KR20140057187A

KR20140057187A - 핵산 리간드를 고정하는 방법

Info

Publication number: KR20140057187A
Application number: KR1020137018802A
Authority: KR
Inventors: 에지스토 보쉐티; 제랄드 페렛
Original assignee: 라보라토이레 프란카이즈 듀 프락티온네먼트 에트 데스 바이오테크놀로지스
Priority date: 2010-12-30
Filing date: 2011-12-30
Publication date: 2014-05-12
Also published as: JP6178727B2; AU2011350672A1; AR084757A1; EP2658864A1; WO2012090183A1; US20130344567A1; CN103403015A; AU2011350672B2; CA2823030A1; BR112013016704A2; US9803184B2; JP2014505867A

Abstract

본 발명은 활성화된 고체 물질에 그래프팅을 함으로써, 적어도 하나의 반응성 아민 작용기를 포함하고, pH 6 미만을 갖는 상기 활성화된 고체 물질에 상기 핵산을 커플링하는 단계를 포함하는 핵산 리간드를 고정하는 방법에 관한 것이다.

Description

핵산 리간드를 고정하는 방법{METHOD FOR IMMOBILIZING NUCLEIC LIGANDS}

본 발명은 산업적 규모에서 이용할 수 있는 친화성 지지체(affinity supports)에 의해 관심있는 물질의 정제 분야에 관한 것으로써, 특히 의학적으로 관심있는 정제된 물질을 얻기 위한 것이다.

관심있는 물질이 포함된 출발 물질의 선택적 농축을 가능하게 하는 친화성 크로마토그래피 지지체(affinity chromatography supports)를 위해서 반복의 필요가 있다. 의학 분야에서, 친화성 크로마토그래피 지지체는 이후 약물 활성 성분으로 사용되는 물질을 정화하는 데 사용된다. 면역친화 크로마토그래피 지지체는 이 지지체에 항체를 고정하기 위해 주로 사용된다. 면역친화 지지체는 뛰어난 잔류 용량 및 표적 분자에 대하여 높은 선택도(selectivity)를 가지기 때문에, 산업적 규모에서 의학적으로 관심있는 물질의 정제에 적합하다. 이러한 면역친화 지지체는 그것의 잔류 용량(retention capacity) 또는 선택도를 실질적으로 손상하지 않으면서 정제 공정의 마지막에 재생(regenerated)될 수 있기 때문에, 오랜 시간 동안 사용할 수 있다. 더욱이, 그것의 높은 잔류 용량 때문에, 면역친화 지지체는 다량의 표적 물질을 정제할 수 있고, 그렇게 함으로써 약물 생산의 기술적 및 경제적 요구와 맞게 사용할 수 있다. 그러나, 특히, (ⅰ) 사전에 함유된 표적 물질의 용출 단계 동안 고정된 항체로부터 유도된 면역성 단백질 단편들의 방출 및 (ⅱ) 용출 조건 및 주기적 항균성 및 항바이러스성 살균 처리(sanitization treatment)에 대한 항체의 취약성(fragility)때문에, 면역친화 지지체는 의학적으로 관심있는 물질을 정제하기 위해 사용될 때 결함을 갖는다.

알려진 면역친화 지지체의 대안을 찾기 위해 다양한 연구가 수행되었다. 한정된 수의 연구들이 표적 단백질을 포함하는 표적 물질을 정제하기 위한 친화성 리간드로서 압타머의 사용에 관하여 관심을 갖는다. 예를 들면, 로밍 등(J. Chromatogra. B Biomed Sci Appl , 1999, 731(2):275-84)의 연구가 언급될 수 있으며, 이 연구는 크로마토그래피 지지체에서의 L-셀렉틴의 정제에 관한 것이고, 항-L-셀렉틴 DNA 압타머는 스트렙타아비딘-비오틴 페어링(streptavidin-biotin pairing)을 통하여 상기 크로마토그래피 지지체에 고정되어 있다.

표적 분자에 대한 압타머의 친화성 및 특이성은 항체들의 친화성 및 특이성 만큼 높을 수 있다. 더욱이, 압타머가 화학 반응에 의하여 얻어질 수 있기 때문에, 이들의 생산비는 항체들보다 더 낮을 수 있다. 그러나, 표적 물질을 정제하기 위한 압타머 친화성 지지체의 사용은 친화성 리간드로서 압타머에서 나타나는 수 많은 경제적 및 기술적 장점에도 불구하고, 현재로서는 지엽적이다. 현재, 발명자의 지식 수준에서, 표적 단백질을 포함하는 표적 물질을 정제하기 위한 산업 공정은 압타머 친화성 지지체를 사용하는 것에 기반한 단계를 포함하지 않는다.

산업-규모의 정제 공정에서 압타머를 이처럼 사용하지 않는 것을 설명하여 내세울 수 있는 하나의 이유는 압타머가 안정적으로 및 정량적으로 부착된 친화성 지지체를 얻기 어렵다는 것이다.

선행기술에 기술되는 압타머를 고정하는 주요 기술은 비오틴-스트렙타아비딘 또는 비오틴-아비딘 페어링의 사용에 기반한다. 이 기술은 아비딘 또는 스트렙타아비딘 리간드에 대한 비오틴의 선택도 및 강한 친화성을 이용하며, 또한 그들의 결합에 의한 비공유성 복합체(covalent complex)의 안정성을 이용한다. 그러나, 친화성 지지체의 이러한 형태는 사용된 커플링제의 단백질 특성 및 지지체 및 압타머 사이에 형성된 결합의 비공유(noncovalent) 특성에 의하여 기술적 제한을 갖는다. 실제로, 비오틴 및 아비딘 또는 스트렙타아비딘은 단백질 변성을 유도할 수 있는 치료에 민감하다. 더욱이, 비오틴/스트렙타아비딘 복합체는 저온에서, 특히 비이온성 또는 저-염-농도 수용액에서 분리된다. 다양한 원인에 의하여, 핵산 압타머는 비오틴/스트렙티아비딘 복합체를 사용하여 리간드로서 친화성 지지체에 고정되며, 친화성 지지체는 정제 공정, 특히 산업적 정제 공정에 적합하지 않고, 각각의 정제 사이클 사이에 친화성 지지체를 재생 및 살균 처리할 가능성이 정제 공정에서 필수적이다.

선행기술은 또한 본질적으로 분석 방법을 수행하기 위한 새로운 도구를 가질 목적으로, 고체 지지체 상에 핵산을 공유결합성 그래프팅하는 몇 가지 기술들을 기술한다. 따라서, 시아노겐 브로마이드로 활성화된 세파로오스 지지체 상에 반응성 아민 기를 갖는 핵산 압타머를 그래프팅하는 것이 기술되어 있다(Madru et al ., 2009, Anal . Chem ., Vol . 81: 7081-7086). 또한, 아디프산 이수화물 기를 활성화 시키는 아가로오스 지지체에 과요오드산염-산화된 RNA 압타머를 그래프팅하는 것이 기술되어 있다(Caputi et al ., 1999, The EMBO Journal , Vol . 18(14): 4060-4067). 또한, SIAB와 같은 이중기능 커플링제를 사용한 핵산 압타머를 그래프팅하는 기술이 알려져 있다(Rehder et al ., Electrophoresis , Vol . 22(17): 3759).

또한, 선행기술은 N-하이드로숙신이미드(NHS)를 예비활성화시키는 카복실산 기를 포함하는 실리카 또는 아가로오스 형태의 고체 지지체에 핵산, 특히 압타머를 공유결합성 커플링하는 기술을 개시한다(Goss et al ., 1990, J Chromatogr , Vol . 508: 279-287; Larson et al ., 1992, Nucleic Acids research , Vol . 20(13): 3525, Allerson et al ., 2003, RNA , Vol . 9: 364-374). 이 커플링 기술들은 고체 지지체에 단백질을 커플링하기 위해 종래 사용되던 기술을 직접적으로 적용하여 구성되었다.

따라서, 고스(Goss) 등(1990, J Chromatogr , Vol . 508: 279-287)은 pH=7.4의 인산 나트륨 버퍼에서 NHS로 예비활성화된 실리카의 다공성 지지체 상에 5'-아미노에틸-폴리(dT)₁₈ 올리고뉴클레오티드를 그래프팅하는 것을 기술한다. 고스 등에 의해 얻어진 친화성 지지체는 실리카의 g 당 0.5μmol의 폴리(dT)₁₈의 그래프팅율을 갖고, 그래프팅율은 실리카 겔의 g 당 카복실 기(실리카의 g 당 500μmol)의 수를 고려할 때 매우 낮다. 다시 말해, 지지체의 표면에 존재하는 카복실 기의 0.1 %만이 폴리(dT)₁₈ 올리고뉴클레오티드에 아마이드 결합을 통해 결합한다. 고스 등은 최종 친화성 지지체와 모델 올리고-(dA)_12-18 핵산의 혼합물 중 소량을 모은 다음, 염도-구배 용출 버퍼에서 연속하여 용출시켰다.

2003년에 발행된 논문에서, 알러손(Allerson) 등(2003, RNA , Vol . 9: 364-374)은 친화성 리간드로서 핵산의 사용에 기반을 둔 크로마토그래피는 지금까지 얻어진 친화성 지지체의 낮은 용량 및/또는 낮은 안정성 때문에 산업적-규모 단백질 정제에 거의 사용되지 않는다는 사실을 개탄하였다. 이 저자들의 지식에 따르면, 알려진 커플링 방법은 많아야 지지체의 밀리리터 당 RNA의 수 나노몰을 고정하는 것을 가능하게 한다. 고스 등의 공정과 유사한 공정에 따라, 알러손 등(2003, RNA , Vol. 9: 364-374)은 IRP1 또는 IRP2 조절 단백질에 대하여, 핵산 압타머를 NHS-예비활성화된 아가로오스 지지체에 커플링하는 시도를 하여 기술하였다. 알러손 등이 커플링의 실현을 위해 "아가로오스 지지체의 제조업체의 권장사항"을 참조하였고, 따라서 8.3과 동일한 염기성 pH에서 커플링 반응을 수행하였다. 제조업체의 권장사항은, 지금도 여전히, 6 내지 9 사이의 pH에서 NHS-예비활성화된 지지체에 리간드의 커플링을 수행하는 것이 명시되어 있다(예를 들어, NHS-활성화된 세파로오스 4 패스트 플로우 겔(NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow gel)에 관한 GE 헬쓰케어의 설명서 No. 71-5000-14 AC 참조). 알러손 등은 NHS-예비활성화된 지지체와 1차 아민 작용기를 갖는 RNA 압타머의 커플링 반응이 기술적 결함을 극복하지 못하고, 커플링 반응 시간 또는 사용한 버퍼 용액의 종류에도 불구하고 약 2%의 매우 낮은 커플링 수율을 가지는 것을 그들 스스로 발견하였다. 알러손 등(2003, 상기 언급함)은, (ⅰ) 지지체 상에 알킬 싸이올 작용기의 도입 단계, (ⅱ) Sulfo-SIAB 이중기능 작용제를 사용하여 압타머의 5' 위치에 5'-아이오도아세트아마이드 기를 도입하는 단계, 및 (ⅲ) 싸이올 결합을 생성하기 위하여 지지체의 싸이올 작용기와 압타머의 아이오도아세트아마이드 기를 실제로 커플링하는 단계를 포함하는, 다단계 그래프팅 기술을 지지하기 위하여, 결국 그래프팅 기술에 대한 견해를 바꾸었다. 같은 방법으로, 루타 등(2008, Anal . Bioanal . Chem ., Vol . 390: 1051-1057)은 NHS-활성화된 실리카 지지체 상에 D-아데노신에 대한 DNA 압타머의 그래프팅으로 인한 고정 단계가 D-아데노신에 대해 매우 낮은 결합 용량을 갖는 것을 나타내었다.

그러므로, 선행기술에 친화성 지지체, 특히 의학적으로 관심있는 물질의 산업-규모 정제에 적합한 친화성 지지체를 제조하는 새로운 방법이 필요하다.

본 발명은 표면에 활성화된 카복실 기를 갖는 고체 지지체 상에 그래프팅을 함으로써, 적어도 하나의 반응성 아민 작용기를 포함하는 핵산을 고정하는 공정에 관한 것이며, 상기 공정은 pH 6 미만에서 상기 활성화된 고체 지지체에 상기 핵산을 커플링하는 단계를 포함한다.

다른 정의에 따르면, 본 발명은 고체 지지체에 적어도 하나의 1차 아민 작용기를 포함하는 핵산 리간드를 고정하는 공정에 관한 것이고, 다음의 단계를 포함한다:

a) 고체 지지체의 표면에 활성화된 카복실산 기를 포함하는 고체 지지체를 제공하는 단계,

b) 적어도 하나의 1차 아민 작용기를 포함하는 핵산을 제공하는 단계, 및

c) pH 6 미만의 조건에서 상기 고체 지지체의 표면에서 활성화된 카복실 산 기와 상기 핵산의 커플링을 수행하는 단계,

단계 a) 및 b)의 순서는 상관없을 것으로 이해된다.

바람직한 일 실시 형태에서, 활성화된 카복실산 기는 N-하이드로시숙신이미드 또는 이의 유도체와의 반응으로 얻어진다.

또한, 본 발명은 상기 규정된 고정 공정의 실시를 포함하는 친화성 지지체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 하나의 주제는 상기 규정된 제조 방법을 사용하여 얻을 수 있는 고체 친화성 지지체이며, 또한 표적 단백질을 정제하거나 검출하기 위한 공정에서 이것의 용도이다.

추가적인 주제는 핵산 리간드와 표적 분자의 상호작용으로 인한 복합체이고, 상기 복합체는 이전에 정의된 고체 지지체의 표면에 형성된다.

마지막으로, 본 발명은 또한 친화성 지지체를 사용하여 표적 리간드를 정제하는 방법에 관한 것이고, 다음의 단계를 포함한다:

a) (ⅰ) 상기 지지체 상에 그래프팅된 핵산 및 (ⅱ) 상기 표적 리간드의 복합체를 형성하기 위하여, 상기 규정된 친화성 지지체와 접촉하여, 관심있는 표적 리간드를 포함하는 정제된 조성물을 준비하는 단계, 및

b) a) 단계에서 형성된 복합체에서 상기 표적 리간드를 방출하는 단계 및 상기 정제된 표적 리간드를 회수하는 단계.

