JP3499869B2 - 活性化支持体材料、それらの調製および使用 - Google Patents
活性化支持体材料、それらの調製および使用Info
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Description
持体材料から調製することができるアフィニティー支持
体および固定化酵素に関する。アフィニティークロマト
グラフィー工程において、分析されるべき材料といわゆ
るアフィニティーリガンドとの間の特異的相互反応が共
存する物質を除去するために利用される。分析されるべ
き材料は支持体に結合したアフィニティーリガンドに可
逆的に結合される。共存する物質は結合されず、したが
って、容易に洗浄除去される。分析されるべき材料は、
結合の可逆性を利用して次いで放出される。放出は、例
えば、pHの変化、イオン強度の変化、または溶解したア
フィニティーリガンドを溶出剤に添加することによって
行われる。これらの工程および工程変法は当業者に公知
である。
のタンパク質に対する抗体の精製が含まれる。タンパク
質はクロマトグラフィー支持体材料に結合される。精製
されるべき抗体を含む溶液をこの支持体材料にアプライ
する。抗体調製物の非結合部分を洗浄除去して、次いで
精製された抗体を溶出する。この工程を逆にして、特定
のタンパク質をアフィニティークロマトグラフィーを用
いて精製することもできる。その場合は、このタンパク
質に対する抗体をクロマトグラフィー支持体材料に結合
させる。アフィニティークロマトグラフィーの他の適用
においては、例えば、補酵素をクロマトグラフィー支持
体に結合させて、この補酵素に結合する酵素を精製す
る。補酵素の代わりに、染料を用いても同様の成果を得
ることができる。多数のアフィニティーリガンドを表1
にまとめて例示する。他のアフィニティーリガンドおよ
び分析されるべき材料、さらに工程の変法はハンドブッ
ク、例えばKirk−Othmer Encyclopedia of Chemical
Technology(pp.35−40、3rd edition、1978、John
Wiley and Sons)およびProtein Purification、J
anson、J.−C.and Ryden、L.(editors)(pp.275−32
5、1989、VCH Publishers)、あるいはVijayalakshim
i、M.A.(1989)TIBTECH 7、pp.71−76に見出され
る。
にはしばしば必要とされる。したがって、特定のリガン
ドを簡単な工程によってそれに結合することができるよ
うな活性化支持体材料の提供が確立されてきた。最初の
製品のひとつはBrCN−アガロースであって、これは臭化
シアンで活性化した架橋アガロースである。これはリガ
ンドの一級アミノ基と反応して、これを支持体材料に結
合する。加圧下の支持体材料の安定性の向上は、例えば
架橋ポリ−(メタ)アクリル酸誘導体の導入によってま
たは基部材料としてシリカゲルを使用することによっ
て、達成された。
シプロピルトリメトキシシランと反応させて、活性化支
持体材料を形成させ、そのオキシラン基にアフィニティ
ーリガンドを結合させることができる。DE 40 02 044に
よれば、例えば「好チオ」リガンドをオキシラン基に結
合させる。これらアフィニティー支持体は、例えばモノ
クローナル抗体のような免疫グロブリンの精製にとくに
適している。US4、737、560には、活性基としてアズラ
クトン化合物を含む架橋ポリマーに基づく活性化支持体
材料が記述されている。しかし、これら材料の結合特性
は不十分である。
した、シリカゲルの芯を有する支持体材料が記述されて
いる。これらポリマーは、活性化基として例えばオキシ
ラン基を含むことができる。いくつかのポリマーのオキ
シラン基の反応によって支持体に結合される。これによ
って、Si−O結合が形成されるが、これは容易に加水分
