JPWO2017034024A1 - リガンドの固定化方法 - Google Patents
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Abstract
Description
以下、本発明を示す。
上記リガンドと上記ホルミル基含有不溶性基材とを混合することによりイミンを形成する工程、および、
pKaが6.5以下のルイス塩基を配位子とするボラン錯体を用いてイミンを還元する工程を含むことを特徴とする方法。
上記[1]〜[8]のいずれかに記載の方法により上記ホルミル基含有不溶性基材に上記リガンドを固定化して吸着体を製造する工程、および、
上記標的化合物を含む混合液と上記吸着体とを接触させることにより、上記標的化合物を上記吸着体に吸着させる工程を含むことを特徴とする方法。
1. 不溶性基材へのホルミル基の導入工程
ホルミル基含有不溶性基材が市販されているなどして入手可能である場合は本工程の実施は必要ないが、入手できない場合は、公知方法に従って不溶性基材へホルミル基を導入する。
リガンドがアミノ基を有する場合は本工程の実施は必要ないが、アミノ基を有さない場合には、アミノ基を導入する。
本工程では、標的化合物に対する特異的親和性を有し且つアミノ基を有するリガンドとホルミル基含有不溶性基材とを混合することにより、リガンドに含まれるアミノ基と不溶性基材に含まれるホルミル基との間でイミンを形成する。
本工程では、前工程においてリガンドのアミノ基と不溶性基材のホルミル基との間で形成されたイミノ基を、pKa6.5以下のルイス塩基を配位子とするボラン錯体を用いて還元する。このようなボラン錯体を用いることにより、不溶性基材のホルミル基とリガンドのアミノ基とで形成されたイミノ基を十分に還元することができ、リガンドがより確実に不溶性基材へ固定化され、その漏出が顕著に抑制されるものと推測される。
以上で説明した本発明方法によりリガンドを不溶性基材に強固に固定化して製造された吸着体は、リガンドの漏出が顕著に抑制されていることから、当該吸着体を標的化合物の精製に用いた場合、標的化合物へのリガンドの混入が顕著に抑制されている。
不溶性基材として、結晶性高架橋セルロース(JNC社製,特開2009−242770号公報に記載の方法により得られるゲル)を用いた。当該不溶性基材3.5mLを、グラスフィルター上で、pH3の0.01Mクエン酸バッファー(クエン酸三ナトリウム二水和物、クエン酸一水和物および逆浸透水を用いて調製)で十分に洗浄した。次いで、洗浄した不溶性基材を遠沈管へ導入し、同クエン酸バッファーを加えて総液量を6mLとした。ここへ、過ヨウ素酸ナトリウム22.5mgを逆浸透水2mLに溶解した水溶液を加え、ミックスローターにて6℃で約30分間振とうすることにより、不溶性基材の1,2−ジオール基をホルミル基へ酸化した。グラスフィルターを用いて濾過し、十分量の逆浸透水で洗浄することにより、ホルミル基含有担体を得た。
還元剤として、ボラン−ピリジン錯体の代わりに、ボラン−α−ピコリン錯体(SIGMA ALDRICH社製)の5.5質量%エタノール溶液を3.5mL用いた以外は実施例1と同様にして、リガンド固定化吸着体を得た。
還元剤として、ボラン−ピリジン錯体の代わりに、ボラン−ジメチルアミン錯体(和光純薬工業社製)の5.5質量%逆浸透水溶液1.93mLを用いた以外は実施例1と同様にして、リガンド固定化吸着体を得た。
還元剤として、ボラン−ピリジン錯体の代わりに、ボラン−トリメチルアミン錯体(東京化成工業社製)の5.5質量%逆浸透水溶液4.78mLを用いた以外は実施例1と同様にして、リガンド固定化吸着体を得た。
還元剤として、ボラン−ピリジン錯体の代わりに、ボラン−N,N−ジエチルアニリン錯体(東京化成工業社製)200μLを用いた以外は実施例1と同様にして、リガンド固定化吸着体を得た。
上記実施例および比較例で作製したリガンド固定化吸着体にヒトIgGを吸着させた場合におけるリガンド漏出量を求めた。
下記A〜E液と中和液を調製し、使用前に脱泡した。
A液: Phosphate buffered saline(シグマ社製)と逆浸透水を用いて調製したpH7.4のPBS緩衝液
B液: 酢酸、酢酸ナトリウムおよび逆浸透水を用いて調製したpH3.5の35mM酢酸ナトリウム水溶液
C液: 酢酸と逆浸透水を用いて調製した1M酢酸水溶液
D液: ポリクロナール抗体(バクスター社製「ガンマガード」)と上記A液を用いて調製した濃度3mg/mLのIgG水溶液
E液: 水酸化ナトリウム、塩化ナトリウムおよび逆浸透水で調製した0.1M水酸化ナトリウム+1M塩化ナトリウム混合水溶液
中和液: トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンと逆浸透水で調製した2Mトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン水溶液
カラムクロマトグラフィー用装置(GEヘルスケア社製「AKTAexplorer100」)の直径0.5cm×高さ15cmのカラムに、上記実施例または比較例で作製した吸着体試料を沈降体積で3mL入れ、線速230cm/hで0.2M塩化ナトリウム逆浸透水溶液を15分通液して充填した。フラクションコレクターに、予め中和液3mLを入れた15mL容採取用チューブをセットした。
上記カラムにA液を15mL通液し、次いでD液(IgG水溶液)を100mL通液した。次いで、A液を21mL通液後、B液を12mL通液することによりIgGを溶出させた。次にC液を6mL、E液を6mL、A液を15mL通液した。なお各液の流速は0.5mL/分または1mL/分とし、吸着体との接触時間が6分または3分となるようにした。
