NL8802003A - Werkwijze voor de bereiding van fibronectine uit bloedplasma met behulp van affiniteitschromatografie en daarvoor te gebruiken kolommateriaal. - Google Patents
Werkwijze voor de bereiding van fibronectine uit bloedplasma met behulp van affiniteitschromatografie en daarvoor te gebruiken kolommateriaal. Download PDFInfo
- Publication number
- NL8802003A NL8802003A NL8802003A NL8802003A NL8802003A NL 8802003 A NL8802003 A NL 8802003A NL 8802003 A NL8802003 A NL 8802003A NL 8802003 A NL8802003 A NL 8802003A NL 8802003 A NL8802003 A NL 8802003A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- gelatin
- column
- fibronectin
- affinity chromatography
- carbon particles
- Prior art date
Links
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 title claims description 26
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 title claims description 26
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 title claims description 18
- 239000000463 material Substances 0.000 title claims description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 18
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 title claims description 16
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims description 48
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims description 48
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims description 48
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims description 48
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims description 48
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 37
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 30
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 29
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 14
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 10
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 8
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 claims description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000007872 degassing Methods 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M sodium bromide Chemical compound [Na+].[Br-] JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000274 adsorptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 239000003518 caustics Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011403 purification operation Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
- B01D15/3804—Affinity chromatography
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
- B01J20/20—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising free carbon; comprising carbon obtained by carbonising processes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
- B01J20/28002—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their physical properties
- B01J20/28004—Sorbent size or size distribution, e.g. particle size
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
- B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/3092—Packing of a container, e.g. packing a cartridge or column
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
- B01J20/3204—Inorganic carriers, supports or substrates
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
- B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
- B01J20/3268—Macromolecular compounds
- B01J20/3272—Polymers obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
- B01J20/3274—Proteins, nucleic acids, polysaccharides, antibodies or antigens
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
- B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
- B01J2220/54—Sorbents specially adapted for analytical or investigative chromatography
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
- B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
- B01J2220/58—Use in a single column
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
Description
f.jeri,Hi jie voor de t-ereiding -.art fiorenectine uit bloeaplasir-a, petbehulp van affiniteitschromatografie en daarvoor te gebruikenkelommateriaaï.
De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de bereidingvan fibronectine uit bloedplasma» waarbij gelatine als lïgand gekoppeldaan een dragermateriaal wordt gebruikt.
Affïniteitschromatografie is een vorm van adsorptïechromatografie»waarbij een uit een vloeibaar mengsel af te scheiden verbinding speci¬fiek en reversibel geadsorbeerd wordt door een complementair bindendestof (ligand)» welke laatste geïmmobiliseerd is op een onoplosbaredrager (matrix).
Bekende matrix-materialen zijn onder andere polysacchariden» metname produkten afgeleid van agarose (zie bijvoorbeeld: "Affinity Chro-matography'* van Pharmacia Fine Chemicals). Axén» Porath en Ernbackvonden dat moleculen welke primaire aminogroepen bevatten als ligand»gekoppeld kunnen worden aan polysaccharide matrices» welke geaktiveerdzijn door een cyaanhalide (CNBr) <214 Nature 1302-1314 (1967)).
Voorts is bekend dat gelatine een geschikte ligand is bij koppe¬ling aan verknoopte (’crosslinked’) agaroseparels voor de afzonderingvan fibronectine uit bloedplasma (Bio-Rad Bulletin» 1084 juni 1981).
Fibronectine is van belang geworden bij het kweken van dierlijkecellen op microdragers voor het produceren van geneesmiddelen. Uit dienhoofde is het van belang dat gemakkelijk uit te voeren en goedkopewerkwijzen ter beschikking komen voor de bereiding van fibronectine.
Affïniteitschromatografie» met als kolommateriaal gelatine enagarose» is een zeer bruikbare techniek voor de winning van fibronec¬tine uit bloedplasma. Het nadeel is evenwel dat het een kostbaremethode is tengevolge van de hoge kostprijs van het matrixmateriaal.
