JP6781154B2 - リガンドの固定化方法 - Google Patents

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Description

本発明は、ホルミル基含有不溶性基材にリガンドを強固に固定化するための方法であって、当該リガンドの漏出が顕著に抑制された吸着体などの製造を可能にする方法に関するものである。
特定の化合物への特異的親和性を有するペプチドや、酵素の基質などの生理活性物質は、不溶性の基材に固定化することにより、固定化された生物活性物質と相互作用する物質を回収したり、検出したりできることからその利用性が高まる。例えば、アフィニティークロマトグラフィーでは、標的化合物と特異的に結合する生物活性物質をリガンドとして不溶性多孔性ビーズに固定化することで、混合液の中から標的化合物のみを効率良く回収することが可能になる。アフィニティークロマトグラフィーの産業利用例としては、固定化されたタンパク質を用いた免疫グロブリンの分離や固定化された抗体を用いた抗原の分離が挙げられる。
リガンドを不溶性基材に固定化する形態としては、固定化されたリガンドの漏出を低減するために、強固な共有結合で固定化されていることが産業利用上極めて重要である。また同時に、固定化されているリガンドの状態も重要であり、リガンドが活性を維持したまま固定化されていることが好ましい。
不溶性基材にリガンドを固定化する方法としては、例えば、不溶性基材にエポキシ基を導入し、リガンド中のチオール基やアミノ基と反応させる方法がある。しかし、リガンドがタンパク質である場合、システイン残基の側鎖チオール基はジスルフィド結合の形成によりタンパク質の高次構造の安定化に関与していることがあり、かかるジスルフィド結合を還元してチオール基にするとタンパク質の高次構造が変化し、標的化合物への親和性が低下してしまうおそれがある。また、エポキシ基にアミノ基を反応させる方法では、低い反応収率が問題となっていた。
そこで、不溶性基材に固定化するために、基材にホルミル基を導入し、当該ホルミル基とアミノ基を有するリガンドとを反応させてイミンとし、イミノ基を還元することで安定なアミンとする還元的アミノ化反応により固定化する方法が開発されている（特許文献１等）。
国際公開第２０１０／０６４４３７号パンフレット
上述したように、還元的アミノ化反応によりアミノ基を有するリガンドを不溶性基材に固定化して吸着体を製造する方法が開発されている。
しかし本発明者らは、当該方法で得られた吸着体を使う場合でも、例えばアフィニティークロマトグラフィー中にリガンドが不溶性多孔性ビーズから脱落することを見出した。脱落したリガンドは溶出液に混入し、ひいては標的化合物にも混入する。また、分析機器のセンサーに固定化されたリガンドの脱落は、機器性能の安定性を損なう。
そこで本発明は、ホルミル基含有不溶性基材にリガンドを強固に固定化するための方法であって、当該リガンドの漏出が顕著に抑制された吸着体などの製造を可能にする方法を提供することを目的とする。また、本発明は、上記方法により製造された吸着体を使って標的化合物を精製するための方法を提供することも目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、還元剤として用いるボラン錯体の配位子であるルイス塩基のｐＫaとリガンドの脱落との間に密接な関係があることを見出して、本発明を完成した。
以下、本発明を示す。
［１］ ホルミル基含有不溶性基材に、標的化合物に対する特異的親和性を有し且つアミノ基を有するリガンドを固定化する方法であって、
上記リガンドと上記ホルミル基含有不溶性基材とを混合することによりイミンを形成する工程、および、
ｐＫaが６．５以下のルイス塩基を配位子とするボラン錯体を用いてイミンを還元する工程を含むことを特徴とする方法。
［２］ 上記ルイス塩基として、窒素含有複素環式芳香族化合物、および／または、置換基としてアミノ基を有する芳香族炭化水素化合物を用いる上記［１］に記載の方法。
［３］ 上記リガンドとしてペプチドを用いる上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］ 上記ペプチドとして抗体アフィニティーリガンドを用いる上記［３］に記載の方法。
［５］ 上記抗体アフィニティーリガンドとして、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬまたはそれらの類縁体を用いる上記［４］に記載の方法。
［６］ 上記ホルミル基含有不溶性基材が、多糖類、合成ポリマーおよびガラスからなる群より選択される少なくとも１種により構成されているものである上記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］ 上記ホルミル基含有不溶性基材がセルロースまたはアガロースにより構成されているものである上記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［８］ 上記ホルミル基含有不溶性基材の形状が多孔性ビーズ、モノリスまたは多孔性膜である上記［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］ 上記標的化合物を精製するための方法であって、
上記［１］〜［８］のいずれかに記載の方法により上記ホルミル基含有不溶性基材に上記リガンドを固定化して吸着体を製造する工程、および、
上記標的化合物を含む混合液と上記吸着体とを接触させることにより、上記標的化合物を上記吸着体に吸着させる工程を含むことを特徴とする方法。
本発明方法によれば、従来方法に比してリガンドがより確実に不溶性基材へ固定化され、その漏出が顕著に抑制される。よって、本発明方法は、不純物混入量が低減された高純度の標的化合物が得られる特異的吸着体を製造可能なものとして、産業上非常に優れている。
