WO2012090183A1 - Procede d'immobilisation de ligands nucleiques - Google Patents

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WO2012090183A1
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solid
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Egisto Boschetti
Gérald PERRET
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    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes

Definitions

  • the invention relates to the field of the purification of substances of interest using affinity supports usable on an industrial scale, in particular for obtaining purified substances of medical interest,
  • affinity chromatography supports are used to purify substances subsequently used as drug active ingredients.
  • immunoaffinity chromatography supports are used on which antibodies are immobilized.
  • the immunoaffinity supports are suitable for purification of substances of medical interest on an industrial scale because they have a good retention capacity and a high selectivity vis-à-vis their target molecule.
  • Such immunoaffinity carriers can be regenerated at the end of the purification processes without substantially altering their retention capacity or their selectivity, allowing their use over a long period of time.
  • the immunoaffinity supports allow the purification of large quantities of the target substance, which makes their use compatible with the technical and economic requirements of the manufacture of drugs.
  • the immunoaffinity supports have disadvantages when they are used for the purification of substances of medical interest, particularly because of (1) the release of immunogenic protein fragments derived from the immobilized antibodies during the elution phase of the target substance previously retained and (ii) the fragility of the antibodies with respect to elution conditions and periodic treatments of antibacterial and anti-viral sanitization.
  • the main aptamer immobilization technique described in the state of the art is based on the use of the biotin-streptavidin or biotin-avidin pair.
  • This technique takes advantage of the selectivity and strong affinity of biotin for its avidin or streptavidin ligand as well as the stability of the non-covalent complex resulting from their association.
  • This type of affinity support however, has technical limitations resulting from the protein nature of the coupling agents used and the non-covalent nature of the bond formed between the support and the aptamers. In fact, biotin and avidin or streptavidin are sensitive to treatments likely to induce protein denaturation.
  • the biotin / streptavidin complex dissociates at low temperature, especially in nonionic aqueous solutions or at low saline concentration.
  • the affinity supports on which nucleic aptamers immobilized as ligands via the biotin / streptavidin complex are not suitable for use in purification processes, in particular industrial processes, for which the possibility Regenerating and sanitizing the affinity media between each purification cycle is paramount.
  • the state of the art also describes several techniques allowing the covalent grafting of nucleic acids onto solid supports, essentially with the aim of having new tools for the implementation of analytical methods.
  • nucleic aptamers possessing a reactive amino group on a cyanogen bromide-activated sepharose support has been described (Madru et al., 2009, Anal Chem, Vol 81: 7081-7086).
  • the grafting of periodate-oxidized RNA gametes to adipic acid dihydrazide-activated agarose support has also been described (Caputi et al., 1999, The EMBO Journal, Vol 18 (14): 4060- 4067).
  • Nucleic aptamer grafting techniques are also known by means of bi-functional coupling agents such as SIAB (Rehder et al, Electrophoresis, Vol 22 (17): 3759).
  • the state of the art also discloses covalent coupling techniques of nucleic acids, among others aptamers, on solid supports of silica or agarose type comprising carboxylic acid groups pre-activated with N-hydroxysuccylmid (NHS) ( Goss et al., 1990, J Chromatogr, Vol 508: 279-287, Larson et al., 1992, Nucleic Acids research, Vol 20 (13): 3525, Allerson et al., 2003, RNA, Vol 9 : 364-374).
  • NHS N-hydroxysuccylmid
  • the affinity support obtained by Goss et al. has a grafting rate of poly (dThs) of 0.5 ⁇ per g of silica, which is very low given the number of carboxylate groups per g of silica gel (500 ⁇ per g of silica).
  • the present invention relates to a method for immobilizing nucleic acids comprising at least one reactive amine function, by grafting on a solid support having on its surface activated carboxylic acid groups, said method comprising a step of coupling said nucleic acids to said solid support activated at a pH below 6.
  • the present invention relates to a method for immobilizing nucleic ligands comprising at least one primary amine function on a solid support comprising the following steps:
  • nucleic ligand comprising at least one primary amino function
  • the activated carboxylic acid groups are obtained by reaction with N-hydroxysuccinimide or a derivative thereof.
  • the invention also relates to a method for preparing an affinity support comprising the implementation of the immobilization method as defined above.
  • Another object of the invention is a solid affinity support obtainable by the method of preparation as defined above as well as its use in methods of purification or detection of a target protein.
  • An additional object is a complex resulting from the interaction of a nucleic ligand and a target molecule, said complex being formed on the surface of a solid support as defined above.
  • the present invention also relates to a method for purifying a target ligand with an affinity support, comprising the following steps: a) contacting a composition to be purified comprising a target ligand of interest with an affinity support as defined above, in order to form a complex between (i) the nucleic acids grafted onto said support and (ii) said target ligand and
  • step b) releasing said target ligand from the complex formed in step a) and recovering said purified target ligand.
  • FIG. 1 illustrates a chromatographic profile obtained by passing a composition comprising 100 g of transgenic human factor VII on a solid support of the invention onto which human anti-FVII DNA aptamers have been grafted.
  • Peak # 1 corresponds to a fraction of human FVII not retained on the affinity support.
  • Peak # 2 corresponds to the human FVII contained in the elution fraction.
  • Peak No. 3 corresponds to the human FVII contained in the regeneration eluent.
  • On the abscissa the time, expressed in minutes.
  • On the ordinate the absorbance, expressed in units of Optical Density at the wavelength of 280 nanometers.
  • FIG. 2 illustrates a chromatographic profile obtained by passing a composition comprising 200 of transgenic human factor VII onto a solid support of the invention onto which human anti-FVII DNA aptamers have been grafted.
  • Peak # 2 corresponds to the human FVII contained in the elution fraction.
  • Peak No. 3 corresponds to the human FVII contained in the regeneration effluent.
  • On the abscissa the time, expressed in minutes.
  • FIG. 3 illustrates a chromatographic profile obtained by passing a composition comprising 1000 g of transgenic human factor VII on a solid support of the invention onto which human anti-FVII DNA aptamers have been grafted.
  • Peak # 2 corresponds to the human FVII contained in the elution fraction.
  • Peak No. 3 corresponds to the human FVII contained in the regeneration effluent.
  • FIG. 4 illustrates a chromatographic profile obtained by passing a composition comprising 200 ⁇ g of transgenic human factor VII on a solid support of the invention onto which human anti-FVII DNA aptamers have been grafted, said carrier having been previously subjected to treatment with a sanitizing solution comprising 0.5 M NaOH.
  • Peak # 2 corresponds to the human FVII contained in the elution fraction.
  • Peak No. 3 corresponds to the human FVII contained in the regeneration effluent.
  • On the abscissa the time, expressed in minutes.
  • On the ordinate the absorbance, expressed in units of Optical Density at the wavelength of 280 nanometers.
  • FIG. 5 illustrates a chromatographic profile obtained by passing a composition comprising 1000 ⁇ g of transgenic human factor VII on a solid support of the invention onto which human anti-FVII DNA aptamers have been grafted, said support having been previously subjected to treatment with a sanitizing solution comprising 0.5 M NaOH.
  • Peak # 2 corresponds to the human FVII contained in the elution action.
  • Peak No. 3 corresponds to the human FVII contained in the regeneration effluent.
  • On the abscissa the time, expressed in minutes.
  • On the ordinate the absorbance, expressed in units of Optical Density at the wavelength of 280 nanometers.
  • FIG. 6 illustrates a chromatographic profile obtained by passing a composition comprising 2.7 mg of transgenic human factor VII onto a solid support of the invention onto which human anti-FVII DNA aptamers have been grafted under the following coupling conditions.
  • 48h 5 ° C, pH 4.2.
  • Point # 1 indicates the timing of human Factor VII injection.
  • Peak # 2 (at about 70 min) corresponds to the human FVII contained in the elution fraction.
  • On the abscissa the time, expressed in minutes.
  • FIG. 7 illustrates a chromatographic profile obtained by passing a composition comprising 2.7 mg of transgenic human factor VII on a solid support of the invention onto which human anti-FVII DNA aptamers have been grafted under the following coupling conditions. 48h, 5 ° C, pH 3.8. Point # 1 (at about 35 min) indicates the timing of Human Factor VII injection. Peak # 2 (at about 70 min) corresponds to the human FVII contained in the elution fraction. On the abscissa: the time, expressed in minutes. On the ordinate: the absorbance, expressed in units of Optical Density at the wavelength of 280 nanometers.
  • FIG. 8 illustrates a chromatographic profile obtained by passing a composition comprising 2.7 mg of transgenic human factor VII on a solid support of the invention onto which human anti-FVII DNA aptamers have been grafted into the following coupling conditions; 2h, 5 ° C, pH 4.2.
  • Point # 1 indicates the timing of Human Factor VII injection.
  • Peak # 2 (at about 70 min) corresponds to the human FVII contained in the elution fraction.
  • On the abscissa the time, expressed in minutes.
  • FIG. 9 illustrates a graphical chromato profile obtained by passing a composition comprising 2.7 mg of transgenic human factor VII on a solid support of the invention onto which human anti-FVII DNA aptamers have been grafted under the coupling conditions.
  • Ih TA (room temperature), pH 4.2.
  • Point # 1 indicates the timing of human Factor VII injection.
  • Peak # 2 (at about 75 min) corresponds to the human FVII contained in the elution fraction.
  • On the abscissa the time, expressed in minutes.
  • the present invention provides novel affinity carriers comprising immobilized nucleic acids, as well as methods for their preparation.
  • a first object of the invention is a method of immobilizing nucleic acids having at least one reactive amine function on a solid support having activated carboxylic acid functions.
  • nucleic acid or “nucleic ligand” is intended to mean a compound comprising a polymer of nucleotides or polynucleotide, that is to say of ribonucleotides and / or of deoxyribonucleotides, optionally chemically modified, having a length ranging from From 5 to 10,000 nucleotides in length, preferably from 5 to 1,000 nucleotides in length, and more preferably from 5 to 120 nucleotides in length.
  • a nucleic acid conventionally includes polyribonucleotides (AR) and polydeoxyribonucleotides (DNA), where appropriate chemically modified.
  • a nucleotide is composed of (i) a phosphate group (mono-, di- or tri-) or an analogue, (ii) a sugar selected from ribose, deoxyribose and their chemical analogues and (iii) a base nitrogen selected from adenine, guanine, thymine, cytosine, puracil and their chemical analogues.
  • a nucleotide may to be modified both on its osidic part and on its nitrogenous base by methods well known to those skilled in the art.
  • patent US5958691 describes aptamers exhibiting a chemical modification at the level of one or more nucleotides.
  • a nucleic acid is a polymer of nucleotides, ribonucleotides or deoxyribonucleotides.
  • a nucleic acid consists essentially of a polymer of nucleotides and comprises a non-nucleotide portion, said non-nucleotide portion being preferably of reduced length, compared to the length of the nucleotide portion, for example a length linear less than the length occupied by a chain of five nucleotides, ribonucleotides or deoxyribonucleotides.
  • a nucleic acid comprises a reactive amine function when said nucleic acid has an amino function accessible to the solvent and capable of reacting with a suitable reactive group carried by another molecular entity.
  • the reactive amino functions include, in particular, primary amines. This primary amine is distinct from the aromatic amines carried by the purine or pyrimidine nucleotide nuclei.
  • nucleic acids are well known in the state of the art and are conventionally used for their chemical coupling to supports or to marker substances.
  • these are nucleic acids that have been modified by the addition of an amino function at their 3 'end or at their 5' end.
  • the amine function is added to the 5 'end of the nucleic acid where its incorporation is easier as the final step of a method of synthesizing a polynucleotide.
  • the reactive amino function and the 5 'or 3' end of the nucleic acid are separated by a spacer chain.
  • a nucleic acid may comprise a reactive amine function at its 3 'or 5' end, which means that the reactive amine function is coupled to the nucleotide portion of said nucleic acid.
  • a nucleic acid may comprise a reactive amine function "on the side" of its 3 'or 5' end, which means that said amine function is not coupled directly to the nucleotide portion of said nucleic acid. , but is valvably bonded to a non-nucleotide portion of said acid nucleotide, for example a non-nucleotide spacer chain which is interposed between said reactive amine function and said end of the nucleotide portion of said nucleic acid.
  • nucleic acid also referred to hereinafter as “nucleic ligand”
  • nucleic ligand comprises:
  • polynucleotide consisting of a sequence of ribonucleotides and / or deoxyribonucleotides, optionally chemically modified, and
  • B optionally, a non-nucleotide portion, preferably a spacer chain,
  • Said ligand or nucleic acid further comprises a reactive amine function, said reactive amine function being able to be attached either to a 3 'or 5' end of the polynucleotide or optionally to the spacer chain.
  • the polynucleotide is at least modified at the 3 'or 5' nucleotide to introduce the reactive amine function directly or via a non-nucleotide part, in particular a spacer chain.
  • the nucleic acid may comprise a chemical entity additional to those previously mentioned, for example a fluorophore or a chromophore.
  • the nucleic acid according to the invention is a ligand, that is to say that it is capable of binding specifically to one or more target molecules.
  • the target molecules include molecules of AR, DNA, chemical molecules of organic or mineral nature, peptides and proteins that are human, animal, plant, viral or bacterial.
  • nucleic acid-based affinity supports can be prepared by chemical grafting of said nucleic acids onto a solid support comprising activated carboxylic acid functions, under specific grafting conditions allowing both a high grafting efficiency and the maintenance of the structural and functional integrity of the grafted nucleic acids.
  • results of the examples show in particular that by using the conventional coupling method carried out at a pH of between 6 and 9 with a variety of distinct nucleic acids, a grafting yield ranging from 0% to 10% maximum is obtained.
  • the results of the examples confirm those obtained by Allerson et al. (2003, Supra), who had opted in the end for another coupling technique.
  • the applicant has tested the effectiveness of a coupling using nucleic acids in which the reactive amine function and the 5 'end of the polynucleotide are separated from each other by a positively charged spacer chain.
  • the spacer chain consisted of a polyamide comprising at least one tertiary amine function.
  • the results, not shown in the examples, showed obtaining an excellent grafting efficiency, close to 100%, on the preactivated support with NHS.
  • the Applicant has shown that contacting the support thus grafted with a solution at an alkaline pH of about 9-10 alters the structure of the spacer chain and causes the nucleic acid to dislodge the support.
  • Such a coupling technique which allows an excellent coupling efficiency, thus provides an affinity support which has proved unsuitable for use in industrial purification processes, said processes generally comprising drastic washing steps and / or or microbial inactivation.
  • the technical solution that was finally developed according to the invention consisted in carrying out the coupling reaction of the nucleic acids on the support pre-activated with N-hydroxysuccinimide under pH conditions of less than 6.
  • the Applicant has shown that this coupling reaction - which leads to the formation of an amide bond between the solid support and the nucleic acid - is very rapid, this reaction being generally completed in less than one year. hour, regardless of the reaction temperature. Moreover, the Applicant has shown that the implementation of the reaction at low temperature is not a prerequisite for preserving the functional integrity of the grafted ligands. In in other words, the immobilization method of the nucleic ligands according to the invention can be carried out independently at low temperature or at room temperature.
  • nucleic acids grafted on the support retain their chemical and physical integrity, since their functionality is intact.
  • This aspect is illustrated in the examples by a support grafted with nucleic aptamers capable of binding to human factor VII (FVIIh). It is shown that the ability of said anti-FVHh nucleic aptamers is intact after grafting under acidic pH conditions, at low temperature or at room temperature, on the NHS pre-activated support.
  • the Applicant has also shown that when a nucleic aptamer capable of selectively binding to forms of active human factor VII comprising a correctly gamma-carboxylated Gla domain is used for grafting, the grafted aptamer retains the ability of the -failed to discriminate (i) the active forms of the correctly gamma-carboxylated Gla domain Factor VII from the (ii) non-active forms of human Factor VII.
  • the combined characteristics of high selectivity with respect to a target ligand and high capture capacity of said target ligand illustrate the compatibility of an affinity support obtained according to the method of the invention with a use in a step of purification of target ligands on an industrial scale. It goes without saying that the method according to the present invention also allows the preparation of affinity supports for the detection of a target molecule.
  • the present invention more precisely relates to a method for immobilizing nucleic ligands comprising at least one reactive amine function, by grafting on a solid support having activated carboxylic acid groups, said method comprising a coupling step co ects said nucleic acids on said solid support at a pH below 6.
  • the method of immobilizing the nucleic ligands comprising at least one reactive amine function on a solid support comprises the following steps:
  • nucleic ligand comprising at least one reactive amino function
  • the coupling step c) allows the creation of amide bonds between the solid support and the nucleic ligands, each amide bond resulting from the reaction between an activated carboxylic acid function of the support and a primary amine function present at the nucleic ligand.
  • the coupling conditions at a pH below 6 include coupling conditions at a pH below 5.5, less than 5, less than 4.9, less than 4.8, less than 4.7. , less than 4.6, less than 4.5, less than 4.3.
  • the pH of the coupling step is in a range of 3 to 6, which includes a pH of 3.0, a pH of 3.1, a pH of 3.2, a pH of pH 3.3, pH 3.4, pH 3.5, pH 3.6, pH 3.7, pH 3.8, pH 3.9, pH of 4.0, pH 4.1, pH 4.2, pH 4.3, pH 4.4, pH 4.5, pH 4.6, pH 4 , 7, pH 4.8, pH 4.9, pH 5.0, pH 5.1, pH 5.2, pH 5.3, pH 5, 4, a pH of 5.5, a pH of 5.6, a pH of 5.7, a pH of 5.8 and a pH of 5.9.
  • the pH of the coupling step is less than 4.5.
  • the pH of the coupling reaction is in the range of 3.5 to 4.5.
  • the coupling step can be carried out at a pH of about 4.2.
  • the coupling is carried out in the presence of an aqueous buffered medium having a pH below 6.
  • the buffered medium can be prepared from any type of acid and / or. weak bases, insofar as the weak acid (s) and base (s) used are not likely to react during the coupling reaction. As illustrated in the examples, it may be an aqueous solution of sodium acetate.
  • the Applicant believes that, at the acid pH conditions used for the coupling reaction, the nucleic acids to be grafted are in linear form, which promotes the accessibility of their solvent-reactive amine group, and in particular promotes the reaction of said reactive amine group with an activated carboxylic acid group accessible on the surface of the solid support.
  • activated carboxylic acid function or “activated carboxylic acid group” is meant a chemical function derived from the “carboxylic acid” function capable of reacting with a nucleophile. More specifically, the term “activated carboxylic acid function” means a chemical function derived from the “carboxylic acid” function capable of reacting with a primary amine so as to form an amide bond.
  • the functions "activated carboxylic acids” are well known to those skilled in the art and include the functions acid chlorides, mixed anhydrides and esters.
  • the activated carboxylic acid functions are in the form of esters resulting from the reaction of said carboxylic acid functions with a compound selected from the group consisting of 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), HOAt, N-hydroxysuccinimide or one of their derivatives.
  • HOBt 1-hydroxybenzotriazole
  • HOAt 1-hydroxybenzotriazole
  • N-hydroxysuccinimide N-hydroxysuccinimide
  • the carboxylic acid groups of the support have been activated by reaction with N-hydroxysuccinimide or one of its derivatives such as N-hydroxysulfosuccinimide.
  • Activation by NHS or sulfc-NHS has the advantage of generating activated esters reactive with primary amines but also sufficiently stable to allow conditioning and storage of the pre-activated support obtained.
  • Solid supports having "activated carboxylic acid” functions are well known in the state of the art and many of them are commercially available.
  • the solid supports may also be prepared according to methodologies well known to those skilled in the art, for example by reacting a support initially having carboxylic acid functions on its surface with a suitable chemical agent allowing the activation of the carboxylic acid functions with a view to the subsequent formation of an amide bond.
  • a suitable chemical agent allowing the activation of the carboxylic acid functions with a view to the subsequent formation of an amide bond.
  • Solid supports having "activated carboxylic acid” functions may be of any type. These supports include the supports conventionally used for chromato graphy, including silica and agarose supports, and which have been treated in order to present on their surface activated carboxylic acid groups. Pre-activated solid supports include dextran, agarose, starch gels, cellulose derivatives, or synthetic polymers such as polyamides, trisacryl, methacrylate derivatives, polystyrene derivatives, and methacrylate derivatives. polyacrylamides, or supports such as silica supports (especially porous glass supports) or alumina, on the surface of which are present activated carboxylic acid groups.
  • the solid supports on which the nucleic ligands according to the invention can be immobilized include any type of support having the structure and the composition found commonly for filter supports, membranes, etc.
  • Solid supports include resins, resins or gels for affinity chromatography columns, polymer beads, magnetic beads, paramagnetic beads, filter membrane support materials, and the like.
  • Solid supports also include glass or metal-based materials such as steel, gold, silver, aluminum, copper, silicon, glass and ceramics.
  • Solid supports also include, in particular, polymeric materials, such as polyethylene, polypropylene, polyamide, polyvinylidene fluoride, polyacrylamide derivatives, and combinations thereof.
  • said solid support can be obtained by reacting a commercial gel having free carboxylic acid functional groups with N-hydroxysuccinimide (NHS), optionally presence of a carbodiimide such as 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC).
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
  • a nucleic ligand according to the invention comprises a polynucleotide, that is to say a polymer of nucleotides.
  • the polynucleotide of the nucleic ligand is responsible for a large part of the specific binding properties of said ligand with respect to its target molecule or molecules. It generally comprises from 5 to 120 nucleotides in length.
  • the nucleic ligand may further comprise a non-nucleotide portion.
  • non-nucleotide portion being preferably bound to the polynucleotide.
  • non-nucleotide part is meant a chemical moiety that does not consist essentially of a polynucleotide.
  • This non-nucleotide portion is preferably a spacer chain.
  • the reactive amine of said nucleic ligand is preferably a primary amine present at the 3 'or 5' end of the polynucleotide or, where appropriate, a primary amine present at the non-nucleotide portion.
