를 원심분리하거나 플루이드를 유리 섬유 필터를 통해 인취한다. 그러나, 이는 상기 과정이 많은 양의 표본을 처리하는데 사용되지 못하도록 하는 제한적 단계이다.

염 및 에탄올의 첨가에 의한 침전 후에 핵산을 고정하기 위해 자기 입자를 이용하는 것은 더 유익하며 예를 들어 : [Alderton, R.P. 등, Anal. Biochem. 201 (1992) 166-169] 및 WO 91/00212 에 기술되어 있다. 이 과정에서, 핵산은 자기 입자를 따라 응집된다. 상기 응집 물질은 자기장을 적용하고 세척 단계를 수행 함으로써 원래의 용매로부터 분리된다. 1 회의 세척 단계 후, 핵산을 트리스 완충용액에 용해시킨다. 그러나, 상기 과정은 상기 침전이 핵산에 대해 선택적이지 않다는 점에서 단점을 가지고 있다. 오히려, 다양한 고체 및 용해된 물질이 응집되기도 한다. 결과적으로, 상기 과정은 존재할 수 있는 특이적효소 반응의 임의의 저해제의 상당량을 제거하는데 사용될 수 없다. 스트렙타비딘을 함유하는 층으로 덮여 있고, 다공성의 입상 유리 매트릭스 내에 자기 입자를 함유하고 있는 자기, 다공성 유리가 또한 시판되고 있다. 그것들이 바이오틴에 공유 결합하도록 복잡한 제조 단계에서 변형된다면, 상기 제품은 예를 들어 단백질 또는 핵산과 같은 생물 재료를 단리하는데 사용될 수 있다. 자기화 입상 흡착제는 자동 표본 제조에 매우 효율적이며 적합한 것으로 판명되었다. 초상자성뿐만 아니라 초준강자성 및 강자성 색소가 이 목적을 위해 사용된다. 가장 바람직한 MGP 는 WO 01/37291 에 기술된 것들이다.

고농도 염의 존재 하, 미네랄 기질과 같은 기질에 핵산을 흡착시키는 방법에 의한 이들의 정제는 다른 복잡한 혼합물에서도 적용된다. 그것을 위한 예가 분자생물학 분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, PCR, 제한 효소 분해, 결찰 반응 등과 같은 시험관-내 핵산의 합성을 수반하는 반응 혼합물을 포함하고 있다. 예를 들어, [Vogelstein, B. 및 Gillespie, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 615-619] 에, 요오드화나트륨의 존재 하 핵산을 아가로스 겔로부터 연마된 플린트 유리에 결합시키는 과정이 제안되어 있다. 고농도 염의 존재 하, 미네랄 기질과 같은 기질에 핵산을 흡착시키는 방법에 의한 이들의 정제의 다른 적용은 핵산으로 공정제할 수 있는 발열성 오염물질의 제거이다.

핵산이 무질서유발제 존재 하 미네랄 지지체에 결합하는 메카니즘은 완전히 밝혀지지 않았다. 핵산과 용매 사이의 상호작용은 핵산이 미네랄 지지체에 흡착하고 변성하는 것에 영향을 받는다고 가정된다. 고농도 무질서유발제 존재 하에서 상기 반응은 거의 정량적이다. 흡착된 핵산을 저이온력의 미네랄 지지체 완충용액에 적용함으로써 용출할 수 있다.

US 5,808,041 은 일부 생물 표본으로부터 약 50 염기 초과 길이를 가진 핵산을 단리하는 방법을 개시하고 있다. 약 2 M 초과의 농도에서 무질서유발 이온을 함유하고 있는 수성의 분해물을 생성하고 분해물로부터 핵산을 실리카 물질에 흡착시킨다 ("결합" 이라고도 함). 실리카 물질 및 무질서유발염을 포함하고 있는 슬러리 또는 수지를 생물학적 물질에 첨가하여 1-단계 분해 및 결합 과정을 일으킨다. 상기 문헌에 개시된 생물 표본의 분해 방법은 알칼리 히드록시드 및 SDS 를 이용한 박테리아의 분해, 2.8 M 구아니디늄의 존재 하에 파지를 인큐베이션하는 M13 또는 람다 파지의 분해, 및 2.8 M 구아니디늄의 존재 하에 조직을 인큐베이션하는 신선 또는 냉동 조직의 분해를 포함한다. 또한, N-라우릴-사르코신을 분해를 돕는 데 이용한다.

EP 0 389 063 및 EP 0 819 696 은 핵산을 함유하고 있는 액체상 물질과 무질서유발 물질 및 핵산-결합 고체상을 혼합하는 방법에 의해 핵산을 정제하는 방법을 개시하고 있다. 따라서, 상기 문헌에서 개시된 과정도 1-단계 분해 및 결합 과정을 나타내고 있다. 분해 및 결합 다음에, 핵산이 결합된 고체상을 액체상으 로부터 분리한다. 세척 단계 다음에, 핵산을 고체상으로부터 용출시킨다. 상기 문헌은 약 10 M 구아니디늄 티오시아네이트, 약 2% 트리톤-X100, 약 0.1 M 트리스염 및 약 50 μM EDTA 를 함유하는 분해 완충용액을 개시한다. 다른 분해 완충용액은 추가로 덱스트란 설페이트를 40 중량/부피% 함유하고 있다. 다른 분해 완충용액은 약 10 M 구아니디늄 티오시아네이트 및 약 50 μM EDTA 를 함유하고 있다. 약 3M 의 농도로 무질서유발 물질로서 요오드화칼륨 또는 요오드화나트륨, 또는 1 M 또는 8 M 요소와 함께 있는 요오드화칼륨 또는 요오드화나트륨을 함유하는 다른 분해 완충용액이 상기 문헌에 개시되어 있다. 생물 표본의 분해는, 생물 표본의 50 부피부를 분해 완충용액의 900 부피부 및 실리카 조립물 40 부피부와 혼합되는, 분해 완충용액과 표본의 인큐베이션으로 수행된다. 실리카 조립물을 이용하는 대안으로서, 실리카 필터 물질을 이용한 다른 과정이 기술되어 있다.

EP 0 658 164 는 크로마토그래픽 정제 방법에 의한 핵산의 크로마토그래픽 정제 방법을 기술하고 있다. 특히, 첫번째 분해 단계 및 두번째 결합 단계를 포함한 2-단계 과정이 기술되어 있다. 1 차 단계 (분해) 에서, 생물 표본을 무질서유발제와 혼합하며, 이 때 혼합물 내 무질서유발제의 농도는 약 2 M 내지 약 4 M 이다. 임의로, 혼합물은 추가로 페놀, 클로로포름 또는 에테르를 함유한다. 임의로, 혼합물은 추가로 세제를 함유한다. 단백질 분해효소를 첨가하고 혼합물을 인큐베이션한다. 두번째 단계 (결합) 에서, 알콜을 첨가하고 생성 혼합물을 핵산-결합 고체상과 접촉시킨다.

선행 기술에서 언급된 방법은 어느 정도의 단점을 가지고 있다. 따라서, 본 발명의 목적은 핵산을 함유하고 있는 생물 표본을 제조하고, 핵산을 제조물질로부터 고체상으로 흡착시키는 대체 방법을 제공하는 것이었다. 본 발명의 또다른 목적은, 알콜은 가연성 물질이며 따라서 알콜의 이용을 제한는 것이 요구되므로, 흡착 단계 동안에 알콜의 필요성을 극복하는 것이었다.

본 문헌에서 용어 "핵산" 은 하나 이상의 핵산을 의미하는 것으로 이해된다. 추가로, 용어 "핵산" 은 핵산의 혼합물을 지시할 수 있다. 용어 "고체상" 및 "기질" 은 수용액 내에서 실질적으로 불용성이고, 물질이 첨가될 때 고이온력의 수용액 내에서 핵산이 그 위에 흡착할 수 있는 물질을 의미한다. 이들의 예는 실리카, 유리, 석영, 제올라이트 또는 이것의 혼합물과 같은 다공성 또는 비-다공성 미네랄 입자이다. 또한, 용어 "기질" 은 실리카, 유리, 석영 또는 제올라이트로 코팅된 자기 흡인성 입자를 포함한다. 추가로, "분말" 또는 "분말화" 형태의 기질은 물질이 액체 유기 화합물 또는 수용액과 같은 액체상에서 분산되어 있을 때, 현탁액을 생성하는 미분된 물질을 나타내는 것으로 이해된다. 용어 "분말" 또는 "분말화" 물질은, 분말화 물질이 응집되지만 여전히 수용액과 같은 액체상과 조합되는 경우 현탁액을 만드는 정제를 포함하고자 하는 것이다. 추가로, 용어 "고이온력" 및 "고농도" 는 약 1 M 과 동등한 또는 초과의 농도에서 용해된 염으로부터 유래된 수용액 내 이온력 또는 농도를 의미한다. 1 내지 10 M 농도의 무질서유발염이 바람직하다.

본 발명자들은 놀랍게도 첫번째 단계에서, 분해가 생물 표본을 무질서유발제를 함유한 수성 분해 완충용액과 혼합하고 상기 혼합물을 인큐베이션하는 것에 의해 수행되며 ; 두번째 단계에서, 혼합물 내 무질서유발제의 농도가 증가되며 혼합물이 핵산과 결합할 수 있는 고체상과 접촉하여, 액체상 내의 핵산이 고체상으로 흡착되는, 2-단계 분해 및 결합 과정을 수행하는 것이 유익하다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명의 제 1 구현예는 (a) 무질서유발제를 함유한 수성 완충용액을 제공하고 ; (b) 분해 완충용액을 생물 표본과 함께 혼합하고 (혼합물 내 무질서유발제의 농도는 1 M 내지 4 M 임), 혼합물을 인큐베이션하고 ; (c) 단계 (b) 의 혼합물 내에 무질서유발제의 추가량을 용해시키거나 혼합물에 추가의 무질서유발제를 함유한 수용액을 첨가하여, 0.5 M 초과로 혼합물 내 무질서유발제의 농도를 증가시키고 ; (d) 단계 (c) 의 혼합물을 고체상과 접촉시켜, 핵산을 혼합물로부터 고체상으로 흡착시키는 단계를 포함하는, 핵산을 생물 표본으로부터 고체상으로 흡착시키는 방법이다.