図１は、還元剤として用いるボラン錯体の配位子アミンのｐＫaとリガンド漏出量との関係を示すグラフである。 図２は、様々なリガンド固定化吸着体のリガンド漏出量試験の結果を示すグラフである。
以下、本発明を工程毎に説明する。
１． 不溶性基材へのホルミル基の導入工程
ホルミル基含有不溶性基材が市販されているなどして入手可能である場合は本工程の実施は必要ないが、入手できない場合は、公知方法に従って不溶性基材へホルミル基を導入する。
不溶性基材は、水など、標的化合物を含む混合液の溶媒に対して不溶性を示し、且つ、標的化合物を吸着すべきものであれば特に制限されない。例えば、クロマトグラフィー用充填剤に用いられる多孔性ビーズ、標的化合物を検出するための分析機器のバイオセンサ、標的化合物の分離回収や分析などに用いられるモノリス、標的化合物の分離回収や夾雑物の除去などに用いられる多孔性膜、プロテインマイクロアレイなどのチップなどを挙げることができる。分析機器のバイオセンサとしては、表面プラズモン共鳴やバイオレイヤー干渉法を利用した分析機器のセンサーチップを挙げることができる。
不溶性基材を構成する材料としては、水に対して不溶性を示すものであれば特に制限されないが、例えば、セルロース、アガロース、デキストラン、デンプン、プルラン、キトサン、キチンなどの多糖類；ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（メタ）アクリル酸エステル、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコールなどの合成ポリマー、およびその架橋体；シリカガラス、ホウケイ酸ガラス、光学ガラス、ソーダガラスなどのガラスを挙げることができる。また、ポリスチレンやスチレン−ジビニルベンゼン共重合体など官能基を有さない合成ポリマーからなる基材の表面を、水酸基などの反応性官能基を有する高分子材料でコーティングしてもよい。かかるコーティング用高分子材料としては、ヒドロキシエチルメタクリレートや、ポリエチレンオキサイド鎖を有する単量体と、反応性官能基を有する他の重合性単量体との共重合体のようなグラフト共重合体などを挙げることができる。上記材料の中では多糖類やポリビニルアルコール等が、基材表面に活性基を導入しやすいため、好ましく用いられる。
不溶性基材である多孔性ビーズの大きさは適宜調整すればよいが、例えば、体積平均粒径で２０μｍ以上１０００μｍ以下とすることが好ましい。当該体積平均粒径が２０μｍ以上であれば、カラムに充填した際における背圧を低く抑えることが可能になる。一方、当該体積平均粒径が１０００μｍ以下であれば、表面積が大きくなって標的化合物の吸着量が大きくなる。当該体積平均粒径としては、３０μｍ以上がより好ましく、４０μｍ以上がさらに好ましく、５０μｍ以上がよりさらに好ましく、６０μｍ以上がよりさらに好ましく、また、２５０μｍ以下がより好ましく、１２５μｍ以下がさらに好ましく、１００μｍ以下がよりさらに好ましく、８５μｍ以下がよりさらに好ましい。多孔性ビーズの体積平均粒径は、ランダムに選んだ１００個の多孔性ビーズの粒径を測定して求めることができる。個々の多孔性ビーズの粒径は、個々の多孔性ビーズの顕微鏡写真を撮影して電子データとして保存し、粒径測定ソフトウェア（例えば、メディアサイバーネティックス社製「イメージプロプラス」）を用いて測定することができる。多孔性ビーズは、強度向上などのため、常法に従って、多官能化合物により架橋することが好ましい。
モノリスは、多孔質連続構造体の一種であり、構造を支える骨格と空孔とが一体となったスポンジ状の構造体である。モノリスは優れた物質移動性や圧流速特性を示し、その空孔サイズおよび骨格サイズを制御することで、標的化合物の吸着効率や分離効率の向上、通液性の向上、或いは検出感度の向上が可能である。構造体が連続的に多孔質であることは、走査型電子顕微鏡観察などを用いて、異なる断面において構造が同様の空孔を有していることを確認することで判断できる。
多孔性膜としては、平膜、ホロファイバー、デプスフィルター構造などの形態を有するものを挙げることができる。
モノリスや多孔性膜など空孔を有する不溶性基材において、空孔径は捕捉対象である標的化合物や通液速度などに応じて適宜調整すればよいが、例えば、１ｎｍ以上、１０μｍ以下程度とすることができる。例えば、標的化合物が抗体または抗体断片である場合、空孔径は１０ｎｍ以上、３００ｎｍ以下程度とすることが特に好ましい。
原材料を不溶性基材にする方法としては、公知方法を用いればよい。例えば多孔性ビーズの場合、原料高分子の溶液または分散液を、油脂などに分散させることにより液滴化した上で、アルコールやアルコール水など前記溶液または分散液の溶媒と混和可能な溶媒と接触させることにより、多孔性粒子化すればよい。
不溶性基材にホルミル基を導入するためには、不溶性基材を構成する原材料やコーティング材料の官能基を利用すればよい。例えば、原材料として多糖類を用いた場合には、多数の水酸基が存在する。当該水酸基にエピクロロヒドリンなどのハロヒドリンを反応させることにより、エポキシ基を導入することができる。或いは、架橋剤としてポリエポキシド化合物を用いた場合には、未反応のエポキシ基が残ると考えられる。エポキシ基は酸性水溶液または塩基性水溶液により容易に開環する。開環したエポキシ基は１，２−ジオール基となり、当該１，２−ジオール基は酸化剤で酸化することによりホルミル基とすることができる。
水酸基をホルミル基に酸化するための酸化剤としては、例えば、過ヨウ素酸や過ヨウ素酸塩を用いることができる。過ヨウ素酸塩としては、過ヨウ素酸ナトリウムや過ヨウ素酸カリウムを挙げることができる。