解される。前もって形成したポリマーをシリカゲルに結
合させることから、そこに付加できる密度は制限され
る。さらにポリマーの架橋は、タンパク質や核酸などの
高分子化合物のアクセスを妨げる。
るべき材料は高分子量(>103)の化合物であることが
多いことから、質量輸送速度、したがって分離工程の生
産性は、拡散工程によって限定される。US5、019、270
には、支持粒子の特異的形状およびそれによる液体動力
学に基づいて、質量輸送の加速が可能になったクロマト
グラフィー支持体が開示されている。EP 0 295 073に
は、質量輸送を加速するための別の方法が開示されてい
るが、そこでは、スペーサーとしてポリエチレングリコ
ールを用いることによってアフィニティーリガンドはよ
りアクセスしやすくなっている。しかし、これら材料の
結合能力には、EP 0 064 833による材料と同様に制限が
ある。
化支持体材料はさらに、一般に酵素の固定化に適してい
る。そのような固定化酵素は、しばしば安定性が向上す
る。さらに、反応バッチから容易に除去され、また再使
用もできる。固定化酵素の別の用途には、貫流条件下で
の連続反応処理を可能にする酵素リアクターの提供があ
る。しかし、酵素は固定化の間にしばしば不活化される
ことが見出され、結合反応後の結合酵素の収量はきわめ
て低い。とくに、高分子量基質(分子量>103)に対す
る反応性はそのために低下する。RNAならびに一本鎖お
よび二本鎖DNAを生物学的に不活性の小オリゴヌクレオ
チドに加水分解する核酸加水分解酵素であるベンゾナー
ゼおよびプロテイナーゼKは高分子量基質を優先的に変
化させる酵素であるが、今日までに知られる方法では固
定化できない酵素の例としてあげることができる。ベン
ゾナーゼは、生物学的に得られた薬物活性化合物に残存
する核酸を分解し、それによって遺伝材料の望ましくな
い転移を排除することができる。そのような工程は貫流
リアクター中で行うことが好ましい。このためには、高
分子量核酸に対する反応性を保持しながらベンゾナーゼ
を適当な活性化支持体に固定化することが必須条件とな
る。
から当業者に公知である。
単な方法で結合できる活性化支持体材料の提供が求めら
れる。得られるアフィニティー支持体は、優れた結合能
を有し、高度の質量輸送を可能にするものでなくてはな
らず、酵素の固定化の間は、その反応性、とくに高分子
量基質に対する反応性が保持されねばならない。
基またはアズラクトン基の前駆体を含む、(メタ)−ア
クリル酸誘導体を、表面に脂肪族水酸基を含む基部支持
体上にグラフトすることが可能であることが見出され
た。本発明によれば、重合はここでセリウム(IV)イオ
ンを用いて始められる(G.Mino and S.Kaizerman(19
58)J.Polymer Science 31,pp.242−243、G.Mino et
al.(1959)J.Polymer Science 38,393−401)。こ
の方法によって得られる支持体材料は簡単な方法でアフ
ィニティー支持体に変換することができ、優れた結合能
および高度の質量輸送能を有している。そのアズラクト
ン基がチオエーテル結合を介して支持体に結合している
アズラクトングループを有する活性化支持体材料もま
た、顕著な特性を示す。これら活性化支持体材料もま
た、チオエーテル結合が直接に基部支持体に結合してい
れば、とくに有利な特性を示す。
合で結合している、水酸基を含む基部支持体に基づく活
性化支持体材料に関し、それは次のように特徴づけられ
る。
して基部支持体に結合され、 c)ポリマーは一般式Iのモノマーユニットを含み、そ
して d)モノマーユニットは線状に結合している。
り、そして Xは、アズラクトン基またはオキシラン基を含む活性
化グループである] 本発明はまた、一般式VII aまたはVII bのひとつに対
応する基を含む活性化支持体材料に関する。
り、そして R5およびR6はそれぞれ互いに独立してHまたは1〜5