본 발명의 제 2 구현예는 (a) 무질서유발제를 함유한 수성 완충용액을 제공하고 ; (b) 분해 완충용액을 생물 표본과 함께 혼합하며 (혼합물 내 무질서유발제의 농도는 1 M 내지 4 M 임), 혼합물을 인큐베이션하고 ; (c) 단계 (b) 의 혼합물 내에 무질서유발제의 추가량을 용해시키거나 혼합물에 추가의 무질서유발제를 함유한 수용액을 첨가하여, 0.5 M 초과로 혼합물 내 무질서유발제의 농도를 증가시키고 ; (d) 고체상을 제공하며 단계 (c) 의 혼합물을 고체상과 접촉시켜, 핵산을 상기 혼합물로부터 고체상으로 흡착시키고 ; (e) 액체상으로부터 고체상을 분리하고 ; (f) 임의로 세척 완충용액으로 단계의 고체상을 세척하고 ; (g) 고체상으로부터 핵산을 용출시켜 핵산을 단리하고 ; (h) 임의로 용출물로부터 단계 (g) 의 핵산을 침전시켜 침전된 핵산을 단리하는 단계를 포함하는, 생물 표본으로부터 핵산을 단리하는 방법이다.

최근 수 년간 유리 표면과 같은 기질에 대한 그것의 결합 거동을 이용하는, 그것의 자연 환경으로부터 핵산을 단리하는 많은 과정이 제안되었다. 고염 조건하에 예를 들어 구아니딘 티오시아네이트와 같은 무질서유발제를 이용하는 것이 보통이다. 고농도의 무질서 유발제는 물의 벌크 특성을 변화시킨다 (Cacace, M.G. 등 Quarterly Review of Biophysics (1997) 30 : 241 - 277).

수중 특정 이온은 소수성 상호작용을 증가시키는 경향을 가질 것이며, 반면에 다른 이온은 소수성 상호작용을 감소시킬 것이다. 어떤 이온이 어떤 효과의 경향을 가지는지는 호프마이스터 시리즈 (Hofmeister series) 라는 것에 의해 기술된다. 그 시리즈는 하기와 같다 :

양이온 :

NH₄ ⁺> Rb⁺> K⁺> Na⁺> Cs⁺> Li⁺> Mg²⁺> Ca²⁺> Ba²⁺> 구아니디늄

음이온 :

PO₄ ^3-> SO₄ ^2- > HPO₄ ^2-> 아세테이트 > 시트레이트 > 타르트레이트 > Cl^-> Br^-> NO₃ ^-> ClO₃ ^-> ClO₄ ^-> I^- > SCN^-

좌측의 이온은 "코스모트로픽" 이라고 하며 소수성 상호작용력을 증가시키며 따라서 고농도에서 단백질을 침전시키거나 "염석" 시킬 것이다. 우측의 이온은 "카오트로픽" 이며 소수성 상호작용을 약화시키는 경향이 있다. 호프마이스터 시리즈는 왜 구아니디늄이 단백질 변성제인지를 설명한다. 이는 소수성 상호작용을 약화시켜 구아니디늄은 단백질 변성을 유발한다. 반면, (NH₄)₂SO₄ 는 NH₄ ⁺및 SO₄ ² ^- 이온으로 해리될 것이다. 상기 이온 둘 다 코스모트로픽하며, 각각의 효과는 독립적이며 부가적이다. 이는 (NH₄)₂SO₄가 단백질 정제 과정에 광범위하게 이용되는 다용도의 침전제가 되게 한다. NaCl 은 시리즈의 중간에 있으며, 즉 코스모트로픽하지도 카오트로픽하지도 않다.

유익하게 핵산을 함유한 생물 표본을 제조하고 제조물로부터 핵산을 고체상으로 흡착하기 위해 2-단계 분해 및 결합 방법이 적용된다는 것이 발명자들에 의해 발견되었다. 첫번째 단계 (분해) 에서, 무질서유발제의 농도는 두번째 단계 (결합) 에서보다 낮다. 분해 단계 동안에, 즉 생물 표본과 분해 완충용액의 혼합물에서 무질서유발제의 바람직한 농도는 1 M 내지 4 M 이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 제 1 구현예는 (a) 무질서유발제를 함유한 수성 완충용액을 제공하 고 ; (b) 분해 완충용액을 생물 표본과 함께 혼합하며 (혼합물 내 무질서유발제의 농도는 1 M 내지 4 M임), 혼합물을 인큐베이션하고 ; (c) 단계 (b) 의 혼합물 내에 무질서유발제의 추가량을 용해시키거나 상기 혼합물에 추가의 무질서유발제를 함유한 수용액을 첨가하여, 혼합물 내 무질서유발제의 농도를 0.5 M 초과로 증가시키고 ; (d) 단계 (c) 의 혼합물을 고체상과 접촉시켜서, 핵산을 상기 혼합물로부터 고체상으로 흡착시키는 단계를 포함하는, 핵산을 생물 표본으로부터 고체상으로 흡착시키는 방법이다.

무질서유발제는 무질서유발염인 것이 바람직하다. 무질서유발제는 구아니디늄 히드로클로라이드, 구아니디늄 티오시아네이트, 구아니디늄 이소티오시아네이트, 알칼리 요오다이드, 및 알칼리 과염소산염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 더 바람직하다. 바람직하게는, 알칼리 요오다이드는 KI 또는 NaI 이다. 바람직하게는, 알칼리 과염소산은 NaClO₄또는 KClO₄이다. 상기 화합물의 혼합물뿐만 아니라 상기 화합물과 요소의 혼합물도 가능하다.

이용되는 무질서유발제에 따라, 단계 (b) 의 혼합물 내 이것의 최적의 농도는 변할 수 있다. 예를 들어, 구아니디늄 히드로클로라이드 또는 구아니디늄 티오시아네이트를 이용하여 상당한 무질서유발 효과를 수득하기 위해서는 1 M 내지 4 M 의 지정된 범위 내에서 다른 농도가 선택되어야만 한다. 이 차이의 기초를 이루는 원리는, 물에서 용해되어 있을 때 구아니디늄 티오시아네이트는 해리되어 2 개의 무질서유발 이온을 초래하며, 반면에 해리된 구아니디늄 히드로클로라이드는 단 하나의 무질서유발 이온만을 초래한다. 따라서 단계 (b) 의 혼합물 내 무질서유발제의 농도는 1 M 내지 2 M 인 것이 바람직하다. 단계 (b) 의 혼합물 내 무질서유발제의 농도는 1.5 M 내지 2 M 인 것이 더 바람직하다. 단계 (b) 의 혼합물 내 무질서유발제의 농도는 약 2 M 인 것이 더욱 더 바람직하다. 이용되는 무질서유발제에 따라, 단계 (b) 의 혼합물 내 무질서유발제의 농도는 2 M 내지 4 M 인 것이 또한 바람직하다. 단계 (b) 의 혼합물 내 무질서유발제의 농도는 2.5 M 내지 3 M 인 것이 더 바람직하다. 단계 (b) 의 혼합물 내 무질서유발제의 농도는 약 3 M 인 것이 더욱 더 바람직하다.

이와 관련하여, 수치 정량값과 조합된 단어 "약" 은 이 수치가 변할 수 있지만, 상기 수치로 기술되거나 정의되는 목적하는 기술적 효과는 변하지 않는다는 것을 의미한다는 것임이 당업자들의 일반적인 이해이다. 일반적으로, "약" 은 5% 의 다양성을 함축하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 약 100 의 수치는 95 내지 105 의 수치를 포함한다.

구아니디늄 및 티오시아네이트 이온은 호프마이스터 시리즈에서 예를 들어 각각 칼륨 또는 나트륨 양이온, 또는 요오다이드 또는 클로레이트 음이온에 비해 증가된 무질서유발 특성을 가진 것으로 분류된다. 따라서 단계 (b) 의 혼합물 내 무질서유발제의 농도는 2 M 내지 4 M 인 것이 또한 바람직하다.

두번째 단계 (결합) 에서 혼합물 내 무질서유발제의 농도는 단계 (b) 의 혼합물에 추가의 무질서유발제를 첨가함으로써 증가된다. 단계 (c) 에 나타낸 바와 같이, 목적하는 증가를 달성하는 방법은 여러 가지가 있다. 단계 (b) 의 혼합 물에 고체 물질로서 무질서유발제를 첨가하고 무질서유발제를 용해시키는 것이 가능하다. 대안적으로, 무질서유발제의 수용액을 제조하고 단계 (b) 의 혼합물에 첨가한다. 바람직하게는, 수용액은 완충염, 세제 또는 둘 다와 같은 추가 성분을 함유한다. 상기 수용액의 예는 실시예 2, 3, 및 4 에 기술된 결합 완충용액이다.

단계 (c) 의 혼합물 내 무질서유발제의 농도는 0.5 M 초과로 증가된다. 따라서, 단계 (c) 는 단계 (b) 의 혼합물 내 무질서유발제의 추가량을 용해시키거나 상기 혼합물에 추가의 무질서유발제를 함유한 수용액을 첨가하여, 혼합물 내 무질서유발제의 농도를 1.5 M 내지 10 M 수치로 증가시키는 것을 포함하는 것이 바람직하다. 추가의 무질서유발제는 혼합물 내에서 포화가 이루어질 때까지 단계 (b) 의 혼합물에 고체 물질로서 첨가될 수 있음이 주지된다. 따라서, 단계 (c) 는 단계 (b) 의 혼합물 내 무질서유발제의 추가량을 용해시켜 무질서유발제로 혼합물을 포화시키는 것을 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 단계 (c) 에서 혼합물 내 무질서유발제의 농도가 0.5 M 내지 6 M 로 증가되는 것이 바람직하다. 단계 (c) 에서 혼합물 내 무질서유발제의 농도가 0.5 M 내지 4 M 로 증가되는 것이 더 바람직하다. 단계 (c) 에서 혼합물 내 무질서유발제의 농도가 0.5 M 내지 3 M 로 증가되는 것이 더욱 더 바람직하다. 단계 (c) 에서 혼합물 내 무질서유발제의 농도가 0.5 M 내지 2 M 로 증가되는 것이 더욱 더 바람직하다. 단계 (c) 에서 혼합물 내 무질서유발제의 농도가 0.5 M 내지 1.5 M 로 증가되는 것이 더욱 더 바람직하다. 단계 (c) 에서 혼합물 내 무질서유발제의 농도가 0.5 M 내지 1 M 로 증가되는 것이 더욱 더 바람직하다.