  • the reactive amine is an aliphatic primary amine, which means that the amine function is not directly linked to an aromatic group.
  • the nucleic ligand is a polynucleotide 5 to 120 nucleotides in length comprising at least one amine function reactive at its 3 'or 5' end.
  • the nucleic ligand comprises (i) a polynucleotide 5 to 120 nucleotides in length and (ii) a spacer chain linked to said polynucleotide, the reactive amine function being attached to a 3 'or 5' end of said polynucleotide polynucleotide or spacer chain.
  • the spacer chain is preferably bonded to the 5 'end or the end
  • the nucleic ligand comprises a polynucleotide and a spacer chain, wherein said spacer chain comprising at one of its ends an amine function and being connected by its second end to the end, 5 ' polynucleotide.
  • Said spacer chain has the function of physically removing the polynucleotide from the surface of the solid support, which makes it possible to increase the relative mobility of the nucleotide portion of the nucleic ligand and to reduce the steric hindrance.
  • the spacer chain can be of any type.
  • the examples illustrate in particular the implementation of the process according to the invention for a hydrophobic chain consisting of a chain consisting of a hydrophobic chain consisting of a chain composed of 3, 6, 12 or more (for example 18) methylene (CH 2 ) named in the following C3, C6, C12 or a hydrophilic chain which may be of polyethylene glycol type, for example Hexaethylene glycol (HEG) or a 1-amino-3,6,9-trioxaundecan-1 yl called in the following Hydrophilic or non-specific oligonucleotide
  • the spacer chain does not comprise ionizable groups other than primary amine functions or secondary amine functions.
  • the spacer chain does not comprise groups or bonds sensitive to alkaline pH or to oxidation or reduction reactions.
  • the spacer chain does not contain a disulfide bond or thiol groups.
  • the spacer chain essentially contains carbon-carbon, carbon-oxygen and carbon-nitrogen bonds.
  • the spacer chain is preferably selected from the group consisting of: a hydrophobic chain consisting of a chain composed of 3, 6, 12 or more (for example 18) methylene (CH 2) named hereinafter C3, C6, C12 or a hydrophilic chain which may be of type polyethylene glycol, for example Hexaethylene glycol (HEG) or a 1,1-amino-3,6,9-trioxaundecan-III, hereinafter referred to as hydrophilic Ci or a nonspecific oligonucleotide substituted by a primary amine function
  • the spacer chain may be introduced according to methods well known to those skilled in the art, in particular as a final step in the chemical synthesis of the polynucleotide.
  • the spacer chain can be introduced at the 5 'end of the polynucleotide using a derivative comprising a phosphoramidite function as described in the examples.
  • the general principle of this reaction is shown in Figure 2 of Greco and Tor, Nature Protocols, 2007, 2, 305-316 entitled "Key steps in solid DNA phospharimidite synthesis cycle".
  • the coupling step can be performed indifferently at low temperature and at room temperature.
  • the implementation of the reaction at room temperature does not induce a decrease in the yield of the reaction.
  • the implementation of the reaction at low temperature - typically at a temperature of 5 ° C - does not induce a substantial decrease in the reaction rate.
  • the coupling step is carried out at a temperature ranging from 0 ° C. to 50 ° C.
  • the coupling step may be carried out at a temperature ranging from 0 ° C to 35 ° C.
  • the coupling reaction may be carried out at room temperature, i.e. at a temperature of from 15 ° C to 35 ° C, preferably at a temperature of from 15 ° C to 25 ° C. Nevertheless, the coupling step may be carried out at low temperature, typically at a temperature ranging from 0 ° C. to 8 ° C., if the reagents at stake - in particular the nucleic ligands - have chemical groups that are sensitive, in particular, to hydrolysis.
  • the coupling step can be carried out at a pH ranging from 3.5 to 4.5, at room temperature and over a period of about one hour.
  • the coupling reaction can be completed by placing the pre-activated carrier / nucleic acid combination under conditions of alkaline pH for a given duration.
  • the coupling step of the method of the invention itself comprises the following two steps:
  • the Applicant believes that the implementation of substep c2) may, in certain specific cases, induce the nucleic acids immobilized on the support to adopt a suitable conformation.
  • the plaintiff is of the opinion that this step is optional.
  • the final phase of coupling at alkaline pH is carried out at a pH of at least 7.5, which includes the pH of at least 8, and at least 8.5.
  • the examples illustrate the completion of step c2) at a pH of about 9
  • Step c2) can be carried out at room temperature or at a low temperature.
  • low temperature for the final stage of the coupling reaction is meant a temperature below 15 ° C, including a temperature below 14 ° C, 13 ° C, 12 ° C, 11 ° C, 10 ° C, 9 ° C, 8 ° C, 7 ° C, 6 ° C or 5 ° C.
  • the duration of the final phase of the coupling step is variable. It is between a few minutes and a few hours. In general, the duration of step c2) is less than 9 hours, which includes a duration of less than 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 and 1 hours. The duration of step c2) may be about 8 hours or about 3 hours, as illustrated in the examples.
  • the coupling reaction is followed by a step of neutralizing d) or blocking the unreacted activated carboxylic acid groups during the coupling step itself.
  • the blocking of the activated and unreacted carboxylic acid functions can be achieved by incubation of the grafted support with a blocking solution comprising 0.5 M ethanolamine, 0.5 M NaCl at pH 8.3. or with a 0.1M Tris-HCl blocking solution at pH 8.5, as recommended in particular by the manufacturer and described elsewhere in the examples.
  • the duration of the neutralization or blocking step is advantageously at least one hour at low temperature. It can be carried out for example for a period of 2 h 30 at the temperature of 4 ° C, as described in the examples.
  • the method according to the invention comprises at the end of the coupling step c) and / or at the end of the blocking or neutralization step d) one or more washing steps e) of said support under conventional conditions so as to obtain ready-to-use affinity support.
  • the washing step (s) can be carried out with a buffer solution of 0.1 M Tris-HCl at a pH ranging from 8 to 9, or with a buffer solution of 0.1 M acetate, 0.5 M NaCl at a pH of 4 to 5, as is illustrated in the examples.
  • a washing step comprises successively (i) washing with a 0.1 M Tris-HCl buffer solution at a pH of from 8 to 9, followed by (ii) washing with a buffer solution of 0.1M acetate, 0.5M NaCl at a pH of from 4 to 5.
  • a plurality of washing steps are carried out, for example 3 washing steps, as illustrated in the examples.
  • the method of immobilizing nucleic acids according to the invention can also be defined as a process comprising the following steps:
  • nucleic acid comprising at least one primary amine function
  • the method for immobilizing nucleic acids according to the invention can also be defined as a process comprising the following steps:
  • nucleic acid comprising at least one primary amine function
  • step c) itself comprises the following two steps:
  • the method for immobilizing the nucleic ligands according to the invention finds a direct application for the manufacture of affinity supports intended for the purification or the detection of target molecules, including target proteins.
  • the present invention relates to a method for preparing an affinity support comprising the implementation of the method for immobilizing nucleic ligands as defined above.
  • the method for preparing an affinity support according to the invention comprises the following steps:
  • nucleic ligand comprising at least one primary amino function
  • Step c) of the method may comprise steps c1) and c2) as defined above.
  • the method may further comprise steps d) and e) previously described.
  • the method and the method according to the invention are particularly suitable for the preparation of an affinity support intended for the purification of one or more target molecules, in particular by chromatography.
  • the solid support is a support adapted to the implementation of a chromatography, filtration or solid phase extraction process.
  • the solid support is suitable for use as a stationary phase in a chromatography, or filtration or solid phase extraction process.
  • a solid affinity support for solid phase extraction reference may be made to Madru et al., (Analytical Chemistry, 2009, 81, 7081-7086).
  • Such a solid support can be selected from the group consisting of silica gels and polysaccharide gels such as agarose gels, dextran gels and their derivatives and also acrylamide gels and their derivatives, methacrylate gels and their derivatives and polystyrene and their derivatives.
  • silica gels and polysaccharide gels such as agarose gels, dextran gels and their derivatives and also acrylamide gels and their derivatives, methacrylate gels and their derivatives and polystyrene and their derivatives.
  • the solid support comprising on its surface activated carboxylic acid groups is a support selected from the group consisting of silica gels, agarose gels, dextran gels and their derivatives and
  • the nucleic acid ligand comprising at least one reactive amine is chosen from the group of polynucleotides of 5 to 120 amino acids optionally comprising at their 3 'or 5' end a spacer chain which may be chosen from the group consisting of a hydrophobic chain consisting of a chain composed of 3, 6, 12 or more (for example 18) methylene (CH 2) named hereinafter C3, C6, C12 or a hydrophilic chain which may be of polyethylene glycol type, for example Hexaethylene glycol (HEG) or a 1-amino-3,6,9-trioxaundecanyl-lyl, hereinafter referred to as hydrophilic or a non-specific oligonucleotide
  • the solid support is selected from agarose gels and their derivatives
  • the nucleic ligand is a polynucleotide of 5 to 120 nucleotides linked at its 5 'end to a spacer chain selected from polyethylene glycol C4-C20, the reactive amine function preferably being carried by the spacer chain.
  • the solid support is selected from agarose gels and their derivatives and
  • the nucleic ligand is a polynucleotide of 5 to 120 nucleotides linked at its 5 'end to a spacer chain chosen from C4-C20 unary alkyls, the reactive amine function preferably being carried by the spacer chain.
  • the examples show that the affinity supports obtained according to the process of the invention allow the quantitative purification of a target ligand in an extremely selective manner. Also, the results of the examples show that an affinity support obtained according to the process of the invention can be used over a very long period of time, in particular according to a large number of capture / washing / elution / lossless washing cycles. significant of its selective and quantitative retention properties of the target ligand. It is also shown that an affinity support according to the invention retains its selective and quantitative retention properties of the target ligand, even after undergoing the drastic stages of regeneration or antibacterial, anti-fungal or anti-viral sanitization.
  • the retention capacity of an affinity support according to the invention for its target protein is not altered by treatment with a solution having a final concentration of NaOH of 0.5. M, or even by treatment with a solution of NaOH having a final concentration of 1 M, that is to say a final concentration of NaOH much higher than that which is usually used during the sanitization steps, and this during a very long period of time (100 hours) also much longer than the duration of a conventional sanitization step which is generally a few minutes.
  • the chromato graphic properties of an affinity support according to the invention are not altered by treatment with a solution having a final concentration of propylene glycol of 50% (vol / vol).
  • the results of the examples illustrate the ability of an affinity support according to the invention to achieve perfectly reproducible quantitative purification steps of a target ligand, and this under industrial conditions of use. conventional, which are generally deleterious to known affinity carriers, including for immunoaffinity carriers.
  • affinity carriers according to the invention therefore constitute purification tools that are both reliable and reproducible, stable over time, and do not require repeated maintenance operations.
  • the affinity supports of the invention because of the numerous technical advantages they provide, allow the implementation of purification processes of a target molecule at moderate costs.
  • the examples describe obtaining an affinity support of the invention by grafting nucleic aptamers, and illustratively by grafting DNA aptamers.
  • the nucleic ligand is a nucleic aptamer.
  • nucleic aptamer or aptamer means a single-stranded nucleic acid which binds specifically to one or more target ligands.
  • Aptamers include those for which complexes can be detected with a single target ligand or with a variety of given target ligands, after a prior step of contacting the respective nucleic and target ligand partners.
  • Aptamers include RNA aptamers and DNA aptamers.
  • aptamer refers to a single-stranded nucleic acid molecule, DNA or RNA, capable of specifically binding to one or more target ligands, such as a protein. Aptamers bind to their target molecules by mechanisms essentially distinct from hybridization. Aptamers are generally characterized by a secondary structure including loops and stems. In other words, the active conformation of the aptamers (i.e. the conformation in which the aptamers are able to bind to their target protein) is non-linear.
  • Aptamers generally comprise between 5 and 120 nucleotides and can be selected in vitro by a process known as SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). Aptamers have many advantages. Because of their oligonucleotide nature, aptamers possess low immunogenicity and high resistance to stringent physicochemical conditions (presence of urea, DMSO, very acidic or very basic pH, use of organic solvents or high temperature ) allowing various sanitization strategies in the context of use as an affinity ligand. Moreover, their selectivity is important. Finally, the production of aptamers involves relatively limited costs.
  • a "nucleic aptamer" used for grafting to the pre-activated solid support may comprise, by definition, a non-nucleotide or nucleotide portion, for example a chain non-nucleotide spacer, which connects one of the 5 'or 3' ends of the nucleic portion of said aptamer and the reactive amine function used for the chemical grafting of said pre-activated support.
  • a nucleic aptamer may have the following formula (I):
  • n is an index of 1 or 0, where 0 means that the aptamer does not comprise a free spacer chain and 1 signifies that the aptamer comprises a spacer chain.
  • N3 ⁇ 4 means the reactive amino function used for grafting onto the solid support pre-activated by NHS groups
  • [NUCL] means a nucleic acid specifically binding to a target molecule, said nucleic acid comprising from 5 to 120 nucleotides.
  • the nucleic acid [NUCL] comprises from 10 to 80 nucleotides and even more preferably from 20 to 60 nucleotides.
  • the "spacer chain” designated [SPAC] in the compound of formula (I) may be of any known type. It may be a non-nucleotide compound, an oligonucleotide or a compound comprising one or more non-nucleotide moieties and one or more nucleotide moieties.
  • the spacer chain does not participate, in general, in the binding of the target ligand on the support.
  • Said spacer chain has the function of physically moving the nucleic acid [NUCL] away from the surface of the solid support on which said compound of formula (I) is chemically grafted, which allows a relative mobility of the nucleic acid [NUCL], relative to the surface of said solid support.
  • the spacer chain limits or avoids that steric hindrances, due to an excessive proximity of the solid support to the nucleic portion of the aptamer, interfere with the binding events between said acid nucleic acid and molecules of the target ligand capable of being brought into contact therewith.
  • the spacer chain is preferably bonded to the 5 'end or the 3' end of [NUCL] nucleic acid.
  • the spacer chain may be a hydrophobic chain consisting of a chain composed of 3, 6, 12 or more (for example 18) methylene (CH 2) named hereinafter C3, C6, Cl 2 or a hydrophilic chain which may be of polyethylene glycol type, for example Hexaethylene glycol (HEG) or a 1-amino-3,6,9-trioxaundecanyl-lyl referred to in the following Cl 1 hydrophilic or non-specific oligonucleotide.
  • HOG Hexaethylene glycol
  • Cl 1 hydrophilic or non-specific oligonucleotide When the spacer chain consists of a nonspecific oligonucleotide, said oligonucleotide advantageously comprises at least 5 nucleotides in length, preferably between 5 and 15 nucleotides in length.
  • the spacer chain may be composite and include the sequence of HEG and an oligonucleotide, for example an oligo (dT).
  • an oligonucleotide for example an oligo (dT).
  • the examples illustrate the production of affinity supports as defined above by grafting the pre-activated support with NHS with three distinct anti-FVTI nucleotide aptamers comprising spacer chains of a similarly distinct nature, namely, a hydrophobic chain consisting of a C6 alkyl chain, a hydrophobic chain consisting of a C1 2 alkyl chain, and a Cl.1-TFA hydrophilic chain.
  • the results of the examples show that the process for obtaining a carrier of The affinity which is described in the present description can be used, whatever the identity or the type of nucleic acid of interest to be grafted.
  • the methods and method according to the invention allow the preparation of affinity supports which are distinguished from known affinity supports by their high density of nucleic acids immobilized on their surface. This high density of nucleic ligands stems directly from the specific method of obtaining the affinity supports.
  • the affinity supports according to the invention are also characterized by a high retention capacity of the target molecule or molecules against which the grafted nucleic acids are directed.
  • the process according to the invention makes it possible to prepare affinity chromatography gels presenting a high density of nucleic ligands. It has thus been observed that chromatographic gels obtained by the process according to the invention have a density of 0.2 ⁇ / ml nucleic ligands at 0.5 ⁇ / ml whereas the initial density in activated carboxylic acid functions of the chromatography gels that the it is commercially available generally between 5 ⁇ / ml to 25 ⁇ / ml of gel.
  • the coupling method of the invention it is possible to derivatize according to the process of the invention at least 0.01% of the activated carboxylic functions initially present on the surface of the solid support, advantageously at least 0.1% more preferably at least 1% and more preferably at least 2% of said activated carboxylic functions.
  • the grafting levels in affinity chromatography with the antibodies as ligand are often less than 1 mg / ml, that is to say less than 0.06 ⁇ / ml, ie less than 0.2% of derivatized carboxylic functions. .
  • Derivatization of at least 0.01% of the activated carboxylic functions includes derivatization of at least 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5% , 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1, 1%, 1, 2%, 1, 3%, 1, 4%, 1, 5%, 1 , 6%, 1, 7%, 1, 8%, 1, 9% and at least 2% of said activated carboxylic functions.
  • the percentage of derivatized carboxylic functions is at most 100%, which encompasses at most 50%, 40%, 30%, and at most 25% of said activated carboxylic functions.
  • Another object of the present invention is an affinity support obtainable according to the method and method described hereinbefore.
  • the present invention relates to a solid affinity support on which nucleic ligands are immobilized by an amide bond and wherein at least carboxyl functions initially present on its surface are derivatized by a nucleic ligand.
  • amide linkage binding a nucleic ligand to the support results from the reaction of a carboxyl function initially present on the surface of the support with a primary amine function present at the level of the nucleic ligand.
  • the solid affinity support is a chromatography gel.
  • Another object of the present invention is a solid affinity support on which nucleic ligands are immobilized by an amide bond, said affinity support being a chromatography gel having a nucleic acid density of at least 0.005 ⁇ / ml. of gel, which includes at least 0.01 ⁇ / ml, 0.05 ⁇ / ml, 0.1 ⁇ / ml, 0.15 ⁇ ⁇ / ml, 0.2 ⁇ / ⁇ , 0.25 ⁇ / ⁇ , 0.3 ⁇ / ⁇ , 0,35 ⁇ / ml and at least 0,38 ⁇ / ml of gel.
  • the density of nucleic ligands is at most 10 ⁇ / ml, which encompasses at most 5 ⁇ / ml, at most 1 ⁇ / ⁇ and at most 0,5 ⁇ ⁇ / ⁇ .
  • the affinity supports according to the invention may have any of the properties described above for solid supports or affinity supports.
  • the affinity support may be a gel that can be used in chromatography, filtration or solid phase extraction selected from the group consisting of agarose, dextran and silica gels and their derivatives.
  • the affinity support can be a highly crosslinked agarose gel on which the nucleic ligands are immobilized.
  • the affinity support is a gel (that is, a stationary phase) for use in affinity chromatography methods.
  • the affinity supports according to the invention may comprise on their surface any type of nucleic ligands as described hereinabove in the present description.
  • the affinity support according to the invention is characterized in that the nucleic ligands are aptamers of formula (II) presented above.
  • the solid affinity support according to the invention may be represented by the following formula (III):
  • - [SUP] represents the solid support of the affinity support - [SPACjn and [NUCL] are as previously defined.
  • - H- (SPAC) n - UCL represents a nucleic aptamer in which:
  • ⁇ n is index of 0 or 1
  • ⁇ SPAC represents a spacer chain
  • NUCL represents a nucleic acid specifically binding to a target molecule, said nucleic acid comprising from 5 to 120 nucleotides.
  • Another object according to the invention is a complex formed between a nucleic acid and a target molecule, said complex being formed on the surface of a solid support as defined above. Said complex results essentially from no-covalent interactions between the target molecule and the nucleic ligand.
  • a further object of the invention relates to the use of an affinity support as described above for the purification or detection of a target molecule.
  • the support according to the invention can be used as a stationary phase in filtrafion, chromatography or solid phase extraction steps.
  • the present invention is also related to a method for purifying a target molecule with an affinity support as defined above, comprising the following steps:
  • composition to be purified comprising a target molecule of interest with an affinity support as defined in the present description, in order to form a complex between (i) the nucleic acids grafted onto said support and (ii) said target ligand and
  • step b) releasing said target molecule from the complex formed in step a) and recovering said purified target molecule.
  • the method comprises a step a '), step a' following step a) and preceding step b), which consists of a step of washing the affinity support with a buffer washing.
  • step a ') of a washing buffer having a high hydrophobicity, in particular a high concentration of propylene glycol makes it possible to effectively remove the non-ionically bound substances. specific to the affinity support without simultaneously detectably affecting the binding of the target ligand to the affinity support.
  • a wash buffer having a final propylene glycol content of at least 20% by volume, based on the total volume of the buffer solution is preferably used.
  • a wash buffer having a final propylene glycol content of at least 20% includes wash buffers having a final propylene glycol content of at least 25% M, 30%, 35%, 40% 45%, 50%, 55%, or at least 60% by volume, based on the total volume of the buffer solution.
  • a wash buffer used in step a ') of the process has a final propylene glycol content of at most 50%.
  • a washing buffer used in step a ') of the process has a final propylene glycol content of between 20% and 50%, preferably between 30% and 50%.
  • the washing buffer used in step a ') contains both NaCl and propylene glycol as described in the examples.
  • step b) is performed by contacting the affinity support with an elution buffer containing a divalent ion chelating agent, preferably EDTA.
  • the elution buffer may contain a final concentration of EDTA of at least 1 mM and at most 30 mM.
  • At least 1 mM includes at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 mM.
  • not more than 30 mM includes not more than 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 or 11 mM .
  • a buffer comprising a mixture of NaCl and propylene glycol, which may be of the same type as that described above for the washing step, is used for the regeneration of the affinity support.
  • target molecule refers to a molecule capable of to link specifically to the aptamer.
  • ⁇ can be nucleic acids, proteins or organic or mineral substances. Proteins can be any type of protein, and in particular, plasma proteins.
  • plasma protein is meant according to the invention any protein, especially any protein of industrial or therapeutic interest, contained in the blood plasma.