De uitvinding beoogt een goedkope werkwijze te verschaffen voor debereiding van fibronectine uit bloedplasma met behulp van affiniteits-chromatografie, waarbij gelatine als ligand materiaal wordt gebruiktdoor een goedkoop matrixmateriaal toe te passen.
De uitvinding heeft voorts betrekking op het bij deze werkwijzetoe te passen kolommateriaal.
Verrassenderwijze werd gevonden dat aktieve koolstof, een produktdat in chemisch opzicht geen enkele verwantschap met bedoelde agarose-produkten vertoont, een matrixmateriaal vormt, waarop gelatine als ligand geïmmobiliseerd kan worden onder behoud van zijn specifieke enreversibele adsorptie-eigenschappen voor fibronectine. Aktieve kool iseen relatief goedkoop produkt, waardoor het een uitstekend matrix-materiaal is voor gelatine als ligand voor de bereiding van fibronec-tine uit bloedplasma.
De uitvinding bestaat uit een werkwijze voor het bereiden vanfibronectine uit bloedplasma met behulp van affiniteitschromatografie,waarbij de ligand van het kolommateriaal uit gelatine bestaat met hetkenmerk dat bloedplasma over een affiniteitschromatografiekolom wordtgeleid, welke gevormd wordt door aktieve koolstofdeeltjes als matrix-materiaal, waaraan gelatine als ligand is gebonden, waarbij fibronec¬tine aan gelatine wordt gebonden en vervolgens fibronectine uit dekolom wordt afgescheiden op voor affiniteitschromatografie geschiktewijze.
De uitvinding van deze werkwijze kan als volgt worden toegelicht.
Als bloedplasma komt bijvoorbeeld het plasma van runderen, bij¬voorbeeld koeien, in aanmerking.
Voor het overige kan in het algemeen worden opgemerkt, dat zowelvoor de bereiding van fibronectine uit bloedplasma als voor de berei¬ding van het kolommateriaal, gebruik kan worden gemaakt van methodenwelke op zichzelf uit de techniek van de affiniteitschromatografiebekend zijn. Hiervoor kan worden verwezen naar de reeds hierbovenvermelde literatuur.
Het is van belang de chromatografiekolom van te voren te equili-breren met een geschikte bufferoplossing, om te voorkomen dat deplasma-eiwitten, inklusief de fibronectine op de kolom denatureren.
Dit gebeurt het eenvoudigste door de kolom te spoelen met een waterige,gebufferde zwak alkalische oplossing, bij voorkeur een waterige oplos¬sing van ammoniumbicarbonaat met een pH van 7-9, in het bijzonder eenpH van B.5, of met een fosfaatbuffer met 0.1 M NaCl-pH 7.5.
Nadat het plasma over de kolom is geleid en het daarin aanwezigefibronectine aan het gelatine is gebonden, wordt de kolom uitg^spoeldmet een waterige oplossing voor het afvoeren van eiwitten welke mede inde kolom zijn achtergebleven. Dit gebeurt bij voorkeur met eenzelfdeoplossing als waarmee de kolom vooraf is geëquilibreerd. Deze spoelingwordt met zoveel oplossing uitgevoerd tot er geen eiwitten meer uit dekolom komen. Vervolgens wordt het fibronectine uit de kolom geëlueerddoor deze te spoelen met een waterige oplossing van een pH en de aan- wezigheid van opgeloste verbindingen·» waarbij de binding tussen hetgelatine en de fibronectine wordt verbroken. Hiervoor komt een gebuf¬ferde waterige oplossing in aanmerking met een pH in de buurt van hetiso-elektrisch punt van gelatine» d.w.z. ongeveer 5.5. In het algemeenwordt met een pH tussen 4 en 6 een goed resultaat bereikt. In aanmer¬king komt een waterige azijnzuur/acetaatoplossing. Bij voorkeur wordenaan de oplossing stoffen toegevoegd welke het verbreken van de bindingtussen het gelatine en het fibronectine bevorderen. Als zodanig kunnenworden genoemd: natriumbomide» glucose» ureum of glycine. Voor dezeelutie» evenals voor de andere stappen van de werkwijze volgens deuitvinding, kan overigens worden verwezen naar in de affiniteits-chromatografie gebruikelijke technieken. Zie hiervoor het reedsgenoemde boek "Affinity Chromatography" en het ,,Bio-Rad,,-bulletin.
