CN101869827A - 一种新型亲和介质的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物化学领域，具体地，涉及一种新型亲和介质的制备方法及其应用。根据本发明的亲和介质，其中，所述玻璃粉的粒径范围为0.1-1000μm。本发明将玻璃粉经过表面处理，偶联上特殊物质，制作成层析介质用于生物物质的分离，为玻璃粉的应用开辟了一条崭新的途径，也为生物物质的分离提供了一种有效、价廉的方法。本发明提供了一种价格低廉、性能优良的新型亲和介质，将其直接用作亲和介质，可以避免了许多其他介质如需添加溴化氰等剧毒物的缺点，更加环保，便于操作，保障了科研人员的身体健康。

Description

一种新型亲和介质的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物化学领域，具体地，涉及一种新型亲和介质的制备方法及其应用。

背景技术

亲和层析法是分离蛋白质等生物活性物质最有效的纯化方法，是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。利用亲和层析载体固相化配基与亲和互补物之间通过范德华力、疏水力、静电力、氢键等作用发生专一性的结合而进行分离。这种有选择性地结合主要归结于固相化配基与亲和互补物二者之间的生物学特性和特异的化学结构以及空间构象。在亲和层析过程中，被纯化的生物分子在一定的条件下，选择性地结合到被共价偶联到不溶性载体上的配基上，然后改变原有的条件，如洗脱液pH值、离子强度、有机溶剂的浓度等，有选择性地从载体上把被分离物洗脱下来。通过亲和层析法分离的物质，其纯度、活性回收率及纯化倍数均较高。

亲和层析的载体必须具备以下几个特点：①不溶于水，但高度亲水；②惰性物质，非特异性吸附少；③具有相当量的化学基团可供活化；④理化性质稳定；⑤机械性能好，具有一定的颗粒形式以保持一定的流速；⑥通透性好，最好为多孔的网状结构，使大分子能自由通过；⑦能抵抗微生物和醇的作用。目前常用的载体是琼脂糖胶粒。它具有机械强度高、透性好、载体本身非特异性吸附少等优点。如Pharmacia公司的Sepharose-4B、6B是目前应用较多的基质。但是，由于这些载体技术掌握在国外一些大公司的手中，价格十分昂贵，机械强度不够高，难以实现大规模蛋白质纯化。

玻璃具有理化性质稳定、非特异性吸附少、机械强度高、材料易得、易制备等特性。目前，玻璃板作为DNA和蛋白质的固定基质应用于生化和生物芯片领域；玻璃粉具有价格低廉，通透性好，难与其他物质发生反应等特点，但其仅用于食品、建筑、工业等领域，未用于生物化学领域。本发明将玻璃粉经过表面处理，偶联上特殊物质，制作成层析介质用于生物物质的分离，为玻璃粉的应用开辟了一条崭新的途径，也为生物物质的分离提供了一种有效、价廉的方法。

发明内容

本发明利用玻璃粉价格低廉，流通性好，难与其他物质发生反应等特点，将其直接用作亲和介质，可以避免许多其他介质如需添加溴化氰等剧毒物的缺点，更加环保，便于操作，保障了科研人员的身体健康。

因此，本发明的目的是提供一种新型亲和介质。

本发明的另一目的是提供上述新型亲和介质的应用。

根据本发明的新型亲和介质，其中所述亲和介质的固相载体为玻璃粉。

根据本发明的亲和介质，其中，所述玻璃粉的粒径范围为0.1-1000μm、优选1μm、10μm、50μm、或200μm。

玻璃粉的表面必须经过修饰处理才能够结合上蛋白质。这种修饰处理是指在玻璃粉表面链接上不同的活性基团，从而进一步形成具有不同活性的基团，来固定各种生物大分子如蛋白质、多肽、酶、抗原、抗体、DNA甚至细胞。玻璃粉的修饰处理主要包括清洗和活化两部分，清洗的同时可以使玻璃粉带上富含羟基的活性表面。活化试剂修饰得到含有氨基、巯基或羟基的活化表面，这种表面即可直接与生物大分子连接。活化后的玻璃粉表面根据所连接的基团的不同分为氨基玻璃粉，环氧基玻璃粉，醛基玻璃粉，巯基玻璃粉等。

当使用本发明的亲和介质固定不同的生物大分子或细胞时，根据分离物的特性，本领域普通技术人员基于公知常识和现有技术可以选择适当的活化试剂处理玻璃粉表面，以使其表面连接合适的活性基团，从而制备得到氨基玻璃粉，环氧基玻璃粉，醛基玻璃粉，巯基玻璃粉等。例如：