상세하게, (하나 이상의) 핵산 (목적 핵산으로 나타내기도 함) 을 예를 들어 실리카 입자, 실리카 섬유, 유리 필터 또는 유리 입자와 같은 기질에 결합하는 과정을 하기와 같이 기술할 수 있다. 본 발명에 따르면, 이는 1.5 M 내지 10 M, 바람직하게는 2 M 내지 6 M 의 농도의 무질서유발염 존재 하에 수행된다.

DNA 또는 RNA 는 상기 조건, 즉 일정 농도의 무질서유발제 존재 하에 유리 표면을 가진 물질에 결합한다. 분해물을 기질, 즉 핵산에 친화도를 가진 물질에 접촉시키기 위해, 분해물을 기질과 혼합하고 결합이 일어나기 충분한 시기 동안 인큐베이션한다. 상기 기질이 예를 들어, 유리, 실리카, 또는 석영 섬유를 포함하는 필터인 경우, 분해물 (예를 들어, 단계 (c) 의 혼합물) 은 중력 인력, 가압 또는 흡입 적용에 의해 필터를 통과할 수 있다. 필터를 통과하는 동안, 액체상 내 핵산은 고체상과 접촉하게 되고 거기에 흡착된다. 전문가들은 통상 액체상 및 고체상의 인큐베이션 기간에 익숙하다. 인큐베이션은 상이한 시점에서 표면상에 고정화된 생물 물질의 양을 결정함으로써 최적화될 수 있다. 10 초 내지 30 분의 인큐베이션 시간이 핵산에 대해 적절할 수 있다.

핵산을 고체상에 결합시키거나 생물 표본으로부터 핵산을 단리하는 과정에서, 핵산을 유리시키기 위해 생물 표본을 분해할 때 단백질 분해 활성을 가진 효소를 이용하는 것이 더 바람직하다. 용어 "단백질 분해 활성을 가진 효소" 는 생물 표본 내에서 핵산분해효소 또는 다른 원하지 않는 단백질을 재빨리 분해하는 단백질분해효소 또는 단백질분해효소의 혼합물을 포함하는 것으로 이해된다. 본 문맥에서, 용어 "단백질분해효소" 는 EC 3.4 - 3.11 에 포함된 바와 같이 임의의 가수분해효소, 펩티드분해효소, 프로테이나제 또는 단백질 분해 활성을 가진 효소 (예를 들어 펩티드 결합상에 작용하는 가수분해효소) 및 그것의 임의의 변형을 의미하며, 상기 변형은 효소의 활성을 유지시키는 것으로 여겨진다. 단백질 분해 활성을 가진 효소는 동물 조직, 식물 조직, 미생물로부터 단리되거나, 재조합 수단에 의해 수득될 수 있다.

따라서, 단계 (a) 의 분해 완충용액은 단백질 분해 활성을 가진 효소를 포함하는 것이 바람직하다. 단백질 분해 활성을 가진 효소는 EC 3.4 - 3.11 에 포함된 단백질분해효소로부터 선택되는 것이 더 바람직하다. 단백질 분해 활성을 가진 효소는 아크로모펩티다제, 아미노펩티다제, 안크로드, 안지오텐신 전환 효소, 브로멜라인, 칼파인, 칼파인 Ⅰ, 칼파인 Ⅱ, 카르복시펩티다제 A, 카르복시펩티다제 B, 카르복시펩티다제 G, 카르복시펩티다제 P, 카르복시펩티다제 W, 카르복시펩티다제 Y, 카스파제, 카스파제 1, 카스파제 2, 카스파제 3, 카스파제 4, 카스파제 5, 카스파제 6, 카스파제 7, 카스파제 8, 카스파제 9, 카스파제 10, 카스파제 13, 카텝신 B, 카텝신 C, 카텝신 D, 카텝신 G, 카텝신 H, 카텝신 L, 키모파파인, 키마제, 알파-키모트립신, 클로스트리파인, 콜라게나제, 보체 C1r, 보체 C1s, 보체 인자 D, 보체 인자 I, 쿠쿠미신, 디펩티딜 펩티다제 Ⅳ, 백혈구 엘라스타제, 췌장 엘라스타제, 엔도프로티나제 Arg-C, 엔도프로티나제 Asp-N, 엔도프로티나제 Glu-C, 엔도프로티나제 Lys-C, 엔테로키나제, 인자 Xa, 피친, 푸린, 그랜자임 A, 그랜자임 B, HIV 단백질분해효소, IGase, 칼리크레인 조직, 루신 아미노펩티다제, 세포질 루 신 아미노펩티다제, 미소체 루신 아미노펩티다제, 매트릭스 메탈로프로테아제, 메티오닌 아미노펩티다제, 뉴트라제, 파파인, 펩신, 플라스민, 프롤리다제, 프로나제 E, 전립선 특이 항원, 스트렙토마이세스 그리세우스 (Streptomyces griseus) 유래의 친알칼리성 단백질분해효소, 아스페르질루스 (Aspergillus) 유래의 단백질분해효소, 아스페르질루스 사이토이 (Aspergillus saitoi) 유래의 단백질분해효소, 아스페르질루스 소제 (Aspergillus sojae) 유래의 단백질분해효소, B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) 유래의 알칼린 단백질분해효소, B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) 유래의 알칼라제, 바실루스 폴리믹사 (Bacillus polymyxa) 유래의 단백질분해효소, 바실루스 종 (Bacillus sp) 유래의 단백질분해효소, 바실루스 종 (Bacillus sp) 유래의 단백질분해효소 (에스퍼라제), 라이조푸스 종 (Rhizopus sp) 유래의 단백질분해효소, 프로테아제 S, 프로테아좀, 아스페르질루스 오리제 (Aspergillus oryzae) 유래의 프로테이나제, 프로테이나제 3, 프로테이나제 A, 프로테이나제 K, 단백질 C, 피로글루타메이트 아미노펩티다제, 레닌, 렌닌, 스트렙토키나제, 서브틸리신, 서모리신, 트롬빈, 티슈 플라스미노겐 활성화제, 트립신, 트립타제, 및 유로키나제로 이루어진 군에서 선택되는 것이 더욱 더 바람직하다. 단백질 분해 활성을 가진 효소는 카스파제, 프로테이나제 K, 프로나제 E, 바실루스 종 (Bacillus sp) 유래의 단백질분해효소 (에스퍼라제) 및 서브틸리신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 더욱 더 바람직하다. EC 3.4 - 3.11 에 포함된 2 개 이상의 다른 단백질분해효소의 혼합물도 바람직하다. 단백질분해효소의 선택에 관해, 전문가들은 통상 분해 완충용액의 최적화에 익숙하다. 실시예 1 에서 기술한 바와 같이, 당업자는 선택된 단백질 분해 효소의 단백질 분해 활성을 다른 농도로 무질서유발제를 함유하고 있는 완충용액 내에서 시험할 것이다. 단계 (b) 에 따라서 혼합물의 무질서유발 조건하에 활성인 단백질분해효소를 바람직하게 선택한다. 전문가는 단백질분해효소로 인큐베이션하는 기간의 최적화뿐만 아니라 인큐베이션 온도의 최적화를 수행할 수 있다. 매개변수로써, 당업자는 생물 표본으로부터 액상 내로 유리되어 기질에 결합할 수 있는 핵산(들) 의 양을 결정할 것이다.

단계 (a) 의 분해 완충용액은 프로테이나제 K 를 함유하는 것이 아주 바람직하다. 바람직하게는, 단계 (b) 의 혼합물 내 프로테이나제 K 의 활성은 0.1 U/㎖ 내지 10 U/㎖ 이다. 단계 (b) 의 혼합물 내 프로테이나제 K 의 활성은 1 U/㎖ 내지 6 U/㎖ 인 것이 더 바람직하다. 단계 (b) 의 혼합물 내 프로테이나제 K 의 활성은 2 U/㎖ 내지 4 U/㎖ 인 것이 더욱 더 바람직하다. 단계 (b) 의 혼합물 내 프로테이나제 K 의 활성은 약 3 U/㎖ 인 것이 더욱 더 바람직하다. 이 와 관련하여, 프로테이나제 K 의 열거된 활성 수치는 실시예 1 에 기술된 바처럼 결정된 활성 수치를 반영하는 것으로 이해된다.

핵산을 유리시키기 위해 생물 표본을 분해할 때 또는 핵산을 고체상으로 결합시킬 때, 상기 과정에서 세제, 즉, 음이온성, 양이온성, 쯔비터이온성 또는 비-이온성 세제를 이용하는 것이 더 바람직하다. 상기 세제는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 일반적으로, "세제" 는 계면활성제로 알려지기도 한 표면활성제이다. 세제는 그것이 용해되는 매질의 표면 장력 및/또는 다른 상과의 계면 장 력을 낮출 수 있으며, 따라서 액체/증기 및/또는 다른 계면에 포지티브하게 흡착된다. 따라서, 세제는 극성 (수용성) 및 비극성 (소수성) 영역을 가진 양친매성 분자이다. 그것들은 소수성 분자 또는 수용성을 수여하는 분자의 영역에 결합할 수 있다. 그것의 이온 특성에 따라서, 세제는 이온성 세제, 비-이온성 세제, 및 쯔비터이온성 세제로 분류될 수 있다. 이온성 세제는 SDS (소듐 도데실 술페이트), LiDS (리튬 도데실 설페이트) 또는 세틸트리메틸암모늄브로마이드 (CTAB) 와 같은 양이온성 세제 및 데옥시콜린산 또는 소듐 라우로일 사르코신과 같은 음이온성 세제의 하나로 추가 분류될 수 있다. 따라서, 이것들은 통상 상당한 단백질 변성제이다. 가령 비-이온성 세제는 약한 단백질 변성제이다. 이는 CHAPS 또는 술포베타인 14 와 같은 쯔비터이온성 세제에 대해서도 마찬가지이다. 쯔비터이온으로도 알려져 있는 쯔비터이온성 화합물, 분자내염 또는 양극성 이온은 반대 기호의 공식 단위 전기 전하를 가지고 있는 중성의 화합물이다.