De verdere zuivering van de oplossing van fibronectine en de iso- !latie daarvan, kan eveneens volgens op zichzelf gebruikelijke technie- ;ken worden uitgevoerd, bijvoorbeeld door gelfiltratie, ultrafiltratie jen door toepassing van ionen-uitwisselaars.
De uitvinding heeft voorts betrekking op een nieuw kolommateriaal ;voor affinïteitschramatografie.
Het nieuwe kolommateriaal wordt gevormd door deeltjes aktieve jkoolstof waaraan gelatine adsorptief is gehecht. Aktieve koolstof is i nagenoeg zuivere koolstof. Het is in de handel verkrijgbaar. In de re-jgel heeft het een of meer zuiveringsbewerkïngen ondergaan, bijvoorbeeld:is het ruwe koolstof eerst aan een oxydatiebehandeling onderworpen ge¬weest en heeft het daarna een zure extractie ondergaan voor het verwij¬deren van elementen, zoals zwavel en zware metalen. Ook wordt dooroxydatie het aantal adsorptieve groepen groter (bindingskapaciteit).
Als geschikte aktieve koolstof voor toepassing van de uitvindingwordt bij voorkeur aktieve koolstof type 500B van “NORIT" gebruikt» i omdat dit type een hoge bindingsaktiviteit voor eiwitten heeft. ί
De deeltjes aktieve koolstof zijn poreus en de poriën zijn gevuld j i met gassen, bijvoorbeeld lucht. Ingesloten gassen beperken het adsorp- ;tievermogen voor gelatine en dus de hechting aan het matrixmateriaal. jOm deze reden verdient het aanbeveling de aktieve koolstof vóör toe- ;passing bij de werkwijze van de uitvinding te ontgassen.
De uitvinding betreft voorts een werkwijze voor de bereiding vanhet nieuwe kolommateriaal.
Deze wordt daardoor gekenmerkt, dat een waterige oplossing van gelatine zolang wordt gemengd met een waterige suspensie van aktievekoolstofdeeltjes, dat gelatine door de aktieve koolstofdeeltjes gead¬sorbeerd wordt» waarna overtollig gelatine door uitwassen wordt ver-wi jderd.
Volgens een voorkeursvorm van de uitvinding wordt voor het berei¬ken van een optimale binding van gelatine aan koolstof» gelatine opge¬lost in een waterige gebufferde oplossing bij 70°C en bij een ionen¬sterkte van de oplossing tussen 0,01 en 0,1 M en een pH welke ligttussen 3 en 8, bij voorkeur omstreeks het iso-elektrisch punt van degelatine <pH 5.5), waarna de waterige oplossing van gelatine gemengdwordt met een suspensie van ontgaste deeltjes van aktieve koolstof,welke suspensie op dezelfde ionensterkte en pH-waarde is gebracht alsde gelatine-oplossing, en daarna de gelatine gelegenheid wordt gegevenzich aan en in de matrix van koolstofdeeltjes te hechten bij een tempe¬ratuur tussen 20°C en 90°C, bij voorkeur 70°C, waarna de overtolligegelatine door uitwassen wordt verwijderd.