도 1은 그 위에 항-인간 FⅦ DNA 압타머가 그래프팅되어 있는 본 발명의 고체 지지체를 거쳐서, 유전자 변형된 인간 인자(transgenic human factor) FⅦ 100μg을 포함하는 조성물을 통과시킴으로써 얻어진 크로마토그래프 프로파일을 도시한다. No. 1 피크는 친화성 지지체에 잔류되지 않은 휴먼 FⅦ의 분획물에 해당한다. No. 2 피크는 용출 분획물(elution fraction)에 포함된 휴먼 FⅦ에 해당한다. No. 3 피크는 재생 용출물(regeneration eluent)에 포함된 휴먼 FⅦ에 해당한다. x-축을 따라: 시간, 분으로 표시함. y-축을 따라: 흡광도, 280 나노미터의 파장에서 광학 밀도 단위로 표시함.
도 2는 그 위에 항-인간 FⅦ DNA 압타머가 그래프팅되어 있는 본 발명의 고체 지지체를 거쳐서, 유전자 변형된 인간 인자 FⅦ 200μg을 포함하는 조성물을 통과시킴으로써 얻어진 크로마토그래프 프로파일을 도시한다. No. 1 피크는 친화성 지지체에 잔류되지 않은 휴먼 FⅦ의 분획물에 해당한다. No. 2 피크는 용출 분획물에 포함된 휴먼 FⅦ에 해당한다. No. 3 피크는 재생 용출물에 포함된 휴먼 FⅦ에 해당한다. x-축을 따라: 시간, 분으로 표시함. y-축을 따라: 흡광도, 280 나노미터의 파장에서 광학 밀도 단위로 표시함.
도 3은 그 위에 항-인간 FⅦ DNA 압타머가 그래프팅되어 있는 본 발명의 고체 지지체를 거쳐서, 유전자 변형된 인간 인자 FⅦ 1000μg을 포함하는 조성물을 통과시킴으로써 얻어진 크로마토그래프 프로파일을 도시한다. No. 1 피크는 친화성 지지체에 잔류되지 않은 휴먼 FⅦ의 분획물에 해당한다. No. 2 피크는 용출 분획물에 포함된 휴먼 FⅦ에 해당한다. No. 3 피크는 재생 용출물에 포함된 휴먼 FⅦ에 해당한다. x-축을 따라: 시간, 분으로 표시함. y-축을 따라: 흡광도, 280 나노미터의 파장에서 광학 밀도 단위로 표시함.
도 4는 그 위에 항-인간 FⅦ DNA 압타머가 그래프팅되어 있는 본 발명의 고체 지지체를 거쳐서, 유전자 변형된 인간 인자 FⅦ 200μg을 포함하는 조성물을 통과시킴으로써 얻어진 크로마토그래프 프로파일을 도시하고, 상기 지지체는 0.5M의 NaOH를 포함하는 살균 처리 용액의 처리 전에 영향을 받는다. No. 1 피크는 친화성 지지체에 잔류되지 않은 휴먼 FⅦ의 분획물에 해당한다. No. 2 피크는 용출 분획물에 포함된 휴먼 FⅦ에 해당한다. No. 3 피크는 재생 용출물에 포함된 휴먼 FⅦ에 해당한다. x-축을 따라: 시간, 분으로 표시함. y-축을 따라: 흡광도, 280 나노미터의 파장에서 광학 밀도 단위로 표시함.
도 5는 그 위에 항-인간 FⅦ DNA 압타머가 그래프팅되어 있는 본 발명의 고체 지지체를 거쳐서, 유전자 변형된 인간 인자 FⅦ 1000μg을 포함하는 조성물을 통과시킴으로써 얻어진 크로마토그래프 프로파일을 도시하고, 상기 지지체는 0.5M의 NaOH를 포함하는 살균 처리 용액의 처리 전에 영향을 받는다. No. 1 피크는 친화성 지지체에 잔류되지 않은 휴먼 FⅦ의 분획물에 해당한다. No. 2 피크는 용출 분획물에 포함된 휴먼 FⅦ에 해당한다. No. 3 피크는 재생 용출물에 포함된 휴먼 FⅦ에 해당한다. x-축을 따라: 시간, 분으로 표시함. y-축을 따라: 흡광도, 280 나노미터의 파장에서 광학 밀도 단위로 표시함.
도 6은 그 위에 항-인간 FⅦ DNA 압타머가 48h, 5℃, pH 4.2의 커플링 조건에서 그래프팅되어 있는 본 발명의 고체 지지체를 거쳐서, 유전자 변형된 인간 인자 FⅦ 2.7 mg을 포함하는 조성물을 통과시킴으로써 얻어진 크로마토그래프 프로파일을 도시한다. No.1 지점(약 45분)은 인간 인자 FⅦ의 주입 순간을 나타낸다. No. 2 피크(약 70분)는 용출 분획물에 포함된 휴먼 FⅦ에 해당한다. x-축을 따라: 시간, 분으로 표시함. y-축을 따라: 흡광도, 280 나노미터의 파장에서 광학 밀도 단위로 표시함.
도 7은 그 위에 항-인간 FⅦ DNA 압타머가 48h, 5℃, pH 3.8의 커플링 조건에서 그래프팅되어 있는 본 발명의 고체 지지체를 거쳐서, 유전자 변형된 인간 인자 FⅦ 2.7 mg을 포함하는 조성물을 통과시킴으로써 얻어진 크로마토그래프 프로파일을 도시한다. No.1 지점(약 35분)은 인간 인자 FⅦ의 주입 순간을 나타낸다. No. 2 피크(약 70분)는 용출 분획물에 포함된 휴먼 FⅦ에 해당한다. x-축을 따라: 시간, 분으로 표시함. y-축을 따라: 흡광도, 280 나노미터의 파장에서 광학 밀도 단위로 표시함.
도 8은 그 위에 항-인간 FⅦ DNA 압타머가 2h, 5℃, pH 4.2의 커플링 조건에서 그래프팅되어 있는 본 발명의 고체 지지체를 거쳐서, 유전자 변형된 인간 인자 FⅦ 2.7 mg을 포함하는 조성물을 통과시킴으로써 얻어진 크로마토그래프 프로파일을 도시한다. No.1 지점(약 35분)은 인간 인자 FⅦ의 주입 순간을 나타낸다. No. 2 피크(약 70분)는 용출 분획물에 포함된 휴먼 FⅦ에 해당한다. x-축을 따라: 시간, 분으로 표시함. y-축을 따라: 흡광도, 280 나노미터의 파장에서 광학 밀도 단위로 표시함.
도 9는 그 위에 항-인간 FⅦ DNA 압타머가 1h, RT(실온), pH 4.2의 커플링 조건에서 그래프팅되어 있는 본 발명의 고체 지지체를 거쳐서, 유전자 변형된 인간 인자 FⅦ 2.7 mg을 포함하는 조성물을 통과함으로써 얻어진 크로마토그래프 프로파일을 도시한다. No.1 지점(약 40분)은 인간 인자 FⅦ의 주입 순간을 나타낸다. No. 2 피크(약 75분)는 용출 분획물에 포함된 휴먼 FⅦ에 해당한다. x-축을 따라: 시간, 분으로 표시함. y-축을 따라: 흡광도, 280 나노미터의 파장에서 광학 밀도 단위로 표시함.

본 발명은 고정된 핵산을 포함하는 신규의 친화성 지지체를 제공하고, 이를 제조하는 공정도 제공한다.

본 발명의 첫 번째 주제는 활성화된 카복실산 작용기를 갖는 고체 지지체에 적어도 하나의 반응성 아민 작용기를 갖는 핵산을 고정하는 공정이다.

본 발명에 따르면, 용어 "핵산" 또는 "핵산 리간드"는 뉴클레오티드의 중합체 또는 폴리뉴클레오티드 즉, 리보뉴클레오티드 및/또는 데옥시리보뉴클레오티드-이들은 5 내지 10,000 개의 뉴클레오티드의 길이 범위를 갖는, 바람직하게는 5 내지 1,000 개의 뉴클레오티드 길이 범위를 갖는, 더 바람직하게는 5 내지 120 개의 뉴클레오티드의 길이 범위를 갖는, 선택적으로 화학적 변형됨-를 포함하는 화합물을 의미하도록 의도된다. 핵산은 종래에는 적절하게 화학적으로 변형된 폴리리보뉴클레오티드(RNAs) 및 폴리데옥시리보뉴클레오티드(DNAs)를 포함한다.

뉴클레오티드는 (ⅰ) (모노-, 디- 또는 트리-) 인산기 또는 유사체, (ⅱ) 리보오스 및 데옥시리보오스에서 선택된 당 및 이의 화학적 유사체, 및 (ⅲ) 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신 및 우라실에서 선택된 질소성 염기, 및 이의 화학적 유사체로 구성된다. 본 발명의 목적을 위해, 뉴클레오티드는 당업자에게 잘 알려진 방법으로 단당류 부분 및 질소성 염기 모두에서 변형될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오티드의 화학적 변형을 가지는 압타머에 대해 기술한 미국특허 제5,958,691호를 참조할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 핵산은 뉴클레오티드의 중합체, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드를 포함한다.

다른 실시 형태에서, 핵산은 뉴클레오티드의 중합체를 필수적으로 포함하고, 비-뉴클레오티드 부분을 포함하고, 상기 비-뉴클레오티드 부분은 뉴클레오티드 부분의 길이에 비해 바람직하게 감소된 길이를 갖고, 예를 들어 직선 길이는 5개의 뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드의 쇄(chain)가 차지한 길이보다 작다.

본 발명에 따르면, 핵산이 용매에 접근가능하고 또 다른 분자 개체가 갖고있는 적절한 반응기와 반응할 수 있는 아민 작용기를 가질 때, 핵산은 반응성 아민 작용기를 포함한다. 반응성 아민 작용기는 특히 1차 아민을 포함한다. 1차 아민은 뉴클레오티드의 퓨린 또는 피리미딘 고리를 갖는 방향족 아민과는 별개의 것이다.

이러한 핵산은 선행기술에서 잘 알려져 있고, 지지체 또는 표지 물질과 화학적으로 커플링하는데 종래 사용되었다. 종래에는, 핵산은 그 3' 말단 또는 그 5' 말단에 아민 작용기의 첨가를 통해 변형된 핵산이었다. 가장 일반적으로, 아민 작용기는 폴리뉴클레오티드를 합성하는 공정의 마지막 단계에서 보다 쉽게 결합되는, 핵산의 5' 말단에 첨가된다. 특정 실시 형태에서, 반응성 아민 작용기 및 핵산의 5' 또는 3' 말단은 스페이서 쇄에 의해 분리된다.

본 발명에 따르면, 핵산은 3' 또는 5' 말단에 반응성 아민 작용기를 포함할 수 있고, 이는 반응성 아민 작용기가 상기 핵산의 뉴클레오티드 부분에 커플링된 것을 의미한다.

다른 실시 형태에 따르면, 핵산은 3' 또는 5' 말단의 "일측"에 반응성 아민 작용기를 포함할 수 있고, 이는 상기 아민 작용기가 상기 핵산의 뉴클레오티드 부분에 직접 커플링되지 않지만, 상기 핵산의 비-뉴클레오티드 부분, 예를 들어 상기 반응성 아민 작용기 및 상기 핵산의 뉴클레오티드 부분의 말단 사이에 위치한 비-뉴클레오티드 스페이서 쇄에 공유결합하는 것을 의미한다.

요약하면, 본 발명의 목적을 위해, "핵산"은 또한 "핵산 리간드"로서 다음 내용을 의미하고 포함한다:

■ 폴리뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 및/또는 데옥시리보뉴클레오티드가 선택적으로 화학적 변형된 시리즈를 포함하는 폴리뉴클레오티드 및

■ 선택사항으로서, 비-뉴클레오티드 부분, 바람직하게는 스페이서 쇄.

상기 핵산 리간드 또는 핵산은 또한 반응성 아민 작용기를 포함하고, 상기 반응성 아민 작용기는 폴리뉴클레오티드의 3' 또는 5' 말단 또는, 적절한 경우에, 스페이서 쇄에 부착되는 것이 가능하다.

일반적으로, 폴리뉴클레오티드는 반응성 아민 작용기를 직접 또는 비-뉴클레오티드 부분, 특히 스페이서 쇄를 사용하여 도입하기 위해, 3' 또는 5' 뉴클레오티드에서 적어도 변형된다.

핵산은 화학적 개체를 포함할 수 있고, 추가로 이전에 언급한 것들, 예를 들어 형광단 또는 발색단을 포함할 수 있다.

일반적으로, 본 발명에 따른 핵산은 리간드이고, 다시 말해서 특히 하나 이상의 표적 분자와 결합할 수 있다. 그러므로 다음의 내용에서, 용어 " 핵산 리간드" 및 "핵산"은 구별없이 사용될 것이다. 표적 분자는 인간, 동물, 식물, 바이러스 또는 박테리아의 RNA 분자, DNA 분자, 유기 또는 무기 특성의 화학 분자, 펩타이드 및 단백질을 포함한다.

출원인은 핵산(또는 핵산 리간드)가 고정되는 친화성 지지체-상기 친화성 지지체는 치료학적으로 관심있는 물질을 정제하기 위한 제조 기술에 사용할 수 있음-를 제조할 수 있음을 보여주고, 그것은 표적 물질을 선택적으로 잔류하는데 양호한 용량 및 재생 치료에 대한 뛰어난 저항력을 가지고 있기 때문에, 그것의 사용은 잠재적 독성 물질 또는 면역성 물질을 최종 정제된 제조물에 도입하는 위험을 초래하지 않는다.

보다 구체적으로는, 높은 그래프팅 수율을 얻을 수 있고 그래프팅된 핵산의 구조적 및 작용 완전성(functional integrity)를 유지할 수 있는 특정 그래프팅 조건 하에서, 핵산에 기반한 친화성 지지체는 핵산을 활성화된 카복실산 작용기를 포함하는 고체 지지체에 화학적으로 그래프팅하여 제조될 수 있다.

출원인은 고스 등(1990, 상기)의 논문에 기재된 것과 반대로, NHS-예비활성화된 지지체에 반응성 아민 작용기를 포함하는 리간드를 커플링하는 기술-상기 기술은 보통 지지체에 단백질을 커플링하는데 사용됨-은 지지체에 핵산을 그래프팅하기 위해 직접 치환될 수 없다.

실시예의 결과, 특히 다양한 별개의 핵산을 사용하여 6 내지 9의 pH에서 수행하는 종래의 커플링 방법을 사용함으로써 0% 내지 최대 10% 범위의 그래프팅 수율을 얻을 수 있음을 나타낸다. 실시예의 결과는 결국 또 다른 커플링 기술을 선택한 알러손 등(2003, 상기 언급함)에 의해 얻어진 결과를 확인한다.

알려진 방법에 대한 대안의 커플링 방법을 찾기 위하여, 1가 또는 2가 이온 인자(a source of monovalent or divalent ions)를 첨가함으로써, 그 경우 Mg ²⁺, Ca²⁺ 및/또는 Na⁺ 이온을 적절하게 첨가함으로써 핵산에 포함된 음이온이 마스킹되는 것 하에서, 출원인은 NHS-활성화된 지지체에 커플링하는 조건을 테스트했다. 실시예의 결과는 핵산에 포함된 음이온 전하를 중화시키는 것 및/또는 2가 또는 1가 양이온을 첨가하여 이온 강도를 증가시키는 것은 그래프팅 수율을 증가시킬 수 없음을 보여주고, 그래프팅 수율은 0% 내지 10%의 범위 내를 유지한다. 폴리브렌(polybrene)^®과 같은 이온화된 고분자를 첨가하여 핵산에 포함된 음이온 전하를 중화시키는 것은 핵산의 그래프팅을 불가능하게 한다는 것을 보여준다.

마찬가지로, 출원인은 핵산-핵산에서 반응성 아민 작용기 및 폴리뉴클레오티드의 5' 말단은 양전하 스페이서 쇄에 의해 서로 분리됨-을 이용하여 커플링하는 것의 효율성을 테스트하였다. 스페이서 쇄는 적어도 하나의 3차 아민 작용기를 포함하는 폴리아마이드를 포함한다. 실시예에 존재하지 않지만, 결과는, NHS-예비활성화 지지체에서 100%에 가까운 뛰어난 그래프팅 수율을 얻는 것을 보여주었다. 반면에, 출원인은 대략 9-10의 알칼리성 pH에서 용액과 접촉하여 그래프팅되는 지지체를 준비하는 것은 스페이서 쇄의 구조를 변형시키고, 지지체로부터 핵산의 분리를 초래하는 것을 나타내었다. 그러므로, 뛰어난 커플링 수율을 가능하게 하는 이러한 커플링 기술은 산업 정제 공정-상기 공정은 일반적으로 극단적 세척 및/또는 미생물 불활성화 단계를 포함함-에서 사용하기에 적합하지 않은 것으로 증명된 친화성 지지체를 제공한다.

결국 본 발명에 따라 개발된 기술적 해결책은 pH 6 미만의 조건 하에서 N-하이드록시숙신이미드-예비활성화된 지지체에 핵산을 커플링하는 반응을 수행하는 것을 포함하는 것이다.

본 발명의 기술적 해결책은 산성 pH에서 당업자가 커플링 반응이 전혀 일어나지 않거나, 또는 적어도 낮은 비율로 일어날 것-1차 아민의 약한 반응성 및 산성 pH에서 일반적으로 관찰되는 핵산의 가수분해에 의한 분해때문에 매우 낮은 그래프팅 수율이 얻어짐-으로 보통 기대하기 때문에 전적으로 놀라운 것이다.

그러나, 실시예에서는 pH 5 미만의 조건 하에서, NHS-예비활성화된 지지체에 핵산을 커플링하는 단계를 수행하는 것은 적어도 70%의 그래프팅 수율을 갖는 그래프팅된 지지체를 얻을 수 있다는 것을 보여주었다. 커플링 반응이 pH 4.5 미만에서 수행될 때, 그래프팅 수율은 심지어 대략 100%이다.

마찬가지로 놀랍게도, 산성 pH에서 커플링 단계를 수행하는 것이, 산성 pH 조건에 대한 핵산의 고감도가 당업자에게 잘 알려져 있더라도, 핵산의 작용 완전성에 영향을 미치지 않는 것을 나타낸다.

더 놀랍게도, 출원인은 이 커플링 반응-커플링 반응은 고체 지지체와 핵산의 아마이드 결합을 형성함-은 반응 온도와 관계없이 일반적으로 한 시간 이내에 끝날 정도로 매우 빠른 것을 보여주었다. 더욱이, 출원인은 저온에서 반응을 수행하는 것은 그래프팅된 리간드의 작용 완전성을 유지하기 위한 전제 조건이 아니라는 것을 보여주었다. 다시 말해, 본 발명에 따른 핵산 리간드를 고정하는 공정은 저온 또는 실온에서 독립적으로 수행할 수 있다.

그들의 작용성이 온전하다는 사실 때문에, 지지체 상에 그래프팅된 핵산은 그들의 화학적 및 물리적 완전성을 유지하는 것이 실시예에서 나타난다. 이 양상은 인간 인자 Ⅶ(hFⅦ)와 결합할 수 있는 핵산 압타머로 그래프팅된 지지체에 의해 실시예에서 설명된다. 상기 항-hFⅦ 핵산 압타머의 용량은 산성 pH 조건, 저온 또는 실온에서 NHS-예비활성화된 지지체 상에 그래프팅된 후에 온전하다는 것을 보여준다. 출원인은 정확하게 감마-카복실레이트 Gla 도메인을 포함하는 활성 인간 인자 Ⅶ 형태와 선택적으로 결합할 수 있는 핵산 압타머가 그래프팅에 사용될 때, 그래프팅된 압타머는 (ⅰ) 정확하게 감마-카복실레이트 Gla 도메인을 포함하는 인간 인자 Ⅶ의 활성 형태 및 (ⅱ) 인간 인자 Ⅶ의 비활성 형태를 식별하는 그래프팅되지 않은 압타머의 용량을 잔류하는 것을 또한 보여주었다.

본 발명의 상세한 설명에 개시된 특정 커플링 조건은 핵산의 임의의 형태, 즉 DNA 핵산 및 RNA 핵산 모두의 그래프팅에 적합하다.

더욱이, 실시예들은 본 발명의 공정이 고밀도의 그래프팅된 핵산을 갖는 친화성 지지체의 제조를 가능하게 하고, 결국 산업적 규모에서 사용할 수 있는 표적 리간드를 포획하는 높은 용량을 갖는 친화성 지지체를 제조할 수 있는 것을 보여준다. 출원인의 지식 수준에 따르면, 이러한 지지체는 선행기술에 기술되어 있지 않다.