  • Blood plasma proteins include antibodies, albumin, alpha macroglobulin, antichymotry sine, antithrombin, antitrypsin, Apo A, Apo B, Apo C, Apo D, Apo E, Apo F, Apo G, beta Xlla, C 1 - inhibitor, C-reactive protein, C7, Clr, Cls, C2 C3, C4, C4bP, C5, C6, Clq, C8, C9, Carboxypeptidase N, Ceruloplasmin, Factor B, Factor D, Factor H, Factor I, Factor ⁇ , Factor V, Factor VII, Factor Vlla, Factor VIII, Factor X, Factor XI, Factor XII, Factor XIII, Fibrinogen, Fibronectin, Haptoglobin, Hemopexin, Heparin Cofactor II, Histidine Rich GP, IgA, IgD, IgE, IgG, ITI, IgM, Kininase
  • plasma proteins include coagulation proteins, that is, plasma proteins involved in the chain of cascade reactions resulting in the formation of a blood clot.
  • Coagulation proteins include Factor I (fibrinogen), Factor II (prothrombin), Factor V (proaccelerin), Factor VII (proconvertin), Factor VIII (antihemophilic factor A), Factor IX (factor Antihemophilic B), Factor X (Stuart Factor), Factor XI (Rosenthal Factor or PTA), Factor XII (Hageman Factor), Factor XIII (Fibrin Stabilizing Factor or FSF), PK (Prekalicrin) KHPM (high molecular weight kininogen), tissue thromboplastin, heparin cofactor II (HCII), protein C (PC), thrombomodulin (TM), protein S (PS), von Willebrand factor (Wf) ) and the tissue factor pathway inhibitor (TFPI), or tissue factors.
  • Factor I fibrinogen
  • the plasma protein is an enzymatically active coagulation protein.
  • Enzymatic coagulation proteins include Factor II (prothrombin), Factor VII (proconvertin), Factor IX (antihemophilic factor B), Factor X (Stuart Factor), Factor XI (Rosenthal Factor or PTA ), the postman XII (Hageman Factor), Factor XIII (Fibrin Stabilizing Factor or FSF) and PK (Prekalicrin).
  • the plasma protein consists of a natural or recombinant human plasma protein.
  • the plasma protein is the factor
  • an aptamer comprising the Mapt 2CS polynucleotide of sequence SEQ ID No. 1 comprising at its 5 'end a hydrophilic C 11 chain (11-amino-3, 6, 9, -trioxaundecan-1 yl)
  • an aptamer comprising the "Mapt 1.2" polynucleotide of sequence SEQ ID No. 2 linked at its 5 'end to a spacer chain composed of 12 methylenes (CH 2) (Cl spacer) 2) and linked at its 3 'end to an oligo-dT
  • the supernatant was recovered and the amount of non-grafted aptamers was assayed.
  • the gel “NHS Activated Sepharose 4 fast flow (GE)” is a crosslinked agarose gel having on its surface functional carboxylic acid functions activated by NHS.
  • the carboxylic acid functions were introduced on the surface of the gel by grafting 6-aminohexanoic acid.
  • This pre-activated agarose gel is described in Technical Instruction Manual No. 71-5000-14 AD dated March 2011 and published by GE Healthcare.
  • the "NHS activated Sepharose 4 Fast Flow” gel exhibits a density of activated carboxylic acid functions ranging from 16 to 23 ⁇ / ml of gel.
  • the supernatant of the reaction medium does not comprise a detectable amount of nucleic aptamer, that is to say, under the analysis conditions used, comprises a quantity aptamer less than 0.08 mg / ml
  • Example 2 Use of an affinity support for the purification of recombinant human factor VIII produced in the milk of transgenic rabbits.
  • FVII-TG a purified recombinant human FVII factor composition produced in the milk of transgenic rabbits
  • the FVI TG composition used for the injection is prepared by neutralizing the citrate initially contained in the formulation with CaCl 2 and modifying the formulation buffer to obtain: between 35 and 40 rM NaCl and between 3.2 and 4 mM MgCl 2
  • Buffer used for chromatography 50mM Tris / 50mM NaCl / 10mM CaCl 2 /
  • Figures 1 and 2 show that almost all human factor VII is retained on the affinity support at the time of passage of the composition to be purified, regardless of the amount of Factor VII contained in the starting composition. It has been estimated for the two amounts of factor VII to be purified (100 ⁇ g and 200 ⁇ g) that less than 10% of the Factor VII contained in the starting composition is not retained on the affinity support. Figures 1 and 2 also show a narrow elution peak, illustrating the excellent chromatographic properties of the affinity support of the invention.
  • Figure 3 illustrates the chromatographic profile obtained with a starting composition containing 1 mg of human factor VII.
  • the chromatographic profile of FIG. 3 is very similar to those shown in FIGS. 1 and 2, which illustrates the very high retention capacity of a target ligand of the affinity support of the invention.
  • FIGS. 4 and 5 illustrate the chromatographic profiles obtained by purification of a quantity of human factor VII of 200 ⁇ g (FIG. 4) and 1000 ⁇ g (FIG. 5) on an affinity support prepared as described in example 1 and having underwent drastic sanitization treatment steps with a sanitizing solution comprising a mixture of 0.5 M NaOH and 50% propylene glycol.
  • the chromatographic profiles obtained show the resistance capacity of an affinity support according to the invention to deleterious sanitization treatments. It is specified that the same chromatographic profile is obtained when carrying out a succession of purifications of transgenic human factor VII and washing and sanitizing steps. This demonstrates the excellent stability of the affinity support, which makes it possible to purify target ligands of interest in an extremely reproducible manner.
  • the loading capacity (or in other words the retention capacity) of the affinity supports was evaluated by injection of a recombinant human FVII composition into the "Tp5" buffer (Tris 50 mM, 1M CaCl 2 , pH 7.5).
  • Tables 1 and 2 below show the performance of the Mapt 2CS-PEG (C1 1) and Mapt 2.2CS-PEG (C11) aptamer grafting reaction on the pre-activated NHS Activated Sepharose 4 fast flow gel (GE Depending on the amount of aptamers involved in the reaction per ml of gel. The yield was determined by quantifying the amount of aptamers present in the supernatant at the end of the quantitative PCR coupling reaction.
  • the loading capacity of the affinity carriers for recombinant human FVII varies linearly with the amount of grafted aptamers per ml of gel. There is therefore no saturation effect of the support capacity of the support and therefore loss of aptamer functionality for the high amounts of grafted aptamers.
  • affinity supports having a grafted aptamer density of greater than ômg / ml and having a loading capacity for FVII greater than 8 mg of human recombinant FVII per mL of gel.
  • Table 3 shows the load capacity of the affinity supports as a function of the number of aptamers grafted onto their surface.
  • the amount of non-grafted aptamers was measured at the column outlet after the grafting step.
  • the results show that the grafting yield varies from 0% to 10% maximum, whatever the grafting conditions described in the Table 1 that were used. Contrary to what Goss et al. (supra), high salinity is not sufficient to increase the coupling efficiency.
  • the amount of ungrafted aptamer at the column outlet after the grafting step was measured.
  • the results show that the grafting yield, whatever the grafting conditions described above, varies from 0% to 10% at most.
  • the implementation of the coupling step in the presence of an acidic pH makes it possible to increase significantly coupling the aptamers to the pre-activated 3 medium without impairing the binding ability of said aptamers to their target protein.
  • a Mapt 2CS-PEG (Ci 1) aptamer solution at a concentration of 2 g / L in the grafting buffer was prepared.
  • reaction medium was added 1 mL of borate buffer at 200 mM pH 9 with stirring and incubated for 3 hours with stirring at 4 ° C.
  • the supernatant was removed for final determination of the supernatant.
  • the pH is a crucial parameter for the implementation of the coupling reaction according to the invention.
  • the load capacities obtained are particularly high, which indicates not only a high level of aptamer grafting but also the ability of aptamers to bind specifically to their target protein.
  • the use at room temperature and at a pH below 4.5 of the coupling reaction between the activated carboxylic acid functions of the support and the primary amine functions present at the spacer level of the aptamers makes it possible to only to obtain a grafting yield close to 100% but also a maintenance of the functional integrity of the aptamers.
  • aptamers comprising a DNA polynucleotide and aptamers comprising an RNA polynucleotide were used respectively.
  • the polynucleotide is linked to a spacer chain by its 5 'end while for the other aptamers, the polynucleotide is linked to a spacer chain by its 3' end.
  • aptamers having a hydrophilic spacer chain or a hydrophobic spacer chain have been used.
  • the aptamers used in Example 6 are the following:
  • the aptamer comprising the "Mapt 2 CS" DNA polynucleotide of sequence SEQ ID No. 1 comprising at its 5 'end the hydrophilic spacer chain Ci I described for the preparation of the first affinity support disclosed in paragraph "a)" of Example 1, said aptamer being designated “Mapt2CS oligoS (5 'Hydrophilic Amine Cl 1)" in Table 6; the aptamer comprising the "Mapt 2 CS" DNA polynucleotide of sequence SEQ ID No.
  • the aptamer comprising the "Mapt2 CS" DNA polynucleotide of sequence SEQ ID No. 1 comprising at its 5 'end the hydrophobic Cl 2 spacer chain described for the preparation of the second affinity support disclosed in paragraph "b" of the Example 1, said aptamer being designated “Mapt2CS oligo3 (5 'Amine C12)" in Table 6;
  • the aptamer comprising the "Mapt2 CS" DNA polynucleotide of sequence SEQ ID No. 1 comprising at its 3 'end the hydrophobic C6 spacer chain described for the preparation of the third affinity support disclosed in paragraph "c" of the example 1, said aptamer being designated “Mapt2CS oligo7 (3 'Amine C6)" in Table 6;
  • the aptamer comprising the RNA polynucleotide "Mapt RNA Anti FIXa" of sequence SEQ ID No. 4 comprising at its 5 'end the hydrophilic spacer chain C1 1 described for the preparation of the first affinity support disclosed in paragraph "a)” of Example 1 and comprising at its 3 'end an inverted deoxyribothymidine residue (3'-dT-5'), said aptamer being designated "Mapt RNA Anti FD has 5 'Amine C1 hydrophilic" in Table 6.
  • An affinity support was also prepared on which was grafted an aptamer comprising the "Maptl.2 CSO" DNA polynucleotide of sequence SEQ ID No. 5 comprising at its 5 'end the hydrophilic spacer chain Ci I described for the preparation of the first affinity support disclosed in paragraph "a)" of Example 1, said aptamer being designated “Mapt 1.2CSO oligoS (5'Amin Ci l hydrophilic)".
  • the results for the latter aptamer are not shown in Table 6 below.
  • the aptamer RNA sequence SEQ ID No. 5 was grafted under the following conditions:
  • RNA aptamer 300 ⁇ g were incubated with 500 ⁇ l of gel at the final gel concentration of 0.6 g / l. the grafting reaction was carried out for 2.5 hours at 17 ° C. (RT) and at pH 4.2.
  • reaction was stopped by neutralization with a 200 mM borate buffer for 2.5 hours at 17 ° C and pH 9.
  • the residual amount of non-grafted aptamers in the supernatant was measured for graft yield, agarose gel electrophoresis, and GelRed® staining (3.5%), and then compared with a standard range of known quantities of the aptamer RNA loaded on other tracks of the same electrophoresis gel.
  • nucleic ligands comprise a polynucleotide DNA or an RNA polynucleotide (and thus also the nucleic ligands comprising a hybrid polynucleotide DNA / RNA), including ligands comprising a modified base polynucleotide, including a modified base RNA polynucleotide.
  • the FVII-TG composition used for the injection is prepared by neutralizing the citrate initially contained in the formulation with CaCl 2 and modifying the formulation buffer to obtain: between 35 and 40 mM NaCl and between 3.2 and 4 mM of MgCl 2
  • Buffer used for chromatography 10mM Tris 50mM / CaCl 2 , pH 7.5
  • FIGS. 6 to 9 and of Table 7 above show that almost all of the human factor VIII is retained on the affinity support at the time of the passage of the composition to be purified, with the exception of the affinity support.
  • Example 7 it is shown that affinity supports as defined in the present description retain their capacity for retention and elution of the target protein, even after many cycles of use, under conditions of implementation.
  • graft support No. 1 an aptamer comprising the Mapt 2CS polynucleotide of sequence SEQ ID No. 1 comprising at its 5 'end a hydrophilic Cl chain (11-amino-3,6,9-trioxaundecanyl),
  • graft support No. 2 an aptamer comprising the Mapt 2.2CS polynucleotide of sequence SEQ ID No. 3 comprising at its 5 'end a hydrophilic Cl 1 chain (11-amino-3,6,9-trioxaundecanyl); , and
  • graft support No. 3 an aptamer comprising the "Mapt 2.2 CS" polynucleotide of sequence SEQ ID No. 3 linked at its 5 'end to a spacer chain composed of 6 methylene (CH 2) (C 6 spacer)
  • the grafting yields were respectively 100% (grafting support No. 1), 93% (grafting support No. 2) and 87% (grafting support No. 3).
  • the theoretical static capacity of the prepared affinity media that is, the amount of human F VII that should be retained on the affinity media if each of the grafted aptamers bound a human F VII molecule, was, respectively, 8.7 mg per carrier (carrier # 1), 17.3 mg / mL (carrier # 2) and 16.3 mg / mL (carrier # 3). 7.2. Operating conditions of the process for purifying human FVII.
  • a FVII-TG composition enriched in human FVII was used, the final concentration of FVII-TG being about 50,000 ppm, said composition comprising a high proportion of FVII forms of -gla (inactive forms of FVII) and said composition having a specific activity FVII of about 0.4 (activity expressed as amidolytic activity / antigen).
  • washing with the washing buffer (eight times the volume of the grafted support),
  • the three supports were determined to have a dynamic retention capacity of human FVIIa of about 10 mg of human FVIIa per milliliter of grafted support, which represents between 53% and 58% of the theoretical maximum static capacity calculated in paragraph 7.1. above. These results show that the respective aptamers grafted on the three supports are widely accessible and functional.
  • the following two biological media have been tested: (i) a human blood plasma cryosurnant and (ii) a clarified milk solution, the milk being a source of human FVII, for example when human FVII is produced in the human body. milk from transgenic animals for the gene encoding human FVII.
  • the affinity support No. 1 prepared as described in paragraph 7.1. was contacted with (i) human plasma cryosurnant or (ii) clarified milk for a period of 100 hours. After washing to remove the tested biological medium, the ability of each of the three affinity carriers to purify the human FVII was measured. The results are shown in Table 10 below.

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Abstract

L'invention concerne un procédé d'immobilisation de ligands nucléiques comprenant au moins une fonction amine réactive, par greffage sur un support solide activé, comprenant une étape de couplage desdits acides nucléiques sur ledit support solide activé à un pH inférieur à 6.

Description

Procédé d'immobilisation de ligands nucléiques
DOMAINE DE L'INVENTION
L'invention se rapporte au domaine de la purification de substances d'intérêt à l'aide de supports d'affinité utilisables à l'échelle industrielle, en particulier pour l'obtention de substances purifiées d'intérêt médical,
ART ANTERIEUR
Il existe un besoin récurrent de supports pour chromatographie d'aftlnité qui permettent l'enrichissement sélectif d'un produit de départ en une substance d'intérêt. Dans le domaine médical, des supports de chromatographie d'affinité sont utilisés pour purifier des substances ultérieurement utilisées comme principes actifs de médicament. Principalement, sont utilisés des supports de chromatographie d'immuno-affinité sur lesquels sont immobilisés des anticorps. Les supports d'immuno-affinité sont adaptés à une purification de substances d'intérêt médical à l'échelle industrielle car ils possèdent une bonne capacité de rétention et une sélectivité élevée vis-à-vis de leur molécule cible. De tels supports d'immuno-affinité peuvent être régénérés à l'issue des procédés de purification sans altération substantielle de leur capacité de rétention ou de leur sélectivité, ce qui permet leur utilisation sur une longue période de temps. De plus, du fait de leur capacité de rétention élevée, les supports d'immuno-affinité permettent la purification de grandes quantités de la substance cible, ce qui rend leur utilisation compatible avec les exigences techniques et économiques de la fabrication des médicaments. Les supports d'immuno-affinité présentent toutefois des inconvénients lorsqu'ils sont utilisés pour la purification de substances d'intérêt médical, en raison notamment (î) du relarguage de fragments protéiques immunogènes dérivés des anticorps immobilisés durant la phase d'élution de la substance cible préalablement retenue et (ii) de la fragilité des anticorps vis-à-vis des conditions d'élution et des traitements périodiques de sanitisation antibactérienne et anti-virale.
Diverses études ont été entreprises afin de trouver des alternatives aux supports d'immuno-affinité connus. Un nombre limité d'études concerne l'utilisation des aptamères en tant que ligands d'affinité pour la purification de substances cibles, y compris de protéines cibles. On pourra ainsi citer à titre d'exemple les travaux de Romig et al. (J. Chromatogra. B Biomed Sci Appl, 1999, 731 (2) :275-84) qui concernent la purification de la L-sélectine sur un support de chromatographie sur lequel des aptamères d'ADN anti-L-sélectine ont été immobilisés via le couple streptavidine- biotine.
Il est connu de longue date que l'affinité et la spécificité des aptamères pour leur molécule cible peuvent être aussi élevées que celles des anticorps. Par ailleurs, les aptamères pouvant être obtenus par synthèse chimique, leur coût de fabrication est beaucoup plus faible que celui des anticorps. Néanmoins, l'utilisation de supports d'affinité d'aptamères pour la purification de substances cibles est à l'heure actuelle marginale en dépit des nombreux avantages économiques et techniques que présentent les aptamères en tant que ligands d'affinité. A la connaissance de la Demanderesse, à l'heure actuelle, aucun procédé industriel de purification d'une substance cible, y compris d'une protéine cible, ne comprend une étape basée sur l'utilisation d'un support d'affinité d'aptamères.
Une raison qui peut être avancée pour expliquer ce défaut d'utilisation des aptamères dans les procédés de purification à l'échelle industrielle est la difficulté à obtenir des supports d'affinité sur lesquels sont fixés de manière stable et quantitative les aptamères.
La principale technique d'immobilisation des aptamères décrite dans l'état de la technique est basée sur l'utilisation du couple biotine- streptavidine ou biotine-avidine. Cette technique tire parti de la sélectivité et de la forte affinité de la biotine pour son ligand avidine ou streptavidine ainsi que de la stabilité du complexe non-covalent résultant de leur association. Ce type de support d'affinité présente toutefois des limitations techniques résultant du caractère protéique des agents de couplage utilisés et du caractère non-covalent de la liaison formée entre le support et les aptamères. En effet, la biotine et l'avidine ou streptavidine sont sensibles aux traitements susceptibles d'induire une dénaturation protéique Par ailleurs, Le complexe biotine/streptavidine se dissocie à faible température, notamment dans des solutions aqueuses non ioniques ou à faible concentration saline. Pour ces différentes raisons, les supports d'affinité sur lesquels des aptamères nucléiques immobilisés en tant que ligands par l'intermédiaire du complexe biotine/streptavidine ne sont pas adaptés à une utilisation dans des procédés de purification, en particulier industriels, pour lesquels la possibilité de régénérer et de sanitiser les supports d'affinité entre chaque cycle de purification est primordiale. L'état de la technique décrit également plusieurs techniques permettant le greffage covalent d'acides nucléiques sur des supports solides, essentiellement dans l'objectif de disposer de nouveaux outils destinés à la mise en œuvre de méthodes analytiques. On a ainsi décrit le greffage d'aptamères nucléiques possédant un groupe aminé réactif sur un support de sépharose activé par le bromure de cyanogène (Madru et al., 2009, Anal. Chem., Vol. 81 : 7081-7086). On a aussi décrit le greffage d'aptamères ARNs oxydés par du periodate sur un support d'agarose activé par des groupes dihydrazide d'acide adipique (Caputi et al., 1999, The EMBO Journal, Vol. 18(14) : 4060- 4067). On connaît également des techniques de greffage d'aptamères nucléiques par l'intermédiaire d'agents de couplage bi-fonctionnels comme le SIAB (Rehder et al, Electrophoresis, Vol. 22(17) : 3759)
L'état de la technique divulgue également des techniques de couplage covalent d'acides nucléiques, entre autres d'aptamères, sur des supports solides de type silice ou agarose comprenant des groupes acide carboxylique pré-activés par le N- hydroxysuccimmide (NHS) (Goss et al., 1990, J Chromatogr, Vol. 508 : 279-287 ; Larson et al.,1992, Nucleic Acids research, Vol. 20(13) : 3525, Allerson et al., 2003, RNA, Vol. 9 : 364-374). Ces techniques de couplage ont consisté en une application directe des techniques utilisées conventionnellement pour le couplage des protéines sur des supports solides.
Goss et al. (1990, J Chromatogr, Vol. 508 : 279-287) ont ainsi décrit le greffage d'un oligonucléotide S'-aminoéthyl-polyidThg sur un support macroporeux de silice pré-activé par le NHS dans un tampon de phosphate de sodium à pH=7,4. Le support d'affinité obtenu par Goss et al. présente un taux de greffage de poly(dThs de 0,5 μηιοΐ par g de silice, ce qui est très faible compte tenu du nombre de groupements carboxylates par g de gel de silice (500 μηιοΐ par g de silice). En d'autres termes, seulement 0.1% des groupements carboxylates présents à la surface du support sont liés via une liaison amidique à un oligonucléotide poly(dT)lg. Goss et al. sont parvenus à capturer une faible quantité d'un mélange d'acides nucléiques modèles de oligo-(dA)i2-i avec le support d'affinité ainsi obtenu, puis à les éluer successivement dans un tampon d'élution à gradient de salinité.