ホルミル基含有不溶性基材におけるホルミル基含量は、特に限定されないが、ホルミル基含有不溶性基材１ｍＬあたり０．５μｍｏｌ以上１００μｍｏｌ以下であることが好ましい。ホルミル基含量がホルミル基含有不溶性基材１ｍＬあたり０．５μｍｏｌ以上であれば、アフィニティーリガンドを効率良く固定化でき、吸着体として用いた場合に、目的物の吸着量が大きくなるため好ましい。また、理由は定かではないが、驚くべきことに、ホルミル基含量がホルミル基含有不溶性基材１ｍＬあたり１００μｍｏｌ以下であれば、目的物の吸着量が大きくなりやすい。また、過ヨウ素酸および／または過ヨウ素酸塩を作用させてホルミル基を導入する方法を用いる場合、ホルミル基含有不溶性基材１ｍＬあたりのホルミル基含量が１００μｍｏｌ以下であれば、ホルミル基含有不溶性基材の強度が大きくなりやすいため好ましい。上記ホルミル基含量としては、ホルミル基含有不溶性基材１ｍＬあたり１μｍｏｌ以上がより好ましく、１．５μｍｏｌ以上がさらに好ましく、２μｍｏｌ以上がよりさらに好ましく、また、５０μｍｏｌ以下がより好ましく、２５μｍｏｌ以下がさらに好ましく、１０μｍｏｌ以下がよりさらに好ましく、７μｍｏｌ以下がよりさらに好ましい。ホルミル基含量は、例えば、ホルミル基導入反応の、時間、温度、過ヨウ素酸および／または過ヨウ素酸塩などのホルミル化剤の濃度などによって調整することができる。なお、本発明において、上記ホルミル基含量などの基準となるホルミル基含有不溶性基材の容積は、モノリスや多孔性膜などに関しては空孔および骨格を含んだ構造体全体の体積であり、多孔性ビーズなどに関しては、特に記載が無い限りタッピング体積をいうものとする。タッピング体積は、多孔性ビーズなどと逆浸透膜水とを含むスラリーを計量容器に投入し、振動を与えながらそれ以上体積が減少しなくなるまで沈降させた状態の体積をいう。
ホルミル基含量は、ホルミル基含有不溶性基材にフェニルヒドラジン溶液を加え、４０℃で１時間撹拌し、反応後の上澄みの吸収スペクトルをＵＶで測定し、フェニルヒドラジンの検量線からフェニルヒドラジン減少量を測定することによって測定することができる。
２． リガンドへのアミノ基の導入工程
リガンドがアミノ基を有する場合は本工程の実施は必要ないが、アミノ基を有さない場合には、アミノ基を導入する。
本発明において不溶性基材に結合させるリガンドとは、標的化合物に特異的な分子間の親和性に基づいて、ある分子の集合から標的化合物に選択的に結合できる物質をいう。リガンドは、標的化合物に対する親和性を有するものであり、例えば、ペプチド、糖鎖、酵素の基質化合物、ＤＮＡなどを挙げることができる。本発明においてペプチドとは、２以上のアミノ酸がペプチド結合により結合している化合物であって、標的化合物に特異的な親和性を有するものをいい、例えば、基質化合物に結合する受容体タンパク質、抗原に対する抗体、糖鎖に結合できるレクチンなど、標的化合物に特異的な親和性を有するタンパク質、また、標的化合物への特異的親和性が維持されているタンパク質のサブユニットやドメイン、Ｆａｂ領域などの抗体断片などを挙げることができる。
リガンドとして用い得るペプチドとしては、例えば、抗体アフィニティーリガンドを挙げることができる。抗体アフィニティーリガンドとしては、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、プロテインＨ、プロテインＤ、プロテインＡｒｐ、プロテインＦｃγＲ、抗体結合性合成リガンド、およびそれらの類縁体が挙げられる。なお、本発明においてこれら抗体アフィニティーリガンドの類縁体とは、上記プロテインＡなどを構成する１以上のアミノ酸を欠失、置換および／または付加したものであって、標的抗体またはその断片に対する親和性が天然型に対して維持または改善された改変体や、標的抗体またはその断片に対する親和性が維持されたそのサブユニットやドメインをいう。上記改変体における欠失などの変異の数の上限は、元となるペプチドを構成するアミノ酸などにもよるが、例えば２０以下とすることができ、１０以下または５以下が好ましく、３以下または２以下がより好ましい。
酵素の基質化合物や糖鎖でアミノ基が存在しない場合には、アミノ基を導入する。なお、当業者であれば、基質化合物や糖鎖に存在する官能基をアミノ基に変換したり、官能基を利用してアミノ基を導入することは容易である。リガンドにすべきペプチドにはＮ末端にしかアミノ基が存在しない場合や側鎖アミノ基が十分に存在しない場合には、遺伝子組み換え技術や合成技術などにより任意の部位にリジン等の塩基性アミノ酸やその誘導体を導入したり置換することもできる。また、ＤＮＡや糖に利用可能なアミノ基が存在しなかったり不十分である場合には、同様の技術によりアミノ基を導入可能である。
本発明においてリガンドが標的とする化合物は、精製や検出の対象であり、リガンドが特異的に結合可能であればよく、特に限定されない。例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、プロテインＨ、プロテインＤ、プロテインＡｒｐ、プロテインＦｃγＲなどの抗体結合性合成リガンドと結合する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）および免疫グロブリンＧ誘導体；レクチンと結合する糖タンパク質；リシンと結合するプラスノミノーゲン；アビジンと結合するビオチン；プロテアーゼ阻害剤と結合するプロテアーゼ；トリアジンと結合するヌクレオチド結合タンパク質；ガゼインあるいはチロシンと結合するｓｒｃキナーゼなどが挙げられる。上記免疫グロブリンＧ誘導体には、各抗体結合性合成リガンドと結合する抗体断片が含まれる。
３． リガンドと不溶性基材の反応工程
本工程では、標的化合物に対する特異的親和性を有し且つアミノ基を有するリガンドとホルミル基含有不溶性基材とを混合することにより、リガンドに含まれるアミノ基と不溶性基材に含まれるホルミル基との間でイミンを形成する。
リガンドと不溶性基材とのイミノ化反応の反応液のｐＨとしては、アミノ基含有リガンドの固定化量及び／または固定化率がより大きくなるため、１０．０以上、１３．０未満の範囲が好ましい。当該ｐＨの測定は、ｐＨが３〜５、６〜７、９〜１０の標準液を用いて３点校正を行ったｐＨ計にて測定することができる。なお、本発明では、「リガンド導入量」を「リガンド固定化量」と同義で用いる。