표적 리간드에 대해 높은 선택도 및 상기 표적 리간드를 포획하는 높은 용량을 결합한 특성은 산업 규모에서 표적 리간드를 정제하기 위한 단계를 사용하여 본 발명의 공정을 통해 얻을 수 있는 친화성 지지체의 양립 가능성(compatibility)을 설명한다. 본 발명에 따른 공정은 표적 분자를 검출할 목적으로 친화성 지지체를 제조할 수 있다는 것은 말할 필요도 없다.

본 발명의 주제는 더 자세하게는, 활성화된 카복실산 기를 갖는 고체 지지체 상에 그래프팅하여 적어도 하나의 반응성 아민 작용기를 포함하는 핵산 리간드를 고정하는 공정이고, 상기 공정은 pH 6 미만에서 고체 지지체에 핵산을 공유 커플링하는 단계를 포함한다.

또 다른 정의에 따르면, 본 발명에 따른 고체 지지체에 적어도 하나의 반응성 아민 작용기를 포함하는 핵산 리간드를 고정하는 공정은 다음의 단계를 포함한다:

a) 표면에 활성화된 카복실산 기를 포함하는 고체 지지체를 제공하는 단계,

b) 적어도 하나의 반응성 아민 작용기를 포함하는 핵산 리간드를 제공하는 단계, 및

c) pH 6 미만의 조건 하에서 상기 고체 지지체의 표면에 존재하는 활성화된 카복실산 기와 핵산 리간드의 커플링을 수행하는 단계,

단계 a) 및 b)의 순서는 차이가 없는 것으로 이해된다.

단계 c)가 고체 지지체 및 핵산 리간드의 아마이드 결합을 생성할 수 있음은 말할 필요도 없으며, 각각의 아마이드 결합은 지지체의 활성화된 카복실산 작용기 및 핵산 리간드에 존재하는 1차 아민 작용기의 반응의 결과이다.

본 발명에 따르면, pH 6 미만에서의 커플링 조건은 pH 5.5 미만, pH 5 미만, pH 4.9 미만, pH 4.8 미만, pH 4.7 미만, pH 4.6 미만, pH 4.5 미만, pH 4.3 미만에서의 커플링 조건을 포함한다.

특정한 실시 형태에서, 커플링 단계의 pH는 3 내지 6 범위를 포함하고, pH 3.0, pH 3.1, pH 3.2, pH 3.3, pH 3.4, pH 3.5, pH 3.6, pH 3.7, pH 3.8, pH 3.9, pH 4.0, pH 4.1, pH 4.2, pH 4.3, pH 4.4, pH 4.5, pH 4.6, pH 4.7, pH 4.8, pH 4.9, pH 5.0, pH 5.1, pH 5.2, pH 5.3, pH 5.4, pH 5.5, pH 5.6, pH 5.7, pH 5.8 및 pH 5.9를 포함한다.

바람직하게는, 커플링 단계의 pH는 4.5 미만이다. 특정 실시 형태에서, 커플링 반응의 pH는 3.5 내지 4.5의 범위를 포함한다.

실시예에서 설명된 바와 같이, 커플링 단계는 약 4.2의 pH에서 수행될 수 있다.

바람직하게는, 커플링은 pH 6 미만을 갖는 수성 버퍼 배지의 존재에서 수행된다. 버퍼 배지는 커플링 반응 동안에 사용된 약산 및 약염기가 반응할 수 없는 한, 임의의 형태의 약산 및/또는 약염기로부터 제조할 수 있다. 실시예에서 설명된 바와 같이, 아세트산 나트륨 수용액일 수 있다.

어떠한 이론에도 구속되지 않고, 출원인은 커플링 반응을 위해 사용된 산성 pH 조건 하에서, 그래프팅된 핵산이 직선형(linear form)이고, 이에 따라 용매에 대한 반응성 아민 기의 접근을 촉진하고, 특히 고체 지지체의 표면에 접근할 수 있는 활성화된 카복실산 기와 반응성 아민 기의 반응을 촉진한다.

용어 "활성화된 카복실산 작용기" 또는 "활성화된 카복실산 기"는 친핵체와 반응할 수 있는 "카복실산" 작용기로부터 유도된 화학적 작용기를 의미하는 것이다. 보다 구체적으로는, 용어 "활성화된 카복실산 작용기"는 아마이드 결합을 형성하기 위하여 1차 아민과 반응할 수 있는 "카복실산" 작용기로부터 유도된 화학적 작용기를 의미하는 것이다. "활성화된 카복실산" 작용기는 당업자에게 잘 알려져 있고, 산 염화물, 혼합 무수물 및 에스테르 작용기를 포함한다.

특정 실시 형태에서, 활성화된 카복실산 작용기는 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBt), HOAt 및 N-하이드록시숙신이미드, 또는 이의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 하나의 화합물과 상기 카복실산 작용기와의 반응으로 인한 에스테르 형태이다.

바람직한 실시 형태에서, 지지체의 카복실산 기는 N-하이드록시숙신이미드 또는 N-하이드록시술포숙신이미드와 같은 이의 유도체와의 반응으로 인해 활성화된다.

고체 지지체의 "활성화된 카복실산" 기는 "N-숙신이미딜 에스테르" 기, 또는 아래의 화합물 (Ⅰ)의 "숙신이미딜 에스테르" 기 또는 "N-하이드록시숙신이미드 에스테르" 기라고 불리는 다른 기에 해당함을 의미하며, R은 에스테르 작용기를 부착한 고체 지지체의 가지(branching)를 나타낸다:

NHS 또는 술포-NHS를 이용한 활성화는 1차 아민과 반응할 뿐만 아니라 얻어진 예비활성화된 지지체의 포장(packaging) 및 저장을 가능하게 하도록 충분히 안정적인 활성화된 에스테르를 생성하는 이점이 있다.

"활성화된 카복실산" 작용기를 포함하는 고체 지지체는 선행기술에서 잘 알려졌고, 이들 중 많은 것이 상업적으로 이용가능하다. 고체 지지체는 또한 당업자에게 잘 알려진 방법론, 예를 들어 아마이드 결합의 연속적 형성의 목적으로, 카복실산 작용기의 활성을 허용하는 적합한 화학 성분(chemical agent)으로 덮인 표면에서 초기에 카복실산 작용기를 갖는 지지체와 반응함에 따라 제조할 수 있다. 특히, 펩타이드 합성에 사용되는, 특히 고체 공정을 통하여 카복실산 작용기를 활성화하기 위한 종래 방법을 참조할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 권장되는 특정 커플링 조건하에서, 당업자에게 잘 알려진 EDC (1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카보디이미드 하이드로클로라이드) 및 NHS를 결합함으로써 활성화하는 방법론을 사용할 수도 있다.

"활성화된 카복실산" 작용기를 갖는 고체 지지체는 임의의 종류일 수 있다. 이들 지지체는 실리카 및 아가로오스 지지체를 포함하는 종래 크로마토그래피에 사용되는 지지체를 포함하고, 지지체는 그 표면에 활성화된 카복실산 기를 갖기 위하여 처리된다. 예비활성화된 고체 지지체는, 활성화된 카복실산 기가 존재하는 표면에 덱스트란, 아가로오스 또는 전분 겔, 셀룰로오스 유도체, 또는 기타 합성 폴리머, 예를 들어 폴리아마이드, 트리사크릴, 세파크릴, 메타크릴레이트 유도체, 폴리스티렌 유도체 및 폴리아크릴아마이드, 또는 기타 무기 지지체, 예를 들어 실리카 지지체(특히 다공성 유리 지지체) 또는 알루미나 지지체를 포함한다. 일반적으로, 본 발명에 따른 핵산 리간드가 고정될 수 있는 고체 지지체는 필터 지지체, 막 등에서 통상 발견되는 구조 및 조성물을 갖는 임의의 종류의 지지체를 포함할 수 있다. 고체 지지체는 수지, 친화성 크로마토그래피 칼럼 수지 또는 겔, 중합체 비드, 자성 비드, 상자성 비드, 여과막 지지체 물질 등을 포함한다. 고체 지지체는 또한 특히 유리 또는 금속, 예를 들어 강철, 금, 은, 알루미늄, 구리, 실리콘, 유리 또는 세라믹에 기반을 둔 물질을 포함한다. 고체 지지체는 또한 특히 중합체 물질, 예를 들어 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아마이드, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리아크릴아마이드 유도체 및 이의 조합을 포함할 수 있다.

고체 지지체의 카복실산 작용기가 NHS로 활성화되는 특정 실시 형태에서, 상기 고체 지지체는 선택적으로 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)와 같은 카르보디이미드의 존재에서 N-하이드록시숙신이미드(NHS)과 자유 카복실산 작용기를 갖는 상업적 겔을 반응시켜 얻을 수 있다.

또한 NHS-예비활성화된 상업적 고체 지지체, 예를 들어 제네랄 일렉트릭 헬스케어사(미국)에서 판매된 "NHS 활성화된 세파로오스 4 패스트 플로우(GE)" 겔, 제네랄 일렉트릭 헬스케어(미국)사에서 판매된 "HiTrap™ NHS-활성화" 겔 또는 써모 사이언티픽 피어스사에서 판매된 "NHS-활성화된 아가로오스" 등을 사용할 수 있다.

상기에서 설명하였듯이, 본 발명에 따른 핵산 리간드는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 뉴클레오티드의 중합체를 포함한다. 핵산 리간드의 폴리뉴클레오티드는 표적 분자(들)에 대하여 리간드의 특정 결합 특성의 원인이 되는 큰 규모일 수 있다. 일반적으로 길이로 5 내지 120 개의 뉴클레오티드를 포함한다.

핵산 리간드는 또한 비-뉴클레오티드 부분을 포함한다. 상기 비-뉴클레오티드 부분은 바람직하게는 폴리뉴클레오티드와 결합한다. 용어 "비-뉴클레오티드 부분"은 폴리뉴클레오티드를 기본적으로 포함하지 않는 화학적 단위를 의미하는 것이다. 이 비-뉴클레오티드 부분은 바람직하게는 스페이서 쇄이다. 핵산 리간드의 반응성 아민은 바람직하게는 폴리뉴클레오티드의 3' 또는 5' 말단에 존재하는 1차 아민이고, 보다 바람직하게는 비-뉴클레오티드 부분의 수준에 존재하는 1차 아민이다.

바람직하게는, 반응성 아민은 지방족 1차 아민이고, 이것은 아민 작용기가 방향족 기에 직접 연결되지 않는 것을 의미한다.

따라서, 일부 실시 형태에서, 핵산 리간드는 3' 또는 5' 말단에 적어도 하나의 반응성 아민 작용기를 포함하는 5 내지 120 개의 뉴클레오티드 길이의 폴리뉴클레오티드이다.

또 하나의 실시 형태에서, 핵산 리간드는 (ⅰ) 5 내지 120 개의 뉴클레오티드 길이의 폴리뉴클레오티드 및 (ⅱ) 상기 폴리뉴클레오티드에 결합하는 스페이서 쇄를 포함하고, 반응성 아민 작용기는 폴리뉴클레오티드 또는 스페이서 쇄의 3' 또는 5' 말단에 부착된다.

스페이서 쇄는 바람직하게는 핵산의 5' 말단 또는 3' 말단에 결합된다.

본 발명에 따른 특정 실시 형태에서, 핵산 리간드는 폴리뉴클레오티드 및 스페이서 쇄로 구성되고, 스페이서 쇄는 한쪽 말단에 아민 작용기를 포함하고, 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 두번째 말단을 통해 결합된다.

스페이서 쇄의 작용기는 고체 지지체의 표면으로부터 폴리뉴클레오티드의 물리적 거리가 있으므로, 핵산 리간드의 뉴클레오티드 부분의 상대적 이동도를 증가시키고 입체 장해(steric hindrance)를 감소시킬 수 있다.

스페이서 쇄는 임의의 종류일 수 있다. 실시예는 특히 3, 6, 12 또는 그 이상(예를 들어, 18)의 메틸렌(CH₂)으로 구성된 소수성 쇄, 다음으로 C3, C6 또는 C12로 알려지거나 폴리에틸렌 글리콜 타입, 예를 들어 헥사에틸렌 글리콜(HEG), 또는 11-아미노-3,6,9-트리옥사운데칸-1-일 일 수 있는 친수성 쇄, 다음으로 친수성 C11로 불리거나, 비특정 올리고뉴클레오티드를 위한 본 발명에 따른 공정의 수행을 설명한다. 바람직하게는, 스페이서 쇄는 1차 아민 작용기 또는 2차 아민 작용기외에 이온화가능한 기를 포함하지 않는다. 일반적으로, 스페이서 쇄는 알칼리성 pH 또는 산화반응 또는 환원반응에 민감한 기 또는 결합을 포함하지 않는다. 특히, 스페이서 쇄는 임의의 이황화 결합 또는 싸이올 기를 포함하지 않는다. 스페이서 쇄는 필수적으로 탄소-탄소, 탄소-산소 및 탄소-질소 유형의 결합을 포함한다. 스페이서 쇄는 바람직하게는 다음으로 구성되는 군에서 선택된다: 3, 6, 12 또는 그 이상(예를 들어, 18)의 메틸렌(CH₂)으로 구성된 소수성 쇄, 다음으로 C3, C6 또는 C12로 알려지거나 폴리에틸렌 글리콜 타입, 예를 들어 헥사에틸렌 글리콜(HEG), 또는 11-아미노-3,6,9-트리옥사운데칸-1-일 일 수 있는 친수성 쇄, 다음으로 1차 아민 작용기로 치환할 수 있는 친수성 C11로 불리거나, 비특정 올리고뉴클레오티드.

스페이서 쇄는 당업자에게 잘 알려진 방법, 특히 폴리뉴클레오티드의 화학적 합성의 마지막 단계를 통하여 도입할 수 있다. 이러한 특정 경우에, 스페이서 쇄는 실시예에 기술된 바와 같이 포스포라미다이트 작용기(phosphoramidite functional)를 포함하는 유도체를 사용하여 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 도입될 수 있다. 이 반응의 일반적 원리는 그레코 및 토르(Greco and Tor), 네이쳐 프로토콜, 2007, 2, 305-316, "고체 DNA 포스파리미다이트 합성 주기의 핵심 단계"의 도 2에 나타난다. 또한, EDC에 존재하는 에틸렌디아민과 같은 디아민을 커플링하여 폴리뉴클레오티드 및 이미다졸의 5' 위치에 1차 아민을 포함하는 분자를 도입할 수 있다(써모 사이언티픽에서 발행된 테크니컬 시트 No. TR0030.5 참조). 허만손에 의한 참조 설명서(Bioconjugate Techniques , 2008, 2 nd Edition , Academic Press , San Diego), 특히 챕터 27, p.970을 참조할 수 있다.

본 출원의 실시예에서 설명되듯이, 커플링 단계는 저온 및 실온의 구별없이 수행될 수 있다. 특히, 실온에서 반응을 수행하는 것은 반응 수율을 감소시킨다. 동일한 방법으로, 저온에서 반응을 수행하는 것-보통 5 ℃ 온도-은 반응률의 상당한 감소를 보이지 않는다.

따라서, 특정 실시 형태에서, 커플링 단계는 0 ℃ 내지 50 ℃의 범위를 포함하는 온도에서 수행된다.

바람직하게는, 커플링 단계는 0 ℃ 내지 35 ℃의 범위의 온도에서 수행될 수 있다.

사실상, 커플링 반응은 실온, 즉 15 ℃ 내지 35 ℃의 범위의 온도, 바람직하게는 15 ℃ 내지 25 ℃의 범위의 온도에서 수행될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 커플링 단계는 저온, 전형적으로 0 ℃ 내지 8 ℃의 범위의 온도에서 수행할 수 있고, 수반된 시약-특히 핵산 리간드-은 특히 가수분해에 민감한 화학 기를 가질 수 있다.

커플링 반응은 특히 빠르기 때문에, 반응의 충분한 진행은 대략 한 시간 또는 심지어 수 분 후에도 일반적으로 얻어진다. 적합한 동적 모니터링 기술(kinetic monitoring technique)을 사용하여, 당업자는 최적의 반응 시간을 결정할 수 있을 것이다. 동일하게 반응 온도도 마찬가지이다.

일반적으로, 실시예에서 설명한 바와 같이, 커플링 단계는 3.5 내지 4.5 범위의 pH, 실온 및 대략 한 시간 주기의 과정을 통해 수행될 수 있다.

물론, 당업자는, 상기 일반적 조건에 근거하여, 화학의 일반적 지식에 근거하여 각각의 정확한 경우에 적합한 최적의 조건을 결정하기 위하여 커플링 반응 조건을 조정할 수 있다. 설명된 방법으로, 당업자는 주어진 커플링 수율을 얻기 위해, 반응 온도를 감소시키는 것이 커플링 단계의 지속 시간을 증가시키는데 필요함을 쉽게 예측할 수 있다.

본 발명에 따른 고정화 공정의 특정 실시 형태에서, 커플링 반응은 주어진 시간 주기 동안의 알칼리성 pH 조건 하에서 예비활성화된 지지체/핵산 결합을 배치함으로써 종결할 수 있다.

이들 실시 형태에서, 본 발명의 공정의 커플링 단계 자체는 다음의 두 단계를 포함한다:

c1) pH 6 미만의 조건 하에서, 고체 지지체의 표면에 존재하는 활성화된 카복실산 기와 핵산을 반응시키는 단계, 및

c2) pH 7.5 초과의 조건 하에서, 고체 지지체의 표면에 존재하는 활성화된 카복실산 기와 핵산을 커플링 하는 반응을 지속하는 단계.