따라서, 단계 (a) 의 분해 완충용액은 세제를 포함하는 것이 바람직하다. 단계 (a) 의 분해 완충용액은 음이온성, 양이온성, 쯔비터이온성 또는 비-이온성 세제를 함유하는 것이 더 바람직하다. 단계 (a) 의 분해 완충용액 내 세제는 소듐 도데실 설페이트, 리튬 도데실 설페이트, 세틸트리메틸암모늄브로마이드, 데옥시콜린산, 소듐 라우로일 사르코신, 트리톤-X100, 트윈 20, 옥틸 베타-D-글루코시드, Nonidet P40, CHAPS 또는 술포베타인 14 로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 더욱 더 바람직하다. 그러나, 다른 세제가 가능하다. 일반적으로, 무질서유발제, 세제 및 생물 표본을 분해하기 위한 단백질분해효소의 혼합물을 이용 할 때, 당업자는 단백질 분해 활성이 유지되는 것을 기반으로, 세제 및 단계 (b) 의 혼합물 내 그것의 농도를 선택한다.

바람직하게는, 고체상은 실리카 겔, 유리 섬유, 석영 섬유 및 제올라이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 다공성 또는 비-다공성 미네랄 기질을 포함한다. 또한 바람직하게는, 고체상은 산화금속 및/또는 혼합 산화 금속, 알루미나, 티타니아, 지르코니아 및 주로 유리로 이루어진 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 다공성 또는 비-다공성 미네랄 기질을 포함한다. 고체상은 0.1 ㎛ 내지 1,000 ㎛ 의 입자 크기를 가진 미네랄 기질을 포함하는 것도 바람직하다. 고체상은 2 내지 1,000 ㎚ 의 구멍 크기를 가진 다공성 미네랄 지지 물질을 포함하는 것도 바람직하다. 더 바람직하게는, 다공성 또는 비-다공성 지지 물질, 특히 제올라이트는 느슨한 패킹의 형태로 있다. 더욱 더 바람직하게는, 고체상은 유리, 석영 또는 세라믹 필터 시트의 형태로 있는 필터 시트, 및/또는 실리카 겔 및/또는 미네랄 지지체 및 석영 또는 유리 모직물의 입자 또는 섬유를 함유한 막으로 이루어진다. 고체상이 자기 흡인성 입자를 포함하는 것도 바람직하다. 더 바람직하게는, 자기 흡인성 입자는 실리카 겔, 유리, 석영 및 제올라이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 미네랄 기질로 코팅된다. 더욱 더 바람직하게는, 기질은 자기 유리 입자를 포함한다.

본 발명의 추가의 구현예는 (a) 무질서유발제를 함유한 수성 분해 완충용액을 제공하고 ; (b) 분해 완충용액을 생물 표본과 함께 혼합하며 (혼합물 내 무질서유발제의 농도가 1 M 내지 4 M 임), 혼합물을 인큐베이션하고 ; (c) 단계 (b) 의 혼합물 내에 무질서유발제의 추가 량을 용해시키거나 혼합물로 추가의 무질서유발제를 함유한 수용액을 첨가하여, 혼합물 내 무질서유발제의 농도를 0.5 M 초과로 증가시키고 ; (d) 고체상을 제공하고 단계 (c) 의 혼합물을 고체상과 접촉시켜서, 핵산을 혼합물로부터 고체상으로 흡착시키고 ; (e) 액체상으로부터 고체상을 분리하고 ; (f) 임의로 세척 완충용액으로 단계의 고체상을 세척하고 ; (g) 고체상으로부터 핵산을 용출시켜 핵산을 단리하고 ; (h) 임의로 용출물로부터 단계 (g) 의 핵산을 침전시켜 침전된 핵산을 단리하는 단계를 포함하는, 생물 표본으로부터 핵산을 단리하는 방법이다.

고체상은 실리카 겔, 유리 섬유, 석영 섬유 및 제올라이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 다공성 또는 비-다공성 미네랄 기질을 포함하는 것이 바람직하다. 고체상은 자기 유리 입자를 포함하는 것도 바람직하다.

무질서유발제는 무질서유발염인 것이 매우 많이 바람직하다. 무질서유발제는 구아니디늄 히드로클로라이드, 구아니디늄 티오시아네이트, 구아니디늄 이소티오시아네이트, 알칼리 요오다이드 및 알칼리 과염소산염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 더 바람직하다.

단계 (a) 의 분해 완충용액은 단백질 분해 활성을 가진 효소 및 세제를 함유하는 것도 바람직하다. 단계 (a) 의 분해 완충용액은 단백질 분해 활성을 가진 효소를 함유하는 것이 매우 많이 바람직하다. 단백질 분해 활성을 가진 효소는 EC 3.4 - 3.11 에 포함된 바와 같은 단백질분해효소로부터 선택되는 것이 더 바람직하다. 단백질 분해 활성을 가진 효소는 카스파제, 프로테이나제 K, 프로나제 E, 바실루스 종 (Bacillus sp) 유래의 단백질분해효소 (에스퍼라제) 및 서브틸리신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 더욱 더 바람직하다. EC 3.4 - 3.11 에 포함된 2 개 이상의 상이한 단백질분해효소의 혼합물도 바람직하다. 단계 (a) 의 분해 완충용액은 음이온성, 양이온성, 쯔비터이온성 또는 비-이온성 세제를 함유하는 것도 매우 많이 바람직하다. 단계 (a) 의 분해 완충용액 내 세제는 소듐 도데실 설페이트, 리튬 도데실 설페이트, 세틸트리메틸암모늄브로마이드, 데옥시콜린산, 소듐 라우로일 사르코신, 트리톤-X100, 트윈 20, 옥틸 베타-D-글루코시드, Nodidet P40, CHAPS 또는 술포베타인 14 로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 더욱 더 바람직하다.

단계 (b) 의 혼합물의 pH 수치는 8.5 내지 4 인 것이 바람직하다. 단계 (b) 의 혼합물의 pH 수치는 7.5 내지 5 인 것이 더 바람직하다. 단계 (b) 의 혼합물의 pH 수치는 7 내지 6 인 것이 더욱 더 바람직하다. 단계 (b) 의 혼합물의 pH 수치는 약 6 인 것이 더욱 더 바람직하다.

단계 (b) 의 혼합물은 생물 표본, 1.5 M 내지 3 M 의 농도로 구아니디늄 티오시아네이트, 20 mM 내지 40 mM 의 농도로 트리스염, 5 부피/부피% 내지 20 부피/부피% 의 농도로 트리톤-X100 및 프로테이나제 K 를 함유하며, 상기 혼합물 내 프로테이나제 K 의 단백질 분해 활성은 1 U/㎖ 내지 5 U/㎖ 이며, 상기 혼합물 내 pH 는 8.5 내지 6.0 인 것이 매우 많이 바람직하다. 이 점에 있어서, 프로테이나제 K 의 활성은 실시예 1 에 기술된 바대로 결정되는 것으로 이해된다.

단계 (b) 의 혼합물은 생물 표본, 1.5 M 내지 2.5 M 의 농도로 구아니디늄 티오시아네이트, 20 mM 내지 30 mM 의 농도로 트리스염, 5 부피/부피% 내지 15 부피/부피% 의 농도로 트리톤-X100 및 프로테이나제 K 를 함유하며, 상기 혼합물 내 프로테이나제 K 의 단백질 분해 활성은 2 U/㎖ 내지 4 U/㎖ 이며, 상기 혼합물 내 pH 는 8.5 내지 6.0 인 것이 매우 바람직하다.

단계 (b) 의 혼합물은 생물 표본, 약 2 M 의 농도로 구아니디늄 티오시아네이트, 약 25 mM 의 농도로 트리스염, 약 10 부피/부피% 의 농도로 트리톤-X100 및 프로테이나제 K 를 함유하며, 상기 혼합물 내 프로테이나제 K 의 단백질 분해 활성은 약 3 U/㎖ 이며, 상기 혼합물 내 pH 는 약 6 인 것이 매우 바람직하다. pH 6 인 것이 더욱 더 바람직하다. 그것을 위한 예는 실시예 2 의 실험 4 에 이용된 분해 완충용액 (예를 들어, 단계 (b) 에 따른 혼합물) 이다.

단계 (b) 의 혼합물은 생물 표본, 약 2.7 M 의 농도로 구아니디늄 히드로클로라이드, 약 5 mM 의 농도로 요소, 약 5 mM 의 농도로 트리스염, 약 9 부피/부피% 의 농도로 트리톤-X100 및 프로테이나제 K 를 함유하며, 상기 혼합물 내 프로테이나제 K 의 단백질 분해 활성은 약 3 U/㎖ 이며, 상기 혼합물 내 pH 는 4.4 내지 6.5 인 것도 매우 바람직하다.

단계 (b) 의 혼합물은 생물 표본, 약 2.4 M 의 농도로 구아니디늄 히드로클로라이드, 약 1.6 mM 의 농도로 요소, 약 85 mM 의 농도로 트리스염, 약 88 mM 의 농도로 EDTA, 약 8 mM 의 농도로 NaCl, 약 9 부피/부피% 의 농도로 트리톤-X100 및 프로테이나제 K 를 함유하며, 상기 혼합물 내 프로테이나제 K 의 단백질 분해 활성은 약 3 U/㎖ 이며, 상기 혼합물 내 pH 는 4.4 내지 6.5 인 것도 매우 바람직 하다.

단백질분해효소를 포함하는 단계 (b) 의 혼합물을 단백질 분해 활성을 허용하는 환경 조건에서 시간의 일정량 동안 인큐베이션하는 것이 더 바람직하다. 단계 (b) 의 혼합물을 20℃ 내지 75℃ 온도에서 10 분 내지 30 분 동안 인큐베이션하며, 상기 혼합물을 교반하는 것이 바람직하다. 용어 "교반" 및 "교반하기" 는 1 초에 한번 시험관을 전화하기 위해 단계 (b) 의 혼합물을 함유한 시험관을 움직이는 것으로 이해된다. 상기 용어는 단계 (b) 의 혼합물 내 교류를 유발하는 점에서 동등한 효과를 가지는 움직임을 포함하기도 한다. 교반의 정도는 단리되는 핵산(들) 의 크기에 의해 영향을 받을 수도 있다. 너무 많은 교반은 혼합물 내 핵산 분자의 크기 제한을 유발하는 전단력을 초래할 수 있다. 따라서, 더 느린 교반이 전문가에 의해 선택될 것이다.