個のC原子を有するアルキルである] 本発明はまた、その表面にポリマーがグラフト重合に
よって共有結合されている水酸基を含む基部支持体から
出発する活性化支持体材料の調製法に関し、それは、水
酸基を含む基部支持体粒子を懸濁させて、セリウム(I
V)イオンの存在下で一般式IVのモノマーからなる溶液
中で重合させ、 [ただし上記式において、 R1、R2およびR3は互いに独立してHまたはCH3であ
り、そして Yは、オキシラン基またはアズラクトン基またはそれ
からアズラクトン基を生じることができる基を含む、活
性化または活性化が可能なグループである」 そして、適宜、前駆体化合物をアズラクトン環系に変
換することを特徴とする。
反応による、チオール基を含む基部支持体から出発する
活性化支持体材料の調製法に関する。
り、そして R5およびR6は、それぞれ互いに独立してHまたは1〜
5個のC原子を有するアルキルである] 本発明はまた、本発明による活性化支持体材料の、ア
フィニティーリガンド結合および酵素固定化のための使
用に関する。
ーリガンドを本発明による活性化支持体材料に結合させ
ることを特徴とする、アフィニティー支持体の調製法に
関する。
る活性化支持体材料に結合させることによって調製する
ことができる、アフィニティー支持体に関する。
の、バイオポリマーの精製における使用に関する。
を結合させることを特徴とする、酵素固定化法に関す
る。
酵素を固定化することによって調製できる固定化酵素、
および酵素反応のためのそれらの使用に関する。
初に記述された一連の反応の結果生じる。すなわち、強
酸性の水溶液中でセリウム(IV)塩を用いる反応によっ
て基部支持体の第一および第二の水酸基の部位は、水酸
基自体もしくは水素原子のみが脱離することで炭素ラジ
カルまたは可能であれば酵素ラジカルに変換される。遊
離ラジカル連鎖反応はこれらのラジカル上で始まり、加
えられるモノマーは鎖に取り込まれる。この鎖は線状
で、モノマーユニットで基部支持体の脂肪族基に連結さ
れる。重合は、セリウム(IV)塩の関わる終結反応で終
わる。したがって、(平均)鎖長は基部支持体、イニシ
エーターおよびモノマーの濃度比によって影響される。
均一モノマーあるいは異なるモノマーの混合物を用いる
こともできる。後者の場合は、グラフト共重合体が形成
される。
結合しているようなアズラクトングループを有する活性
化支持体材料の調製のためには、次のような一連反応が
用いられる。
をも有しない場合は、オキシラン基を最初に導入する。
このために、基部支持体の脂肪族水酸基をエピクロロヒ
ドリンと反応させるか、(メタ)−アクリルグリシジル
エステルを基部支持体の脂肪族水酸基上にグラフトす
る。次いで、既知の方法でアルカリ媒体中でオキシラン
基を二硫化ナトリウムと反応させることによってチオー
ル基を導入する。
既に存在していた基部支持体のチオール基を、ビニルア
ズラクトン誘導体のビニル二重結合上に加える。この反
応は、好ましくは、EP 0 473 457に従って1、8−ジア
ザビシクロ[5、4、0]−ウンデク−7−エンによっ
て触媒される。ビニルジメチルアズラクトンはとくに好
ましいビニルアズラクトン誘導体である。
フトさせるものである。一般に、その表面に第一または
第二脂肪族水酸基を含む限り、通常の有孔または無孔の
支持粒子を基部支持体として用いることができる。とく
に適当な材料は、アガロースを基にした多糖類、セルロ
ース、セルロース誘導体およびデキストランを基にした
ポリマーである。ポリビニルアルコールを基にしたポリ
マーまたは(メタ)アクリル酸塩誘導体の共重合体およ
び脂肪族水酸基との共モノマーが好ましい。ジオール修
飾したシリカゲルはとくに好ましい基部支持体である。
好ましい市販の基部支持体は、脂肪族水酸基と同様、脂
肪族水酸基(1ミリ等量のOH/g)を含む多孔性ビニル基
部の共重合体であるFractogel(登録商標)TSK HW 65