어떠한 이론에도 구속되지 않고, 출원인은 하위 단계 c2)의 실시가 어떤 특정 경우에 적합한 형태를 채택하기 위해 지지체에 고정화된 핵산을 유도할 수 있다고 생각한다. 출원인은 이 단계는 선택 사항이라는 의견이다.

바람직하게는, 알칼리성 pH에서 커플링의 마지막 단계는 적어도 pH 7.5에서 수행되고, 적어도 pH 8, 적어도 pH 8.5를 포함한다. 실시예는 대략 pH 9에서 단계 c2)의 수행을 설명한다.

단계 c2)는 실온 또는 저온에서 수행할 수 있다. 커플링 반응의 마지막 단계의 용어 "저온"은 14 ℃, 13 ℃, 12 ℃, 11 ℃, 10 ℃, 9 ℃, 8 ℃, 7 ℃, 6 ℃ 또는 5 ℃ 미만의 온도를 포함하는 15 ℃ 미만의 온도를 의미하는 것이다.

커플링 단계의 마지막 단계의 지속 시간은 다양하다. 그것은 수 분 및 수 시간 사이이다. 일반적으로, 단계 c2)의 지속 시간은 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 및 1 시간 미만의 지속시간을 포함하는 9 시간 미만이다. 단계 c2)의 지속 시간은 실시예에서 설명하였듯이 대략 8 시간 또는 대략 3 시간일 수 있다.

커플링 단계의 마지막 단계에서, 당업자는 쉽게, 상기 지침에 기반하여, pH, 온도, 지속 시간이 조합된 최적의 조건을 각각의 케이스마다 결정할 수 있다.

유리한 실시 형태에서, 커플링 반응은 다음으로 중화하는 단계 d) 또는 실제 커플링 단계 동안에 반응하지 않는 활성화된 카복실산 기를 차단(blocking)하는 단계가 이어진다. 설명과 같이, 특히 제작자에 의해 권장되고, 더욱이 실시예에서 설명한 것처럼, 반응하지 않는 활성화된 카복실산 작용기를 차단하는 것은 0.5M 에탄올아민, 및 pH 8.3에서 0.5M NaCl 또는 pH 8.5 에서 0.1M Tris-HCl을 포함하는 차단 용액(blocking solution)을 포함하는 그래프팅된 지지체를 배양하여 수행할 수 있다. 중화 또는 차단하는 단계의 지속 시간은 저온에서 유리하게는 적어도 한시간이다. 예를 들어, 실시예에서 설명한 바와 같이, 4 ℃의 온도에서 2시간 30분의 기간으로 수행될 수 있다.

마지막으로, 본 발명에 따른 공정은 커플링 단계 c)의 마지막 및/또는 차단 또는 중화하는 단계 d)의 마지막에, 즉시 사용(ready-to-use) 친화성 지지체를 얻기 위하여 종래의 조건에서 상기 지지체를 한 번 이상 세척하는 단계 e)를 포함한다. 설명과 같이, 세척 단계(들)는 실시예에서 설명한 바와 같이, pH 8 내지 9의 범위에서 Tris-HCl 0.1M의 버퍼, 또는 pH 4 내지 5 범위에서 0.1M 아세테이트, 0.5M NaCl의 버퍼로 수행할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 세척하는 단계는 (ⅰ) pH 8 내지 9의 범위에서 Tris-HCl 0.1M의 버퍼 용액으로 세척하는 단계, 및 (ⅱ) pH 4 내지 5 범위에서 0.1M 아세테이트, 0.5M NaCl의 버퍼 용액으로 세척하는 단계를 연속적으로 포함한다. 종래, 복수의 세척 단계는, 실시예에서 설명한 바와 같이 예를 들어 3 회의 세척 단계가 수행된다.

상기 설명에 비추어, 본 발명에 따른 핵산을 고정하는 공정은 또한 다음의 단계를 포함하는 공정으로 정의될 수 있다:

a) 활성화된 카복실산 기, 바람직하게는 활성화된 N-하이드록시숙신이미드를 지지체의 표면에 포함하는 고체 지지체를 제공하는 단계,

b) 적어도 하나의 1차 아민 작용기를 포함하는 핵산을 제공하는 단계,

c) pH 6 미만의 조건 하에서 상기 고체 지지체의 표면에 존재하는 활성화된 카복실산 기와 핵산의 커플링을 수행하는 단계, 및

d) 커플링 반응을 차단하는 단계.

본 발명에 따른 핵산을 고정하는 공정은 또한 다음의 단계를 포함하는 공정으로 정의될 수 있다.

c) pH 6 미만의 조건 하에서 상기 고체 지지체의 표면에 존재하는 활성화된 카복실산 기와 핵산의 커플링을 수행하는 단계,

d) 커플링 반응을 차단하는 단계, 및

e) 한 번 이상의 지지체 세척 단계를 수행하는 단계.

이전에 특정한 바와 같이, 특정 실시 형태에서, 단계 c)는 다음의 두 단계를 포함한다:

c1) pH 6 미만의 조건 하에서, 고체 지지체의 표면에 존재하는 활성화된 카복실산 기, 바람직하게는 활성화된 N-하이드록시숙신이미드와 핵산을 반응시키는 단계, 및

c2) pH 7.5 초과의 조건 하에서, 상기 고체 지지체의 표면에 존재하는 활성화된 카복실산 기와 핵산을 커플링 하는 반응을 지속하는 단계.

본 발명에 따른 핵산 리간드를 고정하는 공정은 표적 단백질을 포함하는 표적 분자를 정제 또는 검출하기 위한 목적으로 친화성 지지체의 생산에 직접 적용된다.

따라서, 더 일반적으로, 본 발명은 상기에서 정의한 바와 같이 핵산 리간드를 고정하는 공정의 수행을 포함하는 친화성 지지체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 친화성 지지체를 제조하는 방법은 다음의 단계를 포함한다:

b) 적어도 하나의 1차 아민 작용기를 포함하는 핵산 리간드를 제공하는 단계, 및

단계 a) 및 b)의 순서는 상관없을 것이다.

방법의 단계 c)는 앞에서 정의된 단계 c1) 및 c2)를 포함할 수 있다. 동일한 방법으로, 방법은 또한 앞에서 설명한 단계 d) 및 e)를 포함할 수 있다.

실시예에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 방법 및 공정은 특히 크로마토그래피에 경우, 하나 이상의 표적 분자를 정제하기 위한 목적으로 친화성 지지체를 제조하는 데 특히 적합하다.

따라서, 본 발명에 따른 공정의 특정 실시 형태에서, 고체 지지체는 크로마토그래피, 여과 또는 고체-상 추출 공정을 수행하는 데 적합한 지지체이다. 다시 말해서, 고체 지지체는 크로마토그래피, 여과 또는 고체-상 추출 공정의 고정상으로 사용하는데 적합하다. 고체-상 추출을 위한 고체 친화성 지지체의 사용을 위해, 마드루(Madru) 등(Analytical Chemistry , 2009, 81, 7081-7086)을 참조할 수 있다. 이러한 고체 지지체는 실리카 겔 및 다당류 겔, 예를 들어 아가로오스 겔, 덱스트란 겔 및 이의 유도체, 아크릴아마이드 겔 및 이의 유도체, 메타크릴레이트 겔 및 이의 유도체, 및 폴리스틸렌 표면 및 이의 유도체로 이루어진 군에서 선택할 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 고정하는 공정 또는 방법의 하나의 특정 실시 형태에서,

(ⅰ) 지지체의 표면에 활성화된 카복실산 기를 포함하는 고체 지지체는 실리카 겔, 아가로오스 겔, 덱스트란 겔 및 이의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 지지체이고,

(ⅱ) 적어도 하나의 반응성 아민을 포함하는 핵산 리간드는, 3' 또는 5' 말단에 3, 6, 12 또는 그 이상(예를 들어, 18)의 메틸렌(CH₂)으로 이루어진 소수성 쇄, 다음으로 C3, C6 또는 C12로 알려지거나 폴리에틸렌 글리콜 타입, 예를 들어 헥사에틸렌 글리콜(HEG), 또는 11-아미노-3,6,9-트리옥사운데칸-1-일 일 수 있는 친수성 쇄, 다음으로 친수성 C11로 불리거나, 비특정 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택될 수 있는 스페이서 쇄를 선택적으로 포함하는 5 내지 120 개의 아미노산의 폴리뉴클레오티드의 군에서 선택된다.

본 발명에 따른 공정 또는 방법의 또 하나의 특정 실시 형태에서,

(ⅰ) 고체 지지체는 아가로오스 겔 및 이의 유도체에서 선택되고,

(ⅱ) 핵산 리간드는 5' 말단을 통해, 바람직하게는 스페이서 쇄에 포함되는 C₄-C₂₀ 폴리에틸렌 글리콜, 반응성 아민 작용기에서 선택된 스페이서 쇄에 결합된 5 내지 120 개의 뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드이다.

본 발명에 따른 공정 또는 방법의 또 하나의 추가적인 실시 형태에서,

(ⅱ) 핵산 리간드는 5' 말단을 통해, 바람직하게는 스페이서 쇄에 포함되는 C₄-C₂₀ 선형 알킬, 반응성 아민 작용기에서 선택된 스페이서 쇄에 결합된 5 내지 120 개의 뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드이다.

실시예는 본 발명의 공정에 따라 얻어진 친화성 지지체가 매우 선택적인 방식으로 표적 리간드의 정량적 정제를 허용하는 것을 보여준다.

마찬가지로, 실시예의 결과는 본 발명의 공정에 따라 얻을 수 있는 친화성 지지체는 매우 오랜 기간 동안 사용될 수 있고, 특히 표적 리간드의 선택적 및 정량적인 잔류 특성의 상당한 손실없이 다수의 포획/세척/용출/세척 주기에 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 본 발명에 따른 친화성 지지체는 극단적인 항균, 항진균 또는 항바이러스 재생 또는 살균 처리 단계를 거친 후에, 표적 리간드의 선택적 및 정량적 잔류 특성을 나타낸다. 특히, 실시예에서, 표적 단백질에 대한 본 발명에 따른 친화성 지지체의 잔류 용량은 매우 긴 시간 주기(100 시간), 일반적으로 수 분인 종래 살균 처리 단계의 지속 시간보다 훨씬 더 긴 시간 동안, 0.5M의 NaOH 최종 농도를 갖는 용액의 처리에 의해 손상되지 않고, 심지어 1M의 최종 농도, 즉 일반적으로 위생 처리 단계에서 사용되는 것보다 더 높은 NaOH의 최종 농도를 갖는 NaOH의 용액의 처리에 의해 손상되지 않는 것을 보여주었다. 또한, 본 발명에 따른 친화성 지지체의 크로마토그래픽 특성은 프로필렌 글리콜 50%(vol/vol)의 최종 농도를 갖는 용액의 처리에 의해 손상되지 않는 것을 보여주었다.

실시예의 결과는 또한 본 발명에 따른 친화성 지지체의 크로마토그래픽 특성이 심지어 정제될 분자를 포함하는 초기 생물학적 배지에서 상기 지지체의 긴 배양 후에도, 손상되지 않는 것을 나타낸다.

또한, 본 발명에 따른 친화성 지지체의 크로마토그래픽 특성이 수많은 횟수의 사용 후에도, 변하지 않은 것을 나타낸다.

다시 말해, 실시예의 결과는 종래 사용을 위한 산업적 조건에서, 본 발명에 따른 친화성 지지체가 정량적 표적 리간드 정제 단계-면역 친화성 지지체를 포함하는 알려진 친화성 지지체에 대해 일반적으로 유해함-를 완전히 재현성있게 수행하기 위한 용량을 설명한다. 상기의 다양한 정의에 따라 본 발명의 공정의 각 단계의 기술적 특성은 이미 이전 발명의 상세한 설명에서 특정하였다.

따라서, 본 발명에 따른 친화성 지지체는 신뢰성과 재현성있는 정제 도구로 구성되고, 시간이 지나도 안정하며, 반복된 유지 작업이 필요하지 않다. 본 발명에 따른 친화성 지지체는, 그들이 제공하는 다수의 기술적 이점 때문에, 적당한 비용에서 표적 분자를 정제하는 공정을 수행할 수 있다.

실시예는 핵산 압타머의 그래프팅에 의해 본 발명의 친화성 지지체를 얻는 것을 설명하고, DNA 압타머의 그래프팅에 의해 설명된 바와 같다.

따라서, 본 발명에 따른 공정 또는 방법의 하나의 바람직한 실시 형태는, 핵산 리간드가 핵산 압타머이다.

본 발명에 따르면, 용어 "핵산 압타머" 또는 "압타머"는 하나 이상의 표적 리간드, 특히 결합한 단일-가닥 핵산을 의미하는 것이다. 압타머는 각각의 핵산 리간드와 표적 리간드 파트너가 접촉하게 하는 이전의 단계 후에, 하나의 지정된 표적 리간드 또는 다양한 지정된 표적 리간드를 갖는 복합체를 검출할 수 있게 하는 것을 포함한다. 압타머는 RNA 압타머 및 DNA 압타머를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "압타머"는 특히 단백질과 같은 하나 이상의 표적 리간드에 결합할 수 있는 단일-가닥 DNA 또는 RNA 핵산 분자를 의미한다. 압타머는 기본적으로 혼성화(hybridization)와는 구별되는 다른 메카니즘을 통해 표적 분자와 결합한다. 압타머는 일반적으로 루프 및 스템을 포함하는 2차 구조로 특징지어진다. 다시 말해, 압타머의 활성 형태(즉, 압타머가 표적 단백질과 결합할 수 있는 형태)는 비선형이다.

압타머는 일반적으로 5 내지 120 개의 뉴클레오티드를 포함하고, SELEX(기하급수적 농축에 의한 시스테믹 리간드 발전(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment))으로 알려진 공정을 통해 생체 외에서 선택될 수 있다. 압타머는 많은 이점이 있다. 올리고뉴클레오티드의 특성 덕분에, 압타머는 친화성 리간드로서의 사용의 맥락에서 살균 처리 전략에 다양하게 사용될 수 있는 낮은 면역원성 및 엄격한 물리화학적 조건(요소, DMSO, 강한 산성 또는 강한 염기성 pH의 존재, 유기 용매 또는 고온의 사용)에 대한 강한 내성을 갖는다. 더욱이, 압타머는 높은 선택도도 갖는다. 마지막으로, 압타머의 생산은 상대적으로 한정된 비용을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 정의된 공정 또는 방법에 따라 예비활성화된 고체 지지체를 그래프팅하는데 사용되는 "핵산 압타머"는, 정의상, 비-뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 부분, 예를 들어 비-뉴클레오티드 스페이서 쇄를 포함하고, 비-뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 부분은 상기 압타머의 핵산 부분의 5' 또는 3' 말단의 하나 및 상기 예비활성화된 지지체의 화학적 그래프팅에 사용되는 반응성 아민 작용기와 연결된다. 이들 실시 형태에서, 핵산 압타머는 아래의 화학식(Ⅰ)일 수 있다.

NH₂-[SPAC]_n-[NUCL] (Ⅰ)

- n은 1 또는 0과 같은 값이고, 0은 압타머가 프리 스페이서 쇄를 포함하지 않는 것을 의미하고 1은 압타머가 스페이서 쇄를 포함하는 것을 의미하고,

- NH₂는 NHS 기를 갖는 예비활성화된 고체 지지체 상에 그래프팅하는데 사용되는 반응성 아민 작용기를 의미하고,

- [SPAC]는 스페이서 쇄를 의미하고,

- [NUCL]는 특히 표적 분자와 결합하는 핵산을 의미하고, 상기 핵산은 5 내지 120 개의 뉴클레오티드를 포함한다.

바람직하게는, 핵산 [NUCL]은 10 내지 80개의 뉴클레오티드를 포함하고, 보다 더 바람직하게는 20 내지 60개의 뉴클레오티드를 포함한다.

화학식(Ⅰ)의 화합물에서 [SPAC]가 의미하는 "스페이서 쇄"는 알려진 임의의 종류일 수 있다. 스페이서 쇄는 비-뉴클레오티드 화합물, 올리고뉴클레오티드 또는 하나 이상의 비-뉴클레오티드 부분 및 하나 이상의 뉴클레오티드 부분을 포함하는 화합물일 수 있다. 스페이서 쇄는 일반적으로 지지체에 대한 표적 리간드의 결합에 참여하지 않는다.

스페이서 쇄의 작용기는 화학식(Ⅰ)의 화합물이 화학적으로 그래프팅되는 고체 지지체의 표면으로부터 핵산 [NUCL]과 물리적 거리를 가질 수 있기 때문에, 상기 고체 지지체의 표면에 대한 핵산 [NUCL]의 상대적 이동성을 가능하게 한다. 스페이서 쇄는, 고체 지지체와 압타머의 핵산 부분이 지나치게 근접하기 때문에, 입체장해가 상기 핵산과 접촉할 수 있는 표적 리간드 분자와 상기 핵산 사이의 결합 사건을 손상시키는 것을 제한하거나 방해한다.

화학식(Ⅱ)의 화합물에서, 스페이서 쇄는 핵산 [NUCL]의 5' 말단 또는 3' 말단에 우선적으로 결합한다.