上記イミノ化反応の溶媒としては、ｐＨの安定性の観点から緩衝液が好ましい。本発明で用いることができる緩衝液については特に限定はなく、従来公知の緩衝液を好適に用いることができる。
上記イミノ化反応の温度は適宜調製すればよいが、−１０℃以上、４０℃以下が好ましい。反応温度が−１０℃以上であれば、反応液の流動性の観点から好ましく、４０℃以下であれば、アフィニティーリガンドや不溶性基材のホルミル基が失活し難いため好ましい。当該反応温度としては−５℃以上がより好ましく、０℃以上がさらに好ましく、また、３５℃以下がより好ましく、３０℃以下がさらに好ましい。
反応時間は、リガンドと不溶性基材が十分に反応するまでとすればよく、具体的には予備実験などで決定すればよいが、例えば、１時間以上、５０時間以下程度とすればよい。
反応後、常法に従って後処理をしてもよいが、イミノ基は比較的不安定であることから、そのまま次工程に進むことが好ましい。
４． イミノ基の還元工程
本工程では、前工程においてリガンドのアミノ基と不溶性基材のホルミル基との間で形成されたイミノ基を、ｐＫa６．５以下のルイス塩基を配位子とするボラン錯体を用いて還元する。このようなボラン錯体を用いることにより、不溶性基材のホルミル基とリガンドのアミノ基とで形成されたイミノ基を十分に還元することができ、リガンドがより確実に不溶性基材へ固定化され、その漏出が顕著に抑制されるものと推測される。
上記ｐＫaは、上記ルイス塩基の２５℃の水中における酸解離定数Ｋaの−ｌｏｇ値である。本発明者らは、当該ｐＫaが６．２から６．６に変化する間にリガンド漏出量が急激に増加する一方で、当該ｐＫaが６．５以下であればリガンド漏出量を顕著に低減できることを実験的に見出した。より具体的には、後記の実施例の条件において、リガンドの漏出量を５０ｐｐｍ以下にすることができる。当該漏出量としては、４０ｐｐｍ以下がより好ましく、３０ｐｐｍ以下がさらに好ましく、２５ｐｐｍ以下がよりさらに好ましい。
また、担体である不溶性基材にホルミル基が残存していると、標的化合物以外の化合物が当該ホルミル基へ非特異的に吸着し、標的化合物のみを選択的に吸着できなくなるおそれがあり得る。上記のルイス塩基とボランとの錯体には、上記イミンを還元する他、リガンドが反応することなく残留しているホルミル基を不活性化し、上記の非特異的吸着を低減する目的も有する。
上記ｐＫaとしては６．４以下が好ましく、６．３以下がより好ましく、６．２以下がさらに好ましい。一方、ｐＫaの下限は特に制限されず、ｐＫaが低いルイス塩基を有するボラン錯体を用いるほど吸着体のリガンド量は低減される傾向があると考えられるが、ｐＫaが過剰に低いとボランと錯体を形成し難くなるおそれがあり得るため、０．２以上が好ましく、０．５以上または１．０以上がより好ましく、２．０以上、３．０以上、４．０以上がよりさらに好ましく、５．０以上がよりさらに好ましい。
本発明で用いるルイス塩基は、電子対をボランに供与して錯体を形成可能な化合物であり、そのｐＫaが６．５以下を示すものであって、イミンのイミノ基に対して優れた還元作用を発揮する化合物をいう。
本発明で用いるルイス塩基としては、例えば、そのｐＫaが６．５以下を示す、アミン、ホスフィン、フェノール、アミド、ウレア、オキシムを挙げることができる。
ｐＫaは、窒素原子の非共有電子対が芳香環と共役している場合には低下する傾向がある。よって、本発明で用いるｐＫa≦６．５のアミンとしては、窒素含有複素環式芳香族化合物、および／または、置換基としてアミノ基を有する芳香族炭化水素化合物を挙げることができる。
本発明における「窒素含有複素環式芳香族化合物」は、芳香環内に少なくとも１個の窒素原子を含有する芳香族化合物であってｐＫa値が６．５以下である化合物を意味し、例えば、ピロール等の５員窒素含有複素環式芳香族化合物；ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン等の６員窒素含有複素環式芳香族化合物；キノリン、イソキノリン、フタラジン、キナゾリン、キノキサリン等の縮合窒素含有複素環式芳香族化合物を挙げることができる。
「置換基としてアミノ基を有する芳香族炭化水素化合物」は、１以上のアミノ基が置換基として芳香環に直接結合している芳香族炭化水素化合物であってｐＫa値が６．５以下である化合物をいう。アミノ基としては、−ＮＨ2、モノＣ1-6アルキルアミノ基、ジ（Ｃ1-6アルキル）アミノ基を挙げることができる。置換基としてのアミノ基の数は、置換数が増えるほどｐＫa値が大きくなる傾向にあるので、１個または２個が好ましい。芳香族炭化水素化合物としては、例えば、ベンゼン、ナフタレン、ビフェニルなどのＣ6-12芳香族炭化水素化合物を挙げることができる。
上記窒素含有複素環式芳香族化合物は、ｐＫa値が６．５以下である限りアミノ基を含む置換基を有していてもよく、上記芳香族炭化水素化合物は、ｐＫa値が６．５以下である限りアミノ基以外の置換基を有していてもよい。アミノ基以外の置換基としては、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基、水酸基、ハロゲン原子、シアノ基およびニトロ基からなる群より選択される１以上を挙げることができる。
実際には、置換基の種類や数によりｐＫa値は変化するので、ｐＫa値が記載されている資料や実測などによりｐＫa値が６．５以下であるアミンを選択すればよい。例えば、上記窒素含有複素環式芳香族化合物および芳香族炭化水素化合物としては、ピリジン；α−ピコリン、β−ピコリン、γ−ピコリンなどのピコリン；ジフェニルアミン；ｏ−トルイジン、ｍ−トルイジン、ｐ−トルイジンなどのトルイジン；ピロールなどを挙げることができるが、これらに制限されるものではない。
その他、脂肪族アミンであっても、置換基の種類や数によってはｐＫa値が６．５以下になる場合がある。例えば、ｐＫa値が６．５以下である脂肪族アミンとしては、ヒドロキシルアミン、メトキシアミン、Ｎ−メチルヒドロキシルアミン、Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミンなどのヒドロキシルアミンまたはアルコキシアミン；シアノメチルジエチルアミン、ジ（シアノメチル）アミン、ジ（シアノエチル）アミンなどのシアノＣ1-6アルキルアミンを挙げることができる。