Dans leur article publié en 2003, Allerson et al. (2003, RNA, Vol. 9 : 364-374) ont déploré que la chromatographie basée sur l'utilisation d'acides nucléiques en tant que ligand d'affinité est rarement utilisée pour la purification de protéine à l'échelle industrielle en raison de la faible capacité et/ou de la faible stabilité des supports d'affinité obtenus jusqu'à ce jour. A la connaissance de ces auteurs, les méthodes de couplage connues permettent tout au plus de n'immobiliser que quelques nanomoles d'ARN par millilitre de support. Selon un procédé analogue à celui de Goss et al., Allerson et al. (2003, RNA, Vol. 9 : 364-374) ont décrit une tentative de couplage d'aptamères nucléiques, dirigés contre une protéine régulatrice IRP1 ou ÎRP2, sur un support d'agarose pré-activé par le NHS. Allerson et al. se sont référés aux « recommandations du fabricant du support d'agarose» pour la mise en œuvre de ce couplage et ont donc réalisé la réaction de couplage à un pH basique égal à 8,3. On précise que le fabricant recommande, encore aujourd'hui, de réaliser le couplage d'un ligand sur un support pré-activé par le NHS à un pH compris entre 6 et 9 (voir par exemple le document d'instructions n° 71-5000-14 AC de GE Healthcare concernant le gel NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow)). Allerson et al. ont eux-mêmes constaté que la réaction de couplage d'aptamères d'ARN présentant une fonction aminé primaire avec un support préactivé par le NHS fournit un rendement de couplage très faible, de l'ordre de 2%, quels que soient la durée de la réaction de couplage ou le type de solutions tampon utilisées, sans parvenir à surmonter cet inconvénient technique. Allerson et al. (2003, Supra) se sont finalement détournés de cette technique de greffage au profit d'une technique de greffage multi-étape comprenant (i) l'introduction de fonctions alkyl-thiol sur le support, (ii) l'introduction du groupe 5'- iodoacétamide en position 5' des aptamères par l'intermédiaire de l'agent bifonctionnel Sulfo-SIAB et (iii) une étape de couplage proprement dite entre les fonctions thiol du support et les groupes iodo-acétamide des aptamères de manière à créer une liaison thiol. De la même manière, Ruta et al. (2008, Anal. Bioanal. Chem., Vol. 390 : 1051.-1057) ont montré que la phase stationnaire résultant du greffage d'aptamères d'ADN dirigés contre la D-adénosine sur un support de silice activé par le NHS présentait une capacité de liaison pour la D-adénosine très faible.
Il existe donc un besoin dans l'état de la technique pour de nouveaux procédés de préparation de supports d'affinité, notamment de supports d'affinité adaptés à la purification à l'échelle industrielle de substances d'intérêt médical. RESUME DE L'INVENTION
La présente invention est relative à un procédé d'immobilisation d'acides nucléiques comprenant au moins une fonction aminé réactive, par greffage sur un support solide présentant à sa surface des groupes acides carboxyliques activés, ledit procédé comprenant une étape de couplage desdits acides nucléiques sur ledit support solide activé à un pH inférieur à 6.
Selon une définition alternative, la présente invention concerne un procédé d'immobilisation des ligands nucléiques comprenant au moins une fonction aminé primaire sur un support solide comprenant les étapes suivantes :
a) fournir un support solide comprenant à sa surface des groupes acides carboxyliques activés,
b) fournir un ligand nucléique comprenant au moins une fonction aminé primaire, et
c) réaliser le couplage dudit acide nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide dans des conditions de pH inférieur à 6
étant entendu que l'ordre des étapes a) et b) est indifférent.
Dans un mode de réalisation préféré, les groupes acides carboxyliques activés sont obtenus par réaction avec le N-hydroxysuccinimide ou l'un de ses dérivés.
L'invention concerne également une méthode de préparation d'un support d'affinité comprenant la mise en œuvre du procédé d'immobilisation telle que défini ci- dessus.
Un autre objet de l'invention est un support solide d'affinité pouvant être obtenu par la méthode de préparation telle que définie précédemment ainsi que son utilisation dans des procédés de purification ou de détection d'une protéine cible.
Un objet supplémentaire est un complexe résultant de l'interaction d'un ligand nucléique et d'une molécule cible, ledit complexe étant formé à la surface d'un support solide tel que défini précédemment.
Enfin, la présente invention a également trait à un procédé de purification d'un ligand cible avec un support d'affinité, comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact une composition à purifier comprenant un ligand cible d'intérêt avec un support d'affinité tel que défini ci-dessus, afin de former un complexe entre (i) les acides nucléiques greffés sur ledit support et (ii) ledit ligand cible et
b) libérer ledit ligand cible à partir du complexe formé à l'étape a) et récupérer ledit ligand cible purifié.
DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 illustre un profil chromatographique obtenu par passage d'une composition comprenant 100 g de Facteur VII humain transgénique sur un support solide de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII humain. Le pic n°î correspond à une fraction de FVII humain non retenu sur le support d'affinité. Le pic n°2 correspond au FVII humain contenu dans la fraction d'élution. Le pic n° 3 correspond au FVII humain contenu dans l'éluant de régénération. En abscisse : le temps, exprimé en minutes. En ordonnées : i'absorbance, exprimée en unités de Densité Optique à la longueur d'onde de 280 nanomètres.
La Figure 2 illustre un profil chromatographique obtenu par passage d'une composition comprenant 200 de Facteur VII humain transgénique sur un support solide de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII humain. Le pic n°2 correspond au FVII humain contenu dans la fraction d'élution. Le pic n° 3 correspond au FVII humain contenu dans l'effluent de régénération. En abscisse : le temps, exprimé en minutes. En ordonnées : I'absorbance, exprimée en unités de Densité Optique à la longueur d'onde de 280 nanomètres.
La Figure 3 illustre un profil chromatographique obtenu par passage d'une composition comprenant 1000 g de Facteur VII humain transgénique sur un support solide de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII humain. Le pic n°2 correspond au FVII humain contenu dans la fraction d'élution. Le pic n° 3 correspond au FVII humain contenu dans l'effluent de régénération. En abscisse : le temps, exprimé en minutes. En ordonnées : I'absorbance, exprimée en unités de Densité Optique à la longueur d'onde de 280 nanomètres.
La Figure 4 illustre un profil chromatographique obtenu par passage d'une composition comprenant 200 μg de Facteur VII humain transgénique sur un support solide de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII humain, ledit support ayant été préalablement soumis à un traitement par une solution de sanitisation comprenant 0,5 M de NaOH. Le pic n°2 correspond au FVII humain contenu dans la fraction d'élution. Le pic n° 3 correspond au FVII humain contenu dans l'effluent de régénération. En abscisse : le temps, exprimé en minutes. En ordonnées : l'absorbance, exprimée en unités de Densité Optique à la longueur d'onde de 280 nanomètres.
La Figure 5 illustre un profil chromatographique obtenu par passage d'une composition comprenant 1000 μg de Facteur VII humain transgénique sur un support solide de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII humain, ledit support ayant été préalablement soumis à un traitement par une solution de sanitisation comprenant 0,5 M de NaOH. Le pic n°2 correspond au FVII humain contenu dans la f action d'élution. Le pic n° 3 correspond au FVII humain contenu dans l'effluent de régénération. En abscisse : le temps, exprimé en minutes. En ordonnées : l'absorbance, exprimée en unités de Densité Optique à la longueur d'onde de 280 nanomètres.
La Figure 6 illustre un profil chromatographique obtenu par passage d'une composition comprenant 2,7 mg de Facteur VII humain transgénique sur un support solide de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII humain dans les conditions de couplage suivantes : 48h, 5°C, pH 4,2. Le point n° 1 (à environ 45 min) indique le moment de l'injection de Facteur VII humain. Le pic n° 2 (à environ 70 min) correspond au FVII humain contenu dans la fraction d'élution. En abscisse : le temps, exprimé en minutes. En ordonnées : l'absorbance, exprimée en unités de Densité Optique à la longueur d'onde de 280 nanomètres.
La Figure 7 illustre un profil chromatographique obtenu par passage d'une composition comprenant 2,7 mg de Facteur VII humain transgénique sur un support solide de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII humain dans les conditions de couplage suivantes : 48h, 5°C, pH 3,8. Le point n° 1 (à environ 35 min) indique le moment de l'injection de Facteur VII humain. Le pic n° 2 (à environ 70 min) correspond au FVII humain contenu dans la fraction d'élution. En abscisse : le temps, exprimé en minutes. En ordonnées : l'absorbance, exprimée en unités de Densité Optique à la longueur d'onde de 280 nanomètres.
La Figure 8 illustre un profil chromatographique obtenu par passage d'une composition comprenant 2,7 mg de Facteur VII humain transgénique sur un support solide de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII humain dans les conditions de couplage suivantes ; 2h, 5°C, pH 4,2. Le point n° 1 (à environ 35 min) indique le moment de l'injection de Facteur VII humain. Le pic n° 2 (à environ 70 min) correspond au FVII humain contenu dans la fraction d'élution. En abscisse : le temps, exprimé en minutes. En ordonnées : l'absorbance, exprimée en unités de Densité Optique à la longueur d'onde de 280 nanomètres.
La Figure 9 illustre un profil chromato graphique obtenu par passage d'une composition comprenant 2,7 mg de Facteur VII humain transgénique sur un support solide de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII humain dans les conditions de couplage suivantes : Ih, TA (température ambiante), pH 4,2. Le point n° 1 (à environ 40 min) indique le moment de l'injection de Facteur VII humain. Le pic n° 2 (à environ 75 min) correspond au FVII humain contenu dans la fraction d'élution. En abscisse : le temps, exprimé en minutes. En ordonnées : l'absorbance, exprimée en unités de Densité Optique à la longueur d'onde de 280 nanomètres. DESCRIPTION DETAILLEE DE L ''INVENTION
La présente invention fournit de nouveaux supports d'affinité comprenant des acides nucléiques immobilisés, ainsi que des procédés pour les préparer.
Un premier objet de l'invention est un procédé d'immobilisation d'acides nucléiques présentant au moins une fonction aminé réactive sur un support solide présentant des fonctions acides carboxyliques activées.
Par « acide nucléique » ou « ligand nucléique », on entend selon l'invention un composé comprenant un polymère de nucléotides ou polynucléotide, c'est-à-dire de ribonucléotides et/ou de désoxyribonucléotides éventuellement modifiés chimiquement, ayant une longueur allant de 5 à 10 000 nucléotides de longueur, de préférence une longueur allant de 5 à 1000 nucléotides de longueur, et encore mieux de 5 à 120 nucléotides de longueur. Un acide nucléique englobe classiquement les polyribonucléotides (AR ) et les polydésoxyribonucléotides (ADN), le cas échéant chimiquement modifiés.
Un nucléotide est composé (i) d'un groupement phosphate (mono-, di- ou tri-) ou un analogue, (ii) d'un sucre choisi parmi le ribose, le désoxyribose et leurs analogues chimiques et (iii) une base azotée choisie parmi l'adénine, la guanine, la thymine, la cytosine, Puracile et leurs analogues chimiques. Au sens de l'invention, un nucléotide peut être modifié aussi bien sur sa partie osidique que sur sa base azotée par des méthodes bien connues de l'homme du métier. A titre d'exemple, on pourra se référer au brevet US5958691 qui décrit des aptamères présentant une modification chimique au niveau d'un ou plusieurs nucléotides. Dans certains modes de réalisation, un acide nucléique consiste en un polymère de nucléotides, ribonucléotides ou désoxyribonucléotides.
Dans d'autres modes de réalisation, un acide nucléique consiste essentiellement en un polymère de nucléotides et comprend une partie non-nucléotidique, ladite partie non-nucléotidique étant préférentiellement de longueur réduite, comparée à la longueur de la partie nucléotidique, par exemple une longueur linéaire inférieure à la longueur occupée par une chaîne de cinq nucléotides, ribonucléotides ou désoxyribonucléotides.
Selon l'invention, un acide nucléique comprend une fonction aminé réactive lorsque ledit acide nucléique possède une fonction aminé accessible au solvant et apte à réagir avec un groupe réactif approprié porté par une autre entité moléculaire. Les fonctions aminés réactives englobent en particulier les aminés primaires. Cette aminé primaire est distincte des aminés aromatiques portées par les noyaux puriques ou pyrimidiques des nucléotides.
De tels acides nucléiques sont bien connus dans l'état de la technique et sont classiquement utilisés pour leur couplage chimique à des supports ou à des substances marqueurs. Classiquement, il s'agit d'acides nucléiques qui ont été modifiés par l'ajout d'une fonction aminé à leur extrémité 3' ou à leur extrémité 5'. Le plus fréquemment, la fonction aminé est ajoutée à l'extrémité 5' de l'acide nucléique où son incorporation est plus aisée comme étape finale d'un procédé de synthèse d'un polynucléotide. Dans certains modes de réalisation, la fonction aminé réactive et l'extrémité 5' ou 3 ' de l'acide nucléique sont séparées par une chaîne espaceur.
Selon l'invention, un acide nucléique peut comprendre une fonction aminé réactive à son extrémité 3 ' ou 5', ce qui signifie que la fonction aminé réactive est couplée sur la partie nucléotidique dudit acide nucléique.
Selon d'autres modes de réalisation, un acide nucléique peut comprendre une fonction aminé réactive « du côté » de son extrémité 3' ou 5', ce qui signifie que ladite fonction aminé n'est pas couplée directement sur la partie nucléotidique dudit acide nucléique, mais est liée de manière co val ente à une partie non-nucléotidique dudit acide nucléotidique, par exemple une chaîne espaceur non-nucléotidique qui est interposée entre ladite fonction aminé réactive et ladite extrémité de la partie nucléotidique dudit acide nucléique.
Pour résumer, au sens de l'invention, un « acide nucléique », également désigné dans ce qui suit par « ligand nucléique » comprend :
* un polynucléotide, ledit polynucléotide consistant en un enchaînement de ribonucléotides et/ou de désoxyribonucléotides éventuellement chimiquement modifiés, et
B en option, une partie non-nucléotidique de préférence une chaîne espaceur,
Ledit ligand ou acide nucléique comprend, en outre, une fonction aminé réactive, ladite fonction aminé réactive pouvant être fixée soit à une extrémité 3' ou 5' du polynucléotide ou le cas échéant sur la chaîne espaceur.
De manière générale, le polynucléotide est au moins modifié au niveau du nucléotide en 3' ou 5' pour introduire la fonction aminé réactive directement ou par l'intermédiaire d'une partie non-nucléotide, en particulier, une chaîne espaceur.
L'acide nucléique peut comprendre une entité chimique supplémentaire à celles précédemment citées par exemple un fluorophore ou un chromophore.
De manière générale, l'acide nucléique selon l'invention est un ligand c'est-à- dire qu'il est capable de se lier spécifiquement à une ou plusieurs molécules cibles. On parlera donc indifféremment dans ce qui suit de « ligand nucléique » ou d' «acide nucléique ». Les molécules cibles englobent des molécules d'AR , d'ADN, des molécules chimiques de nature organique ou minérale, des peptides et des protéines qu'elles soient humaines, animales, végétales, virales ou bactériennes.
La demanderesse a montré qu'il était possible de préparer des supports d'affinité sur lesquels sont immobilisés des acides nucléiques (ou ligands nucléiques), lesdits supports d'affinité étant utilisables dans des techniques préparatives de purification de substances d'intérêt thérapeutique, car ils possèdent à la fois une bonne capacité de rétention sélective des substances cibles, une excellente résistance aux traitements de régénération et leur utilisation n'entraîne pas de risque d'introduction de substances potentiellement toxiques ou immunogènes dans la préparation purifiée résultante. Plus précisément, il a été montré selon l'invention que des supports d'affinité à base d'acides nucléiques peuvent être préparés par greffage chimique desdits acides nucléiques sur un support solide comprenant des fonctions acides carboxyliques activées, dans des conditions spécifiques de greffage permettant à la fois un haut rendement de greffage et le maintien de l'intégrité structurelle et fonctionnelle des acides nucléiques greffés.
La demanderesse a montré que, contrairement à ce qu'indiquait l'article de Goss et al. (1990, Supra) la technique de couplage d'un ligand comprenant une fonction aminé réactive sur un support pré-activé par NHS, qui est couramment utilisée pour le couplage de protéines sur un support, ne peut pas être directement transposée pour le greffage d'acides nucléiques sur un support.
Les résultats des exemples montrent notamment qu'en utilisant la méthode classique de couplage réalisée à un pH compris entre 6 et 9 avec une variété d'acides nucléiques distincts, on obtient un rendement de greffage variant de 0% à 10% au maximum. Les résultats des exemples confirment ceux obtenus par Allerson et al. (2003, Supra), qui avaient opté au final pour une autre technique de couplage.
Dans l'objectif de rechercher des méthodes de couplage alternatives aux méthodes connues, la demanderesse a testé des conditions de couplage sur support activé par NHS dans lesquelles les charges anioniques portées par les acides nucléiques sont masquées par l'ajout d'une source d'ions monovalents ou divalents, en l'occurrence par addition d'ions Mg2+, Ca2+ et/ou Na+. Les résultats des exemples montrent que la neutralisation des charges anioniques portées par les acides nucléiques et/ou l'augmentation de la force ionique par ajout de cations divalents ou monovalents ne permet pas d'augmenter le rendement de greffage qui reste compris dans une gamme allant de 0% à 10%. Il est également montré que la neutralisation des charges anioniques portées par les acides nucléiques par l'ajout de macromolécules ionisées, comme un Polybrene®, conduit à une impossibilité de greffer ces acides nucléiques.
Egalement, la demanderesse a testé l'efficacité d'un couplage mettant en œuvre des acides nucléiques dans lesquels la fonction aminé réactive et l'extrémité 5' du polynucîéotide sont séparées l'une de l'autre par une chaîne espaceur chargée positivement. La chaîne espaceur consistait en un polyamide comprenant au moins une fonction aminé tertiaire. Les résultats, non présentés dans les exemples, ont montré l'obtention d'un excellent rendement de greffage, proche de 100%, sur le support préactivé avec NHS. En revanche, la demanderesse a montré que la mise en contact du support ainsi greffé avec une solution à un pH alcalin d'environ 9-10 altérait la structure de la chaîne espaceur et entraînait le décrochement des acides nucléiques du support. Une telle technique de couplage, qui permet un excellent rendement de couplage, fournit donc un support d'affinité qui s'est révélé inadapté à une mise en œuvre dans des procédés industriels de purification, lesdits procédés comprenant généralement des étapes drastiques de lavage et/ou d'inactivation microbienne.
La solution technique qui a été finalement mise au point selon l'invention a consisté à réaliser la réaction de couplage des acides nucléiques sur le support pré-activé par le N-hydroxysuccinimide, dans des conditions de pH inférieur à 6.
La solution technique de l'invention est tout à fait surprenante car à un pH acide, l'homme du métier se serait normalement attendu à ce que la réaction de couplage n'ait pas lieu du tout, ou à tout le moins ait lieu dans une si faible proportion qu'un très faible rendement de greffage soit obtenu en raison de la faible réactivité des aminés primaires et à la dégradation par hydrolyse des acides nucléiques généralement observées aux pH acides
Or, on a montré dans les exemples que la réalisation de l'étape de couplage d'un acide nucléique sur un support pré-activé par le NHS, dans des conditions de pH inférieur à 5, permet l'obtention d'un support greffé avec un rendement de greffage d'au moins 70%. Le rendement de greffage est même d'environ 100% lorsque la réaction de couplage est conduite à pH inférieur à 4,5.
C'est de manière tout aussi surprenante qu'il est montré que la réalisation de l'étape de couplage à un pH acide n'affecte pas l'intégrité fonctionnelle des acides nucléiques, alors que la grande sensibilité des acides nucléiques aux conditions de pH acide est bien connue par l'homme du métier.
De manière encore plus surprenante, la Demanderesse a montré que cette réaction de couplage - qui conduit à la formation d'une liaison amidique entre le support solide et l'acide nucléique - est très rapide, cette réaction étant généralement achevée en moins d'une heure, indépendamment de la température de réaction. Par ailleurs, la Demanderesse a montré que la mise en œuvre de la réaction à basse température n'est pas une condition requise pour préserver l'intégrité fonctionnelle des ligands greffés. En d'autres termes, le procédé d'immobilisation des ligands nucléiques selon l'invention peut être effectué indépendamment à basse température ou à température ambiante.
On a aussi montré dans les exemples que les acides nucléiques greffés sur le support conservent leur intégrité chimique et physique, du fait que leur fonctionnalité est intacte. Cet aspect est illustré dans les exemples par un support greffé avec des aptamères nucléiques aptes à se lier au Facteur VII humain (FVIIh). On montre que l'aptitude desdits aptamères nucléiques anti-FVHh est intacte après leur greffage dans des conditions de pH acide, à basse température ou à température ambiante, sur le support pré-activé par le NHS. La demanderesse a aussi montré que lorsqu'on utilise pour le greffage un aptamère nucléique apte à se lier sélectivement à des formes de Facteur VII humain actif comprenant un domaine Gla correctement gamma-carboxylé, Γ aptamère greffé conserve l'aptitude de î'aptamère non-greffé à discriminer (i) les formes actives du Facteur VII humain à domaine Gla correctement gamma-carboxylé des (ii) formes non actives du Facteur VII humain.
On a aussi montré que les conditions de couplage spécifiques divulguées dans la présente description étaient adaptées au greffage de tout type d'acide nucléique, c'est-à- dire à la fois d'acides nucléiques ADN et d'acides nucléiques A N.
De plus, les exemples montrent que le procédé de l'invention aboutit à l'obtention de supports d'affinité possédant une forte densité d'acides nucléiques greffés et permet en conséquence la préparation de supports d'affinité possédant une grande capacité de capture de ligands cibles, utilisables à l'échelle industrielle. A la connaissance de la Demanderesse, de tels supports n'ont jamais été décrits dans l'état de la technique.