스페이서를 갖는 이 구조는 고체 지지체에 압타머를 직접 고정하지 않는 이점이 있다. 바람직하게는, 상기에서 가리키는 바와 같이, 3, 6, 12 또는 그 이상(예를 들어, 18)의 메틸렌(CH₂)으로 구성된 소수성 쇄, 다음으로 C3, C6 또는 C12로 불리거나 폴리에틸렌 글리콜 타입, 예를 들어 헥사에틸렌 글리콜(HEG), 또는 11-아미노-3,6,9-트리옥사운데칸-1-일 일 수 있는 친수성 쇄, 다음으로 친수성 C11로 불리거나, 비특정 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 스페이서 쇄가 비특정 뉴클레오티드를 포함하는 경우, 상기 올리고뉴클레오티드는 유리하게는 적어도 5개의 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 5 내지 15개의 뉴클레오티드 길이를 포함한다.

특정 실시 형태에서, 스페이서 쇄는 합성물일 수 있고, HEG의 연쇄(succession) 및 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 올리고(dT)를 포함한다.

실시예가 이와 별개의 특성의 스페이서 쇄, 즉 C₆ 알킬 쇄로 구성되는 소수성 쇄, C₁₂ 알킬 쇄으로 구성되는 소수성 쇄, 및 친수성 C11-TFA 쇄를 포함하는 세 개의 별개 항-FⅦ 핵산 압타머로 NHS-예비활성화된 지지체를 그래프팅하여 상기 정의한 친화성 지지체를 얻는 것을 설명한 것을 상기한다. 따라서, 실시예의 결과는 본 발명의 상세한 설명에 설명된 친화성 지지체를 얻기 위한 공정이 그래프팅되는 관심 핵산의 동일성 또는 종류와 관계없이 사용될 수 있다는 것을 보여준다.

상기에서 언급하였듯이, 본 발명에 의한 공정 및 방법은 표면에 고정된 핵산 리간드의 높은 밀도 때문에, 공지의 친화성 지지체와는 다른 친화성 지지체를 제조할 수 있다. 이러한 핵산 리간드의 높은 밀도는 친화성 지지체를 얻는 특정 공정의 결과로 직접 발생한다.

주목할 만하게, 본 발명에 따른 친화성 지지체는 또한 전달된 그래프팅된 핵산에 대해 표적 분자(들)의 잔류를 위한 높은 용량의 특징을 지닌다. 특히, 본 발명에 따른 공정은 높은 밀도의 핵산 리간드를 갖는 친화성 크로마토그래피 겔을 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 크로마토그래피 겔은 0.2 μmol/ml 내지 0.5 μmol/ml의 핵산 리간드 밀도를 갖는 것이 발견된 것에 반하여, 상업적으로 이용가능한 크로마토그래피 겔의 활성화된 카복실산 작용기의 초기 밀도는 일반적으로 겔의 5 μmol/ml 내지 25 μmol/ml이다. 따라서, 본 발명의 커플링 공정에 따라서, 고체 지지체의 표면에 초기에 존재하는 적어도 0.01%의 활성화된 카복실 작용기, 바람직하게는 적어도 0.1%, 보다 바람직하게는 적어도 1% 및 보다 더 바람직하게는 적어도 2%의 활성화된 카복실 작용기가 본 발명의 공정에 따라 유도체 합성될(derivatize) 수 있다. 비교하면, 리간드로서 항체를 갖는 친화성 크로마토그래피에서 그래프팅의 정도는 보통 유도체 합성된 카복실 작용기의 1 mg/ml 미만, 즉 0.06 μmol/ml 미만, 즉 0.2% 미만이다.

적어도 0.01의 활성화된 카복실 작용기의 유도체화(derivatization)는 적어도 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1.1%, 1.2%, 1.3%, 1.4%, 1.5%, 1.6%, 1.7%, 1.8%, 1.9% 및 2%의 활성화된 카복실 작용기의 유도체화를 포함한다.

특정 실시 형태에서, 유도체 합성된 카복실 작용기의 퍼센트는 활성화된 카복실 작용기의 최대 100%이고, 최대 50%, 40%, 30% 및 25%를 포함한다.

따라서, 본 발명의 또 하나의 주제는 본 발명의 상세한 설명에서 상기 설명된 공정 및 방법에 따라 얻을 수 있는 친화성 지지체이다.

보다 일반적으로, 본 발명은 고체 친화성 지지체에 관한 것이고, 아마이드 결합을 통해 상기 지지체 상에 핵산이 고정되고, 상기 지지체에서 그 표면에 초기에 존재하는 적어도 카복실 작용기가 핵산 리간드를 이용하여 유도체 합성된다.

지지체에 핵산 리간드를 결합하는 아마이드 결합은 핵산 리간드에 존재하는 1차 아민 작용기를 갖는 지지체의 표면에 초기에 존재하는 카복실 작용기와의 반응의 결과임은 말할 필요도 없다.

바람직한 일 실시 형태에서, 고체 친화성 지지체는 크로마토그래피 겔이다.

본 발명의 또 하나의 주제는 아마이드 결합을 통해 핵산이 고정된 고체 친화성 지지체이며, 상기 친화성 지지체는 적어도 겔의 0.005 μmol/ml의 핵산 리간드 밀도-이는 적어도 겔의 0.01 μmol/ml, 0.05 μmol/ml, 0.1 μmol/ml, 0.15 μmol/ml, 0.2 μmol/ml, 0.25 μmol/ml, 0.3 μmol/ml, 0.35 μmol/ml, 및 0.38 μmol/ml를 포함함-를 갖는 크로마토그래피 겔이다.

특정 실시 형태에서, 핵산 리간드 밀도는 최대 10 μmol/ml이고, 이는 최대 5 μmol/ml, 1 μmol/ml 및 0.5 μmol/ml를 포함한다.

본 발명에 따른 친화성 지지체는 고체 지지체 또는 친화성 지지체에 대해 상기 설명된 특성 중 임의의 것을 가질 수 있다.

따라서, 특정 실시 형태에서, 친화성 지지체는 크로마토그래피, 여과 또는 고체-상 추출 공정에 사용될 수 있는 겔일 수 있고, 이는 아가로오스 겔, 덱스트란 겔 및 실리카 겔, 및 이의 유도체로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

실시에에서 설명된 바와 같이, 친화성 지지체는 핵산이 고정된 고 가교된 아가로오스 겔일 수 있다. 바람직하게는 친화성 지지체는 친화성 크로마토그래피 공정에 사용할 수 있는 겔(즉, 고정상)이다.

본 발명에 따른 친화성 지지체는 표면에 본 발명의 상세한 설명에서 언급한 바와 같이 임의의 종류의 핵산 리간드를 포함할 수 있다.

특정 실시 형태에서, 본 발명에 따른 친화성 지지체는 핵산 리간드가 상기 제시된 화학식(Ⅱ)의 압타머인 것을 특징으로 한다.

특정 실시 형태에서, 본 발명에 따른 고체 친화성 지지체는 아래의 화학식(Ⅲ)로 나타낼 수 있다:

여기에서,

- [SUP]는 친화성 지지체의 고체 지지체를 나타내고,

- [SPAC]n 및 [NUCL]은 이전에 기술한 정의와 일치한다. 즉, -NH-(SPAC)_n-NUCL은 다음의 핵산 압타머를 나타낸다:

· n은 0 또는 1과 같은 값이고,

· SPAC는 스페이서 쇄를 나타내고,

· NUCL은 특히 표적 분자와 결합하는 핵산을 나타내고, 상기 핵산은 5 내지 120 개의 뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명에 따른 또 하나의 주제는 핵산 리간드와 표적 분자 사이에 형성된 복합체이고, 상기 복합체는 상기 정의한 바와 같이 고체 지지체의 표면에 형성된다. 상기 복합체는 표적 분자와 핵산 리간드 사이의 비공유결합성 상호작용으로 인해 필수적으로 야기된다.

본 발명의 추가 주제는 이전에 설명한 바와 같이 표적 분자를 정제하거나 검출하는 친화성 지지체의 사용에 관한 것이다. 표적 분자의 정제의 맥락에서, 본 발명에 따른 지지체는 여과, 크로마토그래피 또는 고체-상 추출 공정 단계에서 고정상으로서 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 정의한 바와 같이 친화성 지지체를 갖는 표적 분자를 정제하는 공정에 관한 것이며, 다음의 단계를 포함한다:

a) (ⅰ) 상기 지지체에 그래프팅된 핵산 및 (ⅱ) 상기 표적 리간드 사이의 복합체를 형성하기 위하여 본 발명의 상세한 설명에서 정의한 바와 같이 친화성 지지체와 접촉한 관심있는 표적 분자를 포함하는 정제될 조성물을 준비하는 단계, 및

b) a) 단계에서 형성된 복합체로부터 표적 분자를 방출하는 단계 및 정제된 표적 분자를 회수하는 단계.

하나의 특정 실시 형태에서, 공정은 단계 a')을 포함하고, 단계 a'은 단계 a)에 따르고 단계 b)을 진행하고, 이것은 세척 버퍼를 사용하여 친화성 지지체를 세척하는 단계를 구성한다.

실시예의 단계 a')에서 높은 소수성, 특히 고농도의 플로필렌 글리콜을 갖는 세척 버퍼의 사용은 동시에 검출될 수 있는 친화성 지지체에 대한 표적 리간드의 결합에 영향을 미치지 않으면서, 친화성 지지체에 비-특이적으로 결합하는 물질을 효율적으로 제거할 수 있을 것이다.

따라서, 단계 a')에서, 버퍼 용액의 총 부피에 대하여 적어도 20 부피%의 프로필렌 글리콜의 최종 함량을 갖는 세척 버퍼가 바람직하게 사용된다.

본 발명에 따르면, 버퍼 용액의 총 부피에 대하여, 적어도 20 부피%의 프로필렌 글리콜의 최종 함량을 갖는 세척 버퍼는 적어도 25 부피%, 30 부피%, 35 부피%, 40 부피%, 45 부피%, 50 부피%, 55 부피%, 또는 60 부피%의 프로필렌 글리콜의 최종 함량을 갖는 세척 버퍼를 포함한다.

바람직하게는, 공정의 단계 a')에서 사용된 세척 버퍼는 최대 50%의 프로필렌 글리콜의 최종 함량을 갖는다. 유리하게도, 공정의 단계 a')에서 사용된 세척 버퍼는 20% 내지 50%, 바람직하게는 30% 내지 50%의 프로필렌 글리콜의 최종 함량을 갖는다.

하나의 특정 실시 형태에 따르면, 단계 a')에서 사용된 세척 버퍼는 실시예에서 설명한 바와 같이 NaCl 및 프로필렌 글리콜 모두를 포함한다.

더욱이, 상기 정제 공정의 특정 실시 형태의 단계 b)는 2가-이온-킬레이트제, 바람직하게는 EDTA를 포함하는 용출 버퍼(elution buffer)와 친화성 지지체를 접촉시켜서 수행된다.

설명한 대로, 용출 버퍼는 적어도 1 mM 및 최대 30 mM의 EDTA의 최종 농도를 포함할 수 있다.

표현 "적어도 1 mM"은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 mM을 포함한다.

표현 "최대 30 mM"은 최대 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 또는 11 mM을 포함한다.

바람직하게는, 세척 단계에서 설명한 바와 같은 동일한 종류일 수 있는, NaCl 및 프로필렌 글리콜의 혼합물을 포함하는 버퍼는 친화성 지지체의 재생에 사용된다.

본 발명의 목적 및 본 발명에 포함된 상기 설명된 다양한 주제에서, 본 명세서에서 사용된 용어 "표적 분자" (또는 "표적 물질 또는 아니면 "표적 리간드")는 특히 압타머에 결합할 수 있는 분자를 나타낸다. 핵산, 단백질 또는 유기 또는 무기 물질의 문제일 수 있다. 단백질은 임의의 종류의 단백질, 특히 플라즈마 단백질일 수 있다.

본 발명에 따르면, 용어 "플라즈마 단백질"은 혈장에 포함되는 모든 단백질, 특히 산업용 또는 치료적으로 관심있는 임의의 단백질을 의미하는 것이다. 혈장 단백질은 항체, 알부민, 알파-마크로글로블린, 항키모트립신, 항트롬빈, 항트립신, Apo A, Apo B, Apo C, Apo D, Apo E, Apo F, Apo G, 베타-XIIa, C1-억제제, C-반응성 단백질, C7, C1r, C1s, C2, C3, C4, C4bP, C5, C6, C1q, C8, C9, 카복시펩티다아제 N, 세룰로플라즈민, 인자 B, 인자 D, 인자 H, 인자 I, 인자 IX, 인자 V, 인자 VII, 인자 VIIa, 인자 VIII, 인자 X, 인자 XI, 인자 XII, 인자 XIII, 피브리노겐, 피브로넥틴, 합토글로빈, 헤모펙신, 헤파린 코펙터 II, 히스티딘 리치 GP, IgA, IgD, IgE, IgG, ITI, IgM, 키니나아제 II, HMW 키니노겐, 라이소자임, PAI 2, PAI I, PCI, 플라즈민, 플라즈민 억제제, 플라즈미노겐, 프리알부민, 프리칼리크레인, 프로퍼딘, 프로테아제 넥신 INH, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 프로트롬빈, TFPI, 싸이올-프로테이나아제, 트롬보모듈린, 조직 인자 (TF), TPA, 트랜스코발라민 II, 트랜스코르틴, 트랜스페린, 비트로넥틴, 및 폰 빌레브란트 인자를 포함한다.

특히, 플라즈마 단백질은 응고 단백질, 즉 혈전의 형성을 일으키는 단계적 연쇄 반응(cascade reactions)의 쇄와 관련된 플라즈마 단백질을 포함한다. 응고 단백질은 인자 I (피브리노겐), 인자 II (프로트롬빈), 인자 V (프로악셀레린), 인자 VII (프로콘버틴), 인자 VIII (항-헤모필릭 인자 A), 인자 IX (항-헤모필릭 인자 B), 인자 X (스튜어트 인자), 인자 XI (로젠탈 인자 또는 PTA), 인자 XII (하게만 인자), 인자 XIII (피브린 안정화 인자 또는 FSF), PK (프리칼리크레인), HMWK (고-분자-량 키니노젠), 조직 트롬보플라스틴, 헤파린 코펙터 II (HCII), 단백질 C (PC), 트롬보모듈린 (TM), 단백질 S (PS), 폰 빌레브란트 인자 (vWF) 및 외인계 응고 억제제 (TFPI), 또는 기타 조직 인자를 포함한다.

특정 실시 형태에서, 플라즈마 단백질은 효소 활성을 갖는 응고 단백질을 포함한다.

효소 활성을 갖는 응고 단백질은 인자 II (프로트롬빈), 인자 VII (프로콘버틴), 인자 IX (항-헤모필릭 인자 B), 인자 X (스튜어트 인자), 인자 XI (로젠탈 인자 또는 PTA), 인자 XII (하게만 인자), 인자 XIII (피브린 안정화 인자 또는 FSF) 및 PK (프리칼리크레인)을 포함한다.

특정 실시 형태에서, 플라즈마 단백질은 천연 또는 재조합 인간 플라즈마 단백질을 포함한다.

바람직한 실시 형태에서, 플라즈마 단백질은 천연 또는 재조합 인간 인자 Ⅶ이다.

본 발명은 다음의 실시예에 의하여 또한 설명되지만, 이에 제한되지는 않는다.

실시예

실시예 1: 친화성 지지체의 획득

- 그래프팅 버퍼: 100 mM 아세트산나트륨, pH =4.2.

- 그래프팅 버퍼에 2.5 g/l의 압타머 1595 μl, 즉 압타머 4 mg의 제조.

- 그래프팅을 위하여 다음의 각각이 사용됨:

a) 제1 친화성 지지체의 제조용으로서, 5' 말단에 친수성 C11 (11-아미노-3,6,9-트리옥사운데칸-1-일)(11-amino-3,6,9-trioxaundecan-1-yl) 쇄를 포함하는 서열번호 1의 Mapt 2CS 폴리뉴클레오티드를 포함하는 압타머;

b) 제2 친화성 지지체의 제조용으로서, 5' 말단에서 12개의 메틸렌(CH₂)으로 구성된 스페이서 쇄(C12 스페이서)와 결합되고, 3' 말단에서 올리고-dT와 결합된, 서열번호 2의 "Mapt 1.2" 폴리뉴클레오티드를 포함하는 압타머;

c) 제3 친화성 지지체의 제조용으로서, 5' 말단에서 6개의 메틸렌(CH₂)으로 구성된 스페이서 쇄(C6 스페이스)와 결합된, 서열번호 1의 "Mapt 2CS" 폴리뉴클레오티드를 포함하는 압타머;

- 1 mM HCl로 세정한 후, 그래프팅 버퍼로 세정함으로써, NHS-활성화된 카복실산 기를 포함하는 겔, 즉 "NHS 활성화 세파로오스 4 패스트 플로우(NHS Activated Sepharose 4 fast flow) (GE)" 예비활성화된 겔 1 ml을 제조함.

- 버퍼 용액에서의 압타머 제조시 pH는 4.2인 것으로 확인되었다.

- 압타머 제조물을 1 ml의 예비활성화된 겔과 혼합하였다. 예비활성화된 겔은 압타머의 존재 하에서 4 ℃에서 48시간(+/- 2 시간)동안 배양되었다.

- pH=9, 200 mM 붕산염 버퍼의 반응 부피의 절반(797 μl)을 교반하면서 첨가하였고, 다음으로 혼합물을 4 ℃에서 교반하면서 8 시간 동안 배양하였다.