ｐＫa値が６．５以下であるホスフィンとしては、例えば、電子吸引性基を有する第三級ホスフィンと、第二級ホスフィンおよび第一級ホスフィンを挙げることができる。電子吸引性基を有する第三級ホスフィンとしては、例えば、２−シアノエチルジＣ1-6アルキルホスフィン、フェニルジＣ1-6アルキルホスフィン、ジ（２−シアノエチル）Ｃ1-6アルキルホスフィン、トリフェニルホスフィンおよびトリ（２−シアノエチル）ホスフィンを挙げることができる。第二級ホスフィンとしては、ジＣ1-6アルキルホスフィン、ジフェニルホスフィンおよびジ（２−シアノエチル）ホスフィンを挙げることができる。第一級ホスフィンとしては、Ｃ1-6アルキルホスフィンを挙げることができる。
ｐＫa値が６．５以下であるフェノールとしては、ｏ位またはｐ位に電子吸引性の置換基を有するフェノールを挙げることができる。例えば、２，４−ジニトロフェノール、２−クロロフェノール、２−ブロモフェノール、４−ニトロフェノールを用いることができる。
ｐＫa値が６．５以下であるアミドとしては、例えば、シアナミド、Ｃ1-6アルキルシアナミド、アセトアミドを挙げることができる。
ｐＫa値が６．５以下であるウレアとしては、例えば、ウレア、ニトロウレアおよびチオウレアを挙げることができる。
ｐＫa値が６．５以下であるオキシムとしては、例えば、オキサミドオキシム、ベンズアミドオキシム、α−フェニルアセトアミドオキシム、スクシンアミドオキシムおよびトルアミドオキシムを挙げることができる。
上記ボラン錯体は、一般にナトリウムボロハイドライドより製造したジボランと配位子となるルイス塩基を反応させることにより製造可能である。
還元反応の溶媒としては、水系溶媒が好ましい。水系溶媒とは、水；緩衝液などの水溶液；水混和性有機溶媒；または水溶液と水混和性有機溶媒との混合溶媒を挙げることができる。水混和性有機溶媒とは、水と無制限に混和可能な有機溶媒をいい、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどの低級アルコール系溶媒；ジメチルホルムアミドやジメチルアセトアミドなどのアミノ系溶媒；ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド系溶媒を挙げることができる。
本工程の還元反応において水系溶媒を用いれば、有機溶媒を用いる場合に比べ、固定化するリガンドの変性や変質を抑制できることから好ましい。但し、アミン−ボラン錯体は水に対して不溶性を示すことがあることから、用いるアミン−ボラン錯体の水溶性に応じて適量の水混和性有機溶媒を配合してもよい。水系溶媒における水混和性有機溶媒の濃度としては、例えば５０質量％以下が好ましく、２５質量％以下がより好ましく、１０質量％以下がさらに好ましく、水または水溶液を用いることが特に好ましい。
本工程の還元反応の反応液のｐＨとしては、２以上、１２未満の範囲が好ましい。当該ｐＨが２以上であれば、イミノ基の分解や、水との反応によるアミン−ボラン錯体の失活をより確実に抑制でき得る。一方、当該ｐＨが１２未満であれば、アミン−ボラン錯体の反応をより一層促進でき得る。当該ｐＨとしては、５以上がより好ましく、７以上がさらに好ましく、また、１０未満がより好ましく、９未満がさらに好ましい。当該ｐＨの測定は、ｐＨが３〜５、６〜７、９〜１０の標準液を用いて３点校正を行ったｐＨ計にて測定することができる。
その他、反応温度や反応時間などは、上記のリガンドと不溶性基材の反応工程３と同様の条件とすることができる。
反応後においては、吸着体を洗浄することにより、本発明方法により不溶性基材に共有結合で固定化されたリガンド以外の試薬などを除去することが好ましい。洗浄剤や洗浄方法に特に限定は無いが、水、酢酸、アルコール、各種有機溶剤、ｐＨ２〜５の液体、ｐＨ８〜１３の液体、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸２水素ナトリウム、緩衝剤、界面活性剤、尿素、グアニジン、グアニジン塩酸塩、その他の再生剤などの、少なくとも１種を含有する溶液などを通液または投入して攪拌することが好ましい。また、同一または異なる溶液を用いて洗浄を複数回行うと、リガンドの漏出量がさらに減少するため好ましい。
本発明に係る吸着体のリガンド導入量としては、ホルミル基含有不溶性基材１ｍＬあたり１ｍｇ以上５００ｍｇ以下が好ましい。リガンドの導入量がホルミル基含有不溶性基材１ｍＬあたり１ｍｇ以上であれば、標的化合物に対する吸着量が大きくなるため好ましく、５００ｍｇ以下であれば、製造コストを抑制できるため好ましい。当該リガンド導入量としては、ホルミル基含有不溶性基材１ｍＬあたり、２ｍｇ以上がより好ましく、３ｍｇ以上がさらに好ましく、４ｍｇ以上がよりさらに好ましく、また、１２０ｍｇ以下がより好ましく、６０ｍｇ以下がさらに好ましく、３０ｍｇ以下がよりさらに好ましく、２０ｍｇ以下がよりさらに好ましい。なお、本発明において、上記リガンド導入量の基準となる吸着体の容積は、ホルミル基含量の基準となるホルミル基含有不溶性基材の容積と同様に、モノリスや多孔性膜などに関しては空孔および骨格を含んだ構造体全体の体積であり、多孔性ビーズなどに関しては、特に記載が無い限りタッピング体積をいうものとする。
また、本発明に係る吸着体のリガンド導入量としては、ホルミル基含有不溶性基材１ｍＬあたり０．０１μｍｏｌ以上１５μｍｏｌ以下が好ましい。リガンドの導入量がホルミル基含有不溶性基材１ｍＬあたり０．０１μｍｏｌ以上であれば、標的化合物に対する吸着量が大きくなるため好ましく、１５μｍｏｌ以下であれば、製造コストを抑制できるため好ましい。当該リガンド導入量としては、ホルミル基含有不溶性基材１ｍＬあたり、０．０３μｍｏｌ以上がより好ましく、０．０５μｍｏｌ以上がさらに好ましく、０．１μｍｏｌ以上がよりさらに好ましく、また、５μｍｏｌ以下がより好ましく、２μｍｏｌ以下がさらに好ましく、０．７５μｍｏｌ以下がよりさらに好ましく、０．５μｍｏｌ以下がよりさらに好ましい。