Les caractéristiques combinées de haute sélectivité vis-à-vis d'un ligand cible et de grande capacité de capture dudit ligand cible illustrent la compatibilité d'un support d'affinité obtenu selon le procédé de l'invention avec une utilisation dans une étape de purification de ligands cibles à l'échelle industrielle. Il va de soi que le procédé selon la présente invention permet également la préparation de supports d'affinité destinés à la détection d'une molécule cible.
La présente invention a plus précisément pour objet un procédé d'immobilisation de ligands nucléiques comprenant au moins une fonction aminé réactive, par greffage sur un support solide présentant des groupes acides carboxyliques activés, ledit procédé comprenant une étape de couplage co valent desdits acides nucléiques sur ledit support solide à un pH inférieur à 6.
Selon une autre définition, le procédé d'immobilisation des ligands nucléiques comprenant au moins une fonction aminé réactive sur un support solide selon l'invention comprend les étapes suivantes :
a) fournir un support solide comprenant à sa surface des groupes acides carboxyl jques activés,
b) fournir un ligand nucléique comprenant au moins, une fonction âmine réactive, et . .
c) réaliser le couplage dudit ligand nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide dans des conditions de pH inférieur à 6.
étant entendu que l'ordre des étapes a) et b) est indifférent.
Il va de soi que l'étape de couplage c) permet la création de liaisons amidiques entre le support solide et les ligands nucléiques, chaque liaison amidique résultant de la réaction entre une fonction acide carboxylique activée du support et une fonction aminé primaire présente au niveau du ligand nucléique.
Selon l'invention, les conditions de couplage à un pH inférieur à 6 englobent des conditions de couplage à un pH inférieur à 5,5, inférieur à 5, inférieur à 4,9, inférieur à 4,8, inférieur à 4,7, inférieur à 4,6, inférieur à 4,5, inférieur à 4,3.
Dans certains modes de réalisation, le pH de l'étape de couplage est compris dans une gamme allant de 3 à 6, ce qui englobe un pH de 3,0, un pH de 3,1 , un pH de 3,2, un pH de 3,3, un pH de 3,4, un pH de 3,5, un pH de 3,6, un pH de 3,7, un pH de 3,8, un pH de 3,9, un pH de 4, 0, un pH de 4,1 , un pH de 4,2, un pH de 4,3, un pH de 4,4, un pH de 4,5, un pH de 4,6 un pH de 4,7, un pH de 4,8, un pH de 4,9, un pH de 5,0, un pH de 5,1 , un pH de 5,2, un pH de 5,3, un pH de 5,4, un pH de 5,5, un pH de 5,6, un pH de 5,7, un pH de 5,8 et un pH de 5,9.
De préférence, le pH de l'étape de couplage est inférieur à 4,5. Dans certains modes de réalisation, le pH de la réaction de couplage est compris dans une gamme allant 3,5 à 4,5.
Comme cela est illustré dans les exemples, l'étape de couplage peut être réalisée à un pH d'environ 4,2. De préférence, le couplage est réalisé en présence d'un milieu tamponné aqueux présentant un pH inférieur à 6. Le milieu tamponné peut être préparé à partir de tout type d'acides et/ou. de bases faibles, dans la mesure ou le ou les acides et bases faibles utilisées ne sont pas susceptibles de réagir au cours de la réaction de couplage. Comme cela est illustré dans les exemples, il peut s'agir d'une solution aqueuse d'acétate de sodium.
Sans vouloir être liée par une quelconque théorie, la demanderesse pense qu'aux conditions de pH acide utilisées pour la réaction de couplage, les acides nucléiques à greffer sont sous forme linéaire, ce qui favorise l'accessibilité de leur groupe amine réactif au solvant, et en particulier favorise la réaction dudit groupe amine réactif avec un groupe acide carboxylique activé accessible à la surface du support solide.
Par « fonction acide carboxylique activée» ou « groupe acide carboxylique activé », on entend une fonction chimique dérivée de la fonction « acide carboxylique » apte à réagir avec un nucléophile. De manière plus spécifique, on entend par « fonction acide carboxylique activée » une fonction chimique dérivée de la fonction « acide carboxylique » apte à réagir avec une amine primaire de manière à former une liaison amidique. Les fonctions « acides carboxyliques activées » sont bien connues de l'homme du métier et englobent les fonctions chlorures d'acide, anhydrides mixtes et esters.
Dans certains modes de réalisation, les fonctions acides carboxyliques activées sont sous forme d'esters résultant de la réaction desdites fonctions acides carboxyliques avec un composé choisi parmi le groupe constitué par le 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), le HOAt, le N-hydroxysuccinimide ou l'un de leurs dérivés.
Dans un mode de réalisation préféré, les groupes acides carboxyliques du support ont été activés par réaction avec le N-hydroxysuccinimide ou l'un de ses dérivés tels que le N-hydroxysulfosuccinimide.
Ceci signifie que les groupes « acides carboxyliques activés » du support solide correspondent à des groupes « esters de N-succinimidyle », ou encore appelés « esters de succinimidyle » ou « esters de N-hydroxysuccinimide », de formule suivante (I) où R représente la ramification du support solide à laquelle la fonction ester est fixée:
Figure imgf000017_0001
L'activation par le NHS ou le sulfc-NHS présente l'avantage de générer des esters, activés réactifs vis-à-vis des aminés primaires mais également suffisamment stables pour permettre le conditionnement et le stockage du support pré- activé obtenu.
Les supports solides présentant des fonctions « acides carboxyliques activées » sont bien connus dans l'état de la technique et nombre d'entre eux sont commercialisés. Les supports solides peuvent être également préparés selon des méthodologies bien connues de l'homme du métier, par exemple en faisant réagir un support présentant initialement des fonctions acides carboxyliques à sa surface avec un agent chimique adapté permettant l'activation des fonctions acides carboxyliques en vue de la formation subséquente d'une liaison amidique. On pourra, en particulier, se référer aux méthodes classiques d'activation des fonctions acides carboxyliques utilisées en synthèse peptidique, en particulier par voie solide. A titre illustratif, on peut aussi utiliser, dans les conditions spécifiques de couplage prescrites par l'invention, la méthodologie d'activation par une combinaison de EDC (chlorhydrate de l-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide) et de NHS, bien connue de l'homme du métier.
Les supports solides présentant des fonctions « acides carboxyliques activées » peuvent être de tout type. Ces supports englobent les supports classiquement utilisés pour la chromato graphie, y compris les supports de silice etd'agarose, et qui ont été traités afin de présenter à leur surface des groupes acides carboxyliquesactivés. Les supports solides pré- activés englobent des gels de dextrane, d'agarose, d'amidon, des dérivés cellulosiques, ou encore des polymères synthétiques tels que des polyamides, du trisacryle, du sephacryle des dérivés de méthacrylate, des dérivés du polystyrène et des polyacryîamides, ou encore des supports tels que des supports de silice (notamment des supports de verre poreux) ou d'alumine, sur la surface desquels sont présents des groupes acides carboxyliques activés. De manière générale, les supports solides sur lesquels peuvent être immobilisés les ligands nucléiques selon l'invention englobent tout type de support ayant la structure et la composition retrouvée communément pour les supports de filtre, des membranes, etc. Les supports solides englobent notamment les résines, les résines ou gels pour colonne de chromatographie d'affinité, les billes de polymères, les billes magnétiques, les billes paramagnétiques, les matériaux supports de membrane filtrante, etc. Les supports solides englobent aussi notamment les matériaux à base de verre ou de métal, tels que l'acier, l'or, l'argent, l'aluminium, le cuivre, le silicium, le verre, la céramique. Les supports solides englobent aussi notamment des matériaux polymères, tels qu'un polyéthylène, un polypropylène, un polyamide, un fluorure de polyvinylidène, des dérivés de polyacrylamide et des combinaisons de ceux-ci.
Dans les modes de réalisation particuliers pour lesquels les fonctions acides carboxyliques du support solide sont activées par le NHS, ledit support solide peut être obtenu en faisant réagir un gel commercial présentant des fonctions acides carboxyliques libres avec le N-hydroxysuccinimide (NHS), éventuellement en présence d'un carbodiimide tel que le l -éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDC) .
On peut également utiliser un support solide commercial pré-activé par le NHS comme par exemple un gel « NHS Activated Sepharose 4 fast flow (GE) » commercialisé par la société General Electric Healthcare (Etats-Unis), un gel « HiTrap™ NHS-activated » commercialisé par la société General Electric Healthcare (Etats-Unis) ou encore un gel «NHS-Activated Agarose » commercialisé par la société Thermo Scientifîc Pierce.
Comme cela est expliqué ci-avant, un ligand nucléique selon l'invention comprend un polynucléotide c'est-à-dire en un polymère de nucléotides. Le polynucléotide du ligand nucléique est responsable en grande partie des propriétés de liaison spécifique dudit ligand vis-à-vis de sa ou ses molécules cibles. Il comprend généralement de 5 à 120 nucléotides de longueur.
Le ligand nucléique peut comprendre, en outre, une partie non-nucléotidique.
Ladite partie non-nucléotidique étant de préférence lié au polynucléotide. On entend par une partie « non-nucléotidique » un motif chimique qui ne consiste pas essentiellement à un polynucléotide. Cette partie non-nucléotide est de préférence une chaîne espaceur. L' aminé réactive dudit ligand nucléique est de préférence une aminé primaire présente à l'extrémité 3' ou 5' du polynucléotide ou le cas échéant une aminé primaire présente au niveau de la partie non-nucléotidique. De manière préférée, l'aminé réactive est une aminé primaire aliphatique, ce qui signifie que la fonction aminé n'est pas directement liée à un groupe aromatique.
Ainsi, dans certains modes de réalisation, le ligand nucléique est un polynucléotide de 5 à 120 nucléotides de longueur comprenant au moins une fonction aminé réactive à son extrémité 3 ' ou 5 ' .
Dans d'autres modes de réalisation, le ligand nucléique comprend (i) un polynucléotide de 5 à 120 nucléotides de longueur et (ii) une chaîne espaceur liée audit polynucléotide, la fonction aminé réactive étant fixée à une extrémité 3 ' ou 5' dudit polynucléotide ou à la chaîne espaceur.
La chaîne espaceur est liée préférentiellement à l'extrémité 5' ou à l'extrémité
3' de l'acide nucléique.
Dans certain mode de réalisation selon l'invention, le ligand nucléique comprend un polynucléotide et une chaîne espaceur, ladite chaîne espaceur comprenant à l'une de ces extrémités une fonction aminé et étant lié par sa deuxième extrémité à l'extrémité , 5' du polynucléotide.
Ladite chaîne espaceur a pour fonction d'éloigner physiquement le polynucléotide de la surface du support solide ce qui permet d'augmenter la mobilité relative de la partie nucléotidique du ligand nucléique et de diminuer l'encombrement stérique.
La chaîne espaceur peut être de tout type. Les exemples illustrent en particulier la mise en œuvre du procédé selon l 'invention pour une chaîne hydrophobe consistant en une chaîne composé d'une chaîne hydrophobe consistant en une chaîne composé de 3, 6, 12 ou plus (par exemple 18) méthylène (CH2) nommé dans la suite C3 , C6, C12 ou une chaîne hydrophile qui peut être de type polyéthylène glycol, par exemple Hexaéthylène glycol (HEG) ou un 1 l-amino-3,6,9-trioxaundécan-l yl appelé dans la suite Ci l hydrophile ou un oligonucléotide non spécifique De préférence, la chaîne espaceur ne comprend pas de groupements ionisables autres que des fonctions aminés primaires ou des fonctions aminés secondaires. De manière générale, la chaîne espaceur ne comprend pas de groupements ou de liaisons sensibles au pH alcalin ou aux réactions d'oxydation ou de réduction. En particulier, la chaîne espaceur ne contient pas de liaison disulfide ou des groupements thiols. La chaîne espaceur contient essentiellement des liaisons de type carbone-carbone, carbone-oxygène et carbone-azote. La chaîne espaceur est de préférence choisie parmi le groupe constitué par : une chaîne hydrophobe consistant en une chaîne composé de 3, 6, 12 ou plus (par exemple 18) méthylène (CH2) nommé dans la suite C3, C6, C12 ou une chaîne hydrophile qui peut être de type polyéthylène glycol, par exemple Hexaéthylène glycol (HEG) ou un l l-amino-3,6,9-trioxaundécan-lyî appelé dans la suite Ci l hydrophile ou un oligonucléotide non spécifiquesubstitués par une fonction aminé primaire
La chaîne espaceur peut être introduite selon des méthodes bien connues de l'homme du métier, en particulier en tant qu'étape finale de la synthèse chimique du polynucléotide. Dans ce cas particulier on pourra introduire la chaîne espaceur à l'extrémité 5' du polynucléotide à l'aide d'un dérivé comprenant une fonction phosphoramidite comme cela est décrit dans les exemples. Le principe général de cette réaction est présenté à la figure 2 de Greco et Tor, Nature Protocols, 2007, 2, 305-316 intitulée « Key steps in solid DNA phospharimidite synthesis cycle ». Il est également possible d'introduire une molécule contenant une aminé primaire en position 5' du polynucléotide par couplage d'une diamine telle que Péthylènediamine en présence d'EDC et d'imidazole (voir Fiche technique n°TR0030.5 éditée par Thermo scientific). On pourra se référer à l'ouvrage de référence de Herrnanson (Bioconjugate Techniques, 2008, 2nd Edition, Académie Press, San Diego) et en particulier au chapitre 27, p.970.
Comme cela est illustré dans les exemples de la présente demande, l'étape de couplage peut être effectuée indifféremment à basse température et à température ambiante. De manière remarquable, la mise en œuvre de la réaction à température ambiante n'induit pas une diminution du rendement de la réaction. De la même manière, la mise en œuvre de la réaction à basse température - typiquement à une température de 5°C - n'induit pas une diminution substantielle de la vitesse de réaction.
Ainsi dans certains modes de réaction l'étape de couplage est effectuée à une température comprise dans une gamme allant de 0°C à 50°C.
De manière préférée, l'étape de couplage peut être réalisée à une température allant de 0°C à 35°C.
De manière pratique, la réaction de couplage pourra être réalisée à température ambiante, c'est-à-dire à une température allant de 15°C à 35°C, de préférence à une température allant de 15°C à 25 °C. Néanmoins, l'étape de couplage pourra être réalisée à basse température, typiquement à une température allant de 0°C à 8°C, si les réactifs mis en jeu - en particulier les ligands nucléiques - présentent des groupements chimiques sensibles, en particulier, à l'hydrolyse.
La réaction de couplage étant particulièrement rapide, un avancement satisfaisant de la réaction est généralement obtenu au bout d'environ d'une heure, voire au bout de quelques minutes. En utilisant des techniques de suivi cinétiques adaptées, l'homme du métier sera à même de déterminer la durée optimale de la réaction. H en est de même pour la température de réaction.
De manière générale, comme cela est illustré dans les exemples, l'étape de couplage peut être effectuée à un pH allant de 3,5 à 4,5, à température ambiante et sur une durée d'environ une heure.
Bien entendu, l'homme du métier peut, sur la base des conditions générales ci- dessus, adapter les conditions de la réaction de couplage afin de déterminer les conditions optimales adaptées dans chaque cas précis, sur la base de ses connaissances générales en chimie. A titre illustratif, l'homme du métier peut facilement prévoir que, pour l'obtention d'un rendement de couplage donné, l'abaissement de la température de réaction est susceptible de nécessiter une augmentation de la durée de l'étape de couplage.
Dans certains modes de réalisation du procédé d'immobilisation selon l'invention, la réaction de couplage peut être achevée en plaçant la combinaison support pré-activé/acides nucléiques dans des conditions de pH alcalin pendant une durée donnée.
Dans ces modes de réalisation, l'étape de couplage du procédé de l'invention comprend elle-même les deux étapes suivantes :
cl) faire réagir ledit acide nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide, dans des conditions de pH inférieur à 6 et
c2) poursuivre la réaction de couplage dudit acide nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide, dans des conditions de pH supérieur à 7,5
Sans vouloir être liée par une quelconque théorie, la demanderesse pense que, la mise en œuvre de la sous-étape c2) peut, dans certains cas spécifiques, induire les acides nucléiques immobilisés sur le support à adopter une conformation adaptée. La demanderesse est d'avis que cette étape est facultative. Avantageusement, la phase finale de couplage à pH alcalin est réalisée à un pH d'au moins 7,5, ce qui englobe les pH d'au moins 8, et d'au moins 8,5. Les exemples illustrent la réalisation de l'étape c2) à un pH d'environ 9
L'étape c2)) peut être réalisée à température ambiante ou à une température basse. Par température basse pour l'étape finale de la réaction de couplage, on entend une température inférieure à 15°C, y compris une température inférieure à 14°C, 13°C, 12°C, 11 °C, 10°C, 9°C, 8°C, 7°C, 6°C ou 5°C.
La durée de la phase finale de l'étape de couplage est variable. Elle est comprise entre quelques minutes et quelques heures. De manière générale, la durée de l'étape c2) est inférieure à 9 heure ce qui englobe une durée inférieure à 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 et 1 heures. La durée l'étape c2) peut être d'environ 8 heures ou d'environ 3 heures, comme cela est illustré dans les exemples.
Pour ladite phase finale de l'étape de couplage, l'homme du métier peut aisément, sur la base des indications ci-dessus, déterminer les conditions optimales de combinaison de pH, température et durée, au cas-par-cas.
Dans des modes de réalisation avantageux, la réaction de couplage est suivie par une étape de neutralisation d) ou de blocage des groupes acides carboxyliques activés n'ayant pas réagi au cours de l'étape de couplage proprement dit. A titre illustra tif, le blocage des fonctions acides carboxyliques activées et n'ayant pas réagi peut être réalisé par incubation du support greffé avec une solution de blocage comprenant 0,5 M d'éthanoiamine, 0,5M de NaCl à pH 8,3 ou bien avec une solution de blocage à 0,1 M Tris- HCl à pH 8,5, comme cela est recommandé notamment par le fabricant et décrit par ailleurs dans les exemples. La durée de l'étape de neutralisation ou de blocage est avantageusement d'au moins une heure à température basse. Elle peut être réalisée par exemple pendant une durée de 2h30 à la température de 4°C, comme décrit dans les exemples.
En dernier lieu, le procédé selon l'invention comprend à l'issue de l'étape de couplage c) et/ou à l'issue de l'étape de blocage ou de neutralisation d) une ou plusieurs étapes de lavage e) dudit support dans des conditions classiques de manière à obtenir un support d'affinité prêt à l'emploi. A titre illustratif, la ou les étapes de lavage peuvent être réalisées avec une solution tampon de 0,1 M Tris-HCl à un pH allant de 8 à 9, ou bien avec une solution tampon de 0,1 M acétate, 0,5M NaCl à un pH allant de 4 à 5, comme cela est illustré dans les exemples. Dans certains modes de réalisation, une étape de lavage comprend successivement (i) un lavage par une solution tampon de 0,1 M Tris-HCl à un pH allant de 8 à 9, suivi de (ii) un lavage par une solution tampon de 0,1M acétate, 0,5M NaCl à un pH allant de 4 à 5. Classiquement, on réalise une pluralité d'étapes de lavage, par exemple 3 étapes de lavage, comme cela est illustré dans les exemples.
Au vu de la description qui précède, le procédé d'immobilisation d'acides nucléiques selon l'invention peut être aussi défini comme un procédé comprenant les étapes suivantes :
a) fournir un support solide comprenant à sa surface des groupes acides carboxyliques activés, de préférence par le N-hydroxysuccinimide,
b) fournir un acide nucléique comprenant au moins une fonction aminé primaire,
c) réaliser le couplage dudit acide nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide dans des conditions de pH inférieur à 6, et
d) bloquer la réaction de couplage.
Le procédé d'immobilisation d'acides nucléiques selon l'invention peut être aussi défini comme un procédé comprenant les étapes suivantes :
a) fournir un support solide comprenant à sa surface des groupes acides carboxyliques activés, de préférence par le N-hydroxysuccinimide,
b) fournir un acide nucléique comprenant au moins une fonction aminé primaire,
c) réaliser le couplage dudit acide nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide dans des conditions de pH inférieur à6,
d) bloquer la réaction de couplage, et
e) réaliser une ou plusieurs étapes de lavage du support.
Comme cela a déjà été précisé précédemment, dans certains modes de réalisation, l'étape c) comprend elle-même les deux étapes suivantes :
cl) faire réagir ledit acide nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés, de préférence par le N-hydroxysuccinimide, présents à la surface dudit support solide dans des conditions de pH inférieur à 6, et c2) poursuivre la réaction de couplage dudit acide nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide dans des conditions de pH supérieur à 7,5
Le procédé d'immobilisation des ligands nucléiques selon l'invention trouve une application directe pour la fabrication de supports d'affinité destinés à la purification ou à la détection de molécules cibles, y compris de protéines cibles.
Ainsi, de manière plus générale, la présente invention concerne une méthode de préparation d'un support d'affinité comprenant la mise en œuvre du procédé d'immobilisation de ligands nucléiques tel que défini ci-avant. Ainsi, la méthode de préparation d'un support d'affinité selon l'invention comprend les étapes suivantes :
a) fournir un support solide comprenant à sa surface des groupes acides carboxyliques activés,
b) fournir un ligand nucléique comprenant au moins une fonction aminé primaire, et
c) réaliser le couplage dudit ligand nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide dans des conditions de pH inférieur à 6
étant entendu que l'ordre des étapes a) et b) est indifférent.
L'étape c) de la méthode peut comprendre les étapes cl) et c2) telles que définies précédemment. De la même manière, la méthode peut comprendre en outre les étapes d) et e) décrites précédemment.
Comme cela est illustré dans les exemples, la méthode et le procédé selon l'invention sont particulièrement adaptés pour la préparation d'un support d'affinité destiné à la purification d'une ou plusieurs molécules cibles, en particulier par chromatographie.