단계 (b) 의 혼합물을 실온에서 30 분 동안 인큐베이션하며, 상기 혼합물을 롤러 혼합기를 이용하여 교반하는 것이 더 바람직하다. 단계 (b) 의 혼합물을 50℃ 내지 75℃ 의 온도에서 약 10 내지 20 분 동안 인큐베이션하며, 상기 혼합물을 열혼합기를 이용하여 교반하는 것이 더욱 더 바람직하다. 단계 (b) 의 혼합물을 약 56℃ 에서 10 분 내지 20 분 동안 인큐베이션하며, 상기 혼합물을 롤러 혼합기 또는 열혼합기를 이용하여 교반하는 것이 더욱 더 바람직하다. 단계 (b) 의 혼합물을 56℃ 에서 15 분 동안 인큐베이션하며, 상기 혼합물을 롤러 혼합기 또는 열혼합기를 이용하여 교반하는 것이 더욱 더 바람직하다. 단계 (b) 의 혼합물을 약 72℃ 에서 10 분 내지 20 분 동안 인큐베이션하며, 상기 혼합물을 롤러 혼 합기 또는 열혼합기를 이용하여 교반하는 것도 매우 많이 바람직하다. 단계 (b) 의 혼합물을 72℃ 에서 10 분 동안 인큐베이션하며, 상기 혼합물을 롤러 혼합기 또는 열혼합기를 이용하여 교반하는 것이 더욱 더 바람직하다.

핵산(들) 을 단계 (c) 의 혼합물로부터 고체상으로 흡착시킨 후, 결합된 핵산(들) 을 액체상으로부터 분리한다. 이는 일반적으로는 중력에 의해서 또는, 자기장을 적용함으로써 자기 입자에 결합된 물질을 분리함으로써 자기 유리 입자에 결합된 핵산의 사용하기 편한 경우에 달성될 것이다. 예를 들어, 자기 입자는 인큐베이션이 수행되는 용기의 벽으로 당겨질 수 있다. 다음, 자기 입자에 결합하지 않은 표본 함량을 함유한 액체를 제거할 수 있다. 이용되는 제거 과정은 인큐베이션이 수행되는 용기의 유형에 따라 다르다. 적합한 단계는 파이페팅 또는 흡인을 통한 액체의 제거를 포함한다.

고체상이 필터 (석영 또는 유리 섬유를 포함하는 필터와 같은) 인 경우에, 단계 (c) 의 혼합물을 필터를 통해 바람직하게 통과시킨다. 이어서 고체상으로부터 액체상의 분리는 인력에 의해, 가압에 의해 또는 흡인에 의해 영향을 받는다.

이어서 결합된 DNA 또는 RNA 와 함께 고체상을 세척할 것이다. 이 단계는 단리되는 핵산의 목적하는 순도뿐만 아니라 생물 표본 내 목적하지 않는 물질의 성질 및 양에 따라 선택적이다. 세척 단계가 필요하다면, 예를 들어, 이소프로필 알콜 또는 에탄올과 같은 알콜의 부피에 의해 1-90 부피% 의 혼합물로 고체상을 1 번 이상 세척하는 것이 바람직하다. 세척 용액의 예는 실시예 2 (A) 에 기술된 "저해제 제거 완충용액" 및 "세척 완충용액" 이다. 일반적으로, 세척 용액 은 핵산(들) 이 고체상의 표면으로부터 해리되지 않도록, 그러나 목적하지 않는 오염물질을 가능한 한 완전히 세척 제거하는 데 이용된다. 이 세척 단계는 바람직하게는 결합된 핵산(들) 이 있는 물질을 세척 용액과 함께 인큐베이션함으로써 일어난다. 바람직하게는 고체상은 이 단계 동안에 재혼탁된다. 고체상이 필터인 경우, 세척 용액을 필터를 통해 통과시키는 것이 바람직하다. 오염된 세척 용액은 바람직하게는 핵산을 결합하기 위한 상기에서 언급된 단계에서처럼 제거된다. 2 가지 연속 세척 단계를 수행하는 것이 더욱 더 바람직하며, 첫번째 세척 단계는 저해제 제거 완충용액을 이용하여 수행하고, 두번째 세척 단계는 세척 완충용액을 이용하여 수행한다. 저해제 제거 완충용액은 무질서유발제를 함유하는 것을 특징으로 한다. 저해제 제거 완충용액으로 세척하는 것은 독성 물질, 또는 예를 들어 제한 효소 또는 중합효소에 의해 수행되는 반응과 같은 효소 반응을 방해할 수 있는 저해제를 제거한다. 세척 완충용액으로 세척하는 것은 결합된 핵산으로부터 잔존한 무질서유발제를 제거한다. 마지막 세척 단계 후, 물질을 진공에서 간단히 건조시킬 수 있거나, 유체를 증발시키도록 할 수 있다. 아세톤을 이용한 전처리 단계가 수행되기도 할 것이다.

후에, 조건이 역전될 것인데, 예를 들어, 물질에 결합된 DNA 또는 RNA 를 용출하기 위해 염 농도를 감소시킨다. 용출 완충용액은 DE 37 24 442 및 Jakobi, R. 등, Anal. Biochem. 175 (1988) 196 - 201 로부터 공지된다. 저염 함량을 가진 용출 완충용액은 특히 0.2 M 미만의 함량을 가진 완충용액이다. 바람직하게는, 용출 완충용액은 완충 목적을 위한 물질 트리스를 함유한다. 용출 완충 용액은 트리스 염을 함유한 수용액이며, 트리스염의 농도는 50 mM 인 것이 매우 많이 바람직하다. 트리스염을 함유한 수용액은, 트리스염의 농도가 50 mM 이며 pH 가 6.5 내지 8.5 인 것이 더 바람직하다. pH 가 7.5 인 것이 더욱 더 바람직하다. 또한 바람직하게도, 용출 완충용액은 탈미네랄화된 물 (탈염수) 이다. 정제된 DNA 또는 RNA 를 함유한 용액은 현재 다른 반응에 이용될 수 있다. 임의로, 핵산(들) 은 예를 들어, 에탄올 또는 이소프로판올을 이용하여 용액으로부터 침전될 수 있다. 침전물은 추가의 세척 단계를 받을 수도 있다. 이런 종류의 방법은 당업자에 잘 공지되어 있으며 [Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition, CSHL Press, 2001] 에 상세히 기술되어 있다.

목적 핵산(들) 을 검출하고 결정할 수 있다. 상기-언급된 정제 방법이 선호되며, 이어서 결정 또는 검출 단계가 일어나거나 정제 방법에 이어서, 증폭 및 결정 또는 탐지 단계가 후속된다. 목적 핵산 또는 중요한 핵산은 비-목적 핵산의 매트릭스 내에 함유될 수 있으며, 특정 핵산의 상기 혼합물 내에서 소수의 성분이 될 것이기도 하다. 적합한 DNA 검출 방법은 당업자에 공지되어 있으며 [Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition, CSHL Press, 2001 ; 및 Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley and Sons, NY, 1987] 와 같은 표준 교과서에 기술되어 있다.

DNA 검출 단계가 예를 들어 침전 단계로서 수행되기 전에 추가의 정제 단계가 있을 수도 있다. 검출 방법을 포함할 것이나, 이중-가닥 DNA 내로 삽입하여 그 후 그것의 형광을 변화시키는 에티듐브로마이드와 같은 특정 염료의 결합 또는 삽입에 제한되지는 않을 것이다. 정제된 DNA 는 임의로 제한효소 처리한 후, 전기영동 방법에 의해 분리되어 그 후 시각화될 것이기도 하다. 특정 서열에 대한 올리고뉴클레오티드 혼성화 및 혼성물의 후속적인 검출을 알아보는 프로브-기재 분석도 있다. 당업자에 공지된 추가의 단계 후에 DNA 를 서열분석하는 것도 가능하다. 다른 방법은 DNA 서열의 상이성을 특정 프로브가 결합되는 실리카 칩에 응용하여 상보 서열이 결합할 때 신호를 산출한다.

본 발명은 비-단백질 분해성 및 핵산이 DNA 또는 RNA 또는 둘 다를 포함하므로 핵산을 포함한 단백질 분해성 성분의 혼합물을 포함하기도 한다.

본 발명은 핵산이 정제되는, 바이러스 또는 박테리아 세포뿐만 아니라, 예를 들어 백혈구와 같은 인간 및 동물 세포와 같은 다세포 개체로부터 단리된 세포, 합텐, 항원, 항체 및 핵산과 같은 면역적으로 활성이 낮고 높은 분자 화학 화합물, 혈장, 척수액, 담, 변, 생검 표본, 골수, 구강 세정제, 혈청, 조직, 요소 또는 이것의 혼합물을 포함하는, 생물 표본을 포함하기도 한다. 본 발명은 인간 또는 동물 개체 유래의 유체와 같은 생물 표본을 포함하기도 한다 ; 바람직하게는 생물 표본은 전혈, 혈장, 혈청 또는 요소이다. 전혈 표본은 바람직하게는 EDTA 혈액, 헤파린 또는 구연산혈이다. 혈장은 바람직하게는 EDTA, 헤파린 또는 구연산 혈장이다. 본 발명의 구현예에서 생물 표본은 박테리아 세포, 진핵 세포, 바이러스 또는 이것의 혼합물을 포함한다.

핵산 및 단백질 분해성 물질의 혼합물은 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵 산 (RNA) 또는 둘 다를 포함하는 것이 바람직하기도 하며, 바람직하게는 DNA 또는 RNA 또는 둘 다 하나의 바이러스 또는 하나 (하나 이상) 의 미생물로부터 유래된다. 바이러스는 간염 A 바이러스 (HAV), 간염 B 바이러스 (HBV), 간염 C 바이러스 (HCV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 인간 유두종 바이러스 (HPV) 또는 파르보바이러스 B19 일 수 있다.