- 상청액을 회수하고, 그래프팅되지 않은 압타머의 양을 분석하였다.

- 커플링 반응을 차단하기 위하여, pH=8.5, 0.1 M Tris-HCl 2 ml를 4 ℃에서 2 시간 30분 동안 교반하면서 첨가하였다.

- 상청액의 첨가/교반/제거의 3회 사이클은 다음을 포함한다: 즉시 사용(ready-to-use) 친화성 지지체를 얻기 위하여, 1) 0.1 M Tris-HCl 1 ml, pH=8.5, 이후 2) 0.1 M 아세트산나트륨 1 ml, 0.5 M NaCl, pH=4.0가 실시되었다.

모든 점에서, "NHS 활성화된 세파로오스 4 패스트 플로우(GE)" 겔은 그 표면에 NHS-활성화된 카복실산 작용기를 갖는 가교된 아가로오스 겔인 것을 보여준다. 카복실산 작용기는 6-아미노헥사노에이트를 그래프팅하여 겔의 표면에 유도하였다. 이러한 예비활성화된 아가로오스 겔은 2011년 3월 기술 지시 매뉴얼 제71-5000-14 AD호에 기술되어 있고, GE 헬스케어에 의해 공개되었다. "NHS 활성화된 세파로오스 4 패스트 플로우" 겔은 겔의 16 내지 23 μmol/m 범위의 활성화된 카복시산 작용기 밀도를 갖는다.

결과는, 커플링 반응의 마지막에, 반응 배지의 상청액이 검출될 수 있을 정도의 핵산 압타머 양을 포함하지 않고, 즉 사용된 분석 조건 하에서, 0.08 mg/l 미만의 양의 압타머를 포함한다는 것을 보여준다.

이러한 결과들로부터, 그래프팅 수율이 100%, 또는 100%에 매우 가깝다는 것을 추정할 수 있다.

실시예 2: 유전자 변형 래빗 밀크에서 생산된 재조합 인간 인자 Ⅶ를 정제하기 위한 친화성 지지체의 사용

- 겔: XK-16 컬럼(GE)에 4 mg/ml로 포장된, 실시예 1에 개시된 방법으로 제조된 Mapt 2CS-PEG(C11)로 그래프팅된 1 ml.

- 유전자 변형 래빗 밀크(FⅦ-TG)에서 생산된, 정제된 재조합 인간 인자 FⅦ 조성물의 주입: FⅦ-TG 100 또는 200 또는 1,000 μg.

주입에 사용된 FⅦ-TG 조성물은, 제형에 최초로 함유된 시트르산을 CaCl₂로 중화하고 이하를 얻기 위하여 제형 버퍼를 변경하여 제조된다: 35 내지 40 mM의 NaCl 및 3.2 내지 4 mM의 MgCl₂.

- 크로마토그래피에 사용된 버퍼: 50 mM Tris/50 mM NaCl/10 mM CaCl₂/4 mM MgCl₂.

- 유속 : 0.5 ml/min

- 용출 버퍼 : 50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH=7.4

- 세척 또는 재생 버퍼: 1 M NaCl/50% 프로필렌 글리콜

- 각 테스트 사이에 사용된 살균 용액: 0.1 또는 0.5 M NaOH(1 ml) + 1 M NaCl/50% 프로필렌 글리콜(2×1 ml).

결과들은 도 1 내지 5에 나타낸다.

도 1 및 2는 거의 모든 인간 인자 Ⅶ가 정제될 조성물이 친화성 지지체를 통과하는 순간에, 출발 조성물에 함유된 인자 Ⅶ의 양에 상관없이 친화성 지지체에 잔류된다(retain)는 것을 보여준다. 정제되는 인자 Ⅶ의 두 가지 양(100 μg 및 200μg)에 대하여, 출발 조성물에 함유된 인자 Ⅶ의 10 % 미만은 친화성 지지체에 잔류되지 않는다는 것이 측정되었다. 도 1 및 도 2는 또한 좁은 용출 피크를 보여주는데, 이는 본 발명의 친화성 지지체의 우수한 크로마토그래피 특성을 나타내는 것이다.

도 3은 1 mg의 인간 인자 Ⅶ를 함유하는 출발 조성물로 얻어진 크로파토그래피 프로파일을 나타낸다. 도 3의 크로마토그래피 프로파일은 도 1 및 도 2에 나타낸 것과 매우 유사하고, 이는 본 발명의 친화성 지지체의 표적 리간드의 매우 높은 잔류 용량(retention capacity)을 나타내는 것이다.

도 4 및 도 5는 실시예 1에 기술된 방법으로 제조된 친화성 지지체에 200 μg(도 4) 및 1,000 μg(도 5)의 양의 인간 인자 Ⅶ의 정제에 의해 얻어지고, 0.5 M NaOH 및 50 % 프로필렌 글리콜의 혼합물을 포함하는 살균 용액으로 급격하게 살균 처리 단계를 거쳐서 얻어진 크로마토그래피 프로파일을 나타낸다. 얻어진 크로마토그래피 프로파일은 본 발명에 따른 친화성 지지체의 유해한 살균 처리를 견디는 능력을 나타낸다.

동일한 크로마토그래피 프로파일이 유전자 변형 인간 인자 Ⅶ의 정제 및 세척 및 살균 단계가 연속적으로 수행되어 얻어진다는 것이 명시된다. 이는 친화성 지지체의 우수한 안정성을 나타내고, 이는 관심이 있는 표적 리간드가 매우 재현가능하게 정제되는 것이 가능하게 한다.

실시예 3: 사용된 압타머 양의 작용으로서의 그래프팅 수율 및 얻어진 친화성 지지체의 적재용량

그래프팅 수율에 대한 압타머 양의 영향력 및 친화성 지지체의 적재용량이 Mapt 2CS-(친수성 C11) 및 Mapt 2.2CS-(친수성 C11) 압타머를 대상으로 연구되었다. 사용된 그래프팅 프로토콜은 실시예 1에 기술된 것과 동일하다. Mapt 2.2CS-(친수성 C11) 압타머는 서열번호 3의 Mapt 2.2CS와 11-(트리플루오로아세트아미도)-3,6,9-트리옥사운데칸-1-일[(2-시아노에틸)(N,N-디이소프로필)]포스포라미다이트(Link Technologies)의 커플링의 결과물이고, 이어서 시아노에틸기의 산화 및 제거에 의한 포스포디에스테르기의 생성 및 스페이서 쇄의 말단에 존재하는 1차 아민 작용기의 디프로텍션(deprotection)이 이어진다. Mapt 2.2CS는 인자 Ⅶ를 향한다(directed agains).

겔 ml 당 FⅦ mg으로 나타내는, 친화성 지지체의 적재용량(또는 다른 말로 잔류 용량)은, "Tp5" 버퍼 (50 mM Tris, 10 mM CaCl₂, pH 7.5)에서 재조합 인간 FⅦ 조성물을 주입하여 측정되었다.

아래 표 1 및 2는 겔 ml 당 반응에 사용된 압타머 양의 작용으로서 Mapt 2CS-PEG(C11) 및 Mapt 2.2CS-PEG(C11) 압타머를 'NHS 활성화된 세파로오스 4 패스트 플로우(GE)" 예비활성화된 겔에 그래프팅 시키는 반응의 수율을 제시한다. 수율은 정량화 PCR에 의하여 커플링 반응의 후반에 상청액에 존재하는 압타머의 양을 정량화하여 측정하였다.

겔 ml 당 그래프팅된 압타머의 최종 양은 또한 아래 표 1 및 2에 나타낸다.

표 1: 커플링 반응의 수율에 대한 겔 ml 당 Mapt 2CS 압타머 양의 영향 및 얻어진 친화성 지지체의 특징

겔 mg/ml에서 사용된 압타머의 양	커플링 반응 수율	겔 mg/ml에서 그래프팅된 압타머의 양	겔 μmol/ml에서 그래프팅된 압타머의 양	압타머와 커플링된 카복실산 사이트 퍼센트
0.1	99.97%	0.1	0.007	0.04%
0.2	99.96%	0.2	0.014	0.07%
0.6	99.95%	0.6	0.042	0.21%
0.8	99.94%	0.8	0.056	0.29%
1.0	100%	1.0	0.07	0.36%
2.0	100%	2.0	0.12	0.6%
3.5	100%	3.5	0.23	1.2%
6.0	97%	5.8	0.39	2%

표 2: 커플링 반응의 수율에 대한 겔 ml 당 Mapt 2.2CS 압타머 양의 영향 및 얻어진 친화성 지지체의 특징

겔 mg/ml에서 사용된 압타머의 양	커플링 반응 수율	겔 mg/ml에서 그래프팅된 압타머의 양	겔 μmol/ml에서 그래프팅된 압타머의 양	압타머와 커플링된 카복실산 사이트 퍼센트
0.1	100%	0.1	0.007	0.04%
3.5	100%	3.5	0.23	1.2%
6.0	92.6%	5.55	0.37	1.9%

Mapt 2.2CS-PEG(11) 및 Mapt 2CS-PEG(C11) 압타머에 대하여 얻어진 커플링 수율은 시험된 모든 압타머 양에 대하여 90% 내지 100%이다. 주목할 만하게, 겔 ml 당 0.4 μmol까지 그래프팅하는 것이 가능하고, 이는 겔의 표면에 2% 존재하는 활성화된 카복실산 작용기의 퍼센트 작용기화(functionalization)에 상당한다.

재조합 인간 FⅦ에 대한 친화성 지지체의 적재 용량은 겔 ml 당 그래프팅된 압타머의 양에 따라 직선형(linear fashion)으로 변한다. 지지체의 적재 용량의 포화의 효과는 없으며, 이에 따른 압타머의 기능성 손실의 효과 없다는 것이 그래프팅된 압타머의 고 용량에 대하여 관찰된다.

이들 결과에 비추어, 6 mg/ml 초과의 그래프팅된 압타머 밀도를 갖는 친화성 지지체를 획득하는 것이 가능할 수 있고, 이는 겔 ml 당 재조합 인간 FⅦ 8 mg을 초과하는 FⅦ에 대한 적재용량을 갖는다.

아래 표 3은 이들의 표면에서 그래프팅된 압타머 수의 작용으로써 친화성 지지체의 적재용량을 제공한다.

표 3: 획득된 친화성 지지체의 적재용량

	Mapt 2CS-PEG(C11)				Mapt 2.2CS-PEG(C11)
겔 mg/ml에서 그래프팅된 압타머의 양	0.1	1.00	3.50	5.80	1.00	3.50	5.60
겔 μmol/ml에서 그래프팅된 압타머의 양	0.007	0.07	0.23	0.39	0.07	0.23	0.37
겔의 FⅦ/ml에서 발현된, 인간 FⅦ 적재용량	0.05	1.00	3.60	5.40	1.6	5.2	8.0

실시예 4: NHS 기로 예비활성화된 고체 지지체 상에 핵산을 화학적 그래프팅시키는 비교 테스트

4.1 다양한 pH 조건을 사용한 비교 테스트

실시예 1에서 사용된 출발 예비활성화된 지지체의 그래프팅에 대한 비교 테스트는, 중성 또는 약알칼리성 pH 조건하에서, 이하 주어진 표 4에 기술된 것처럼 실시되었다.

Mapt 2CS	변형 (스페이서 성질)	테스트	압타머양	조건: 그래프팅 버퍼
올리고1	5'아민 C6 스페이서	테스트1	6.5 mg	100 mM MOPS, 10 mM CaCl₂, pH 7.0 (조건 1) 100 mM MOPS, 10 mM CaCl₂, 0.5 M NaCl, pH 7.0 (조건 2)
올리고1		테스트2	6.5 mg
올리고1		테스트3	6.5 mg
올리고4	5'아민 C12 스페이서 3'dT	테스트4	3.5 mg	0.2 M NaHCO₃ _, 0.5 M NaCl, pH 8.3 (조건 3)
올리고4	5'아민 C12 스페이서 3'dT	테스트5	3.5 mg	0.2 M NaHCO₃ _, 2 M NaCl, pH 8.3 (조건 4)
올리고5	5'아민 친수성 C11 스페이서	테스트5	6.5 mg	100 mM MOPS, 10 mM CaCl₂, 0.5 M NaCl, pH 7.0 (조건 2)

다음 프로토콜이 사용되었다:

- 겔 1 ml를 1 mM HCl 15ml로 헹구고 다음으로 그래프팅 버퍼 7 ml로 헹구었다. 1 g/l 로 Mapt 2CS 6.5 ml(또는 3.5 ml)를 첨가하고, 실온에서 4 시간 동안 Mapt 2CS와 함께 겔을 배양함.

- 50 mM Tris 버퍼, pH=7.4로 활성화된 사이트를 중화시킴.

그래프팅 단계 후 컬럼 배출물에서 그래프팅 되지 않은 압타머의 양을 측정하였다. 결과들은, 사용된 표 1에 기술된 그래프팅 조건에도 불구하고, 그래프팅 수율이 0 % 내지 최대 10% 범위인 것을 보여준다. 고스(Goss) 등(상기)에서 관찰되었던 것과 대조적으로, 높은 염도는 커플링 수율을 증가시키기에 충분하지 않다.

4.2. 이가 양이온을 첨가하거나 NaCl 을 첨가하여 핵산의 음전하를 중화시키는 동안의 비교 테스트

다음 프로토콜이 사용되었다:

- 겔 100 μl를 1 mM HCl 15ml로 행구고 다음으로 그래프팅 버퍼 700 μl로 헹구었다/ 130 mg/l으로 Mapt 2CS 650 μl(올리고 5)를 첨가하고, 실온에서 4 시간 동안 Mapt 2CS와 함께 겔을 배양함.

- 사용된 조건:

■ 조건 1: 92 mM MOPS 버퍼, pH=7.0, 200 mM CaCl₂, 200 mM MgCl₂

■ 조건 2: 92 mM MOPS 버퍼, pH=7.0, 200 mM CaCl₂, 200 mM MgCl₂

■ 조건 3: 0.2 M NaHCO₃, 0.5 M NaCl, pH 8.3

■ 조건 4: 0.2 M NaHCO₃, 2 M NaCl, pH 8.3.

그래프팅 단계 후 컬럼 배출물에서 그래프팅 되지 않은 압타머의 양을 측정하였다. 결과들은, 상기에서 기술된 그래프팅 조건이 무엇이든지, 그래프팅 산출율이 0% 내지 최대 10% 범위인 것을 보여준다.

상기에서 나타낸 모든 실험들의 결과는, 선행기술에서 또는 예비활성화된 겔의 지시서(instruction leaflets)에서 추천하는 염기성 또는 중성 pH 하에서 커플링 단계를 수행하는 것은 예비활성화된 겔에서의 압타머의 커플링 수율이 매우 낮다는 것, 즉 10% 미만이라는 것을 보여준다.

2 M 까지 농도범위에서 NaCl 용액을 사용하거나, 압타머의 음전하를 마스킹할 수 있는 이가 양이온 염을 사용하여, 이온 강도를 강화하는 것은 커플링 수율을 증가시킬 수 없다.

당업자가 기대할 수 있는 것과는 대조적으로, 산성 pH의 존재하에서 커플링 단계를 수행하는 것은 압타머의 표적 단백질에 결합하기 위한 압타머의 용량에 해를 미치지 않으면서 예비활성화된 지지체에 압타머를 커플링하는 것을 유의적으로 증가시킬 수 있다.

실시예 5: 본 발명에 따른 커플링 반응을 실시하기 위한 파라미터들의 조정

pH, 온도 및 반응 지속시간의 영향은, 겔("NHS-활성화된 세파로오스 4 패스트 플로우")의 활성화된 카복실산 기능기와 Mapt 2CS-PEG(C11) 압타머의 스페이서 쇄에 존재하는 지방족 1차 아민 작용기의 커플링 반응을 제어하는 파라미터를 결정하기 위하여 평가되었다.

다음 프로토콜이 이어졌다:

- 그래프팅 버퍼는 100 mM 아세트산나트륨을 사용하여 원하는 pH로 조정하면서 제조되었고, 반응이 pH=8.3에서 수행될 때는 예외적으로 NaHCO₃ 버퍼를 제조하였다.

- 그래프팅 버퍼에 2 g/l 농도로 Mapt 2CS-PEG(C11) 압타머 용액을 제조하였다.

- 압타머 용액 1 ml를 겔 1 ml와 혼합하였고, 원하는 온도에서 교반하면서 배양하였다. 커플링 반응의 진행은 상청액에 존재하는 압타머를 정량화하여 모니터링한다.

- 반응의 동적 모니터링(kinetic monitoring)의 후반에, pH 9의 200 m 붕산염 버퍼 1 ml를 반응배지에 교반하면서 첨가하고, 이어서 최종 혼합물을 4 ℃에서 교반하면서 3 시간 동안 배양하였다. 상청액은 최종 분석을 위하여 옮겨두었다. 겔의 잔여 카복실산 작용기의 중화는 4 ℃에서 2시간 30분 동안 교반하면서 pH=8.5, 0.1 M에서 Tris-HCl 버퍼 2 ml를 추가하여 실시되었다.

- 추가/교반/상청액 이동의 3 주기는 다음을 포함하여 실시되었다: 1) pH=8.5, 0.1 M에서 Tris-HCl 1ml, 다음으로 2) 0.1 M 아세트산나트륨 1ml, 0.5 M NaCl, pH=4.0.

- 상청액을 옮겨두었다. 최종 겔은 4 ℃ 저장용 0.2 % 아자이드가 보충된 Tp1 버퍼에 넣어 저장하였다.