Ainsi dans certains modes de réalisation du procédé selon l'invention, le support solide est un support adapté à la mise en œuvre d'un procédé de chromatographie, de filtration ou d'extraction en phase solide. En d'autres termes le support solide est adapté pour une utilisation en tant que phase stationnaire dans un procédé de chromatographie, ou de filtration ou d'extraction en phase solide. Pour la mise en œuvre d'un support solide d'affinité pour l'extraction en phase solide, on pourra se référer à Madru et al., (Analytical Chemistry, 2009, 81, 7081-7086). Un tel support solide peut être choisi parmi le groupe constitué par les gels de silice et les gels de polysaccharide tels que les gels d'agarose, les gels de dextrane et leurs dérivés et également les gels acrylamide et leurs dérives, les géls methacrylate et leurs dérivés et les surfaces polystyrène et leurs dérivés.
Ainsi, dans un mode de réalisation particulier du procédé ou de la méthode d'immobilisation l'invention,
(i) le support solide comprenant à sa surface des groupes acides carboxyliques activés est un support choisi parmi le groupe constitué par les gels de silice, les gels d'agarose, les gels de dextrane et leurs dérivés et
(ii) le ligand acide nucléique comprenant au moins une aminé réactive est choisi parmi le groupe des polynucléotides de 5 à 120 acides aminés comprenant éventuellement en leur extrémité 3' ou 5' une chaîne espaceur pouvant être choisie parmi le groupe constitué par une chaîne hydrophobe consistant en une chaîne composé de 3, 6, 12 ou plus (par exemple 18) méthylène (CH2) nommé dans la suite C3 , C6, C12 ou une chaîne hydrophile qui peut être de type polyéthylène glycol, par exemple Hexaéthylène glycol (HEG) ou un l l-amino-3,6,9-trioxaundécan-lyl appelé dans la suite Ci l hydrophile ou un oligonucléotide non spécifique
Dans un autre mode de réalisation particulier du procédé ou de la méthode selon l'invention,
(i) le support solide est choisi parmi les gels d'agarose et leurs dérivés, et
(ii) le ligand nucléique est un polynucléotide de 5 à 120 nucléotides lié par son extrémité 5' à une chaîne espaceur choisie parmi les polyéthylèneglycol en C4-C20, la fonction aminé réactive étant de préférence portée par la chaîne espaceur.
Dans un mode de réalisation supplémentaire du procédé ou de la méthode selon l'invention,
(i) le support solide est choisi parmi les gels d'agarose et leurs dérivés et
(ii) le ligand nucléique est un polynucléotide de 5 à 120 nucléotides lié par son extrémité 5' à une chaîne espaceur choisie parmi les alkyles Unaires en C4-C20, la fonction aminé réactive étant de préférence portée par la chaîne espaceur.
Les exemples montrent que les supports d'affinité obtenus selon le procédé de l'invention permettent la purification quantitative d'un ligand cible de manière extrêmement sélective. Egalement, les résultats des exemples montrent qu'un support d'affinité obtenu selon le procédé de l'invention peut être utilisé sur une très longue période de temps, notamment selon un grand nombre de cycles de capture/lavage/élution/lavage sans perte significative de ses propriétés de rétention sélective et quantitative du ligand cible. On montre aussi, qu'un support d'affinité selon l'invention conserve ses propriétés de rétention sélective et quantitative du ligand cible, même après avoir subi les étapes drastiques de régénération ou de sanitisation antibactérienne, anti-fongique ou anti-virale. On a montré, en particulier, dans les exemples que la capacité de rétention d'un support d'affinité selon l'invention pour sa protéine cible ne sont pas altérées par un traitement par une solution ayant une concentration finale de NaOH de 0,5 M, ni même par un traitement par une solution de NaOH ayant une concentration finale de 1 M, c'est-à-dire à une concentration finale de NaOH bien supérieure à celle qui est usuellement employée lors des étapes de sanitisation, et ceci pendant une très longue période de temps (100 heures) également bien supérieure à la durée d'une étape conventionnelle de sanitisation qui est en générale de quelques minutes. On a également montré que les propriétés chromato graphiques d'un support d'affinité selon l'invention ne sont pas altérées par un traitement par une solution ayant une concentration finale de propylène glycol de 50 % (vol/vol).
Les résultats des exemples montrent aussi que les propriétés chromatographiques d'un support d'affinité selon l'invention ne sont pas altérées, même après une incubation de longue durée dudit support avec le milieu biologique de départ contenant la molécule à purifier.
Il est également montré dans les exemples que les propriétés chromatographiques d'un support d'affinité selon l'invention sont inchangées, même après de nombreux cycles d'utilisation.
En d'autres termes, les résultats des exemples illustrent la capacité d'un support d'affinité selon l'invention a réaliser de manière parfaitement reproductible des étapes de purification quantitatives d'un ligand cible, et ceci dans des conditions d'utilisation industrielles classiques, qui sont en général délétères pour les supports d'affinité connus, y compris pour les supports d'immuno-affinité. Les caractéristiques techniques de chacune des étapes du procédé de l'invention, selon les différentes définitions ci-dessus, ont déjà été précisées précédemment dans la présente description. Les supports d'affinité selon l'invention constituent donc des outils de purification qui sont à la fois fiables et reproductibles, stables dans le temps, et ne nécessitant pas d'opérations de maintenance répétées. Les supports d'affinité de l'invention, du fait des nombreux avantages techniques qu'ils procurent, permettent la mise en œuvre de procédés de purification d'une molécule cible à des coûts modérés.
Les exemples décrivent l'obtention d'un support d'affinité de l'invention par greffage d'aptamères nucléiques, et de manière illustrative par greffage d'aptamères d'ADN.
Ainsi, dans un mode de réalisation préféré du procédé ou de la méthode selon la présente invention, le ligand nucléique est un aptamère nucléique.
Par « aptamère nucléique » ou par aptamère, on entend selon l 'invention un acide nucléique simple brin se liant spécifiquement à un ou plusieurs ligands cibles. Les aptamères englobent ceux pour lesquels on peut détecter des complexes avec un seul ligand cible ou avec une variété de ligands cibles donnés, après une étape préalable de mise en contact des partenaires respectivement nucléique et ligand cible. Les aptamères englobent les aptamères d'ARN et les aptamères d'ADN.
Le terme « aptamère » tel qu'utilisé ici désigne une molécule d'acide nucléique monobrin, ADN ou ARN, capable de se lier de manière spécifique à un ou plusieurs ligands cibles, telle qu'une protéine. Les aptamères se lient à leurs molécules cibles par des mécanismes essentiellement distincts de l'hybridation. Les aptamères sont généralement caractérisés par une structure secondaire comprenant des boucles et des tiges. En d'autres termes, la conformation active des aptamères (c'est-à-dire la conformation dans laquelle les aptamères sont capables de se lier à leur protéine cible) est non linaire.
Les aptamères comprennent généralement entre 5 et 120 nucléotides et peuvent être sélectionnés in vitro selon un procédé connu sous le nom de SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). Les aptamères présentent de nombreux avantages. De par leur nature oligonucléotidique, les aptamères possèdent une faible immunogénicité et une résistance importante à des conditions physico- chimiques stringentes (présence d'urée, de DMSO, d'un pH très acide ou très basique, utilisation de solvants organiques ou de température élevée) permettant des stratégies de sanitisation variées dans le cadre d'un usage en tant que ligand d'affinité. De plus leur sélectivité est importante. Enfin la production d'aptamères implique des coûts relativement limités.
Dans certains modes de réalisation, un « aptamère nucléique » utilisé pour le greffage au support solide pré-activé, selon le procédé ou la méthode définie ci-dessus, peut comprendre, par définition, une partie non nucléotidique ou nucléotidique, par exemple une chaîne espaceur non nucléotidique, qui relie l'une des extrémités 5' ou 3' de la partie nucléique dudit aptamère et la fonction aminé réactive utilisée pour le greffage chimique dudit support pré-activé. Dans ces modes de réalisation, un aptamère nucléique peut être de formule (I) suivante :
NH2-[SPAC]n- [NUCL] (I), dans laquelle :
- n étant indice valant 1 ou 0, 0 signifiant que l'aptamère ne comprend pas une chaîne espaceur libre et 1 signifiant que l'aptamère comprend une chaîne espaceur.
- N¾ signifie la fonction aminé réactive utilisée pour le greffage sur le support solide pré-activé par des groupes NHS,
- [SPAC] signifie une chaîne espaceur, et
- [NUCL] signifie un acide nucléique se liant spécifiquement à un molécule cible, ledit acide nucléique comprenant de 5 à 120 nucléotides.
De préférence, l'acide nucléique [NUCL] comprend de 10 à 80 nucléotides et de manière encore plus préférée de 20 à 60 nucléotides.
La « chaîne espaceur » désignée [SPAC] dans le composé de formule (I) peut être de tout type connu. Il peut s'agir d'un composé non-nucléotidique, d'un oligonucléotide ou d'un composé comprenant une ou plusieurs parties non-nucléotidiques et une ou plusieurs parties nucléotidiques. La chaîne espaceur ne participe pas, en général, à la liaison du ligand cible sur le support.
Ladite chaîne espaceur a pour fonction d'éloigner physiquement l'acide nucléique [NUCL] de la surface du support solide sur lequel ledit composé de formule (I) est greffé chimiquement ce qui permet une mobilité relative de l'acide nucléique [NUCL], par rapport à la surface dudit support solide. La chaîne espaceur limite ou évite que des encombrements stériques, dus à une trop grande proximité du support solide avec la partie nucléique de l'aptamère, gênent les événements de liaison entre ledit acide nucléique et des molécules du ligand cible susceptibles d'être mises en contact avec celui- ci.
Dans le composé de formule (II), la chaîne espaceur est liée préférentiellement à l'extrémité 5' ou à l'extrémité 3' de l'acide nucléique [NUCL].
Cette construction avec espaceur a pour avantage de ne pas immobiliser directement l'aptamère sur le support solide. De préférence, comme cela a été indiqué ci- avant, la chaîne espaceur peut être une chaîne hydrophobe consistant en une chaîne composé de 3, 6, 12 ou plus (par exemple 18) méthylène (CH2) nommé dans la suite C3 , C6, Cl 2 ou une chaîne hydrophile qui peut être de type polyétliylène glycol, par exemple Hexaéthylène glycol (HEG) ou un 1 l-amino-3,6,9-trioxaundécan-lyl appelé dans la suite Cl 1 hydrophile ou un oligonucléotide non spécifique. Lorsque la chaîne espaceur consiste en un oligonucléotide non spécifique, ledit oligonucléotide comprend avantageusement au moins 5 nucléotides de longueur, de préférence entre 5 et 15 nucléotides de longueur.
Dans certains modes de réalisation, la chaîne espaceur peut être composite et comprendre la succession d'HEG et d'un oligonucléotide, par exemple d'un oligo(dT).
On rappelle que les exemples illustrent l'obtention de supports d'affinité tels que définis ci-dessus par greffage du support pré-activé par le NHS avec trois aptamères nucléiques distincts anti-FVTI comprenant des chaînes espaceur de nature également distincte, à savoir, une chaîne hydrophobe consistant en une chaîne alkyle en C6 une chaîne hydrophobe consistant en une chaîne alkyle en Cl 2, et une chaîne hydrophile Cl.1- TFA Ainsi, les résultats des exemples montrent que le procédé d'obtention d'un support d'affinité qui est décrit dans la présente description peut être utilisé, quel, que soit l'identité ou le type d'acide nucléique d'intérêt à greffer.
Comme cela a été évoqué ci-avant, les procédés et méthode selon l'invention permettent la préparation de supports d'affinité qui se distinguent des supports d'affinité connus par leur densité élevée en Hgands nucléiques immobilisés à leur surface. Cette densité élevée de ligands nucléiques découle directement du procédé spécifique d'obtention des supports d'affinité.
De manière remarquable, les supports d'affinité selon l'invention se caractérisent également par une capacité élevée de rétention de la ou les molécules cibles contre lesquels sont dirigés les acides nucléiques greffés. En particulier, le procédé selon l'invention permet de préparer des gels de chromatographie d'affinité présentant une densité élevée en ligands nucléiques. H a été ainsi observé que des gels de chromatographie obtenus par le procédé selon l'invention présentent une densité en ligands nucléiques 0.2 μιηοΐ/ml à 0.5 μπιοΐ/ml alors que la densité initiale en fonctions acides carboxyliques activées des gels de chromatographie que l'on trouve dans le commerce est généralement comprise entre 5 μιηοΐ/ml à 25 μηΊθΙ/ml de gel. Ainsi, selon le procédé de couplage de l'invention, il est possible de dérivatiser selon le procédé de l'invention au moins 0,01% des fonctions carboxyliques activées initialement présentes à la surface du support solide, avantageusement au moins 0,1%, mieux au moins 1% et encore mieux au moins 2% desdites fonctions carboxyliques activées. A titre de comparaison les taux greffage en chromatographie d'affinité avec les anticorps comme ligand sont souvent inférieurs à lmg/ml, c'est-à-dire inférieure à 0.06 μηιοΐ/ml, soit moins de 0,2% de fonctions carboxyliques dérivatisées.
Une dérivatisation d'au moins 0,01% des fonctions carboxyliques activées englobe une dérivatisation d'au moins 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1 %, 1 ,1 %, 1 ,2%, 1 ,3%, 1 ,4%, 1 ,5%, 1 ,6%, 1 ,7%, 1 ,8%, 1 ,9% et au moins 2% desdites fonctions carboxyliques activées.
Dans certains modes de réalisation, le pourcentage de fonctions carboxyliques dérivatisées est d'au plus 100%, ce qui englobe au plus 50%», 40%, 30%, et au plus 25% desdites fonctions carboxyliques activées.
Ainsi, un autre objet de la présente invention, un support d'affinité pouvant être obtenu conformément au procédé et à la méthode décrits ci-avant dans la présente description.
De manière plus générale, la présente invention concerne un support solide d'affinité sur lequel des ligands nucléiques sont immobilisés par une liaison amidique et dans lequel au moins des fonctions carboxyles présentes initialement à sa surface sont dérivatisées par à un ligand nucléique.
Il va de soi que la liaison amidique liant un ligand nucléique au support résulte de la réaction d'une fonction carboxyle présente initialement à la surface du support avec une fonction aminé primaire présente au niveau du ligand nucléique.
Dans un mode de réalisation préféré, le support solide d'affinité est un gel de chromatographie. Un autre objet de la présente invention est un support solide d'affinité sur lequel des Iigands nucléiques sont immobilisés par une liaison amidique, ledit support d'affinité étant un gel de chromatographie présentant une densité en Iigands nucléiques d'au moins 0,005 μηιοΐ/ml de gel, ce qui englobe au moins 0,01 μΓηοΙ/ml, 0,05 μηιοΐ/ml, 0,1 μηιοΐ/ml, 0,15 μη οΐ/ml, 0,2 μιτιοΐ/ιηΐ, 0,25 μηιοΐ/ηιΐ, 0,3 μιηοΐ/ιηΐ, 0,35 μηιοΐ/ml et au moins 0,38 μηιοΐ/ml de gel.
Dans certains modes de réalisation, la densité en Iigands nucléiques est d'au plus 10 μηιοΐ/ml, ce qui englobe au plus 5 μηιοΐ/ml, au plus 1 μηιοΐ/ηιΐ et au plus 0,5 μη οΐ/ηϊΐ.
Les supports d'affinité selon l'inventio peuvent présenter l'une quelconque des propriét s décrites ci-avant pour les supports solides ou les supports d'affinité.
Ainsi, dans certains modes de réalisation, le support d'affinité peut être un gel utilisable en chromatographie, en filtration ou en extraction en phase solide choisi parmi le groupe constitué par les gels d'agarose, de dextrane, de silice et leurs dérivés.
Comme cela est illustré dans les exemples, le support d'affinité peut être un gel d'agarose hautement réticulé sur lequel sont immobilisés les Iigands nucléiques. De préférence, le support d'affinité est un gel (autrement dit une phase stationnaire) utilisable dans des procédés de chromatographie d'affinité.
Les supports d'affinité selon l'invention peuvent comprendre à leur surface tout type de Iigands nucléiques tels que décrits ci-avant dans la présente description.
Dans certains modes de réalisation, le support d'affinité selon l'invention est caractérisé en ce que les Iigands nucléiques sont des aptamères de formule (II) présentés ci-avant.
Dans des modes de réalisation particuliers, le support solide d'affinité selon l'invention peut être représenté par la formule suivante (III) :
Figure imgf000031_0001
dans laquelle :
- [SUP] représente le support solide du support d'affinité - [SPACjn et [NUCL] répondent aux définitions précédemment indiquées. En d'autres termes, - H-(SPAC)n- UCL représente un aptamère nucléique dans lequel :
■ n est indice valant 0 ou 1 ,
■ SPAC représente une chaîne espaceur, et
■ NUCL représente un acide nucléique se liant spécifiquement à une molécule cible, ledit acide nucléique comprenant de 5 à 120 nucléotides.
Un autre objet selon l'invention est un complexe formé entre un Hgand nucléique et une molécule cible, ledit complexe étant formé à la surface d'un support solide tel que défini précédemment. Ledit complexe résulte essentiellement d'interactions no-covalentes entre la molécule cible et le ligand nucléique.
Un objet supplémentaire de l'invention concerne l'utilisation d'un support d'affinité tel que décrit précédemment pour la purification ou la détection d'une molécule cible. Dans le contexte de la purification d'une molécule cible, le support selon l'invention peut être utilisé comme phase stationnaire dans des étapes de filtrafion, de chromatographie ou d'extraction en phase solide.
La présente invention est également relati ve à un procédé de purification d'une molécule cible avec un support d'affinité tel que défini ci-dessus, comprenant les étapes suivantes :
a) mettre en contact une composition à purifier comprenant une molécule cible d'intérêt avec un support d'affinité tel que défini dans la présente description, afin de former un complexe entre (i) les acides nucléiques greffés sur ledit support et (ii) ledit ligand cible et
b) libérer ladite molécule cible à partir du complexe formé à l'étape a) et récupérer ladite molécule cible purifiée.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé comprend une étape a'), l'étape a' suivant l'étape a) et précédant l'étape b), qui consiste en une étape de lavage du support d'affinité avec un tampon de lavage.
On a également montré dans les exemples que l'utilisation à l'étape a') d'un tampon de lavage ayant une hydrophobicité élevée, en particulier une concentration élevée en propylène glycol, permet d'éliminer efficacement les substances liées de manière non- spécifique au support d'affinité sans simultanément affecter de manière détectable la liaison du ligand cible au support d'affinité. A l'étape a'), on utilise ainsi de préférence un tampon de lavage ayant une teneur finale en propylène glycol d'au moins 20% en volume, par rapport au volume total de la solution tampon.
Selon l'invention, un tampon de lavage ayant une teneur finale en propylène glycol d'au moins 20% englobe les tampons de lavage ayant une teneur finale en propylène glycol d'au moins 25% M, 30%, 35%, 40% , 45%, 50%, 55%, ou au moins 60%.en volume, par rapport au volume total de la solution tampon.
. De préférence un tampon de lavage utilisé à l'étape a') du procédé a une teneur finale en propylène glycol d'au plus 50%. Avantageusement, un tampon de lavage utilisé à l'étape a') du procédé a une teneur finale en propylène glycol comprise entre 20% et 50%, de préférence entre 30% et 50%.
Selon un mode de réalisation particulier, le tampon de lavage utilisé à l'étape a') contient à la fois du NaCl et du propylène glycol comme décrit dans les exemples.
De plus, dans certains modes de réalisation du procédé de purification ci- dessus, l'étape b) est réalisée par la mise en contact du support d'affinité avec un tampon d'élution contenant un agent chélateur des ions divalents, de préférence l'EDTA.
A titre ilîustratif, le tampon d'élution peut contenir une concentration finale d'EDTA d'au moins 1 mM et d'au plus 30 mM.
L'expression « au moins 1 mM » englobe au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 mM.
L'expression « au plus 30 mM » englobe au plus 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 ou 11 mM.
Avantageusement, on utilise, pour la régénération du support d'affinité, un tampon comprenant un mélange de NaCl et de propylène glycol, qui peut être du même type que celui décrit ci-dessus pour l'étape de lavage.
Au sens de la présente invention et pour les différents objets décrits ci-avant compris dans l'invention, le terme «molécule cible » (ou « substance cible » ou encore « ligand cible ») tel qu'utilisé ici désigne une molécule capable de se lier de manière spécifique à l'aptamère. Π peut s'agir de d'acides nucléiques, de protéines ou de substances organiques ou minérales. Les protéines peuvent être tout type de protéines, et en particulier, les protéines plasmatiques. Par « protéine plasmatique », on entend selon l'invention toute protéine, spécialement toute protéine d'intérêt industriel ou thérapeutique, contenue dans le plasma sanguin. Les protéines du plasma sanguin englobent les anticorps, l'albumine, alpha macroglobuline, antichymotry sine, antithrombine, antitrypsine, Apo A, Apo B, Apo C, Apo D, Apo E, Apo F, Apo G, beta Xlla, C 1 -inhibiteur, protéine C-réactive, C7, Clr, Cls, C2 C3, C4, C4bP, C5, C6, Clq, C8, C9, carboxypeptidase N, céruloplasmine, Facteur B, Facteur D, Facteur H, Facteur I, Facteur ΓΧ, Facteur V, Facteur VII, Facteur Vlla, Facteur VIII, Facteur X, Facteur XI, Facteur XII, Facteur XIII, Fibrinogène, Fibronectine, Haptoglobine, Hemopexine, Héparine cofacteur II, Histidine rich GP, IgA, IgD, IgE, IgG, ITI, IgM, Kininase II, Kininogène HPM, Lysozyme, PAI 2, PAI I, PCI, Plasmine, Inhibiteur de la plasmine, Plasminogène, Préalbumine, Prokallicréine, Properdine, Protéase Nexine INH, Protéine C, Protéine S, Protéine Z, Prothrombine, TFPI, Thiol-protéinase, Thrombomoduline, Facteur tissulaire (TF), TPA, Transcolabamine II, Transcortine, Transferrine, Vitronectine, et le Facteur de Willebrand.