목적 핵산 성분 및 다른 핵산을 상기에 언급한 바와 같이 필수적으로 정제하는 것도 바람직하다. 이어서, 목적 핵산 성분을 추가로 조작 및 검출하는데, 예를 들어, 검출할 수 있을 정도의 양으로 목표 서열을 특이적으로 증폭시키는 중합 연쇄 반응으로 증폭시킨다. 다른 가능한 증폭 반응은 결찰 연쇄 반응 (LCR, Wu, D.Y., 및 Wallace, R.B., Genomics 4 (1989) 560-569, 및 Barany, F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 189-193 ; 중합 결찰 연쇄 반응 (Barany, F., PCR Methods and Applic. 1 (1991) 5 - 16) ; Gap-LCR (WO 90/01069) ; 리페어 연쇄 반응 (EP 0 439 182), 3SR (Kwoh, D. Y.등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(1989) 1173 - 1177 ; Guatelli, J. C.등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 1874 - 1878 ; WO 92/08800), 및 NASBA (US 5,130,238) 이다. 추가로, 가닥 치환 증폭 (SDA), 전사 매개 증폭 (TMA) 및 Q-베타-증폭 (예를 들어 Whelen, A. C., 및 Persing, D. H., Annu. Rev. Microbiol. 50 (1996) 349 - 373 ; Abramson, R. D., 및 Myers, T.W., Curr. Opin. Biotechnol. 4 (1993) 41 - 47 을 참조 리뷰) 이 있다.

WO 92/02638 및 상응하는 미국 특허 US 5,210,015 ; US 5,804,375 ; US 5,487,972 에 개시된 TaqMan

검출 방법이 특히 바람직하다. 상기 방법은 신호를 발생시키는 중합효소의 외부핵산 가수분해효소 활성을 이용한다. 상세하게는, 표본을 목적 핵산 성분의 영역에 상보적인 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 동일한 목적 핵산 성분 서열 가닥의 두번째 영역에 상보적인 서열을 포함하는 표지된 올리고뉴클레오티드와 접촉시키나, 첫번째 올리고뉴클레오티드에 의해 정의된 핵산 서열을 포함하지는 않는 것을 포함하는 방법에 의해 목적 핵산 성분을 검출하여, 혼성화 조건 동안에 이중가닥의 혼합물을 창출하는데, 여기에서, 상기 이중가닥은 첫번째 올리고뉴클레오티드의 3'-말단이 표지된 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 인접해 있는 점에서, 첫번째 올리고뉴클레오티드 및 표지된 올리고뉴클레오티드에 결합된 목적 핵산을 포함한다. 이어서 상기 혼합물을 중합효소의 5' 에서 3' 으로의 핵산가수분해효소 활성이, 어닐링되고 표지된 올리고뉴클레오티드를 자르고 표지된 단편을 해리시키기에 충분한 조건하에 5' 에서 3' 핵산가수분해효소 활성을 가진 주형-의존성 핵산중합효소로 처리한다. 표지된 올리고뉴클레오티드의 가수분해에 의해 발생된 신호를 검출 및/또는 측정한다. TaqMan

기술은 형성되고 검출되는 반응 복합체에 결합되는 고체상의 필요성을 배제한다. 더 일반적으로 말하자면, 목적 핵산 성분의 정제에 이어 검출 단계가 따르는 방법이 개시되며, 여기에서 증폭 및/또는 검출 반응은 균질한 용액-상이다.

하기 실시예, 참고 및 도는 본 발명의 이해를 돕고자 제공되는 것으로, 진정한 영역은 첨부된 청구항에 기술된다. 변형은 본 발명의 진의를 벗어나지 않으면서 가능하다고 이해된다.

실시예 1

(A) 무질서유발제 존재 하 프로테이나제 K 의 인큐베이션

프로테이나제 K (Roche Diagnostics GmbH, Mannheimm, 카탈로그 번호. 745723 ; 4.5 ㎖ 물에 용해된 90 ㎎) 의 20 ㎎/㎖ 의 원액 10 ㎕ 를 50 mM 트리스-HCl pH 6.0, 1% DTT, 20% 트리톤-X100 및 x M 구아니디늄 티오시아네이트 (x = 0,1,2,3,4,5,6) 을 포함하는 무질서유발제와 혼합하였다. 혼합직후, 프로테이나제 K 활성을 혼합물의 첫번째 분취량 (10 ㎕) 중에서 하기에 기술된 분석으로 측정하였다 (0 분 활성 수치). 혼합 15 분 후에, 프로테이나제 K 활성을 혼합물의 두번째 분취량 (10 ㎕) 중에서 하기에 기술된 분석으로 측정하였다 (15 분 활성 수치).

(B) 프로테이나제 K 활성을 결정하는 분석

무질서유발 완충용액 (상기 (A) 참조) 중에서 프로테이나제 K 의 10 ㎕ 를 분석 완충용액, 즉 0.2 M 트리에탄올아민 980 ㎕, 0.05% (중량/부피) PEG 6000, 0.1 M 염화칼슘 및 200 mM 기질 용액 10 ㎕ 와 혼합하였다. 기질은 Suc-Ala-Ala-Ala-p-Nitroanilid 였다. 분석 완충용액은 큐벳 내에 제공되었다. 혼합한 직후, 큐벳을 광도계 내에 두었다. 측정 (흡광도) 은 25℃ 에서 15 분에 걸쳐 수행되었다. 분석 완충용액 내 프로테이나제 K 의 활성은 405 ㎚ 에서 흡광도 변화에 의해 나타나는 반응속도로부터 계산되었다.

표 1 은 (A) 에 주어진 다른 농도에서 구아니디늄 티오시아네이트 존재 하 프로테이나제 K 의 0 분 활성의 수치를 기재하였다. 표 2 는 (A) 에 주어진 다 른 농도에서 구아니디늄 티오시아네이트 존재 시 프로테이나제 K 의 15 분 활성 수치뿐만 아니라 대조 수치 (무질서유발제가 없음) 를 기재하였다. 수치는 무질서유발제가 없는 대조 완충용액 내 프로테이나제 K 의 0 분 활성 수치에 상응하는 0.5 U/㎖ 과 관련해서 표현하였고 ((A) 참조) ; 이 수치는 100% 로 설정되었다. 표 1 및 표 2 의 데이타를 도 1 및 도 2 에 도식적으로 나타내었다.

구아니디늄 티오시아네이트의 농도를 변화시키면서 시간 = 0 분에서 프로테이나제 K 의 활성 (0 분 수치)

농도 [M]	활성 [%]
0	81
1	94
2	100
3	66
4	1
5	0
6	0

구아니디늄 티오시아네이트의 농도를 변화시키면서 시간 = 15 분에서 프로테이나제 K 의 활성 (15 분 수치)

농도 [M]	활성 [%]
0	105
1	95
2	95
3	1
4	0
5	0
6	0

실시예 2

(A) 시약

a) 프로테이나제 K 원액 : 재조합 프로테이나제 K, PCR 등급, 50 U/㎖

b) 분해 완충용액 : 4 M 구아니디늄 티오시아네이트, 50 mM 트리스-HCl, 20% 트리톤-X100, pH 6.0

c) 결합 완충용액 : 4 M 구아니디늄 티오시아네이트, 50 mM 트리스-HCl, 20% 트리톤-X100, pH 6.0

d) 저해제 제거 완충용액 : 5 M 구아니디늄 히드로클로라이드, 20 mM 트리스-HCl, 38% 에탄올, pH 6.6

e) 세척 완충용액 : 20 mM NaCl, 2 mM 트리스-HCl, 80% 에탄올, pH 7.5

f) 용출 완충용액 : 50 mM 트리스-HCl, pH 8.2

g) 에탄올 (100%)

추가로 필요한 것들 : 예를 들어 Machery & Nagel 에서 판매하는 NucleoSpin Blood L 과 같은 실리카막을 포함하는 시판 회전 칼럼.

(B) 실험 1 : 프로테이나제 K 처리없는 1-단계 과정

1. 1,000 ㎕ EDTA 혈액을 15 ㎖ Falcon 튜브내로 파이펫팅함

2. 1,000 ㎕ 분해 완충용액을 첨가하고, 부드럽게 와류시킴

3. 롤러 혼합기 상에서 실온에서 15 분 동안 인큐베이션하고, 교반함

4. 새 Falcon 튜브에 스핀 칼럼을 넣음

5. 단계 1. - 2. 의 혼합물 (약 2,000 ㎕) 를 스핀 칼럼에 이동시킴

6. 1,900 ×g 에서 3 분 동안 원심분리함

7. 1,000 ㎕ 저해제 제거 완충용액을 첨가함

8. 4,500 ×g 에서 2 분 동안 원심분리함

9. 2,000 ㎕ 세척 완충용액을 첨가함

10. 4,500 ×g 에서 10 분 동안 원심분리함

11. 플로우쓰로우를 버리고 새 Falcon 튜브에 필터 칼럼을 넣음

12. 300 ㎕ 사전-가열된 (70℃) 용출 완충용액으로 용출시킴

13. 실온에서 5 분 동안 인큐베이션함

14. 4,500 ×g 에서 2 분 동안 원심분리함

15. 260, 280 및 320 ㎚ 에서 용출물의 OD 를 측정함.

(C) 실험 2 : 프로테이나제 K 처리를 포함하는 1-단계 과정

1. 125 ㎕ 프로테이나제 K 를 15 ㎖ Falcon 튜브에 파이펫팅함

2. 1,000 ㎕ EDTA 혈액을 첨가하고, 부드럽게 와류시킴

3. 1,000 ㎕ 분해 완충용액을 첨가하고, 부드럽게 와류시킴

4. (예를 들어, 열혼합기를 이용하여) 56℃ 에서 15 분 동안 인큐베이션하고 진탕하며, 교반함

5. 새 Falcon 튜브에 스핀 칼럼을 넣음

6. 단계 1. - 3. 의 혼합물 (약 2,125 ㎕) 을 스핀 칼럼에 이동시킴

7. 1,900 ×g 에서 3 분 동안 원심분리함

8. 1,000 ㎕ 저해제 제거 완충용액을 첨가함

9. 4,500 ×g 에서 2 분 동안 원심분리함

10. 2,000 ㎕ 세척 완충용액을 첨가함

11. 4,500 ×g 에서 10 분 동안 원심분리함

12. 플로우쓰로우를 버리고 새 Falcon 튜브에 필터 칼럼을 넣음

13. 300 ㎕ 사전-가열된 (70℃) 용출 완충용액으로 용출시킴

14. 실온에서 5 분 동안 인큐베이션함

15. 4,500 ×g 에서 2 분 동안 원심분리함

16. 260, 280 및 320 ㎚ 에서 용출물의 OD 를 측정함.