(S)(E.Merck)および、ジオール置換シリカゲルで
あるLiChrospher(登録商標)DIOL(E.Merck)である。
基を含むか自体公知の方法でそこに脂肪族水酸基を導入
することができるような、膜または糸様および網様また
は織物様材料がある。これらの材料はまた、機械的安定
性を向上させるための追加の支持体構成を含むことがで
きる。同様に、これら材料は、それらの脂肪族水酸基を
用いることによって活性化支持体材料に変換することも
できる。粒子状基部支持体のための下記のような同様の
一連反応が本質的にここでは用いられる。
とができ、したがって、アフィニティークロマトグラフ
ィーにおける使用に適している、化学的化合物である。
そのようなアフィニティーリガンドの例の概要は表1に
示されている。
たはモノマーユニットと共有結合して存在し、アフィニ
ティーリガンドとの共有結合をする、化学的反応性を有
する基である。本発明における活性化基は、とくに、オ
キシラン基を含む一般式IIによる基、およびアズラクト
ンを含む一般式IIIによる基である。
〜12個のC原子を含むアリールであり、そして nは1から5までの整数である。
原子を有するアルキルである。
の上に結合されたかたちで存在する基部支持体である。
アフィニティー支持体は、アフィニティーリガンドを有
するポリマーがその上に結合している基部支持体であ
り、その結合は活性化基によって達成される。
かし、触媒的機能を有しており(いわゆるリボチー
ム)、本発明によれば「酵素」という用語で包含される
核酸誘導体もまた、知られている。酵素は、例えばアル
コールまたは核酸などの特定の基質が反応する、例えば
酸化還元反応または加水分解反応などの特定の反応を特
異的に触媒する。これらの反応において酵素によって補
足因子がしばしば必要とされる。代謝においては、いく
つかの酵素が一緒に作用して、反応鎖を触媒する。酵素
的触媒反応、これらに関与する酵素および補足因子、お
よび生化学的反応鎖の詳細は、当業者に公知である。さ
らに酵素は、例えばオキシラン、カルボニルイミダゾー
ルまたはトレシル誘導体などの多様な反応物質によって
支持体材料上に固定化することができる。種々の酵素が
反応鎖において一緒に作用するとすれば、中間的産物の
拡散経路を短縮するためにそれら酵素を互いに接近させ
て支持体に固定化することができる。したがって、本発
明によると、酵素を個々に固定化するか、または例えば
反応鎖で共同で作用する種々の酵素を一緒に固定化する
こともできる。
前駆体化合物を含む基である。その一例として、一般式
IIIによるアズラクトン基に変換できる、一般式VIによ
るカルボン酸塩誘導体があげられる。
原子を有するアルキルである。
はHであり、すなわちアクリル酸およびメタクリル酸誘
導体が好ましい。
あり、R4は好ましくはH、メチル、エチルまたはプロピ
ルである。2、3−エポキシプロピル基は一般式IIの化
合物としてとくに好ましく、その場合、n=1およびR4
=Hである。
5およびR6基は好ましくは同じであり、つまり光学的に
不活性の化合物が好ましい。R5およびR6基は好ましくは
H,メチル、エチルまたはプロピルである。ふたつの基は
とくに好ましくはHまたはメチルのいずれかであり、す
なわちグリシンおよび2−メチルアラニンの誘導体であ
り、さらにアズラクトンとの組み合わせはとくに好まし
い。
ましくは置換されておらず、すなわち一般式VII a、VII
bおよびVIIIにおけるR1、R2およびR3は好ましくはHで
ある。
することもまた有益である。このために、一般式Iによ
るモノマーに加えて、活性化基を含まない一般式Vのモ
ノマーを好ましくは追加して用いる。
と同じ意味を有する。好ましくは、一般式IVによるモノ
マー60〜99.5%および一般式Vによるモノマー0.5〜40
%を、共重合体の調製において用いる。
が、当業者に公知の標準的工程によって得ることができ