Notamment, les protéines plasmatiques englobent les protéines de la coagulation, c'est-à-dire les protéines plasmatiques impliquées dans la chaîne de réactions en cascade aboutissant à la formation d'un caillot sanguin. Les protéines de la coagulation englobent le Facteur I (fibrinogène), le Facteur II (prothrombine), le Facteur V (proaccélérine), le Facteur VII (proconvertine), le Facteur VIII (facteur anti-hémophilique A), le Facteur IX (facteur anti-hémophilique B), le Facteur X (Facteur Stuart), le Facteur XI (Facteur Rosenthal ou PTA), le Facteur XII (Facteur Hageman), le Facteur XIII (Facteur stabilisant la fibrine ou FSF), la PK (Prékalicrine) le KHPM (kininogène de haut poids moléculaire), la thromboplastine tissulaire, le cofacteur II de l'héparine (HCII), la protéine C (PC), la thrombomoduline (TM), la protéine S (PS), le facteur de Willebrand (Wf) et l'inhibiteur de la voie du facteur tissulaire (TFPI), ou encore les facteurs tissulaires.
Dans certains modes de réalisation, la protéine plasmatique consiste en une protéine de la coagulation à activité enzymatique.
Les protéines de la coagulation à activité enzymatique englobent le Facteur II (prothrombine), le Facteur VII (proconvertine), le Facteur IX (facteur anti-hémophilique B), le Facteur X (Facteur Stuart), le Facteur XI (Facteur Rosenthal ou PTA), le Facteur XII (Facteur Hageman), le Facteur XIII (Facteur stabilisant la fibrine ou FSF) et la PK (Prékalicrine).
Dans certains modes de réalisation préférés, la protéine plasmatique consiste en une protéine plasmatique humaine, naturelle ou recombinante.
Dans des modes de réalisation préférés, la protéine plasmatique est le Facteur
VII humain, naturel ou recombinant.
La présente invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les exemples suivants. EXEMPLES
Exemple 1 : Obtention d'un support d'affinité
- Tampon de greffage : Acétate de sodium lOOmM, pH = 4,2
- Préparation de 1595 μΐ d'aptamère à 2,5 g/1 dans tampon de greffage soit : 4 mg d'aptamère.
- Pour le greffage, on a utilisé respectivement :
a) pour la réalisation d'un premier support d'affinité, un aptamère comprenant le polynucléotide Mapt 2CS de séquence SEQ ID N°l comprenant à son extrémité 5' une chaîne C 11 hydrophile ( 1 1 -amino-3 ,6,9-trioxaundécan- 1 yl)
b) pour la réalisation d'un second support d'affinité, un aptamère comprenant le polynucléotide « Mapt 1.2 » de séquence SEQ ID N° 2 lié à son extrémité 5' à une chaîne espaceur composée de 12 méthylènes (CH2) (espaceur Cl 2) et lié à son extrémité 3 ' à un oligo-dT
c) cpour la réalisation d'un troisième support d'affinité, un aptamère comprenant le polynucléotide « Mapt 2 CS » de séquence SEQ ID N° 1 lié à son extrémité 5' à une chaîne espaceur composée de 6 méthylènes (CH2) (espaceur C6)
- Préparation d' iml de gel comprenant des groupes acides carboxyliques activés par le NHS à savoir le gel pré-activé « NHS Activated Sepharose 4 fast flow (GE) » en réalisant un lavage avec HC1 ImM, puis un lavage avec le tampon de greffage.
- On a vérifié que le pH dans la préparation d'aptamère dans la solution tampon était de 4,2 - On a mélangé la préparation d'aptamère avec 1ml de gel pré-activé. Le gel pré-activé a été incubé en présence des aptamères sous agitation pendant 48h (+/-.2H) à 4°C
- On a ajouté un demi volume réactionnel (797μ1) de Tampon borate 200mM pH=9 en agitant, puis on a incubé pendant 8h sous agitation à 4°C
- On a récupéré le surnageant et on a dosé la quantité d' aptamères non greffés
- On a ajouté 2ml de Tris-HCL 0,1 M pH = 8.5 sous agitation pendant 2h30 à 4°C pour bloquer la réaction de couplage.
- On a réalisé 3 cycles d'ajout /agitation /élimination du surnageant comprenant : 1) lml de Tris-HCl 0,1M pH = 8.5 puis 2) 1ml d'acétate de sodium à 0,1M NaCl 0,5 M, pH - 4,0, afin d'obtenir un support d'affinité prêt à l'emploi.
A toute fin utile, on indique que le gel « NHS Activated Sepharose 4 fast flow (GE) » est un gel d'agarose réticulé présentant à sa surface des fonctions acides carboxyliques activés par le NHS. Les fonctions acides carboxyliqu.es ont été introduites à la surface du gel par greffage de l'acide 6-aminohexanoique. Ce gel d'agarose pré-activé est décrit dans le manuel d'instructions techniques N°71-5000-14 AD daté de mars 2011 et édité par GE Healthcare. Le gel « NHS activated Sepharose 4 Fast Flow » présente une densité en fonctions acides carboxyliques activées allant de 16 à 23 μηιοΐ/ml de gel.
Les résultats montrent qu'à l'issue de la réaction de couplage, le surnageant du milieu réactionnel ne comprend pas de quantité détectable d'aptamère nucléique, c'est-à- dire, dans les conditions d'analyse utilisées, comprend une quantité d'aptamère inférieure à 0,08mg/ml
Il peut être déduit de ces résultats que le rendement de greffage est de 100%, ou très proche de 100%. Exemple 2 : Utilisation d'un support d'affinité pour la purification de Facteur VÏI humain recombinant produit dans te lait de lapines transgéniques.
- Gel : 1ml greffé avec Mapt 2CS- PEG(Cl l) préparé comme décrit à l'exemple 1 , à 4mg/ml packé dans une colonne XK-16 (GE)
- Injection d'une composition de facteur FVII humain recombinant purifié, produit dans le lait de lapines transgéniques (FVÏI-TG) : 100 ou 200 ou 1000μg de FVII-TG La composition de FVI TG utilisée pour l'injection est préparée par neutralisation du citrate contenu initialement dans la formulation par du CaCl2 et modification du tampon de formulation pour obtenir : entre 35 et 40 raM de NaCl et entre 3,2 et 4 mM de MgCl2
- Tampon utilisé pour la chromatographie :Tris 50mM / NaCl 50mM / CaCl2 lOmM /
MgCl2 4mM
- Débit : 0,5ml/min
- Tampon d'Elution : Tris 50mM, EDTA lGmM, pH = 7.4
- Tampon de lavage ou régénération : NaCl 1 M/Propylène glycol 50%
- Solution de sanitisation utilisée entre chaque essai : 0,1 ou 0,5 M NaOH (1ml) + NaCl ÎM/Propylène glycol 50% (2x 1ml)
Les résultats sont représentés sur les figures 1 à 5.
Les figures 1 et 2 montrent que la presque totalité du facteur VII humain est retenu sur le support d'affinité au moment du passage de la composition à purifier, quelle que soit la quantité de Facteur VII contenue dans la composition de départ. On a estimé, pour les deux quantités de facteur VII à purifier (100pg et 200 μg) que moins de 10% du Facteur VII contenu dans la composition de départ n'est pas retenu sur le support d'affinité. Les figures 1 et 2 montrent aussi un pic d'élution étroit, ce qui illustre les excellentes propriétés chromatographiques du support d'affinité de l'invention.
La Figure 3 illustre le profil chromatographique obtenu avec une composition de départ contenant 1 mg de Facteur VII humain. Le profil chromatographique de la Figure 3 est très similaire à ceux représentés sur les figures 1 et 2, ce qui illustre la très grande capacité de rétention d'un ligand cible du support d'affinité de l'invention.
Les figures 4 et 5 illustrent les profils chiOmatographiques obtenus par purification d'une quantité de Facteur VII humain de 200 μg (Figure 4) et 1000 μg (Figure 5) sur un support d'affinité préparé comme décrit à l'exemple 1 et ayant subi des étapes de traitement drastique de sanitisation avec une solution de sanitisation comprenant un mélange de 0,5 M NaOH et de 50 % de propylène glycol. Les profils chromatographiques obtenus montrent la capacité de résistance d'un support d'affinité selon l'invention à des traitements délétères de sanitisation. On précise que le même profil chromatographique est obtenu lorsqu'on réalise une succession de purifications de Facteur VII humain transgénique et d'étapes de lavage et de sanitisation. Ceci démontre l'excellente stabilité du support d'affinité, qui permet de réaliser la purification de ligands cibles d'intérêt de manière extrêmement reproductible.
Exemple 3 : rendement de greffage en fonction de la quantité d'aptamères utilisés et capacité de charge des supports d'affinités obtenus
L'influence de la quantité d'aptamères sur le rendement de greffage et la capacité de charge des supports d'affinité a été étudiée pour les aptamères Mapt 2CS-(C11 hydrophile) et Mapt 2.2CS-(C1 1 hydrophile). Le protocole de greffage utilisé est identique à celui décrit dans l'exemple 1. L'aptamère Mapt 2 ,2CS-(C 11 -hydrophile) résulte du couplage de Mapt 2.2CS de séquence SEQ ID N°3 et du 11 -(trifluoroacétamido)-3, 6,9- trioxaundécan- 1 -yl-[(2-cyanoéthyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite (Link Technologies) suivie de la génération du groupe phosphodiester par oxydation et élimination du groupe cyanoéthyle et de la déprotection subséquente de la fonction aminé primaire présente à l'extrémité de la chaîne espaceur. Mapt 2.2Cs est dirigé contre le facteur VIL
La capacité de charge (ou autrement dit la capacité de rétention) des supports d'affinité, exprimée en mg de FVII par ml de gel, a été évaluée par injection d'une composition de FVII humain recombinant dans le tampon "Tp5" (Tris 50 mM, CaCl2 1 OroM, pH 7,5).
Les tableaux 1 et 2 ci-dessous présentent le rendement de la réaction de greffage des aptamères Mapt 2CS-PEG(C1 1) et Mapt 2.2CS-PEG(C11) sur le gel pré- activé « NHS Activated Sepharose 4 fast flow (GE) » en fonction de la quantité d'aptamères engagée dans la réaction par ml de gel. Le rendement a été déterminé par quantification de la quantité d'aptamères présents dans le surnageant à l'issue de la réaction de couplage par PCR quantitative.
La quantité finale d'aptamères greffés par ml de gel est également indiquée dans les tableaux 1 et 2 ci-dessous. Tableau 1 : Influence de la quantité d'aptamère Mapt 2CS par mi de gel sur le rendement de la réaction de couplage et les caractéristiques du support d'affinité obtenu
Figure imgf000039_0001
Tableau 2 : Influence de la quantité d'aptamère Mapt 2.2 CS par ml de gel sur le rendement de la réaction de couplage et les caractéristiques du support d'affinité obtenu
Quantité Rendement Quantité Quantité Pourcentage des d'aptamères de la réaction d'aptamères d'aptamères sites acides engagée en de couplage greffés en greffés en carboxyliques du mg/ml de gel mg/ml de gel μηιοΐ/ιηΐ de gel gel couplés à un aptamère
0.1 100% 0,1 0,007 0.04 %
3,5 100% 3,5 0,23 1.2%
6,0 92,6% 5,55 0.37 1.9% Les rendements de couplage obtenus pour les aptamères Mapt 2.2Cs- PEG(Cl l) et Mapt2Cs-PEG(Cl l) sont compris entre 90% et 100% pour toutes les quantités d'aptameres testées. De manière remarquable, il est possible de greffer jusqu'à 0.4 μιηοΐ par ml de gel, ce qui correspond à un pourcentage de fonctîonnalisation des fonctions acides carboxyliques activées présents à la surface du gel de 2%.
La capacité de charge des supports d'affinité pour le FVII humain recombinant varie de manière linéaire avec la quantité d' aptamères greffés par ml de gel. On n'observe donc pas d'effet de saturation de la capacité de charge du support et donc de perte de fonctionnalité des aptamères pour les quantités élevées d' aptamères greffés.
Au vu de ces résultats, il pourrait être possible d'obtenir des supports d'affinité présentant une densité d'aptamères greffés supérieure à ômg/ml et ayant une capacité de charge pour le FVII supérieure à 8 mg de FVII recombinant humain par mL de gel.
Le tableau 3 ci-dessous présente la capacité de charge des supports d'affinité en fonction du nombre d'aptamères greffés à leur surface.
Tableau 3 : Capacité de charge des supports d'affinité obtenus
Figure imgf000040_0001
Exemple 4 : Essais comparatifs de greffage chimique d'acides nucléiques sur un support solide ré- activé par des groupes NES
4.1. Essais comparatifs en utilisant différentes conditions de pH On a réalisé des essais comparatifs de greffage du support pré-activé de départ utilisé à l'exemple 1, dans des conditions de pH neutre ou légèrement alcalin, comme décrit dans le Tableau 4 présenté ci-après : Tableau 4
Figure imgf000041_0001
On a utilisé le protocole suivant :
- lml de gel rincé avec 15ml HC1 ImM puis 7ml de tampon de greffage. Ajout des 6,5 ml (ou 3,5ml) de Mapt2CS à 1 g/1 et incubation du gel avec Mapt2CS pendant 4 heures à température ambiante
- Neutralisation des sites activés par un tampon Tris 50mM pH = 7.4
On a mesuré la quantité d'aptamères non greffés en sortie de colonne après l'étape de greffage. Les résultats montrent que le rendement de greffage varie de 0% à 10% au maximum, quelles que soient les conditions de greffage décrites dans le Tableau 1 qui ont été utilisées. Contrairement à ce qu'ont observé Goss et al. (supra), une salinité élevée n'est pas suffisante pour augmenter le rendement de couplage.
4.2. Essais comparatifs en neutralisant les charges négatives des acides nucléiques à greffer par l'ajout de cations divalents ou par l'ajout de NaCL
On a utilisé le protocole suivant :
- ΙΟΟμΙ de gel rincé avec 15ml HC1 ImM puis 700μ1 de tampon de greffage / Ajout des 650 μΐ de Mapt2CS (oligo 5) à 130mg l et incubation du gel avec Mapt2CS pendant 4 heures à température ambiante
- Conditions mises en œuvre :
■ Condition 1 : Tampon MOPS 92mM pH = 7,0, CaCl2 200mM, MgCl2 200mM
* Condition 2 : Tampon MOPS 92mM pH = 7,0, CaCl2 200mM, MgCl2 200mM
■ Condition 3 : NaHC03 0,2M, NaCl 0,5M, pH 8.3
■ Condition 4 : NaHC03 0,2M, NaCl 2 M, pH 8.3
On a mesuré la quantité d'aptamère non greffé en sortie de colonne après l'étape de greffage. Les résultats montrent que le rendement de greffage, quelles que soient les conditions de greffage décrites ci-dessus, varie de 0% à 10% au maximum.
Il résulte de l'ensemble des expériences ci-dessus présentées que la mise en œuvre de l'étape de couplage en présence d'un pH basique ou neutre tel que recommandé dans l'état de la technique ou dans les notices d'utilisation des gels pré-activés fournit un rendement de couplage des aptamères sur le gel pré-activé très faible c'est-à-dire inférieur à 10% .
L'augmentation de la force ionique par utilisation d'une solution de NaCl à une concentration allant jusqu'à 2M ou l'utilisation de sels de cations divalents susceptibles de masquer les charges négatives des aptamères ne permettent pas d'augmenter le rendement de couplage.
Contrairement à ce qu'aurait pu attendre l'homme du métier, la mise en œuvre de l'étape de couplage en présence d'un pH acide permet d'augmenter de manière significative le couplage des aptamères sur 3e support pré-activé sans nuire à la capacité de liaison desdits aptamères à leur protéine cible.
Exemple 5 : Modulation des paramètres de mise en œuyre de mise en œuyre de la réaction de couplage selon la présente invention
L'influence du pH, de la température et de la durée de réaction a été évaluée afin de détenrnner les paramètres contrôlant la réaction de couplage des fonctions acides carboxyliques activées du gel (« NHS-activated Sepharose 4 fast Flow) avec les fonctions aminés primaires aliphatiques présentes sur les chaînes espaceurs des aptamère Mapt 2CS- PEG (Cl l).
Le protocole suivant a été suivi :
- Le tampon de greffage a été préparé à l'aide partir d'acétate de sodium 100 mM avec ajustement au pH désiré sauf pour la mise en œuvre de la réaction à un pH = 8,3 où un tampon de NaHC03 a été préparé.
- Une solution d'aptamères Mapt 2CS-PEG (Ci l) à une concentration de 2 g/L dans le tampon de greffage a été préparée.
-1 mL de la solution d' aptamère a été mélangé à 1 mL de gel et incubé à la température désirée, sous agitation. L'avancement de la réaction de couplage est suivi par quantification des aptamères présents dans le surnageant.
- A l'issue du suivi cinétique de la réaction, le milieu réactionnel a été additionné de 1 mL de tampon borate à 200 mM à pH 9 sous agitation puis incubé pendant 3h sous agitation à 4°C. Le surnageant a été prélevé pour le dosage final du surnageant. La neutralisation des fonctions acides carboxyliques résiduelles du gel a été effectuée par ajout de 2 mL de tampon Tris-HCÎ à 0,1 M et à pH = 8,5 sous agitation pendant 2h30 à 4°C.
- 3 cycles d'ajout /agitation /élimination du surnageant comprenant : 1) 1ml de Tris-HCI 0,1 M pH - 8.5 puis 2) lml d'acétate de sodium à 0,1M NaCÎ 0,5 M, pH = 4,0 ont été effectués.
- Le surnageant a été éliminé. Le gel ainsi obtenu est stocké dans du tampon Tpl additionné de 0,2% d'azide pour stockage à 4°C.
Les résultats du suivi cinétique de la réaction de couplage en fonction de la température, de la durée de réaction et du pH sont présentés dans le tableau 5 ci-après : Tableau 5 : Influence de la température de réaction (TA : température ambiante), du pH et de la durée de réaction
Figure imgf000044_0001
Comme cela est illustré dans le tableau 5 ci-dessus, le pH est un paramètre crucial pour la mise en œuvre de la réaction de couplage selon l'invention.
La mise en œuvre de la réaction selon les conditions décrites dans l'état de la technique, c'est-à-dire à un pH basique de 8,3, offre un rendement de couplage très faible d'au plus 10%. La diminution du pH permet d'améliorer de manière significative le rendement de la réaction. On observe en particulier un rendement d'au moins 98%> pour un pH d'environ 3,8 à 4,3. Un tel résultat est tout à fait surprenant : l'homme du métier s'attendrait à un faible rendement de couplage à ces pH en raison de la dégradation des acides nucléiques par hydrolyse acide et de la diminution de la réactivité des aminés primaires. Au vu de ces résultats expérimentaux, il apparaît que la réaction de couplage peut être conduite indifféremment à basse température ou à température ambiante.
De manière remarquable, les supports d'affinité obtenus à pH = 3,8 ou à température ambiante à pH - 4,3 présentent une capacité de charge (c'est-à-dire une capacité de rétention) du Facteur VII recombinant humain équivalent aux supports obtenus à pH = 4,2 et à 5°C. De manière générale, les capacités de charge obtenues sont particulièrement élevées ce qui traduit non seulement un haut taux de greffage des aptamères mais aussi le maintien de la capacité des aptamères à se lier spécifiquement à leur protéine cible. En d'autres termes, la mise en œuvre à température ambiante et à un pH inférieur à 4,5 de la réaction de couplage entre les fonctions acides carboxyliques activées du support et les fonctions aminés primaires présentes au niveau de Γ espaceur des aptamères permet non seulement d'obtenir un rendement de greffage proche de 100% mais également un maintien de l'intégrité fonctionnelle des aptamères.
Exemple 6 : modes de réalisation additionnels d'un support d'affinité
D'autres supports d'affinité ont été préparés en faisant varier (i) les conditions de greffage ainsi que (ii) les types d'aptamères utilisés. 6.1. Types d'aptamères greffés
Concernant les types d'aptamères, on a utilisé respectivement des aptamères comprenant un polynucléotide ADN et des aptamères comprenant un polynucléotide ARN. De plus, pour certains aptamères, le polynucléotide est lié à une chaîne espaceur par son extrémité 5' alors que pour les autres aptamères, le polynucléotide est lié à une chaîne espaceur par son extrémité 3'. Egalement, on a utilisé des aptamères comprenant une chaîne espaceur hydrophile ou une chaîne espaceur hydrophobe.
Les aptamères utilisés à l'exemple 6 sont les suivants :
- l'aptamère comprenant le polynucléotide ADN "Mapt 2 CS" de séquence SEQ ID N° 1 comprenant à son extrémité 5' la chaîne espaceur Ci l hydrophile décrite pour la préparation du premier support d'affinité divulgué au paragraphe "a)" de l'exemple 1, ledit aptamère étant désigné "Mapt2CS oligoS (5' Aminé Cl 1 hydrophile)" dans le Tableau 6; - l'aptamère comprenant le polynucléotide ADN "Mapt 2 CS" de séquence SEQ ID N° 1 comprenant à son extrémité 5' la chaîne espaceur C6 hydrophobe décrite pour la préparation du troisième support d'affinité divulgué au paragraphe "c" de l'exemple 1 et comprenant à son extrémité 3' un résidu de désoxyribothymidine inversé (3'-dT-5')7 ledit aptamère étant désigné "Mapt2CS ollgo2 (5'Amine C6 et 3' dT) dans le Tableau 6;
- l'aptamère comprenant le polynucléotide ADN "Mapt2 CS" de séquence SEQ ID N° 1 comprenant à son extrémité 5' la chaîne espaceur Cl 2 hydrophobe décrite pour la préparation du second support d'affinité divulgué au paragraphe "b" de l'exemple 1, ledit aptamère étant désigné "Mapt2CS oligo3 (5' Aminé C12)" dans le Tableau 6;
- l'aptamère comprenant le polynucléotide ADN "Mapt2 CS" de séquence SEQ ID N° 1 comprenant à son extrémité 3' la chaîne espaceur C6 hydrophobe décrite pour la préparation du troisième support d'affinité divulgué au paragraphe "c" de l'exemple 1, ledit aptamère étant désigné "Mapt2CS oligo7 (3' Aminé C6)" dans le Tableau 6;
- l'aptamère comprenant le polynucléotide ARN "Mapt ARN Anti FIXa" de séquence SEQ ID N° 4 comprenant à son extrémité 5' la chaîne espaceur Cl 1 hydrophile décrite pour la préparation du premier support d'affinité divulgué au paragraphe "a)" de l'exemple 1 et comprenant à son extrémité 3' un résidu de désoxyribothymidine inversé (3'-dT-5'), ledit aptamère étant désigné "Mapt ARN Anti FD a 5' Aminé Ci l hydrophile" dans le Tableau 6.