リガンドの導入量は、固定化反応前後の反応液上清中のアフィニティーリガンド由来の吸光度を測定し、測定値の差から未反応のリガンド量を求め、それ以外のリガンドはすべて不溶性基材に結合したと仮定することによって求めることができる。また、元素分析法を用いても、リガンドの導入量を求めることができる。例えば、アミノ基含有リガンドであれば、吸着体のＮ含量分析を行うことにより、リガンドの導入量を測定することができる。
５． 吸着体の使用例
以上で説明した本発明方法によりリガンドを不溶性基材に強固に固定化して製造された吸着体は、リガンドの漏出が顕著に抑制されていることから、当該吸着体を標的化合物の精製に用いた場合、標的化合物へのリガンドの混入が顕著に抑制されている。
本発明に係る吸着体を用いて標的化合物を精製するには、標的化合物を含む混合液と吸着体とを接触させる。接触方法は特に制限されず、例えば、単に上記混合液に吸着体を加えて混合してもよいが、カラムに吸着体を充填した上で上記混合液を当該カラムへ導入する方法が効率的で便利である。
例えば、直径０．１ｃｍ以上２０００ｃｍ以下、高さ１ｃｍ以上５０００ｃｍ以下のカラムを用いることが好ましい。直径が０．１ｃｍ以上および高さが１ｃｍ以上であれば、標的化合物の吸着を効率良く行うことができる。また、吸着の精度や効率の観点から、直径としては２０００ｃｍ以下で高さとしては５０００ｃｍ以下が好ましい。
標的化合物を含む混合液と上記吸着体との接触時間（ｒｅｓｉｄｅｎｃｅ ｔｉｍｅ）としては、吸着の精度や装置の耐久性の観点から１分間以上が好ましい。一方、効率の観点からは当該接触時間としては１２分間以下が好ましい。上記接触時間としては２分間以上がより好ましく、３分間以上がさらに好ましく、また、１０分間以下がより好ましく、９分間以下がさらに好ましい。
具体的な吸着条件に関しては、例えば、吸着体１ｍＬあたりの標的化合物の吸着量が１ｍｇ以上となるように調整することが好ましい。当該吸着量が１ｍｇ以上であれば、効率良く精製が行える。一方、当該吸着量が２００ｍｇ以下であれば、吸着した標的化合物を吸着体から溶出し易い。当該吸着量としては、１０ｍｇ以上１５０ｍｇ以下がより好ましく、２０ｍｇ以上１００ｍｇ以下がさらに好ましく、３０ｍｇ以上９０ｍｇ以下がよりさらに好ましく、４０ｍｇ以上８０ｍｇ以下がよりさらに好ましい。
標的化合物の吸着量は、特に限定は無いが、静的吸着量や動的吸着量によって求めることができる。例えば静的吸着量を測定する場合は、ｐＨ７．４のリン酸バッファーで十分に洗浄した吸着体０．５ｍＬに対し、７０ｍｇの標的化合物を３５ｍＬのｐＨ７．４の同リン酸バッファーに溶解させた溶液を接触させ、２５℃で２時間攪拌した後、上清中の標的化合物の減少量を測定することにより求めることができる。
本発明に係る吸着体に標的化合物を吸着させた後は、非特異的吸着物を除去するために、吸着体を洗浄することが好ましい。洗浄条件は特に制限されないが、吸着された標的化合物が脱離しないようにｐＨが６．０以上８．０以下程度の緩衝液または、超純水、純水、逆浸透水、蒸留水などで十分に洗浄することが好ましい。
次いで、吸着体に吸着した標的化合物を脱離させることにより、精製された標的化合物を得ることができる。標的化合物を吸着体から脱離させるには、例えば、ｐＨが３．０以上５．０以下程度の緩衝液で吸着体を洗浄すればよい。
本願は、２０１５年８月２７日に出願された日本国特許出願第２０１５−１６８０６６号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１５年８月２７日に出願された日本国特許出願第２０１５−１６８０６６号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
実施例１： ボラン−ピリジン錯体を用いた吸着体の作製
不溶性基材として、結晶性高架橋セルロース（ＪＮＣ社製，特開２００９−２４２７７０号公報に記載の方法により得られるゲル）を用いた。当該不溶性基材３．５ｍＬを、グラスフィルター上で、ｐＨ３の０．０１Ｍクエン酸バッファー（クエン酸三ナトリウム二水和物、クエン酸一水和物および逆浸透水を用いて調製）で十分に洗浄した。次いで、洗浄した不溶性基材を遠沈管へ導入し、同クエン酸バッファーを加えて総液量を６ｍＬとした。ここへ、過ヨウ素酸ナトリウム２２．５ｍｇを逆浸透水２ｍＬに溶解した水溶液を加え、ミックスローターにて６℃で約３０分間振とうすることにより、不溶性基材の１，２−ジオール基をホルミル基へ酸化した。グラスフィルターを用いて濾過し、十分量の逆浸透水で洗浄することにより、ホルミル基含有担体を得た。
得られたホルミル基含有担体３．５ｍＬを、グラスフィルター上で、ｐＨ１２の０．６Ｍクエン酸バッファー（クエン酸三ナトリウム二水和物、水酸化ナトリウム、逆浸透水を用いて調製）で十分に洗浄した。次いで、洗浄したホルミル基含有担体を遠沈管に導入し、同クエン酸バッファーを加えて総液量を７．５ｍＬとした。別途、ＷＯ２０１１／１１８６９９を参考にして、同国際公報に記載の配列番号２のアミノ酸配列を有するプロテインＡを調製した。当該プロテインＡの５７．９８ｍｇ／ｍＬ水溶液０．９１ｍＬを上記ホルミル基含有担体に加え、ミックスローターにて６℃で２３時間振とうした。その後、２．４Ｍクエン酸水溶液（クエン酸１水和物と逆浸透水で調製）を加えて混合液のｐＨを８に調整し、６℃で４時間振とうを継続した。ボラン−ピリジン錯体（東京化成工業社製）２００μＬを加え、２５℃で１８時間振とうした。反応後、反応液の２７６ｎｍの吸収極大の吸光度を測定することにより、担体に固定化されたリガンド量を求めた。その結果、リガンド固定化量は１４ｍｇ／ｍＬ−ｇｅｌであった。