リガンドの漏出量を評価するために、IgG溶出液に含まれるリガンド量を測定した。具体的には、上記(3)で得られた溶出液を回収し、溶出液中のIgG量とリガンド(プロテインA)の量を測定し、精製IgG中に漏出したリガンド濃度を漏出量として求めた。リガンド濃度はELISA法で測定した。ボラン錯体のアミン配位子のpKaとリガンド漏出量との関係を、表1と図1に示す。
ホルミル基含有担体としてホルミル基含有アガロース基材(ABT社製「High Density glyoxal」)3.5mLを用いた以外は実施例1と同様にして、リガンドを14mg/mL固定化した吸着体を得た。
ホルミル基含有担体としてホルミル基含有合成ポリマー基材(東ソー社製「toyopearl AF−Formyl 650M」)3.5mLを用いた以外は実施例1と同様にして、リガンドを14mg/mL固定化した吸着体を得た。
不溶性基材としてガラスビーズ(ミリポア社製「Silica gel60)8mLを、10mLの特級トルエン(和光純薬工業社製)および1mLの3−グリシドキシプロピル−トリメトキシシラン(信越化学社製)の混合溶液に加え、90℃にて8時間攪拌した。次いで、アセトンと逆浸透水にて洗浄し、エポキシ基導入担体を得た。エポキシ基導入担体を0.2規定の硫酸水溶液に加えて50℃にて3時間攪拌し、エポキシ基を開環し、ジオール基導入担体を得た。上記ジオール基導入基材を用いたこと、固定化時のpHを9としたこと以外は実施例1と同様にして、リガンドを4mg/mL固定化した吸着体を得た。
リガンドとしてプロテインG(Prospec社製)を用いた以外は実施例1と同様にして、リガンドを15mg/mL固定化した吸着体を得た。
リガンドとしてプロテインL(Prospec社製)を用いた以外は実施例1と同様にして、リガンドを14mg/mL固定化した吸着体を得た。
還元剤としてボラン−ピコリン錯体の代わりにボラン−ジメチルアミン錯体(和光純薬工業社製)の5.5質量%逆浸透水溶液1.93mLを用いた以外は実施例3と同様にして、リガンドを15mg/mL固定化した吸着体を得た。
還元剤としてボラン−ピコリン錯体の代わりにボラン−ジメチルアミン錯体(和光純薬工業社製)の5.5質量%逆浸透水溶液1.93mLを用いた以外は実施例4と同様にして、リガンドを14mg/mL固定化した吸着体を得た。
還元剤としてボラン−ピコリン錯体の代わりにボラン−ジメチルアミン錯体(和光純薬工業社製)の5.5質量%逆浸透水溶液1.93mLを用いた以外は実施例5と同様にして、リガンドを4mg/mL固定化した吸着体を得た。
還元剤としてボラン−ピコリン錯体の代わりにボラン−ジメチルアミン錯体(和光純薬工業社製)の5.5質量%逆浸透水溶液1.93mLを用いた以外は実施例6と同様にして、リガンドを15mg/mL固定化した吸着体を得た。
還元剤としてボラン−ピコリン錯体の代わりにボラン−ジメチルアミン錯体(和光純薬工業社製)の5.5質量%逆浸透水溶液1.93mLを用いた以外は実施例7と同様にして、リガンドを14mg/mL固定化した吸着体を得た。
実施例3〜5,7および比較例4〜6,8で作製したリガンド固定化吸着体を用いた以外は上記試験例1と同様にして、リガンドの漏出量を測定した。結果を図2に示す。
図2に示す結果のとおり、不溶性基材として、ポリマー基材、アガロース基材またはシリカ基材を用いても、また、リガンドとしてプロテインLを用いても、pKaが6.2以下であるアミンが配位したボラン錯体を使ってイミノ基を還元してリガンドを不溶性基材に固定化することにより、リガンド漏出量を顕著に低減できることが証明された。
Claims (9)
- ホルミル基含有不溶性基材に、標的化合物に対する特異的親和性を有し且つアミノ基を有するリガンドを固定化する方法であって、
上記リガンドと上記ホルミル基含有不溶性基材とを混合することによりイミンを形成する工程、および、
pKaが6.5以下のルイス塩基を配位子とするボラン錯体を用いてイミンを還元する工程を含むことを特徴とする方法。 - 上記ルイス塩基として、窒素含有複素環式芳香族化合物、および/または、置換基としてアミノ基を有する芳香族炭化水素化合物を用いる請求項1に記載の方法。
- 上記リガンドとしてペプチドを用いる請求項1または2に記載の方法。
- 上記ペプチドとして抗体アフィニティーリガンドを用いる請求項3に記載の方法。
- 上記抗体アフィニティーリガンドとして、プロテインA、プロテインG、プロテインLまたはそれらの類縁体を用いる請求項4に記載の方法。
- 上記ホルミル基含有不溶性基材が、多糖類、合成ポリマーおよびガラスからなる群より選択される少なくとも1種により構成されているものである請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 上記ホルミル基含有不溶性基材がセルロースまたはアガロースにより構成されているものである請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 上記ホルミル基含有不溶性基材の形状が多孔性ビーズ、モノリスまたは多孔性膜である請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 上記標的化合物を精製するための方法であって、
請求項1〜8のいずれかに記載の方法により上記ホルミル基含有不溶性基材に上記リガンドを固定化して吸着体を製造する工程、および、
上記標的化合物を含む混合液と上記吸着体とを接触させることにより、上記標的化合物を上記吸着体に吸着させる工程を含むことを特徴とする方法。
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