On a aussi préparé un support d'affinité sur lequel a été greffé un aptamère comprenant le polynucléotide ADN "Maptl.2 CSO" de séquence SEQ ID N°5 comprenant à son extrémité 5' la chaîne espaceur Ci l hydrophile décrite pour la préparation du premier support d'affinité divulgué au paragraphe "a)" de l'exemple 1, ledit aptamère étant désigné "Mapt 1.2C S O oligoS (5'Amine Ci l hydrophile)". Les résultats concernant ce dernier aptamère ne sont pas présentés dans le Tableau 6 qui suit.
6.2. Conditions de greffage de l'aptamère ARN
L'aptamère ARN de séquence SEQ ID N° 5 a été greffé dans les conditions suivantes :
- 300 μg d'aptamère ARN ont été incubés avec 500 μL de gel, à la concentration finale de gel de 0,6 g/L. - la réaction de greffage a été réalisée pendant 2,5 heures à 17°C (TA) et à pH 4,2.
- puis la réaction a été stoppée par neutralisation avec un tampon borate 200 mM pendant 2,5 heures à 17°C et à pH 9.
- on a mesuré la quantité résiduelle d'aptamères non greffés dans le surnageant afin de déterminer le rendement de greffage, par électrophorèse en gel d'agarose et coloration au GelRed® (à 3,5%), puis comparaison avec une gamme étalon de quantités connues de l'aptamère ARN chargées sur d'autres pistes du même gel d'électrophorèse.
Les résultats montrent que le rendement de greffage était supérieur à 99%. Ces résultats montrent que le procédé de greffage à un pH inférieur à 5 est efficace pour le greffage de tous les types de ligands nucléiques, que ces ligands nucléiques comprennent un polynucléotide ADN ou un polynucléotide ARN (et donc également les ligands nucléiques comprenant un polynucléotide hybride ADN/ARN), y compris les ligands comprenant un polynucléotide à bases modifiées, y compris un polynucléotide ARN à bases modifiées.
6,3. Efficacité de la réaction de greffage
La réaction de couplage a été réalisée comme décrit à l'exemple 5, sauf indication spécifique concernant la durée, la température et le pH. Les résultats sont présentés dans le Tableau 6 ci-après.
Tableau 6
Figure imgf000048_0001
* Durée de la réaction de couplage exprimée en heures; Température exprimée en degrés Celsius - TA= température ambiante (18°C-25°C) ** Le taux de greffage visé est atteint pour un rendement de greffage de 100%. Le rendement de greffage a été mesuré comme décrit à l'exemple 3
*** ND= Non Déterminé Les résultats du tableau 6 montrent que, pour un aptamère donné, un rendement de greffage de 100% est obtenu quelles que soient les conditions testées.
En particulier, ces résultats confirment ceux de l'exemple 4, et plus spécifiquement les résultats du Tableau 5, qui montrent qu'un rendement de greffage maximal est obtenu, même au pH très acide de 3,8. Ces résultats confirment aussi la cinétique rapide de la réaction de couplage réalisée à température ambiante.
Il est également montré que l'étape de neutralisation à pH 9, subséquente à la réaction de couplage, n'est pas essentielle pour l'obtention d'un rendement de greffage maximal, puisque le taux et le rendement de greffage dans ces conditions sont identiques à ceux observés lorsque l'étape de neutralisation est réalisée (voir Tableau 6 ci-dessus).
Les résultats du Tableau 6 montrent aussi que la nature hydrophile ou hydrophobe de la chaîne espaceur de l'aptamère n'a pas d'influence sur l'efficacité du greffage. 11 est également montré que le greffage est aussi efficace lorsque la chaîne espaceur, hydrophile ou hydrophobe, est liée à l'extrémité 5' ou à l'extrémité 3' du polynucléotide ADN ou ARN.
On ajoute que la neutralisation préalable des charges du polynucléotide ADN par incubation de celui avec un Polybrene® (Hexamethrine bromide, 1 ,5-Dimethyl-1 ,5- diazaundecamethylene polymethobromide) rend impossible la réalisation de la réaction de couplage. 6.4. Fonctionnalité des supports d'affinité.
On a testé la fonctionnalité de supports d'affinité sur lesquels a été immobilisé l'aptamère "Mapt2CS oligo5" décrit au §6.1. ci-dessus, respectivement dans les conditions de température, durée et pH de la réaction de couplage suivantes :
- Conditions n° 1 : 48h, 5°C, pH 4,2;
- Conditions n° 2 : 48h, 5°C, pH 3,8;
- Conditions n° 3 : 2h, 5°C, pH 4,2; et
- Conditions n° 4 : Ih, TA (Température Ambiante), pH 4,2. Pour le test, on a utilisé 500 μΐ de gel greffé avec les aptamères dans chacune des conditions n° 1 à 4 ci-dessus, à la concentration finale de 4,4 mg/mL.
Pour chacun des supports de chromatographie, on a injecté 2,7 mg d'une composition de FVII humain recombinant purifié, produit dans le lait de lapines tyransgéniques (FVII-TG).
La composition de FVII-TG utilisée pour l'injection est préparée par neutralisation du citrate contenu initialement dans la fonnulation par du CaCl2 et modification du tampon de formulation pour obtenir : entre 35 et 40 mM de NaCI et entre 3,2 et 4 mM de MgCl2
- Tampon utilisé pour la chromatographie : Tris 50mM / CaCl2 lOmM, pH 7,5
- Débit : 0,5ml/min
- Tampon d'Elution : Tris 50mM, EDTA lOmM, pH = 7,5
Les résultats sont représentés sur les figures 6 à 9, respectivement pour les conditions de couplage n°l à 4 décrites ci-dessus. Les résultats sont aussi réprésentés dans le Tableau 7 ci-dessous.
Tableau 7
Figure imgf000051_0001
Les résultats des figures 6 à 9 et du Tableau 7 ci-dessus montrent que la presque totalité du facteur VÏI humain est retenu sur le support d'affinité au moment du passage de la composition à purifier, à l'exception du support d'affinité préparé par greffage selon les conditions n° 2 (48h, 5°C, pH 3,8) pour lequel on observe un taux de rétention du facteur VII qui est substantiel mais pas maximal.
Les résultats montrent aussi que la totalité du facteur VII humain retenu sur le support d'affinité est libéré lors de l'étape d'élution.
Ces résultats montrent que des supports d'affinité totalement fonctionnels peuvent être préparés en utilisant les conditions de greffage n° 1 et n° 3-4, ce qui signifie que les conditions de température et de durée du greffage ne sont pas absolument déterminantes au regard de la capacité du support d'affinité obtenu à retenir, puis à libérer la molécule cible.
En particulier, on oberve que les conditions de couplage des aptamères pendant une durée courte (1 heure) et à température élevée (température ambiante) (i) permet un taux de greffage de 100% des aptamères et (ii) n'entraîne aucune altération dans la capacité des aptamères greffés à se lier au facteur VII humain cible.
En revanche, les résultats moins bons obtenus avec le support d'affinité préparé par couplage des aptamères à pH 3,8 montrent que les conditions de pH sont importantes pour le maintien de l'intégrité des aptamères gerffés, et en partculier pour le maintien de l'aptitude des aptamères greffés à se lier au facteur VII humain cible. Lorsque la réaction de couplage est réalisée à pH 3,8, on obtient un support d'affinité qui reste fonctionnel pour enrichir sélectivement un échantillon de départ en facteur VII humain. Toutefois, un tel support d'affinité ne peut être valablement utilisé dans le cadre d'un procédé industriel de purification du facteur VII humain, en raison de la perte importante de facteur VII (plus de 20%) et donc du caractère économiquement désavantageux d'un tel procédé.
Exemple 7 : Maintien de rintergrité du support d'affinité dans des conditions d'uilisation indutrielle impliquant des contacts en milieux biologiques et une étape de sanitisation puissante (soude à la concentration 1M )
Dans l'exemple 7, on montre que des supports d'affinité tels que définis dans la présente description conservent leur capacité de rétention et d'élution de la protéine cible, même après de nombreux cycles d'utilisation, dans des conditions de mise en oeuvre industrielles 7.1. Préparation des supports de greffage
Trois supports de greffage ont été préparés comme décrit à l'exemple 1 , en utilisant respectivement chacun des trois aptamères suivants :
- support de greffage n° 1 : un aptamère comprenant le polynucléotide Mapt 2CS de séquence SEQ ID N°l comprenant à son extrémité 5' une chaîne Cl 1 hydrophile (11- amino-3,6,9-trioxaundécan-lyl),
- support de greffage n° 2 : un aptamère comprenant le polynucléotide Mapt 2.2CS de séquence SEQ ID N°3 comprenant à son extrémité 5' une chaîne Cl 1 hydrophile (1 1 - amino-3,6,9-trioxaundécan-lyl), et
- support de greffage n° 3 : un aptamère comprenant le polynucléotide « Mapt 2.2 CS » de séquence SEQ ID N° 3 lié à son extrémité 5' à une chaîne espaceur composée de 6 méthylènes (CH2) (espaceur C6)
Les rendements de greffage ont été respectivement de 100% (support de greffage n° 1), de 93% (support de greffage n° 2) et de 87% (support de greffage n° 3).
La capacité statique théorique des supports d'affinité préparés, c'est-à-dire la quantité de F VII humain qui devrait être retenue sur les supports d'affinité si chacun des aptamères greffés liait une molécule de F VII humain, était respectivement de 1 8.7 mg par raililitre de support (support n° î), 17,3 mg/mî (support n° 2) et 16,3 mg/ml (support n° 3). 7.2. Conditions opératoires du procédé de purification de FVII humain.
On a utilisé une composition de FVII-TG enrichie en FVII humain, la concentration finale de FVII-TG étant d'environ 50 000 ppm, ladite composition comprenant une forte proportion de formes des-gla de FVII (formes inactives de FVII) et ladite composition possédant une activité spécifique FVII d'environ 0,4 (activité exprimée en activité amidolytique/antigène).
Le protocole général est îe suivant :
- équilibrage du support dans le tampon TP4 (Tris 50 mM, CaCl2 10 mM, MgCl2 4 mM, pH 7,5), en utilisant un volume de tampon de cinq fois le volume du support greffé,
- injection de la matière première (composition de FVII-TG), préalablement dialysée contre un tampon Tris 50 mM, CaCl2 10 mM, MgCl2 4 mM,
- lavage avec le tampon de lavage (huit fois le volume du support greffé), et
- équilibrage avec le tampon d'équilibrage Tris 50 mM, EDTA 10 mM à pH 7,5 (trois fois le volume du support greffé)
7.3. Propriétés des supports pour la purification du FVII humain.
On a testé la capacité des trois supports préparés comme décrit au paragraphe 7.1. ci-dessus à retenir sélectivement le FVIIa humain actif.
On a déterminé que les trois supports avaient une capacité dynamique de rétention du FVIIa humain d'environ 10 mg de FVIIa humain par mililitre de support greffé, ce qui représente entre 53% et 58% de la capacité statique maximale théorique calculée au pragraphe 7.1. ci-dessus. Ces résultats montrent que les aptamères respectifs greffés sur les trois supports sont largement accessibles et fonctionnels.
On a aussi montré que chacun des trois supports d'affinité préparés comme décrit au paragraphe 7.1. ci-dessus était capable de retenir sélectivement les molécules de FVII humain ayant un domaine GLA actif, comme cela est exposé dans le Tableau 8 ci-dessous. Tableau 8
Figure imgf000054_0001
Les résultats du Tableau 8 montrent que, à partir d'une composition comprenant seulement 41% de FVII humain à domaine GLA actif par rapport à la quantité totale de FVII humain présente dans ladite composition, on obtient une composition finale enrichie en FVII humain qui comprend de 70% à 80% de FVII humain à domaine GLA actif par rapport à la quantité totale de FVII humain présente dans ladite composition enrichie. Ces résultats montrent que les trois supports d'affinité (i) permettent la purification de FVII humain et (ii) permettent d'obtenir une composition de FVII purifié qui est enrichie en forme active de FVII humain, par élimination des formes inactives de FVII humain. 7.4, Résistance des supports d'affinité vis-à-vis d'un traitement par la soude.
On a testé la résistance des trois supports d'affinité à un traitement prolongé par une solution de soude à 1M.
Les supports préparés comme décrit au paragraphe 7.1. ont été mis en contact avec une solution de soude à 1M pendant une durée de 100 heures. Après lavage pour éliminer la soude, la capacité de chacun des trois supports d'affinité à purifier le FVII humain a été mesurée. Les résultats sont présentés dans le Tableau 9 ci-dessous.
Tableau 9
Figure imgf000055_0001
Les résultats du Tableau 9 montrent qu'un traitement par de la soude à 1M pendant une très longue durée (100 heures) n'entraîne aucun changement significatif dans la capacité des supports n°l, n°2 et n°3 à purifier le FVII humain. 7.5. Résistance des supports d'affinité vis-àvis d'un contact prolongé avec divers milieux biologiques.
On a testé la résistance des trois supports d'affinité à un traitement prolongé avec divers milieux biologiques, qui peuvent être utilisés comme produits de départ dans des procédés de purification de FVII humain. On a testé en particulier les deux milieux biologiques suivants : (i) un cryosurnageant de plasma sanguin humain et (ii) une solution de lait clarifié, le lait pouvant constituer une source de FVII humain, par exemple lorsque le FVII humain est produit dans le lait d'animaux transgéniques pour le gène codant le FVII humain.
Le support d'affinité n° 1 préparé comme décrit au paragraphe 7.1. a été mis en contact avec (i) un cryosurnageant plasmatique humain ou (ii) un lait clarifié, pendant une durée de 100 heures. Après lavage pour éliminer le milieu biologique testé, la capacité de chacun des trois supports d'affinité à purifier le FVII humain a été mesurée. Les résultats sont présentés dans le Tableau 10 ci-dessous.
Tableau 10
Figure imgf000057_0001
(Rendement FVIIam % 90,6 94,8
Les résultats du Tableau 10 montrent que l'incubation d'un support d'affinité tel que défini dans la présente description avec des milieux biologiques qui représentent des produits de départ pour la purification de FVII humain, pendant une très longue durée (100 heures), n'entraîne aucun changement significatif dans la capacité dudit support à purifier le FVII humam.
7.6. Résistance de supports d'affinité à la réalisation de cycles de purification successifs
On a testé la résistance du support d'affinité n° 3 préparé comme décrit au paragraphe 7.1 ci-dessus à subir des cycles successifs de purification de FVII humain. Chaque cycle de purification comprenait les étapes suivantes :
- équilibrage du support d'affinité en tampon TP4 (5 fois le volume du support d'affinité),
- simulation de mise en contact avec la composition à purifier: injection de tampon TP4 (5 fois le volume du dupport d'affnité),
- élution avec le tampon d'élution (5 fois le volume du support d'affinité),
- sanitisation avec une solution de NaOH 1 M durant 10 minutes (5 fois le volume du support d'affinité), et
- ré- équilibrage du support d'affinité avec le tampon TP4 (10 fois le volume du support d'affinité).
On a réalisé respectivement 15 ou 30 cycles de purification ci-dessus avec le support d'affinité n°3 et on a déterminé la capacité dudit support à l'issue des 15 ou 30 cycles à purifier le FVII humain. Les résultats sont réprésentés sur le Tableau 11 ci- dessous.
Tableau 11
Figure imgf000058_0001
Les résultats du Tableau 1 1 montrent que la capacité d'un support d'affinité tel défini dans la présente description à purifier le FVII humain est inchangée, même après au moins 30 cycles de réalisation d'un procédé mimant la purification d'une protéine cible.
Tableau 12 : liste des séquences
N° SEO Π> Description
SEQ ID 01 Aptamère Mapt 2 CS
SEO ID N°2 Aptamère Mapt 1.2
SEO ID N°3 Aptamère Mapt 2.2 CS
SEO ID N°4 Aptamère Mapt AR Anti FIXa
SEO ID N°5 Aptamère Mapt 1.2 CSO

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'immobilisation de ligands nucléiques comprenant au moins une fonction aminé primaire, par greffage sur un support solide présentant des groupes acides carboxyliques activés, comprenant une étape de couplage covalent desdits acides nucléiques sur ledit support solide à un pH inférieur à 6.
2. Procédé d'immobilisation des ligands nucléiques comprenant au moins une fonction aminé primaire sur un support solide les étapes suivantes :
a) fournir un support solide comprenant à sa surface des groupes acides carboxyliques activés,
b) fournir un ligand nucléique comprenant au moins une fonction aminé primaire, et
c) réaliser le couplage dudit acide nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide dans des conditions de pH inférieur à 6
étant entendu que l'ordre des étapes a) et b) est indifférent.
3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 caractérisé en ce que les groupes acides carboxyliques activés sont obtenus par réaction avec le N- hydroxysuccinimide ou l'un de ses dérivés.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que le pH de l'étape de couplage est compris dans une gamme allant de 3,5 à 4,5.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que l'étape de couplage est réalisée à une température allant de 0°C à 35°C.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que le ligand nucléique est un polynucîéotide de 5 à 120 nucléotides comprenant au moins une fonction aminé primaire à son extrémité 3' ou 5' .
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que le ligand nucléique comprend (i) un polynucîéotide de 5 à 120 nucléotides de longueur et (ii) une chaîne espaceur lié audit polynucîéotide, la fonction aminé primaire étant fixée à une extrémité 3 ' ou 5' dudit polynucîéotide ou à la chaîne espaceur.
8. Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que la chaîne espaceur est choisie parmi le groupe des alkyles linaires en C2-C20 et des polyéthylène glycols en C2-C20 substitués par une fonction aminé primaire.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 caractérisé en ce que le support solide est sélectionné parmi le groupe constitué par les gels de silice, les gels de dextrane, les gels d'agarose et leurs dérivés.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 9 caractérisé en ce que l'étape de couplage c) comprend les deux étapes suivantes :
cl) faire réagir ledit ligand nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide, dans des conditions de pH inférieur à 6 et
c2) poursuivre la réaction de couplage dudit ligand nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide, dans des conditions de pH supérieur à 7,5.
1 1. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'étape de couplage est suivie d'une étape d) dé blocage de la réaction de couplage.
12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que ligand nucléique comprenant au moins une fonction aminé primaire consiste en un aptamère nucléique.
13. Méthode de préparation d'un support d'affinité comprenant la mise en œuvre du procédé d'immobilisation telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 12.
14. Support solide d'affinité obtenu par la méthode de préparation telle que définie dans la revendication 13.
15. Support solide d'affinité sur lequel des ligands nucléiques sont immobilisés par liaison amidique et dans lequel au moins 0,01% des fonctions carboxyles présentes initialement à sa surface sont dérivatisées par à un ligand nucléique.
16. Support solide d'affinité sur lequel des ligands nucléiques sont immobilisés par liaison amidique, ledit support d'affinité étant un gel de chromatographie présentant une densité en ligands nucléiques d'au moins 0,005 μηαοΐ/ιηΐ à 0.4 μηκ>1Λη1 de gel.
17. Support solide d'affinité selon la revendication 16 caractérisé en ce que le support solide d'affinité est choisi parmi le groupe constitué par les gels d'agarose, les gels de dextrane, les gels de silice et leurs dérivés.
18. Support solide d'affinité selon l'une des revendications 14 à 17 caractérisé en ce que les ligands nucléiques sont des aptameres nucléiques et en ce que ledit support solide présente à sa surface les structures suivantes de formule (III)
Figure imgf000062_0001
dans laquelle :
- SUP représente le support
- H-(SPAC)n-NUCL représente un aptamère nucléique dans lequel :
* n est un indice valant 0 ou 1 ,
■ SPAC représente une chaîne espaceur, et
■ NUCL représente un acide nucléique se liant spécifiquement à une molécule cible, ledit acide nucléique comprenant de 5 à 120 nuciéotides.
19. Complexe résultant de l'interaction d'un ligand nucléique et une molécule cible, ledit complexe étant formé à la surface d'un support solide tel que défini dans l'une quelconque des revendications 14 à 18.
20. Utilisation d'un support d'affinité tel que défini dans l'une quelconque des revendications 14 à 18 pour la purification d'une molécule cible.
21. Utilisation d'un support d'affinité tel que défini dans l'une quelconque des revendications 14 à 18 pour la détection d'une molécule cible
22. Procédé de purification d'une molécule cible avec un support d'affinité tel que défini selon l'une quelconque des revendications 14 à 18, comprenant les étapes suivantes :
a) mettre en contact une composition à purifier comprenant la molécule cible d'intérêt avec un support solide d'affinité tel que défini dans l'une des revendications 14 à 18, afin de former un complexe entre (i) ligands nucléiques greffés sur ledit support et (ii) ladite molécule cible et b) libérer ladite molécule cible à partir du complexe formé à l'étape a) et récupérer ladite molécule cible purifié.
23. Utilisation selon les revendications 20 et 21 ou procédé selon la revendication 22 caractérisé en ce que la molécule cible est une protéine plasmatique.
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