(D) 실험 3 : 에탄올을 포함하는 2-단계 과정

1. 125 ㎕ 프로테이나제 K 를 15 ㎖ Falcon 튜브에 파이펫팅함

2. 1,000 ㎕ EDTA 혈액을 첨가하고, 부드럽게 와류시킴

3. 1,000 ㎕ 분해 완충용액을 첨가하고, 부드럽게 와류시킴

5. 1,000 ㎕ 에탄올을 첨가하고, 부드럽게 와류시킴

6. 새 Falcon 튜브에 스핀 칼럼을 넣음

7. 단계 1. - 5. 의 혼합물 (약 3,125 ㎕) 을 스핀 칼럼에 이동시킴

8. 1,900 ×g 에서 3 분 동안 원심분리함

9. 1,000 ㎕ 저해제 제거 완충용액을 첨가함

10. 4,500 ×g 에서 2 분 동안 원심분리함

11. 2,000 ㎕ 세척 완충용액을 첨가함

12. 4,500 ×g 에서 10 분 동안 원심분리함

13. 플로우쓰로우를 버리고 새 Falcon 튜브에 필터 칼럼을 넣음

14. 300 ㎕ 사전-가열된 (70℃) 용출 완충용액으로 용출시킴

15. 실온에서 5 분 동안 인큐베이션함

16. 4,500 ×g 에서 2 분 동안 원심분리함

17. 260, 280 및 320 ㎚ 에서 용출물의 OD 를 측정함.

(E) 실험 4 : 결합 완충용액을 포함하는 2-단계 과정

1. 125 ㎕ 프로테이나제 K 를 15 ㎖ Falcon 튜브에 파이펫팅함

2. 1,000 ㎕ EDTA 혈액을 첨가하고, 부드럽게 와류시킴

3. 1,000 ㎕ 분해 완충용액을 첨가하고, 부드럽게 와류시킴

5. 1,000 ㎕ 결합 완충용액을 첨가하고, 부드럽게 와류시킴

6. 새 Falcon 튜브에 스핀 칼럼을 넣음

8. 1,900 ×g 에서 3 분 동안 원심분리함

9. 1,000 ㎕ 저해제 제거 완충용액을 첨가함

10. 4,500 ×g 에서 2 분 동안 원심분리함

11. 2,000 ㎕ 세척 완충용액을 첨가함

12. 4,500 ×g 에서 10 분 동안 원심분리함

14. 300 ㎕ 사전-가열된 (70℃) 용출 완충용액으로 용출시킴

15. 실온에서 5 분 동안 인큐베이션함

16. 4,500 ×g 에서 2 분 동안 원심분리함

17. 260, 280 및 320 ㎚ 에서 용출물의 OD 를 측정함.

인간 DNA 의 수율 [㎍/㎖ 혈액]

	실험 1	실험 2	실험 3	실험 4
(a)	8.72	11.78	21.23	17.96
(b)	8.81	12.57	17.43	17.30
평균	8.77	12.18	19.33	17.63
SD	0.06	0.55	2.68	0.46

(a) 및 (b) 는 반복 실험으로부터 나온 데이타를 나타낸다 ; SD : 표준편차

320 ㎚ 로 보정한 260 ㎚/280 ㎚ 비율에 의해 결정된 DNA 순도

	실험 1	실험 2	실험 3	실험 4
(a)	1.95	1.92	1.87	1.88
(b)	1.96	1.85	1.88	1.84

(a) 및 (b) 는 반복 실험으로부터 나온 데이타를 나타낸다 (표 3 참조)

DNA 의 순도에 관해, 1.8 ±0.1 의 260 ㎚/280 ㎚ 비율 (320 ㎚ 보정을 포함함) 은 허용가능한 것으로 간주된다. 상기 데이타는 본 발명에 따른 방법 즉, 실험 4 의 방법이 실험 3 의 방법과 비교했을 때 (더 높은 순도의 DNA 가 아니라면) 동등하게 순수한 것을 생성한다는 것을 보여주었다.

실시예 3

(A) 시약

a) 분해 완충용액 / 결합 완충용액, 무질서유발성 (7 M [분해 완충용액] / 4 M [결합 완충용액] 구아니디늄 티오시아네이트, 50 mM 트리스-HCl, 20% 트리톤-X100, pH 6.0)

b) 저해제 제거 완충용액 (5 M 구아니디늄 HCl, 20 mM 트리스-HCl, 38% 에탄올, pH 6.6)

c) 세척 완충용액 (20 mM NaCl, 2 mM 트리스-HCl, 80% 에탄올, pH 7.5)

d) 용출 완충용액 (50 mM 트리스, pH 8.1)

e) 에탄올 (무수물)

추가로 필요한 것 : 유리 섬유 필터 칼럼 (예를 들어, Macherey-Nagel 에서 시판하는 NucleoSpin Blood L 과 같은 실리카막이 있는 것)

(B) 실험 5, 1-단계 과정 : 분해 완충용액 : 7 M, 결합 완충용액 없음

1,000 ㎕ EDTA 혈액을 15 ㎖ Falcon 튜브내로 파이펫팅하고 1,000 ㎕ 분해 완충용액 (7 M) 을 첨가하고, 튜브를 와류시켰다. 혼합물을 Thermo Mixer 상에서 56℃ 에서 15 분 동안 인큐베이션하였다. 유리 섬유 필터 칼럼이 있는 새 Falcon 튜브를 제공하고 전 표본 제조물 (약 2,000 ㎕ ; 무질서유발제 농도 3.5 M) 을 필터 칼럼에 이동시켰다. 1,900 ×g 에서 3 분 동안 원심분리한 다음, 1,000 ㎕ 저해제 제거 완충용액을 상기 칼럼에 이동시키고, 4,200 ×g 에서 2 분 동안 또다른 원심분리 단계가 이어졌다. 그 후, 2,000 ㎕ 세척 완충용액을 칼럼에 이동시키고, 이어서 4,200 ×g 에서 10 분 동안 원심분리하였다. 플로우쓰로우를 버리고 필터 칼럼을 새 Falcon 튜브에 넣었다. 500 ㎕ 사전-가열된 (70℃) 용출 완충용액을 이용하여 결합된 핵산을 용출시켰다. 용출 완충용액을 칼럼에 이동시키고 실온에서 5 분 동안 인큐베이션하였다. 4,200 ×g 에서 2 분 동안 원심분리한 다음, 플로우쓰로우를 230, 260, 280 및 320 ㎚ 에서 광학밀도 측정에 의해 분석하였다.

(C) 실험 6, 2-단계 과정 : 분해 완충용액 : 7 M, 결합 완충용액 : 4 M

1,000 ㎕ EDTA 혈액을 15 ㎖ Falcon 튜브내로 파이펫팅하고, 1,000 ㎕ 분해 완충용액 (7 M) 을 첨가하고, 상기 튜브를 와류시켰다. 상기 혼합물을 Thermo Mixer 상에서 56℃ 에서 15 분 동안 인큐베이션하였다. 500 ㎕ 결합 완충용액 (4 M) 을 첨가하고 와류에 의해 혼합시켰다. 유리 섬유 필터 칼럼이 있는 새 Falcon 튜브를 제공하고 전 표본 제조물 (약 2,500 ㎕ ; 무질서유발제 농도 4.5 M) 을 필터 칼럼에 이동시켰다. 1,900 ×g 에서 3 분 동안 원심분리한 다음, 1,000 ㎕ 저해제 제거 완충용액을 상기 칼럼에 이동시키고, 4,200 ×g 에서 2 분 동안 또다른 원심분리 단계가 이어졌다. 그 후, 2,000 ㎕ 세척 완충용액을 칼럼에 이동시키고, 이어서 4,200 ×g 에서 10 분 동안 원심분리하였다. 플로우쓰로우를 버리고 필터 칼럼을 새 Falcon 튜브에 넣었다. 500 ㎕ 사전-가열된 (70℃) 용출 완충용액을 이용하여 결합된 핵산을 용출시켰다. 용출 완충용액을 칼럼에 이동시키고 실온에서 5 분 동안 인큐베이션하였다. 4,200 ×g 에서 2 분 동안 원심분리한 다음, 플로우쓰로우를 230, 260, 280 및 320 ㎚ 에서 광학밀도 측정에 의해 분석하였다.

인간 DNA 의 수율 [㎍/㎖ 혈액]

	실험 5	실험 6
(a)	5.95	11.35
(b)	11.35	13.02
평균	8.65	12.18
SD	3.82	1.18

320 ㎚ 로 보정한 260 ㎚/280 ㎚ 비율에 의해 결정된 DNA 순도

	실험 5	실험 6
(a)	1.92	1.94
(b)	1.88	1.81
평균	1.90	1.88

(a) 및 (b) 는 반복 실험으로부터 나온 데이타를 나타낸다 (표 5 참조)

실시예 4

(A) 시약

a) 분해 완충용액 / 결합 완충용액, 무질서유발성 (7 M [분해 완충용액] / 5 M [분해 완충용액] / 4 M [결합 완충용액] 구아니디늄 티오시아네이트, 50 mM 트리스-HCl, 20% 트리톤-X100, pH 6.0)

c) 세척 완충용액 (20 mM NaCl, 2 mM 트리스-HCl, 80% 에탄올, pH 7.5)

d) 용출 완충용액 (50 mM 트리스, pH 8.1)

e) 에탄올 (무수물)

추가로 필요한 것 : 유리 섬유 필터 칼럼 (예를 들어, Macherey-Nagel 에서 시판되는 NucleoSpin Blood L 과 같은 실리카막이 있는 것)

(B) 실험 7, 1-단계 과정 : 분해 완충용액 : 7 M, 결합 완충용액 없음

1,000 ㎕ EDTA 혈액을 15 ㎖ Falcon 튜브내에 파이펫팅하고, 1,000 ㎕ 분해 완충용액 (7 M) 을 첨가하고, 상기 튜브를 와류시켰다. 상기 혼합물을 Thermo Mixer 상에서 56℃ 에서 15 분 동안 인큐베이션하였다. 유리 섬유 필터 칼럼이 있는 새 Falcon 튜브를 제공하고 전 표본 제조물 (약 2,000 ㎕ ; 무질서유발제 농도 3.5 M) 을 필터 칼럼에 이동시켰다. 1,900 ×g 에서 3 분 동안 원심분리한 다음, 1,000 ㎕ 저해제 제거 완충용액을 상기 칼럼에 이동시키고, 4,200 ×g 에서 2 분 동안 또다른 원심분리 단계가 이어졌다. 그 후, 2,000 ㎕ 세척 완충용액을 칼럼에 이동시키고, 이어서 4,200 ×g 에서 10 분 동안 원심분리하였다. 플로우쓰로우를 버리고 필터 칼럼을 새 Falcon 튜브에 넣었다. 500 ㎕ 사전-가열된 (70℃) 용출 완충용액을 이용하여 결합된 핵산을 용출시켰다. 용출 완충용액을 칼럼에 이동시키고 실온에서 5 분 동안 인큐베이션하였다. 4,200 ×g 에서 2 분 동안 원심분리한 다음, 플로우쓰로우를 230, 260, 280 및 320 ㎚ 에서 광학밀도 측정에 의해 분석하였다.