온도 작용에 따른 커플링 반응의 동적 모니터링의 결과는, 반응시간 및 pH와 함께 아래 표 5에 나타낸다.

표 5: 반응 온도(RT: 실온), pH, 반응 시간의 영향

	pH	T℃	시간	반응 수율(%)
pH 영향	3.8	5℃	48h	99.8
	4.3	5℃	48h	98.4
	4.8	5℃	48h	75.9
	5.6	5℃	48h	64.9
	8.3	5℃	48h	10
온도 및 반응시간의 영향	4.3	5℃	24h	99.5
	4.3	5℃	2h	100
	4.3	5℃	4h	100
	4.3	5℃	6h	100
	4.3	5℃	8h	100
	4.3	5℃	24h	100
	4.3	5℃	48h	97.8
	4.3	RT*	1h	100
	4.3	RT*	2h	100
	4.3	RT*	3h	100
	4.3	RT*	3h	99.8

상기 표 5에 나타난 것처럼, pH는 본 발명에 따른 커플링 반응을 실시하기 위한 결정적인 파라미터이다.

선행 기술에서 기술된 조건에 따라, 즉 pH 8.3의 염기성에서 반응을 실시하는 것은 최대 10%의 매우 낮은 수율을 가져온다. pH를 감소시키는 것은 반응 수율을 유의적으로 개선할 수 있다. 적어도 98 %의 수율은 특히 대략 3.8 내지 4.3의 pH에서 관찰된다. 이러한 결과는 전적으로 놀랍다: 당업자는 산 가수분해에 의한 핵산의 분해 때문에 및 1차 아민의 반응성에서의 감소 때문에 이들 pH에서 낮은 커플링 수율을 기대할 것이다. 이러한 실험결과들에 비추어, 커플링 반응은 낮은 온도 또는 실온을 구별하지 않고 실시할 수 있다는 것이 명백하다.

주목할 만하게도, pH=3.8 또는 pH=4.3의 실온에서 획득된 친화성 지지체는 pH=4.2 및 5 ℃에서 획득된 지지체와 동등한 재조합 인간 인자 Ⅶ 적재 용량(즉, 잔류 용량)을 가진다. 일반적으로, 얻어진 적재 용량은 특히 높고, 이는 압타머의 높은 그래프팅 정도 뿐만 아니라, 압타머의 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 압타머의 용량의 유지를 반영한다. 다시 말해, 실온 및 4.5 미만의 pH에서 지지체의 활성화된 카복실산 작용기와 압타머의 스페이서에 존재하는 1차 아민 작용기 사이의 커플링 반응을 수행하는 것은, 100 %에 가까운 그래프팅 수율을 획득하는 것 뿐만 아니라, 압타머의 작용 완전성(functional integrity)을 유지하는 것을 가능하게 한다.

실시예 6: 친화성 지지체의 추가 실시형태

다른 친화성 지지체들은 (ⅰ) 그래프팅 조건 및 또한 (ⅱ) 사용된 압타머의 형태를 변화시켜서 제조하였다.

6.1 그래프팅된 압타머 형태

압타머 형태와 관련하여, DNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 압타머들 및 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 압타머들을 각각 사용하였다. 더욱이, 일부 압타머들은, 폴리뉴클레오티드가 그들의 5' 말단을 따라 스페이서 쇄와 결합되고, 한편, 다른 압타머들은, 폴리뉴클레오티드가 그들의 3' 말단을 따라 스페이서 쇄와 결합된다. 마찬가지로, 친수성 스페이서 쇄 또는 소수성 스페이서 쇄를 포함하는 압타머들을 사용하였다.

실시예 6에서 사용된 압타머들은 아래와 같다:

- 서열번호 1의 "Mapt 2CS" DNA 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 그 5' 말단에 실시예 1의 단락 "a)"에서 개시된 제1 친화성 지지체의 제조에서 기술된 친수성 C11 스페이서 쇄를 포함하는 압타머, 상기 압타머는 표 6에서 "Mapt 2CS 올리고 5(5' 아민 친수성 C11)"로 나타냄;

- 서열번호 1의 "Mapt 2CS" DNA 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 그 5' 말단에 실시예 1의 단락 "c)"에서 개시된 제3 친화성 지지체의 제조에서 기술된 소수성 C6 스페이서 쇄를 포함하고, 그 3' 말단에 역위된(inverted) 디옥시리보티미딘 잔기(3'-dT-5')를 포함하는 압타머, 상기 압타머는 표 6에서 "Mapt 2CS 올리고 2(5' 아민 및 3'dT1)"로 나타냄;

- 서열번호 1의 "Mapt 2CS" DNA 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 그 5' 말단에 실시예 1의 단락 "b)"에서 개시된 제2 친화성 지지체의 제조에서 기술된 소수성 C12 스페이서 쇄를 포함하는 압타머, 상기 압타머는 표 6에서 "Mapt 2CS 올리고 3(5' 아민 C12)"로 나타냄;

- 서열번호 1의 "Mapt 2CS" DNA 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 그 3' 말단에 실시예 1의 단락 "c)"에서 개시된 제3 친화성 지지체의 제조에서 기술된 소수성 C6 스페이서 쇄를 포함하는 압타머, 상기 압타머는 표 6에서 "Mapt 2CS 올리고 7(3' 아민 C6)"로 나타냄;

- 서열번호 4의 "Mapt 항-FIXa RNA" RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 그 5' 말단에 실시예 1의 단락 "a)"에서 개시된 제1 친화성 지지체의 제조에서 기술된 친수성 C11 스페이서 쇄를 포함하고, 그 3' 말단에 역위된 디옥시리보티미딘 잔기(3'-dT-5')을 포함하는 압타머, 상기 압타머는 표 6에서 "Mapt 항-FIXa RNA 5' 아민 친수성 C11"로 나타냄.

서열번호 5의 "Mapt 1.2CSO" DNA 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 그 5' 말단에 실시예 1의 단락 "a)"에서 개시된 제1 친수성 지지체의 제조에서 기술된 친수성 C11 스페이서 쇄를 포함하며, 압타머가 그 위에 그래프팅되는 친화성 지지체를 또한 제조하였고, 상기 압타머는 "Mapt 1.2CS 올리고 5(5' 아민 친수성 C11)"로 나타낸다. 후자 압타머에 대한 결과는 아래 표 6에 나타내지 않는다.

6.2. RNA 압타머 그래프팅 조건

서열번호 5의 RNA 압타머는 아래 조건하에서 그래프팅되었다:

- RNA 압타머 300 μg을 최종 겔 농도 0.6 g/l의 겔 500 μl와 함께 배양하였다.

- 그래프팅 반응은 17 ℃(RT) 및 pH 4.2에서 2.5 시간 동안 실시되었다;

- 이후, 반응은 17 ℃ 및 pH 9에서 2.5 시간 동안 200 mM 붕산염 버퍼로 중화시켜서 정지되었다;

- 상청액에서 그래프팅 되지 않은 압타머의 잔량을, 아가로오스 겔 전기영동법 및 GelRed^®(3.5 %에서)을 이용한 염색법에 의하여, 그래프팅 수율을 결정하기 위하여 측정하였고, 이후, 동일한 전기영동 겔의 다른 레인들 상에 적재된 RNA 압타머의 공지된 양을 보정 범위로 하여 비교하였다.

결과들은 수율이 99%를 초과하였다는 것을 보여준다. 이들 결과들은 5 미만의 pH에서의 그래프팅 공정이 모든 형태의 핵산 리간드의 그래프팅에 효율적이라는 것을 보여주고, 상기에서 이들 핵산 리간드들은 DNA 폴리뉴클레오티드 또는 RNA 폴리뉴클레오티드(및 그러므로 또한 DNA/RNA 하이브리드 폴리뉴클레오티드를 포함하는 리간드)를 포함하고, 변형된 염기를 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 리간드를 포함하고, 변형된 염기를 갖는 RNA 뉴클레오티드를 포함한다.

6.3. 그래프팅 반응의 효율성

커플링 반응은, 시간, 온도 및 pH에 관한 특정 지시사항을 제외하고, 실시예 5에서 기술된 것처럼 실시되었다. 결과들은 아래 표 6에 나타낸다.

압타머	그래프팅 조건* (시간; 온도;pH)	목표 그래프팅 정도 (겔 mg/ml)**	그래프팅 수율 (%(\)**
Mapt 2CS 올리고 5 (5'아민 친수성 C11)	48h; 5℃; pH 4.3	4.4	100
	48h; 5℃; pH 3.8	4.4	100
	2h; 5℃; pH 4.3	4.4	100
	1h; RT; pH 4.3	4.4	100
	2h; 5℃; pH 없음 중성	4.4	100
Mapt 2CS 올리고 2 (5'아민 C6 및 3'dT)	2h; RT; pH 4.3	0.7	100
Mapt 2CS 올리고 3 (5'아민 C12)	2h; RT; pH 4.3	0.7	100
Mapt 2CS 올리고 7 (3'아민 C6)	2h; RT; pH 4.3	0.8	100
Mapt 1.2CSO 올리고 5 (5'아민 친수성 C11)	2h; 5℃; pH 4.3	ND***	100
Mapt 항-FIXa RNA 5' 아민 친수성 C11 및 3'dT5'	2h; 5℃; pH 4.2	0.6	100

* 시간으로 나타낸 커플링 반응 시간; 섭씨 단위로 나타낸 온도 - RT = 실온 (18℃-25℃)

** 목표 그래프팅 정도는 그래프팅 수율 100%에 대하여 얻어진다. 그래프팅 수율은 실시예 3에 기술된 것처럼 측정되었다.

*** ND= 측정되지 않음

표 6의 결과들은 주어진 압타머에 대하여, 테스트된 조건들이 무엇이든지 100% 그래프팅 수율이 얻어진다는 것을 보여준다.

특히, 이들 결과들은 실시예 4의 결과들, 보다 구체적으로는, 극산성인 pH 3.8에서 조차도 최대 그래프팅 수율이 얻어지는 것을 보여주는, 표 5의 결과들을 확인해 준다. 이들 결과들은 또한 실온에서 실시되는 커플링 반응의 빠른 동역학(kinetic)을 확인해 준다.

또한, 커플링 반응에 이어서, pH 9에서의 중화 단계가 최대 그래프팅 수율을 획득하는데 필수적이지 않다는 것을 보여주는데, 이는 이들 조건 하에서의 그래프팅의 정도 및 그래프팅 수율이 중화단계가 실시될 때 관찰되는 것들과 동일하기 때문이다(상기 표 6 참조).

표 6의 결과들은 또한 압타머의 스페이서 쇄의 친수성 및 소수성 특성이 그래프팅 효율성에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다. 또한 친수성 또는 소수성 스페이서 쇄가 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단 또는 3' 말단에 결합할 때 그래프팅이 효율적이라는 것을 보여준다.

폴리브렌^®(헥사메트린 브로마이드, 1,5-디메틸-1,5-디아자운데카메틸렌 폴리메토브로마이드(1,5-dimethly-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide))와 함께 배양함으로써 DNA 폴리뉴클레오티드의 전하를 미리 중화시키는 것은 커플링 반응의 실시를 불가능하게 한다는 것이 추가된다.

6.4. 친화성 지지체의 작용성

상기 6.1에 기술된 "Mapt 2CS 올리고 5" 압타머가 고정된 친화성 지지체의 작용성(functionality)은 각각 다음의 커플링 반응 온도, 시간 및 pH 조건 하에서 테스트되었다.

- 조건 1: 48h, 5℃, pH 4.2;

- 조건 2: 48h, 5℃, pH 3.8;

- 조건 3: 2h, 5℃, pH 4.2; 및

- 조건 4: 1h, RT(실온), pH 4.2

상기 조건 1 내지 4의 각각에서 최종 농도가 4.4 mg/ml인 압타머로 그래프팅된 겔 500 μl가 테스트를 위하여 사용되었다.

크로마토그래피 지지체 각각에 대하여, 유전자 변형된 래빗 밀크(FⅦ-TG)에서 생산된, 정제된 재조합 인간 FⅦ의 조성물 2.7 mg이 주입되었다.

주입에 사용된 FⅦ-TG 조성물은 제형에 초기에 함유된 시트르산을 CaCl₂로 중화시키고, 이하를 얻기 위하여 제형 버퍼를 변형시켜서 제조된다: 35 내지 40 mM NaCl 및 3.2 내지 4 mM MgCl₂.

- 크로마토그래피에 사용된 버퍼: 50 mM Tris / 10 mM CaCl₂, pH 7.5

- 유속: 0.5 ml/min

- 용출 버퍼: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH=7.5

상기 기술된 커플링 조건 1 내지 4에 대하여 결과들을 도 6 내지 9에 각각 나타낸다.

커플링 조건 (시간; 온도; pH)	컬럼 상에 잔류되지 않은 FⅦ 분획물(%)	용출된 FⅦ 분획물(%)
1: 48h; 5℃; pH 4.2	5	95
2: 48h; 5℃; pH 3.8	24	76
3: 2h; 5℃; pH 4.2	15	85
4: 1h; RT; pH 4.2	5	95

도 6 내지 9 및 상기 표 7의 결과들은, 정제된 조성물이 친화성 지지체를 통과할 시점에, 거의 모든 인간 인자 Ⅶ가 친화성 지지체에 잔류된다는 것을 보여주고, 상당하지만 최대는 아닌 인자 Ⅶ의 잔류 정도가 관찰되는, 조건 2(48h, 5℃, pH 3.8)에 따른 그래프팅에 의해 제조된 친화성 지지체는 예외이다.

또한 결과들은 친화성 지지체에 잔류된 인간 인자 Ⅶ가 용출 단계에서 방출된다는 것을 보여준다.

이들 결과들은 완전한 작용성인 친화성 지지체가 그래프팅 조건 1 및 3-4를 사용하여 제조될 수 있다는 것을 보여주고, 이는 표적 분자를 잔류 및 이후 방출을 위하여 그래프팅 온도 및 시간 조건이 획득된 친화성 지지체의 용량의 관점에서 전적으로 결정되는 것이 아니라는 것을 의미한다.

특히, 단시간(1 시간) 및 높은 온도(실온)에 대한 압타머의 커플링 조건은 (ⅰ) 100% 압타머 그래프팅 수준을 가능하게 하고, (ⅱ) 표적 인간 인자 Ⅶ에 대한 그래프팅된 압타머의 결합 용량에 어떠한 손상도 가져오지 않는다는 것이 관찰된다.

반면에, pH 3.8에서 압타머와 커플링 되어 제조된 친화성 지지체로 얻어진 더 나쁜 결과들은, pH 조건이 그래프팅된 압타머의 완전성(integrity)을 유지하는데 중요하다는 것을 보여주고, 특히 그래프팅된 압타머가 표적 인간 인자 Ⅶ과 결합하는 능력을 유지하는데 중요하다는 것을 보여준다. 커플링 반응은 pH 3.8에서 수행될 때, 인간 인자 Ⅶ로 출발 샘플을 선택적으로 강화시키기 위한 작용성이 남아 있는 친화성 지지체가 얻어졌다. 그러나, 이와 같은 친화성 지지체는 인간 인자 Ⅶ를 정제하기 위한 산업 공정 상황에서는 유효하게 사용될 수 없는데, 이는 상당한 인자 Ⅶ의 손실(20% 이상)과 이에 따라 이러한 공정의 경제적으로 바람직하지 않은 특성 때문이다.

실시예 7: 생물학적 배지에의 접촉 및 강력한 살균 단계를 포함하는 산업 용도의 조건 하에서 친화성 지지체의 완전성 유지(1M 농도의 아세트산 나트륨)

실시예 7에서, 본 발명에서 규정된 친화성 지지체가, 산업 공정 조건하에서 수많은 횟수의 사용 후에도, 표적 단백질을 잔류 및 방출하는 그들의 용량을 보전한다는 것을 보여준다.

7.1. 그래프팅 지지체의 제조

3개의 그래프팅 지지체들은, 아래 3개의 압타머들 각각을 사용하여, 실시예 1에 기술된 것처럼 제조되었다.

- 그래프팅 지지체 1: 그 5' 말단에 친수성 C11(11-아미노-3,6,9-트리옥사운데칸-1-일(11-amino-3,6,9-trioxaundecan-1-yl)) 쇄를 포함하는 서열번호 1의 Mapt 2CS 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 압타머

- 그래프팅 지지체 2: 그 5' 말단에 친수성 C11(11-아미노-3,6,9-트리옥사운데칸-1-일) 쇄를 포함하는 서열번호 3의 Mapt 2.2CS 폴리뉴클레오티드를 포함하는 압타머, 및

- 그래프팅 지지체 3: 그 5' 말단에서 6개의 메틸렌(CH₂)으로 구성된 스페이서 쇄(C6 스페이서)와 결합된 서열번호 3의 "Mapt 2.2CS" 폴리뉴클레오티드를 포함하는 압타머.

그래프팅 수율은 각각 100 %(그래프팅 지지체 1), 93 %(그래프팅 지지체 2) 및 87 %(그래프팅 지지체 3)이었다.

제조된 친화성 지지체의 이론적인 정적 용량(static capacity), 즉, 그래프팅된 압타머 각각이 인간 FⅦ 분자와 결합하면 친화성 지지체에 잔류되어야 하는 인간 FⅦ의 양은 각각 지지체 ml 당 18.7 mg(지지체 1), 17.3 mg/ml(지지체 2), 및 16.3 mg/ml(지지체 3)이었다.