得られた担体を、グラスフィルター上で、逆浸透水を用いて洗浄濾液の電気伝導度が５μＳ／ｃｍ以下になるまで洗浄し、さらに、０．１Ｍクエン酸水溶液、０．０５Ｍ水酸化ナトリウム＋０．５Ｍ硫酸ナトリウム混合水溶液、クエン酸緩衝液（０．５Ｍクエン酸三ナトリウム２水和物＋クエン酸１水和物，ｐＨ＝６）にて順次洗浄した。最終的に、逆浸透水を用いて、洗浄濾液の電気伝導度が５μＳ／ｃｍ以下になるまで洗浄し、リガンド固定化吸着体を得た。
実施例２： ボラン−ピコリン錯体を用いた吸着体の作製
還元剤として、ボラン−ピリジン錯体の代わりに、ボラン−α−ピコリン錯体（ＳＩＧＭＡ ＡＬＤＲＩＣＨ社製）の５．５質量％エタノール溶液を３．５ｍＬ用いた以外は実施例１と同様にして、リガンド固定化吸着体を得た。
比較例１： ボラン−ジメチルアミン錯体を用いた吸着体の作製
還元剤として、ボラン−ピリジン錯体の代わりに、ボラン−ジメチルアミン錯体（和光純薬工業社製）の５．５質量％逆浸透水溶液１．９３ｍＬを用いた以外は実施例１と同様にして、リガンド固定化吸着体を得た。
比較例２： ボラン−トリメチルアミン錯体を用いた吸着体の作製
還元剤として、ボラン−ピリジン錯体の代わりに、ボラン−トリメチルアミン錯体（東京化成工業社製）の５．５質量％逆浸透水溶液４．７８ｍＬを用いた以外は実施例１と同様にして、リガンド固定化吸着体を得た。
比較例３： ボラン−Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン錯体を用いた吸着体の作製
還元剤として、ボラン−ピリジン錯体の代わりに、ボラン−Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン錯体（東京化成工業社製）２００μＬを用いた以外は実施例１と同様にして、リガンド固定化吸着体を得た。
試験例１： リガンドの漏出量の測定
上記実施例および比較例で作製したリガンド固定化吸着体にヒトＩｇＧを吸着させた場合におけるリガンド漏出量を求めた。
（１） 溶液調製
下記Ａ〜Ｅ液と中和液を調製し、使用前に脱泡した。
Ａ液： Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（シグマ社製）と逆浸透水を用いて調製したｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液
Ｂ液： 酢酸、酢酸ナトリウムおよび逆浸透水を用いて調製したｐＨ３．５の３５ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液
Ｃ液： 酢酸と逆浸透水を用いて調製した１Ｍ酢酸水溶液
Ｄ液： ポリクロナール抗体（バクスター社製「ガンマガード」）と上記Ａ液を用いて調製した濃度３ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ水溶液
Ｅ液： 水酸化ナトリウム、塩化ナトリウムおよび逆浸透水で調製した０．１Ｍ水酸化ナトリウム＋１Ｍ塩化ナトリウム混合水溶液
中和液： トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと逆浸透水で調製した２Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン水溶液
（２） 充填と準備
カラムクロマトグラフィー用装置（ＧＥヘルスケア社製「ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ１００」）の直径０．５ｃｍ×高さ１５ｃｍのカラムに、上記実施例または比較例で作製した吸着体試料を沈降体積で３ｍＬ入れ、線速２３０ｃｍ／ｈで０．２Ｍ塩化ナトリウム逆浸透水溶液を１５分通液して充填した。フラクションコレクターに、予め中和液３ｍＬを入れた１５ｍＬ容採取用チューブをセットした。
（３） ＩｇＧ精製
上記カラムにＡ液を１５ｍＬ通液し、次いでＤ液（ＩｇＧ水溶液）を１００ｍＬ通液した。次いで、Ａ液を２１ｍＬ通液後、Ｂ液を１２ｍＬ通液することによりＩｇＧを溶出させた。次にＣ液を６ｍＬ、Ｅ液を６ｍＬ、Ａ液を１５ｍＬ通液した。なお各液の流速は０．５ｍＬ／分または１ｍＬ／分とし、吸着体との接触時間が６分または３分となるようにした。
（４） リガンドの漏出量の測定
リガンドの漏出量を評価するために、ＩｇＧ溶出液に含まれるリガンド量を測定した。具体的には、上記（３）で得られた溶出液を回収し、溶出液中のＩｇＧ量とリガンド（プロテインＡ）の量を測定し、精製ＩｇＧ中に漏出したリガンド濃度を漏出量として求めた。リガンド濃度はＥＬＩＳＡ法で測定した。ボラン錯体のアミン配位子のｐＫaとリガンド漏出量との関係を、表１と図１に示す。
Figure 0006781154
表１と図１に示す結果のとおり、ボラン錯体においてボランに配位しているアミンのｐＫa値が６．２から６．６に変化する間にリガンド漏出量が急激に増加する一方で、当該ｐＫa値が６．５以下であればリガンド漏出量が顕著に低減されているといえ、６．２以下であればリガンド漏出量がより一層低減されている。このように、ｐＫa値が６．５以下であるアミンが配位したボラン錯体によりイミノ基を還元してリガンドを不溶性基材に固定化することにより、リガンド漏出量を顕著に低減できることが証明された。
実施例３： ボラン−ピコリン錯体を用いたアガロース吸着体の作製
ホルミル基含有担体としてホルミル基含有アガロース基材（ＡＢＴ社製「Ｈｉｇｈ Ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｌｙｏｘａｌ」）３．５ｍＬを用いた以外は実施例１と同様にして、リガンドを１４ｍｇ／ｍＬ固定化した吸着体を得た。
実施例４： ボラン−ピコリン錯体を用いた合成ポリマー吸着体の作製
ホルミル基含有担体としてホルミル基含有合成ポリマー基材（東ソー社製「ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＡＦ−Ｆｏｒｍｙｌ ６５０Ｍ」）３．５ｍＬを用いた以外は実施例１と同様にして、リガンドを１４ｍｇ／ｍＬ固定化した吸着体を得た。