一、制备氨基玻璃粉

1、将玻璃粉用1M的NaOH浸泡2小时；

2、将玻璃粉浸泡于1％3-氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇中，摇床上室温摇1小时；

3、95％乙醇清洗两次，离心甩干；

4、150℃真空烘干；

二、制备醛基玻璃粉

1、将上述氨基玻璃粉放入到含有12.5％的戊二醛磷酸缓冲液中室温摇3小时，洗净；

2、150℃真空烘干；

使用这种方法固定的醛基可与蛋白质的氨基通过形成碳-氮键结合，从而实现与蛋白质相连。

三、环氧基玻璃粉

1、将玻璃粉用1M的NaOH浸泡2小时；

2、将玻璃粉浸泡于1％3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷[3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane，GPTMS]的甲醇中，摇床上室温摇1小时；

3、95％甲醇清洗两次，离心甩干；

4、150℃真空烘干。

使用这种方法在玻璃表面引入环氧乙烷基团，最后与氨基发生反应生成仲胺，从而实现与蛋白质相连。

四、制备巯基玻璃粉

1、将玻璃粉在铬酸中浸泡过夜，并且清洗干净；

2、配1％3-巯基丙基乙氧基硅烷[3-Mercaptopropyltrimethoxysilane，MPS]的乙醇溶液(pH4.5用乙酸调pH值)；

3、用上述溶液浸泡玻璃粉30分；

4、用pH4.5的乙醇-乙酸混合液清洗玻璃粉；

5、150℃真空烘干。

使用这种方法可使带有巯基的玻璃粉直接与蛋白质中的二硫键反应而使蛋白质固定在玻璃粉上。由于二硫键与巯基的特异性结合，可以有效的避免生物分子中其他基团非特异的与巯基结合。

本发明还提供了上述新型亲和介质的应用，其可以用于分离蛋白、核酸、或细胞。

在使用本发明的亲和介质时，根据分离物的特性，本领域普通技术人员可以根据本领域的公知常识和现有技术确定具体的分离纯化条件，如蛋白偶联pH的选择、硅烷化玻璃粉与BSA饱和偶联量的确定、硅烷化玻璃粉封闭液的选择等。

本发明提供了一种价格低廉、性能优良的新型亲和介质，将其直接用作亲和介质，可以避免了许多其他介质如需添加溴化氰等剧毒物的缺点，更加环保，便于操作，保障了科研人员的身体健康。

附图说明

图1显示硅烷化玻璃粉封闭条件选择，1：乙酰胺；2：甲酰胺；3：Tween-20；4：TritonX-100；5：(NH₄)₂SO₄；6：甘氨酸；7：过硫氨酸；8：三乙醇胺；9：NH₄CL；10：Tris。

图2显示BSA偶联的玻璃粉提取BSA抗体的结果，1：蛋白质Marker；2：抗体标准；3：含抗BSA抗体的血清；4：结合后上清；5：PB洗；6：NaCl洗脱；7：洗脱下BSA抗体。

图3显示c-myc多肽偶联的玻璃粉提取c-myc抗体的结果，1：抗体标准；2：c-myc腹水；3：结合后上清；4：NaCl洗脱；5、6：洗脱下c-myc抗体；7、8：洗脱下的TCA沉淀的c-myc抗体；9：BSA。

具体实施方式

制备实施例1、制备氨基玻璃粉

1、将玻璃粉(粒径为0.1μm、1μm、10μm、50μm、200μm、1000μm)用1M的NaOH浸泡2小时；

2、将玻璃粉浸泡于1％3-氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇中，摇床上室温摇1小时；

3、95％乙醇清洗两次，离心甩干；

4、150℃真空烘干；

制备实施例2

使用玻璃粉的粒径为1200μm，以与制备实施例1相同的方法制备氨基玻璃粉。

制备实施例3、制备醛基玻璃粉

1、将上述制备实施例1制备的氨基玻璃粉放入到含有12.5％的戊二醛磷酸缓冲液中室温摇3小时，洗净；

2、150℃真空烘干。

制备实施例4、环氧基玻璃粉

1、将玻璃粉(粒径为0.1μm、10μm、50μm、200μm、1000μm)用1M的NaOH浸泡2小时；

2、将玻璃粉浸泡于3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷[3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane，GPTMS]的甲醇中，摇床上室温摇1小时：