De deeltjesgrootte van het nieuwe matrixmateriaal is niet aannauwe grenzen gebonden. De afmetingen worden bepaald door eisen welkedaaraan worden gesteld ten aanzien van doorstromingssnelheid van eenwaterige oplossing door een kolom van een waterige suspensie van de ;deeltjes en ten aanzien van de diffusiesnelheid van de reagentia in bematrix van de deeltjes. Te kleine deeltjes zijn ongunstig voor dedoorstromingssnelheid, te grote deeltjes zijn ongunstig voor de diffu¬siesnelheid. Bij voorkeur ligt de deeltjesgrootte tussen 0.01 en 1 mm,in het bijzonder tussen 0.1 en 0.5 mm. Voor het nieuwe kolommateriaalvan de uitvinding wordt bij voorkeur zuivere gelatine gebruikt metminder dan 1 gew.*/. verontreinigingen.
De ontgassing van de koolstofdeeltjes kan gemakkelijk worden uit¬gevoerd, door een waterige suspensie van de deeltjes aktieve koolstofgedurende enige tijd te verwarmen, bijv. tussen 50°C en 100eC, bijvoorkeur 100°C.
Voorts is het van voordeel gebleken het ontgassen van de kool- stofdeeltjes uit te voeren onder gebufferde omstandigheden, waarbij |deionenconcentratie laag en de pH konstant worden gehouden. De pH ligtdaarbij bij voorkeur omstreeks het iso-elektrisch punt van de gelatineen de ionensterkte tussen 0.1 en 1 Mol. Deze omstandigheden komen over¬een met die waarbij een goede hechting tussen de gelatine en de aktievekoolstofdeeltjes tot stand komt.
Met de hechting van gelatine aan en in de deeltjes aktieve kool¬stof i is enige tijd gemoeid. Deze duur is mede afhankelijk van de ge¬bruikte soort gelatine en de aard en de omvang van de koolstofdeeltjesIn het algemeen is hiermee een periode tussen EQ en 4 uur gemoeid.
De verwijdering van niet-gebonden gelatine kan op eenvoudige wijzigeschieden door de suspensie van de deeltjes aktieve koolstof met daar¬aan gebonden gelatine te filtreren en het filterresidu te wassen meteen gebufferde waterige oplossing van eenzelfde pH en ionensterkte alsvan de hiervóór bedoelde oplossing voor het binden van de gelatine aanhet matrixmateriaal.
Het nieuwe kolommateriaal volgens de uitvinding kan in de vorm vareen waterige suspensie van aan en in de aktieve koolstofdeeltjes gead¬sorbeerde gelatine in de handel worden gebracht? bij voorkeur met eenlage ionenconcentratie en gebufferd bij een pH omstreeks het iso-elektrisch punt van gelatine? maar ook in gedroogde vorm. Het gedroogdekolommateriaal volgens de uitvinding bevat 10-50 gew.ü gelatine adsorp-tief gebonden aan koolstof? 50-90 gew.% koolstofdeeltjes e~ 0-10 "«‘w.Kionogene bestanddelen.
Uitvoeringsvoorbeeld: 10 g zogenaamd Sigma III Calfskin gelatine? betrokken van SigmaChemical Co» St.Louis - USA? catalogus no. 6 0510 werd opgelost in 100ml qedestilleerd water? waaraan 5 mMol (0,410 g) natriumacetaat wastoegevoegd <pH 5?5). De oplossing werd weggezet bij 75°C; 10 g aktieve koolstofdeeltjes? type 5008? betrokken van NORIT(staafjes)? gemiddelde deeltjesgrootte 0?lxQ?5 cm? werd gesuspendeerdin 100 ml gedestilleerd water? waaraan 5 mMol (0?410 g) natriumacetaat-buffer was toegevoegd (pH 5?5>. De suspensie werd 5 min. gekookt om delucht uit de poriën te verwijderen. Daarna werd de suspensie afgekoeldtot kamertemperatuur en door titratie met loog of zuur (NaOH of HC1)opnieuw op pH 5?5 ingesteld? totdat de pH in de tijd stabiel was gewor¬den? waarna de suspensie weer op 75°C verwarmd werd.