る。そのような標準的工程の例としては、Schotten−Ba
umannアシル化およびStrecker合成法などがあげられ
る。これらの工程の詳細は、例えばHouben−Weyl、Meth
oden der Organischen Chemie(有機化学の方法)、
Georg Thieme Verlag、Stuttgartなどの通常のハンド
ブックに記述がある。
の純粋水溶液中で既知の工程によって行われる。したが
って、この反応は、容易に水に溶けるモノマーについて
のみ可能である。しかし、驚くべきことに、水と水酸基
を含まない有機溶媒との混合物を溶媒として用いると、
セリウム(IV)塩を用いる反応もまた可能であることが
見出された。ジオキサンまたはテトラヒドロフランはこ
こでとくに好ましい。反応液中の有機溶媒の含量は、好
ましくは10〜80容量%であり、とくに好ましくは20〜50
容量%である。
分解され得ることが知られていることから、オキシラン
基を含むモノマーが無機酸溶液中でセリウム(IV)塩に
よって重合されてそのオキシラン構造が保持されること
は驚くべきことである。
ン基のための前駆体化合物は、当業者に公知の工程によ
ってアズラクトン基に変換される。無水酢酸を用いる反
応がこの目的のために好ましい。
活性化グループがまだ残っている。これらの基は通常、
過剰の水溶性アミノまたはチオール化合物との反応によ
って変換される。この目的のために、アミノエタノール
が好ましく用いられる。アフィニティーリガンドが加水
分解に対して安定である場合には、過剰の活性化グルー
プはまた、例えば酸素を含む硫酸または硝酸などの希無
機酸によって加水分解的に除去できる。0.5M硫酸による
35〜60℃での反応(持続時間、1〜5時間)がここで好
ましい。
ニティー支持体が本発明による活性化支持体材料から調
製されることが見出された。質量輸送およびその結果と
してアフィニティー支持体の生産性もまた、改善され
る。これらの特長は、多数の活性化基が活性化支持体材
料上に付与されたことに基づくことは明らかであり、こ
れらの基は可撓性の線状ポリマーによって結合されてい
る。アフィニティー支持体の調製中には、とくに立体構
造的に好ましい活性化基が反応する。さらに、これらア
フィニティー支持体は、ポリマーに被われていない従来
の支持体材料よりも酸や塩基の作用に対してより抵抗性
がある。本発明による活性化支持体材料から調製され得
る固定化酵素もまた、従来の支持体材料上に固定化され
た酵素調製物に比較すると、改善された特性を有する。
れた記述をより広範囲に利用することができると考えら
れる。したがって、好ましい実施態様は単なる説明的開
示であり、開示を限定するものでは決してないことが了
解されるべきである。
らびに1992年4月16日出願の対応する出願DE 42 12 730
の完全な開示は、本出願中に参考文献として表示されて
いる。
本発明を限定するものではない。
重合は、攪拌器、滴下濾過および温度計を備えた適当な
大きさの三つ首フラスコの中で行う。洗浄は吸引フィル
ター上で吸引による濾過によって行う。
するオキシラン−活性化支持体の調製 2gの硝酸セリウム(IV)アンモニウム(25mlの2M HNO
3に溶解)を、50mlの沈澱させたFractogel(登録商標)
−TSK HW 65(S)および25mlの水との懸濁液を室温で
はげしく攪拌しながら混合する。1分間後に、3gのメタ
クリル酸2、3−エポキシプロピル30mlのジオキサン溶
液を加える。攪拌をさらに3時間続ける。次いで、反応
懸濁液を、最初に蒸留水で、次に0.05MのEDTA溶液で、
洗浄する。
シラン−活性化支持体の調製 調製は実施例1と同様にして行うが、Fractogel−TSK
HW 65(S)の代わりにLiChrospher(登録商標)−ジ
オール(粒子サイズ15〜25μm、孔サイズ80nm)を基部
支持体として用いる。