3、95％甲醇清洗两次，离心甩干；

4、150℃真空烘干。

制备实施例5、制备巯基玻璃粉

1、将玻璃粉(粒径为0.1μm、10μm、50μm、200μm、1000μm)在铬酸中浸泡过夜，并且清洗干净；

2、配1％3-巯基丙基乙氧基硅烷[3-Mercaptopropyltrimethoxysilane，MPS]的乙醇溶液(pH4.5用乙酸调pH值)；

3、用上述溶液浸泡玻璃粉30分；

4、用pH4.5的乙醇-乙酸混合液清洗玻璃粉；

5、150℃真空烘干。

应用实施例1、分离牛血清白蛋白(BSA)抗体

1、玻璃粉的硅烷化修饰

1)将玻璃粉(粒径为0.1μm、10μm、50μm、200μm 1000μm)浸泡于1MNaOH溶液中，震荡2小时；

2)蒸馏水洗涤5次，每次3000r/min离心4分钟，去除洗液；

3)无水甲醇洗涤2次，每次3000r/min离心4分钟，去除洗液；

4)用1％氨丙基三甲氧基硅烷甲醇溶液硅烷化反应，震摇2小时；

5)用无水甲醇洗涤一次，用滤纸过滤除去甲醇，倒扣于硫酸纸上，真空150℃烘箱内烘烤过夜。

2、不同半径的玻璃粉与BSA偶联量的对比

使用制备实施例1-2制备的氨基玻璃粉，分别取40mg的玻璃粉与200μg的BSA在pH9.0的磷酸缓冲液中过夜反应，离心后测上清。通过上清残留的BSA量换算出每毫克玻璃粉与BSA的偶联量。

每毫克制备实施例1-2制备的氨基玻璃粉与BSA的偶联量如下表所示：

表1

氨基玻璃粉半径(单位：μm)	每毫克的氨基玻璃粉与BSA的偶联量(μg)
		0.1	4.8
1	4.6
		10	4.4
50	4.3
		200	4.0
1000	3.1
		1200	2.8

由表1可以看出，随着玻璃粉颗粒的减小，与BSA的偶联量逐步上升，但玻璃粉的颗粒太小会增加离心沉淀的难度和降低流速，所以通常选用50μm的玻璃粉。

3、硅烷化玻璃粉封闭液选择

1)分别配置1％乙醇胺，甲酰胺，tween-20，tritonX-100，硫酸胺，甘氨酸，过硫酸铵，三乙醇胺，氯化铵，Tris溶于pH7.4的TBS溶液中；

2)40mg玻璃粉(粒径1μm)与100μgBSA偶联过夜，并用PBS洗一次；

3)分别用上述封闭液封闭过夜；

4)将25μl的血清加入到玻璃粉中，反应1小时，并用PBS洗4次；

5)用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果显示tween-20的封闭效果最好(如图1所示)。

4、用BSA偶联的玻璃粉提取BSA抗体

1)100mg的硅烷化玻璃粉(粒径50μm)与280μg的BSA在pH9.0的磷酸缓冲液中偶联过夜，并用PBS洗一次；

2)1％tween-20的TBS溶液封闭，PBS洗2次；

3)向玻璃粉中加入800μl的PBS和200μl的含有羊抗BSA的血清，反应1小时，并用PBS清洗3次；

4)用1ml 0.3M NaCl/0.1％tritonX-100/pH7.4Tris溶液洗涤3次；

5)用pH11.5的三乙醇胺溶液洗脱；并用聚丙烯酰胺凝胶电泳检验，结果表明用此法可以提取较纯的BSA抗体，每毫克玻璃粉大约能够提取1μg的抗体(结果如图2所示)。

应用实施例2、用c-myc多肽偶联的玻璃粉提取c-myc抗体

1)100mg的硅烷化玻璃粉(粒径100μm)与100μg的c-myc多肽在pH pH9.0的磷酸缓冲液中偶联过夜，并用PBS洗一次；

2)1％tween-20的TBS溶液封闭，PBS洗2次；

3)向玻璃粉中加入900μl的PBS和100μl的含有c-myc抗体的腹水，反应1小时，并用PBS清洗3次；

4)用1ml 0.3M NaCl/0.1％tritonX-100/pH7.4Tris溶液洗涤3次；

5)用pH11.5的三乙醇胺溶液洗脱，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳检验，结果表明用此法可以提取很纯的c-myc抗体(结果如图3所示)。

Claims (8)

1.一种新型亲和介质，其特征在于，所述亲和介质的固相载体为玻璃粉。

2.根据权利要求1所述的亲和介质，其特征在于，所述玻璃粉的粒径范围为0.1-1000μm。

3.根据权利要求2所述的亲和介质，其特征在于，所述玻璃粉的粒径范围为1μm、10μm、50μm、或200μm。

4.根据权利要求1所述的亲和介质，其特征在于，所述玻璃粉表面连接有活化基团。

5.根据权利要求4所述的亲和介质，其特征在于，所述活化基团为氨基、巯基、环氧基、或醛基。

6.权利要求1所述的新型亲和介质的应用。

7.权利要求1所述新型亲和介质用于分离小分子化合物、蛋白、核酸、或细胞的应用。

8.玻璃粉作为亲和介质的固相载体的应用。

Images