(C) 실험 8, 2-단계 과정 : 분해 완충용액 : 5 M, 결합 완충용액 : 4 M

1,000 ㎕ EDTA 혈액을 15 ㎖ Falcon 튜브내에 파이펫팅하고, 1,000 ㎕ 분해 완충용액 (5 M) 을 첨가하고, 상기 튜브를 와류시켰다. 상기 혼합물을 Thermo Mixer 상에서 56℃ 에서 15 분 동안 인큐베이션하였다. 500 ㎕ 결합 완충용액 (4 M) 을 첨가하고 와류에 의해 혼합하였다. 유리 섬유 필터 칼럼이 있는 새 Falcon 튜브를 제공하고 전 표본 제조물 (약 2,500 ㎕ ; 무질서유발제 농도 3.5 M) 을 필터 칼럼에 이동시켰다. 1,900 ×g 에서 3 분 동안 원심분리한 다음, 1,000 ㎕ 저해제 제거 완충용액을 상기 칼럼에 이동시키고, 4,200 ×g 에서 2 분 동안 또다른 원심분리 단계가 이어졌다. 그 후, 2,000 ㎕ 세척 완충용액을 칼럼에 이동시키고, 이어서 4,200 ×g 에서 10 분 동안 원심분리하였다. 플로우쓰로우를 버리고 필터 칼럼을 새 Falcon 튜브에 넣었다. 500 ㎕ 사전-가열된 (70℃) 용출 완충용액을 이용하여 결합된 핵산을 용출시켰다. 용출 완충용액을 칼럼에 이동시키고 실온에서 5 분 동안 인큐베이션하였다. 4,200 ×g 에서 2 분 동안 원심분리한 다음, 플로우쓰로우를 230, 260, 280 및 320 ㎚ 에서 광학밀도 측정에 의해 분석하였다.

인간 DNA 의 수율 [㎍/㎖ 혈액]

	실험 7	실험 8
(a)	5.95	7.16
(b)	11.35	12.20
평균	8.65	9.68
SD	3.82	3.57

320 ㎚ 로 보정한 260 ㎚/280 ㎚ 비율에 의해 결정된 DNA 순도

	실험 7	실험 8
(a)	1.92	1.91
(b)	1.88	1.92
평균	1.90	1.92

(a) 및 (b) 는 반복 실험으로부터 나온 데이타를 나타낸다 (표 7 참조)

본 발명에 따라 핵산을 고체상으로 흡착할 수 있으며, 추가로, 생물 표본으로부터 핵산을 단리할 수 있다.

참고 리스트

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Claims

하기 단계를 포함하는, 핵산을 생물 표본으로부터 고체상으로 흡착시키는 방법 :

(a) 무질서유발제를 함유함하는 수성 분해 완충용액을 제공하고 ;

(b) 분해 완충용액을 생물 표본과 혼합하고 (혼합물 내 무질서유발제의 농도는 1 M 내지 4 M 임), 혼합물을 인큐베이션하고 ;

(c) 단계 (b) 의 혼합물 내에 무질서유발제의 추가량을 용해시키거나 혼합물에 추가의 무질서유발제를 함유하는 수용액을 첨가하여, 혼합물 내 무질서유발제의 농도를 0.5 M 초과로 증가시키고 ;

(d) 단계 (c) 의 혼합물을 고체상과 접촉시켜, 핵산을 혼합물로부터 고체상으로 흡착시킴.
제 1 항에 있어서, 무질서유발제는 구아니디늄 히드로클로라이드, 구아니디늄 티오시아네이트, 구아니디늄 이소티오시아네이트, 알칼리 요오다이드 및 알칼리 과염소산염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 및 제 2 항에 있어서, 단계 (a) 의 분해 완충용액이 단백질 분해 활성을 가진 효소를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 단백질 분해 활성을 가진 효소는 카스파제, 프로테이나제 K, 프로나제 E, 바실루스 종 (Bacillus sp) 유래의 단백질분해효소 (에스퍼라제) 및 서브틸리신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 단계 (a) 의 분해 완충용액이 세제를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 단계 (a) 의 분해 완충용액이 세제 및 단백질 분해 활성을 가진 효소를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 단계 (a) 의 분해 완충용액 내 세제가 소듐도데실 설페이트, 리튬 도데실 설페이트, 세틸트리메틸암모늄브로마이드, 데옥시콜린산, 소듐 라우로일 사르코신, 트리톤-X100, 트윈 20, 옥틸 베타-D-글루코시드, Nonidet P40, CHAPS 또는 술포베타인 14 로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 고체상이 실리카 겔, 유리 섬유, 석영 섬유 및 제올라이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 다공성 또는 비-다공성 미네랄 기질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 8 항에 있어서, 고체상이 자기 유리 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
하기 단계를 포함하는, 생물 표본으로부터 핵산을 단리하는 방법 :

(a) 무질서유발제를 함유하는 수성 분해 완충용액을 제공하고 ;

(b) 분해 완충용액을 생물 표본과 혼합하고 (혼합물 내 무질서유발제의 농도가 1 M 내지 4 M 임), 혼합물을 인큐베이션하고 ;

(c) 단계 (b) 의 혼합물 내에 무질서유발제의 추가량을 용해시키거나 혼합물에 추가의 무질서유발제를 함유하는 수용액을 첨가하여, 혼합물 내 무질서유발제의 농도를 0.5 M 초과로 증가시키고 ;

(d) 고체상을 제공하고 단계 (c) 의 혼합물을 고체상과 접촉시켜, 핵산을 상기 혼합물로부터 고체상으로 흡착시키고 ;

(e) 액체상으로부터 고체상을 분리하고 ;

(f) 고체상으로부터 핵산을 용출하여 핵산을 단리함.
제 10 항에 있어서, 단계 (e) 와 단계 (f) 사이에 추가의 단계가 수행되며, 추가의 단계는 세척 완충용액으로 단계의 고체상을 세척하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 단계 (f) 에 뒤따라 추가의 단계가 수행 되며, 추가의 단계는 용출물로부터 단계의 핵산을 침전시키고 침전된 핵산을 단리하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서, 무질서유발제는 구아니디늄 히드로클로라이드, 구아니디늄 티오시아네이트, 구아니디늄 이소티오시아네이트, 알칼리 요오다이드 및 알칼리 과염소산염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서, 단계 (a) 의 분해 완충용액이 단백질 분해 활성을 가진 효소 및 세제를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14 항에 있어서, 단백질 분해 활성을 가진 효소는 카스파제, 프로테이나제 K, 프로나제 E, 바실루스 종 (Bacillus sp) 유래의 단백질분해효소 (에스퍼라제) 및 서브틸리신으로 이루어진 군으로부터 선택되며,

세제는 소듐 도데실 설페이트, 리튬 도데실 설페이트, 세틸트리메틸암모늄브로마이드, 데옥시콜린산, 소듐 라우로일 사르코신, 트리톤-X100, 트윈 20, 옥틸 베타-D-글루코시드, Nonidet P40, CHAPS 또는 술포베타인 14 로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서, 단계 (b) 의 혼합물이 생물 표본, 약 2 M 농도의 구아니디늄 티오시아네이트, 약 25 mM 농도의 트리스염, 약 10 부피/부피% 농도의 트리톤 -X100 및 프로테이나제 K 를 함유하며, 혼합물 내 프로테이나제 K 의 단백질 분해 활성은 약 3 U/㎖ 이며, 혼합물의 pH 는 약 6 인 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서, 단계 (b) 의 혼합물이 생물 표본, 약 2.7 M 농도의 구아니디늄 히드로클로라이드, 약 5 mM 농도의 요소, 약 5 mM 농도의 트리스염, 약 9 부피/부피% 농도의 트리톤-X100 및 프로테이나제 K 를 함유하며, 혼합물 내 프로테이나제 K 의 단백질 분해 활성은 약 3 U/㎖ 이며, 혼합물의 pH 는 4.4 내지 6.5 인 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서, 단계 (b) 의 혼합물이 생물 표본, 약 2.4 M 농도의 구아니디늄 히드로클로라이드, 약 1.6 mM 농도의 요소, 약 85 mM 농도의 트리스염, 약 88 mM 농도의 EDTA, 약 8 mM 농도의 NaCl, 약 9 부피/부피% 농도의 트리톤-X100 및 프로테이나제 K 를 함유하며, 혼합물 내 프로테이나제 K 의 단백질 분해 활성은 약 3 U/㎖ 이며, 혼합물의 pH 는 4.4 내지 6.5 인 것을 특징으로 하는 방법.
제 16 항에 있어서, 단계 (b) 의 혼합물이 약 20℃ 내지 약 75℃ 온도에서 10 분 내지 30 분 동안 진탕 인큐베이션되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서, 고체상은 실리카 겔, 유리 섬유, 석영 섬유 및 제올라이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 다공성 또는 비-다공성 미네랄 기질을 포함하 는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서, 고체상은 자기 유리 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서, 생물 표본은 박테리아 세포, 진핵 세포, 바이러스 또는 이것의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.