グラフィーのためのアフィニティー支持体の調製 イミノ二酢酸のジナトリウム塩の0.4M溶液200mlを、
実施例1によって調製した吸引濾過したオキシラン−活
性化支持体材料の100mlに加える(pH=11)。溶液を45
℃で24時間攪拌する。反応生産物を吸引濾過して、水で
洗浄して、未反応のオキシラン基を200mlの0.5M硫酸に
よる処理によって加水分解する(45℃で2時間)。
液(pH=2)、そして1M硝酸および0.5M水酸化ナトリウ
ム溶液で洗浄する。
ートクロマトグラフィーのためのアフィニティー支持体
の調製 イミノ二酢酸のジナトリウム塩の0.4M溶液200mlを、
実施例2によって調製した吸引濾過したオキシラン−活
性化支持体材料の100mlに加える(pH=9)。溶液を45
℃で24時間攪拌する。反応生産物を吸引濾過して、水で
洗浄して、未反応のオキシラン基を200mlの0.5M硫酸に
よる処理によって加水分解する(45℃で2時間)。
液(pH=2)および1M硝酸で洗浄する。最後に、Na燐酸
塩緩衝液(0.1M、pH7)で洗浄して中和する。
チオ」タンパク質吸着のためのアフィニティー支持体の
調製 ステップ1: 実施例1によって調製した吸引濾過したオキシラン−
活性化支持体材料の100mlを、200mlの4M NaHS溶液(pH
=11)に懸濁させて、懸濁液を室温で1時間攪拌する。
次いでこれを蒸留水で洗浄する。
に溶解、pH=11)をステップ1において得られた材料に
加えて、混合物を室温で1時間攪拌する。次いでゲルを
蒸留水で洗浄する。
トエタノールの0.5M Na2CO3溶液(pH=11)中で45分間
攪拌する。次いで、生産物をそれぞれ2回それぞれ200m
lの0.2M亜硫酸塩溶液(pH=1)、1M硝酸および0.05M N
aOHで洗浄する。
オ」タンパク質吸着のためのアフィニティー支持体の調
製 ステップ1: 100mlの実施例2によって調製した吸引濾過したオキ
シラン−活性化支持体材料を、200mlの4M NaHS溶液(pH
=9)に懸濁させて、懸濁液を室温で1時間攪拌する。
次いで、これを蒸留水で洗浄する。
に溶解、pH=9)をステップ1において得られた材料に
加えて、混合物を室温で1時間攪拌する。次いでゲルを
蒸留水で洗浄する。
トエタノールの0.5M Na2CO3溶液(pH=9)中で45分間
攪拌する。
溶液(pH=1)および1M硝酸で洗浄する。最後に、これ
をNa燐酸塩緩衝液(0.1M、pH7)で洗浄して中和する。
するアズラクントン−活性化支持体の調製 ステップ1:ポリ−(アクリロイルメチルアラニン)から
なるグラフト重合体 反応のために、出発物質を懸濁させてモノマー溶液お
よびイニシエーター溶液を調製する。
を20mlの水に4M NaOHを加えて溶解する。50mlのジオキ
サンを添加した後、混合物を45℃に加熱する。次いで、
pHを25%HClを用いてpH=1.5にする。
ニウムを50mlの2M HNO3に溶解する。
録商標)TSK HW 65(S)を75mlの蒸留水に懸濁して、
懸濁液をはげしく攪拌しながら100mlのジオキサンで希
釈する(約200回転/分)。
してからアルゴンを通す。
し、次いで、45℃に加熱したモノマー溶液を加える。得
られる混合物を45℃で3時間攪拌する。室温まで冷却し
た後、生産物を0.2M亜硫酸溶液(pH=1)、0.5M NaOH
およびアセトンで洗浄する。次いで、ゲルを60℃で24時
間で乾燥する。
えて、混合物を100℃で2時間攪拌する。生産物を吸引
濾過して、真空乾燥キャビネット中で60℃で24時間乾燥
する。
アズラクトン−活性化支持体の調製 ステップ1:ポリ−(アクリロイルメチルアラニン)から
なるグラフト重合体 反応のために、出発物質を懸濁させてモノマー溶液お
よびイニシエーター溶液を調製する。
を20mlの水に4M NaOHを加えて溶解する。50mlのジオキ
サンを添加した後、混合物を45℃に加熱する。次いで、