Vervolgens werd de warme gelatine-opiossing gemengd met de warmesuspensie en de menging onder roeren gedurende E4 uur bij 75°C voort¬gezet .
Hierna werd het kolommateriaal drie keer met 100 ml gedestilleerdwater? waarin 5 mMol (0?410 g) natriumacetaat was opgelost (pH 5?5)?bij een temperatuur van 75eC op een Büchnertrechter gespoeld voor hetverwijderen van niel-geadsorbeerde gelatine. Tenslotte werd nog één keer met 100 ml van eenzelfde waterige natriumacetaat-oplossing bijkamertemperatuur gespoeld.
Het aldus bereide, gedroogde kolommateriaal werd in een hoeveel¬heid van 5 g gestort in een glazen kolom, welke aan de binnenzijde metsiliconen was behandeld, met een doorsnede van 3 cm en een hoogte van 6cm. De aldus gevulde kolom werd gespoeld met een oplossing van 5 mtiol(0,395 g) ammoniumbicarbonaat (pH B,5), waaraan 0,25 mMol (1,410 g) EDTA was toegevoegd. De kolom was nu geëquilibreerd en gereed voor deisolatie van fibronectine uit bloedplasma van koeien.
Door de geëquilibreerde kolom wordt 64 ml vers runderplasma ge¬pompt, of zoveel tot de kolom verzadigd is met fibronectine. Vervolgenswordt de kolom gespoeld met 66 ml 0,05 M fosfaatbuffer, 0.9*/. NaCl 5mMol EDTA pH 7,2, en 50 mM azijnzuur/acetaat-buffer 1 M NaCl pH 5, toter geen eiwit meer uit de kolom komt.
Fibronectine wordt nu van de kolom geëlueerd door te spoelen met50 ml 50 mMol azijnzuur/acetaat-buffer 1 M NaBr pH 5.0. De febronectinewordt met deze buffer uit de kolom gespoeld. O 90% zuiver, opbrengst50-90%). Het fibronectine kan ontzout worden over een Sephadex G25moleculaire zeefkolom, of ook anderszins (ultrafiltratie, etc.) en kandan verder gezuiverd worden (>97F) over een anionenwisselaar.
Claims (3)
1. Werkwijze voor de bereiding van fibronectine uit bloedplasmamet behulp van affiniteitschromotografie» waarbij kolommateriaal wordtgebruikt dat gelatine als ligand bevat» met het kenmerk» dat bloedplasma over een affiniteitschromatografie-kolom wordt geleid» welke gevormd wordt door aktieve koolstofdeeltjesals matrixmateriaal» waaraan gelatine als ligand is gebonden» waarbijfibronectine aan gelatine wordt gebonden» en vervolgens fibronectineuit de kolom wordt afgescheiden op voor affiniteitschromatografiegeschikte wijze.
2. Kolommateriaal voor affiniteitschromatografie dat gelatine alsligand bevat» met het kenmerk» dat het kolommateriaal als matrixmateriaal aktievekoolstofdeeltjes bevat waaraan gelatine als ligand is gebonden.