実施例５： ボラン−ピコリン錯体を用いたガラス吸着体の作製
不溶性基材としてガラスビーズ（ミリポア社製「Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ６０）８ｍＬを、１０ｍＬの特級トルエン（和光純薬工業社製）および１ｍＬの３−グリシドキシプロピル−トリメトキシシラン（信越化学社製）の混合溶液に加え、９０℃にて８時間攪拌した。次いで、アセトンと逆浸透水にて洗浄し、エポキシ基導入担体を得た。エポキシ基導入担体を０．２規定の硫酸水溶液に加えて５０℃にて３時間攪拌し、エポキシ基を開環し、ジオール基導入担体を得た。上記ジオール基導入基材を用いたこと、固定化時のｐＨを９としたこと以外は実施例１と同様にして、リガンドを４ｍｇ／ｍＬ固定化した吸着体を得た。
実施例６： ボラン−ピコリン錯体を用いたプロテインＧ固定化担体の作製
リガンドとしてプロテインＧ（Ｐｒｏｓｐｅｃ社製）を用いた以外は実施例１と同様にして、リガンドを１５ｍｇ／ｍＬ固定化した吸着体を得た。
実施例７： ボラン−ピコリン錯体を用いたプロテインＬ固定化担体の作製
リガンドとしてプロテインＬ（Ｐｒｏｓｐｅｃ社製）を用いた以外は実施例１と同様にして、リガンドを１４ｍｇ／ｍＬ固定化した吸着体を得た。
比較例４： ボラン−ジメチルアミン錯体を用いたアガロース吸着体の作製
還元剤としてボラン−ピコリン錯体の代わりにボラン−ジメチルアミン錯体（和光純薬工業社製）の５．５質量％逆浸透水溶液１．９３ｍＬを用いた以外は実施例３と同様にして、リガンドを１５ｍｇ／ｍＬ固定化した吸着体を得た。
比較例５： ボラン−ジメチルアミン錯体を用いた合成ポリマー吸着体の作製
還元剤としてボラン−ピコリン錯体の代わりにボラン−ジメチルアミン錯体（和光純薬工業社製）の５．５質量％逆浸透水溶液１．９３ｍＬを用いた以外は実施例４と同様にして、リガンドを１４ｍｇ／ｍＬ固定化した吸着体を得た。
比較例６： ボラン−ジメチルアミン錯体を用いたガラス吸着体の作製
還元剤としてボラン−ピコリン錯体の代わりにボラン−ジメチルアミン錯体（和光純薬工業社製）の５．５質量％逆浸透水溶液１．９３ｍＬを用いた以外は実施例５と同様にして、リガンドを４ｍｇ／ｍＬ固定化した吸着体を得た。
比較例７： ボラン−ジメチルアミン錯体を用いたプロテインＧ固定化担体の作製
還元剤としてボラン−ピコリン錯体の代わりにボラン−ジメチルアミン錯体（和光純薬工業社製）の５．５質量％逆浸透水溶液１．９３ｍＬを用いた以外は実施例６と同様にして、リガンドを１５ｍｇ／ｍＬ固定化した吸着体を得た。
比較例８： ボラン−ジメチルアミン錯体を用いたプロテインＬ固定化担体の作製
還元剤としてボラン−ピコリン錯体の代わりにボラン−ジメチルアミン錯体（和光純薬工業社製）の５．５質量％逆浸透水溶液１．９３ｍＬを用いた以外は実施例７と同様にして、リガンドを１４ｍｇ／ｍＬ固定化した吸着体を得た。
試験例２： リガンドの漏出量の測定
実施例３〜５，７および比較例４〜６，８で作製したリガンド固定化吸着体を用いた以外は上記試験例１と同様にして、リガンドの漏出量を測定した。結果を図２に示す。
図２に示す結果のとおり、不溶性基材として、ポリマー基材、アガロース基材またはシリカ基材を用いても、また、リガンドとしてプロテインＬを用いても、ｐＫaが６．２以下であるアミンが配位したボラン錯体を使ってイミノ基を還元してリガンドを不溶性基材に固定化することにより、リガンド漏出量を顕著に低減できることが証明された。

Claims (9)

  1. ホルミル基含有不溶性基材に、標的化合物に対する特異的親和性を有し且つアミノ基を有するリガンドを固定化する方法であって、
    上記リガンドとしてのペプチドと上記ホルミル基含有不溶性基材とを混合することによりイミンを形成する工程、および、
    ｐＫaが６．５以下のルイス塩基を配位子とするボラン錯体を用いてイミンを還元する工程を含むことを特徴とする方法。
  2. 上記ルイス塩基として、窒素含有複素環式芳香族化合物、および／または、置換基としてアミノ基を有する芳香族炭化水素化合物を用いる請求項１に記載の方法。
  3. 上記イミンを形成する反応液のｐＨを１０．０以上、１３．０未満とする請求項１または２に記載の方法。
  4. 上記ペプチドとして抗体アフィニティーリガンドを用いる請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  5. 上記抗体アフィニティーリガンドとして、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬまたはそれらの類縁体を用いる請求項４に記載の方法。
  6. 上記ホルミル基含有不溶性基材が、多糖類、合成ポリマーおよびガラスからなる群より選択される少なくとも１種により構成されているものである請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  7. 上記ホルミル基含有不溶性基材がセルロースまたはアガロースにより構成されているものである請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  8. 上記ホルミル基含有不溶性基材の形状が多孔性ビーズ、モノリスまたは多孔性膜である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
  9. 上記標的化合物を精製するための方法であって、
    請求項１〜８のいずれかに記載の方法により上記ホルミル基含有不溶性基材に上記リガンドを固定化して吸着体を製造する工程、および、
    上記標的化合物を含む混合液と上記吸着体とを接触させることにより、上記標的化合物を上記吸着体に吸着させる工程を含むことを特徴とする方法。
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