7.2 인간 FⅦ를 정제하기 위한 공정의 작동 조건

인간 FⅦ가 다량 함유된(풍부한) FⅦ-TG 조성물이 사용되었고, 최종 FⅦ-TG 농도는 대략 50,000 ppm이고, 상기 조성물은 FⅦ의 des-gla 형태(FⅦ의 불활성 형태)를 대부분 포함하고, 상기 조성물은 대략 0.4의 FⅦ 특정 활성을 갖는다(아미돌리틱 활성/항원으로 표현된 활성).

일반 프로토콜은 다음과 같다:

- TP4 버퍼에서 지지체의 평형(50 mM Tris, 10 mM CaCl₂, 4 mM MgCl₂, pH 7.5), 그래프팅된 지지체 부피의 5배의 버퍼 부피를 사용함,

- 원료 주입(FⅦ-TG 조성물), 10 mM CaCl₂ 및 4 mM MgCl₂를 함유하는 50 mM Tris 버퍼에 대하여 미리 투석됨.

- 세척 버퍼를 사용하여 세척함(그래프팅된 지지체 부피의 8배), 및

- 50 mM Tris, 10 mM EDTA 평형 버퍼로 pH 7.5에서 평형화(그래프팅된 지지체 부피의 3배).

7.3. 인간 FⅦ를 정제하기 위한 지지체의 특성

상기 7.1에서 기술된 바에 따라 제조된 3개의 지지체들의 활성 인간 FⅦa에 대해 선택적으로 잔류하려는 용량을 테스트하였다.

3개의 지지체들이 그래프팅된 지지체 밀리리터당 대략 인간 FⅦa 10 mg의 인간 FⅦa를 잔류하는 동적 용량을 갖는 것이 측정되었고, 이는 상기 7.1에서 계산된 이론적인 최대 정적 용량의 53% 내지 58%를 나타낸다. 이들 결과들은 3개의 지지체들에 그래프팅된 개별 압타머들이 매우 접근하기 쉽고(accesible) 작용성이라는 것을 보여준다.

상기 7.1에서 기술된 바에 따라 제조된 3개의 친화성 지지체들 각각은, 아래 표 8에 개시된 것처럼, 활성 GLA 도메인을 갖는 인간 FⅦ 분자를 선택적으로 잔류할 수 있다는 것을 보여주었다.

	친화성 지지체 1	친화성 지지체2	친화성 지지체3
출발 FⅦ (OD280) mg FⅦam IU FⅦam / FⅦ: Ag ratio	17 13906 0.41	17 139060 0.41	15 12270 0.41
잔류하지 않음 FⅦ (OD280) mg FⅦam IU FⅦam / FⅦ: Ag ratio FⅦ 수율(OD) % FⅦ 수율 %	7.7 94 0.006 45.5 0.7	9.7 273 0.014 56.9 2.0	7.8 134 0.009 52.1 1.1
용출 FⅦ (OD280) mg FⅦam IU FⅦam / FⅦ: Ag ratio FⅦ 수율(OD) % FⅦ 수율 %	7.7 12270 0.80 45.3 88.2	7.3 10675 0.71 42.9 76.8	6.3 9055 0.72 42.0 73.8

표 8의 결과들은, 조성물에 존재하는 인간 FⅦ 총량에 대하여, 활성 GLA 도메인을 포함하는 인간 FⅦ 41 %만을 포함하는 조성물로부터, 상기 조성물에 존재하는 인간 FⅦ 총량에 대하여, 활성 GLA 도메인을 포함하는 인간 FⅦ를 70 % 내지 80% 포함하는, 인간 FⅦ가 풍부한 최종 조성물이 얻어진다. 이들 결과들은 3개의 지지체들이 (ⅰ) 인간 FⅦ를 정제하는 것을 가능하게 하고, (ⅱ) 인간 FⅦ의 불활성 형태를 제거함으로써, 인간 FⅦ의 활성화된 형태가 풍부한 정제된 FⅦ의 조성물을 획득하는 것을 가능하게 한다.

7.4. 수산화 나트륨에 대한 친화성 지지체의 저항성

1M 수산화 나트륨 수용액으로 하는 장기간 처리를 하여 3개의 친화성 지지체의 저항성이 테스트되었다.

7.1에서 기술된 바에 따라 제조된 지지체들을 100 시간 동안 1M 수산화나트륨에 접촉시켰다. 수산화나트륨을 제거하기 위하여 세척한 후, 인간 FⅦ를 정제에 대한 3개의 지지체 각각의 용량이 측정되었다. 결과들을 표 9에 나타내었다.

	친화성지지체 1	친화성지지체2	친화성 지지체3
출발 FⅦ (OD280) mg FⅦam IU FⅦam / FⅦ: Ag ratio	17 13906 0.41	17 13906 0.41	15 12270 0.41
잔류하지 않음 FⅦ (OD280) mg FⅦam IU FⅦam / FⅦ: Ag ratio FⅦ 수율(OD) % FⅦ 수율 %	8.1 156 0.010 47.7 1.1	9.2 434 0.024 53.9 3.1	7.9 163 0.010 52.5 1.3
용출 FⅦ (OD280) mg FⅦam IU FⅦam / FⅦ: Ag ratio FⅦ 수율(OD) % FⅦ 수율 %	7.9 13560 0.9 46.5 97.5	7.1 11500 0.82 41.5 82.7	6.9 12215 0.89 45.7 99.6

표 9의 결과들은 시간의 매우 긴 시간 동안(100시간) 1M 수산화나트륨으로 처리하는 것은 인간 FⅦ를 정제하는 지지체 1, 2 및 3의 용량에 어떠한 유의적인 변화도 가져오지 않는다는 것을 보여준다.

7.5. 다양한 생물학적 배지와 장시간 접촉하는 것에 대한 친화성 지지체의 저항성

인간 FⅦ를 정제하기 위한 공정에서 출발 제품으로 사용될 수 있는, 다양한 생물학적 배지로 장시간 처리하는 것에 대한 3개의 친화성 지지체의 저항성을 테스트하였다. 다음의 2개의 생물학적 배지가 특히 테스트되었다: (ⅰ) 인간 혈장의 한랭 상청액(cryosupernatant) 및 (ⅱ) 정화된 밀크 용액, 예를 들어 인간 FⅦ를 인코딩하는 유전자에 대하여 유전자 변형된 동물의 밀크에서 인간 FⅦ가 생산될 때, 밀크가 인간 FⅦ의 제공원이 되는 것이 가능하다.

7.1에 기술된 바에 따라 제조된 친화성 지지체 1은 (ⅰ) 인간 혈장의 한랭 상청액(cryosupernatant) 및 (ⅱ) 정제된 밀크 용액과 100 시간 동안 접촉되었다. 테스트된 생물학적 배지를 제거하기 위하여 세척한 후, 인간 FⅦ를 정제하기 위한 3개의 친화성 지지체 각각의 용량을 측정하였다. 결과는 아래 표 10에 나타내었다.

	한랭 상청액에서 100 시간 배양한 후 지지체 1	정제된 밀크에서 100 시간 배양한 후 지지체 1
출발 FⅦ (OD280) mg FⅦam IU	17 13906	17 13906
잔류하지 않음 FⅦ (OD280) mg FⅦam IU FⅦam / FⅦ: Ag ratio FⅦ 수율(OD) % FⅦ 수율 %	9.3 496 0.027 54.6 3.6	10.2 192 0.009 60.2 1.4
용출 FⅦ (OD280) mg FⅦam IU FⅦam / FⅦ: Ag ratio FⅦ 수율(OD) % FⅦ 수율 %	7.3 12605 0.87 42.6 90.6	7.1 13180 0.93 41.8 94.8

표 10의 결과들은 매우 긴 시간 기간(100 시간) 동안, 인간 FⅦ를 정제하기 위한 출발 물질을 나타내는 생물학적 배지를 사용하여 본 설명(description)에서 정의된 친화성 지지체를 배양하는 것이 인간 FⅦ를 정제하기 위한 상기 지지체의 용량에 어떠한 유의적인 변화도 가져오지 않는다는 것을 보여준다.

7.6. 연속적인 정제 사이클을 실시하는 것에 대한 친화성 지지체의 저항성

인간 FⅦ 정제의 연속적인 사이클을 거치는 것에 대한 상기 7.1에서 기술된 것처럼 제조된 친화성 지지체 3의 저항성이 테스트되었다.

각 정제 사이클은 다음의 단계들을 포함한다:

- TP4 버퍼(친화성 지지체 부피의 5배)에서의 친화성 지지체를 평형화하는 단계,

- 정제된 조성물에 접촉시켜 자극하는 단계; TP4 버퍼의 주입(친화성 지지체부피의 5배),

- 용출 버퍼로 용출하는 단계(친화성 지지체 부피의 5배),

- 1 M NaOH로 10분간 살균하는 단계(친화성 지지체 부피의 5배), 및

- TP4 버퍼(친화성 지지체 부피의 10배)로 친화성 지지체를 재-평형화하는 단계.

상기 15회 또는 30회의 정제 사이클은 각각 친화성 지지체 3으로 실시되었고, 15회 또는 30회 사이클의 후반에서, 인간 FⅦ를 정제하기 위한 상기 지지체의 용량을 측정하였다. 결과들은 아래 표 11에 나타내었다.

	지지체 3- 15회 사이클	지지체 3- 30회 사이클
출발 FⅦ (OD280) mg	15	15
잔류하지 않음 FⅦ (OD280) mg FⅦ 수율(OD) %	7.2 48.3	6.5 43.1
용출 FⅦ (OD280) mg FⅦ 수율(OD) %	6.5 43.0	6.2 41.0

표 11의 결과들은 인간 FⅦ를 정제하기 위하여 본 설명에서 규정된 친화성 지지체의 용량이 변하지 않고, 심지어 표적 단백질의 정제를 흉내내는 공정의 30회 사이클 이행 후에도 그러하다는 것을 보여준다.

표 12: 서열 목록

서열번호	설명
서열번호 1	Mapt 2CS 압타머
서열번호 2	Mapt 1.2 압타머
서열번호 3	Mapt 2.2CS 압타머
서열번호 4	Mapt 항-FⅨa RNA 압타머
서열번호 5	Mapt 1.2 CSO 압타머

<110> LFB Biotechnologies <120> Method for immobilizing nucleic ligands <130> PR94343 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 45 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> aptamer <400> 1 atgcagccag ccgcagtgta agtgaatgca gacatggtct aagtg 45 <210> 2 <211> 43 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> aptamer <400> 2 cgcacatgac ttgaagtaaa acgcgaatta cagaccaaac ccg 43 <210> 3 <211> 44 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> aptamer <400> 3 ccgcacgcta cgcgcatgaa cccgcgcaca cgacttgaag tagc 44 <210> 4 <211> 34 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> aptamer <220> <221> misc_RNA <222> (3)..(6) <223> 2'-fluoro ribosyl <220> <221> misc_RNA <222> (8)..(8) <223> 2'-fluoro ribosyl <220> <221> misc_RNA <222> (13)..(14) <223> 2'-fluoro ribosyl <220> <221> misc_RNA <222> (15)..(15) <223> 2'-fluoro ribosyl <220> <221> misc_RNA <222> (16)..(16) <223> 2'-fluoro ribosyl <220> <221> misc_RNA <222> (17)..(17) <223> 2'-fluoro ribosyl <220> <221> misc_RNA <222> (22)..(22) <223> 2'-fluoro ribosyl <220> <221> misc_RNA <222> (23)..(23) <223> 2'-fluoro ribosyl <220> <221> misc_RNA <222> (25)..(25) <223> 2'-fluoro ribosyl <220> <221> misc_RNA <222> (26)..(27) <223> 2'-fluoro ribosyl <220> <221> misc_RNA <222> (29)..(32) <223> 2'-fluoro ribosyl <400> 4 auggggacua uaccgcguaa ugcugccucc ccau 34 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> aptamer <400> 5 ccacgacctc gcacatgact tgaagtaaaa cgcgaattac 40

Claims

적어도 하나의 1차 아민 작용기를 포함하는 핵산 리간드를 그래프팅에 의하여 활성화된 카복실 기를 갖는 고체 지지체 상에 고정하는 방법으로서, pH 6 미만에서 상기 고체 지지체에 상기 핵산을 공유결합성 커플링하는 단계를 포함하는, 적어도 하나의 반응성 아민 작용기를 포함하는 핵산 리간드를 고정하는 방법.
적어도 하나의 1차 아민 작용기를 포함하는 핵산 리간드를 고체 지지체에 고정하는 방법으로서,
a) 표면에 활성화된 카복실산 기를 포함하는 고체 지지체를 제공하는 단계,
b) 적어도 하나의 1차 아민 작용기를 포함하는 핵산 리간드를 제공하는 단계, 및
c) pH 6 미만의 조건 하에서 상기 고체 지지체의 표면에 존재하는 활성화된 카복실산 기와 상기 핵산의 커플링을 수행하는 단계를 포함하며,
단계 a) 및 b)의 순서는 차이가 없는 것인, 핵산 리간드를 고정하는 방법.
제1항 및 제2항에 있어서, 상기 활성화된 카복실산 기는 N-하이드록시-숙신이미드 또는 이의 유도체와의 반응으로 얻어지는 것인, 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 커플링 단계의 pH는 3.5 내지 4.5의 범위를 포함하는 것인, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 커플링 단계는 0 ℃ 내지 35 ℃의 범위의 온도에서 수행되는 것인, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 리간드는 3' 또는 5' 말단에 적어도 하나의 1차 아민 작용기를 포함하는 5 내지 120 개의 뉴클레오티드를 갖는 폴리뉴클레오티드인 것인, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 리간드는
(ⅰ) 5 내지 120 개의 뉴클레오티드 길이의 폴리뉴클레오티드 및
(ⅱ) 상기 폴리뉴클레오티드에 결합된 스페이서 쇄를 포함하고,
상기 1차 아민 작용기는 상기 폴리뉴클레오티드의 3' 또는 5' 말단, 또는 상기 스페이서 쇄에 부착되는 것인, 방법.
제7항에 있어서, 상기 스페이서 쇄는 1차 아민 작용기로 치환된 C2-C20 직선형 알킬 및 C2-C20 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군에서 선택된 것인, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 지지체는 실리카 겔, 덱스트란 겔, 아가로오스 겔, 및 이의 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법.
제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 커플링 단계 c)는
c1) pH 6 미만의 조건 하에서, 상기 고체 지지체의 표면에 존재하는 상기 활성화된 카복실산 기와 상기 핵산 리간드를 반응시키는 단계, 및
c2) pH 7.5 초과의 조건 하에서, 상기 고체 지지체의 표면에 존재하는 상기 활성화된 카복실산 기와 상기 핵산 리간드를 커플링 하는 반응을 지속하는 단계를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 커플링 단계 이후에 커플링 반응을 차단하는 단계 d)가 이루어지는 것인, 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 1차 아민 작용기를 포함하는 핵산 리간드는 핵산 압타머로 이루어지는 것인, 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에서 따른 고정 공정의 실시를 포함하는 친화성 지지체를 제조하는 방법.
제13항에 따른 제조 방법에 의하여 얻어진 고체 친화성 지지체.
아마이드 결합을 통해 핵산이 고정되고, 그 표면에 초기에 존재하는 적어도 0.01%의 카복실 작용기가 핵산 리간드에 의해 유도되는 것인, 고체 친화성 지지체.
아마이드 결합을 통해 핵산이 고정되는 고체 친화성 지지체로서, 상기 친화성 지지체는 적어도 겔의 0.005 μmol/ml 내지 0.4 μmol/ml의 핵산 리간드 밀도를 갖는 크로마토그래피 겔인, 고체 친화성 지지체.
제16항에 있어서, 상기 고체 친화성 지지체는 아가로오스 겔, 덱스트란 겔, 실리카 겔, 및 이의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 것인, 고체 친화성 지지체.
제14항 내지 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 리간드는 핵산 압타머이고, 상기 고체 지지체는 그 표면에 아래의 식(Ⅲ)의 구조를 가지며,

여기에서:
- SUP는 지지체를 나타내고,
- NH-(SPAC)n-NUCL은 핵산 압타머를 나타내며, 여기에서:
· n은 0 또는 1과 같은 값이고,
· SPAC는 스페이서 쇄를 나타내고, 그리고
· NUCL은 특이적으로 표적 분자와 결합하는 핵산을 나타내고, 상기 핵산은 5 내지 120 개의 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 고체 친화성 지지체.
핵산 리간드와 표적 분자의 상호작용으로 얻어진 복합체로서, 상기 복합체는 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에서 따른 고체 지지체의 표면에 형성되는 것인, 복합체.
제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 표적 분자를 정제하기 위한 고체 지지체의 사용.
제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 따른 표적 분자를 검출하기 위한 고체 지지체의 사용.
제14항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 따른 친화성 지지체를 사용하여 표적 분자를 정제하는 방법으로서,
a) (ⅰ) 상기 지지체 상에 그래프팅된 핵산 및 (ⅱ) 상기 표적 분자의 복합체를 형성하기 위하여, 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 친화성 지지체와 접촉하여, 관심있는 표적 분자를 포함하는 정제된 조성물을 준비하는 단계, 및
b) a) 단계에서 형성된 상기 복합체에서 상기 표적 리간드를 방출하는 단계 및 상기 정제된 표적 분자를 회수하는 단계를 포함하는 방법.
제20항 또는 제21항에 따른 용도 또는 제22항에 따른 방법에 있어서, 상기 표적 분자는 플라즈마 단백질인 것인, 용도 또는 방법.