3. Werkwijze voor de bereiding van kolommateriaal voor affini-teitschromatografie dat gelatine als ligand bevat» met het kenmerk» dat een waterige oplossing van gelatine zolang wordtgemengd met een waterige suspensie van aktieve koolstofdeeltjes» datgelatine dbor de aktieve koolstofdeeltjes is geadsorbeerd» waarna j overtollig gelatine door uitwassen wordt verwijderd. j h. Werkwijze volgens konklusie 3 met het kenmerk dat de suspensievan aktieve koolstofdeeltjes vóór menging met de gelatine-oplossing isontgast door verwarming.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL8802003A NL8802003A (nl) | 1988-08-11 | 1988-08-11 | Werkwijze voor de bereiding van fibronectine uit bloedplasma met behulp van affiniteitschromatografie en daarvoor te gebruiken kolommateriaal. |
| EP89201896A EP0355882A1 (en) | 1988-08-11 | 1989-07-19 | Method for the preparation of fibronectine from blood plasma, with the help of affinity chromatography and the column material to be used with it |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL8802003 | 1988-08-11 | ||
| NL8802003A NL8802003A (nl) | 1988-08-11 | 1988-08-11 | Werkwijze voor de bereiding van fibronectine uit bloedplasma met behulp van affiniteitschromatografie en daarvoor te gebruiken kolommateriaal. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL8802003A true NL8802003A (nl) | 1990-03-01 |
Family
ID=19852748
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL8802003A NL8802003A (nl) | 1988-08-11 | 1988-08-11 | Werkwijze voor de bereiding van fibronectine uit bloedplasma met behulp van affiniteitschromatografie en daarvoor te gebruiken kolommateriaal. |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0355882A1 (nl) |
| NL (1) | NL8802003A (nl) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2001281824A1 (en) * | 2000-06-15 | 2001-12-24 | Patrizia Castellani | Methods for quantitative determination of b-fibronectin in biological fluids and tissues |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5637164B2 (nl) * | 1974-05-13 | 1981-08-29 |
-
1988
- 1988-08-11 NL NL8802003A patent/NL8802003A/nl not_active Application Discontinuation
-
1989
- 1989-07-19 EP EP89201896A patent/EP0355882A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0355882A1 (en) | 1990-02-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2598223B1 (en) | Chromatography media and method | |
| SU867284A3 (ru) | Анионообменный материал дл разделени биологических макромолекул и способ его получени | |
| Ruckenstein et al. | Albumin separation with Cibacron Blue carrying macroporous chitosan and chitin affinity membranes | |
| JPH0214325B2 (nl) | ||
| JP3499869B2 (ja) | 活性化支持体材料、それらの調製および使用 | |
| WO2012090183A1 (fr) | Procede d'immobilisation de ligands nucleiques | |
| JPH11506603A (ja) | 新規因子ｉｘ精製法 | |
| JP5109003B2 (ja) | 刺激応答型アフィニティクロマトグラフィー材料等の分離材料および分離精製方法 | |
| Yarmush et al. | Immunoaffinity purification: basic principles and operational considerations | |
| CN101185880A (zh) | 一种用于抗体清除的血液净化吸附剂及其制备方法 | |
| JPS6356501A (ja) | アフイニテイークロマトグラフイー用カラム充填剤及びその製造方法 | |
| US4093612A (en) | Selective removal of albumin from blood fluids and compositions therefore | |
| NL8802003A (nl) | Werkwijze voor de bereiding van fibronectine uit bloedplasma met behulp van affiniteitschromatografie en daarvoor te gebruiken kolommateriaal. | |
| US4279998A (en) | Regenerable insoluble support for protein immobilization | |
| JPH09506256A (ja) | メンブレンクロマトグラフィーによるビタミンｋ依存性蛋白の精製 | |
| JPS6155415B2 (nl) | ||
| Burton | Affinity chromatography | |
| JPS5929200B2 (ja) | 水不溶性タンニン製剤の製法 | |
| JPS5838151B2 (ja) | カリクレインの精製法 | |
| JPH05261281A (ja) | 生理活性物質固定化担体とその製法 | |
| WO1993009869A1 (en) | Adsorbent for blood coagulation factor viii | |
| SU1395640A1 (ru) | Способ получени сорбента дл лигандообменной хроматографии белков | |
| JP2005281399A (ja) | 分子鋳型材料の製造方法、分子鋳型材料および標的物質の分離・精製方法 | |
| Ayhan et al. | Protein A immobilized poly (methylmethacrylate-co-hydroxyethylmethacrylate) microbeads for IgG adsorption | |
| Gribnau | Coupling of effector-molecules to solid supports: development and application of a new method for affinity chromatography and enzyme/hormone-immobilization |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A1B | A search report has been drawn up | ||
| BV | The patent application has lapsed |