pHを25%HClを用いてpH=1.5にする。
ニウムを50mlの2M HNO3に溶解する。
(登録商標)−ジオールを75mlの蒸留水に懸濁して、懸
濁液をはげしく攪拌しながら100mlのジオキサンで希釈
する(約200回転/分)。
してからアルゴンを通す。
し、次いで、45℃に加熱したモノマー溶液を加える。得
られる混合物を45℃で3時間攪拌する。室温まで冷却し
た後、生産物を0.2M亜硫酸溶液(pH=1)およびNa燐酸
塩緩衝液(0.1M、pH7)で洗浄する。次いで、ゲルを60
℃で24時間乾燥する。
えて、混合物を100℃で2時間攪拌する。生産物を吸引
濾過して、真空乾燥キャビネット中で60℃で24時間で乾
燥する。
および25mlのNa燐酸塩緩衝液(20mM、pH=7.5)の混合
物に溶解する。実施例7で得られる1gのアズラクトン−
活性化支持体材料を加えて、懸濁液を室温で24時間振盪
する。
液に加えて、混合物をさらに1時間振盪する。その後、
生産物を吸引濾過して、25mM Na燐酸塩+0.15M NaCl(p
H=7.5)で洗浄する。
ゲル1g当たり20mgのγ−グロブリンを結合する(9g/リ
ットルNaClを含む50mMのトリス緩衝液(pH8)中で)。
た、アズラクトン−活性化支持体の調製 ステップ1:エポキシ基の導入 250mlのFractogel(登録商標)HW 65(S)(E.Merc
k、DE)を15gのNaOHの100ml水溶液中に懸濁する。60ml
のエピクロロヒドリンを、20分間かけて攪拌しながら滴
下して加える。次いで温度を70℃に上げて、混合物を90
分間攪拌する。次いで懸濁液を再び室温にまで放冷し
て、ゲルを吸引濾過する。次いでゲルをそれぞれ200ml
の水を用いて3回、メタノールで2回および水で2回洗
浄する。
ム緩衝液(pH11)中に懸濁させて、200gのNaHS(一水化
物、商品番号17.150 78(Jansen Chimica、DE))を攪
拌しながら加えて、混合物を1時間攪拌する。次いで生
産物を吸引濾過して、それぞれ200mlの水で3回洗浄し
て、500mlの0.5M硫酸中に再懸濁する。懸濁液を60℃に
攪拌しながら加熱して、2時間攪拌する。生産物を吸引
濾過して、それぞれ200mlの水で5回およびそれぞれ200
mlのアセトンで3回洗浄して、次いで乾燥する(60℃で
16時間)。
の付加 7gのビニルジメチルアズラクトンを35mlのジメチルホ
ルムアミドに溶解して、ステップ2で得られる3.5gのチ
オール−誘導体化したFractogel(登録商標)をこの溶
液に懸濁させる。600μlの1、8−ジアザビシクロ
(5.4.0)ウンデク−7−エン(商品番号803282、E.Mer
ck/DE)を加えて、混合物を室温で24時間攪拌する。ゲ
ルを吸引濾過して、それぞれ50mlのジオキサンで3回洗
浄して、300mlの酢酸エチルを用いてソクスレー抽出装
置中で16時間抽出する。ゲルを再び吸引濾過して、それ
ぞれ50mlのジオキサンで3回、それぞれ50mlのアセトン
で3回洗浄して、60℃で16時間乾燥する。
た、アズラクトン−活性化支持体の調製 溶液: a)スターター溶液: 4gの硝酸セリウム(IV)アンモニウムおよび7.5gの硝
酸(含量65%)を500mlの水に溶解する。
lの1、4−ジオキサンに溶解する。
(S)を125mlの水に懸濁する。スターター溶液を攪拌
しながら加えて、混合物を1分間攪拌する。次いでモノ
マー溶液を攪拌しながら加える。3時間攪拌した後、ゲ
ルをガラスフィルター吸引フィルター上で吸引濾過し
て、それぞれ250mlの次の洗浄溶液で処理する。水で2
回、0.05M燐酸ナトリウム緩衝液(pH7)で1回、水で1
回、0.05M EDTA溶液で1回、水で2回、アセトンで2
回、ジエチルエーテルで2回。生産物を35℃で真空乾燥
キャビネット中で乾燥させる。元素分析の結果は、C:5
3.7%、H:7.6%、N:0.4%である。
ム緩衝液(pH11)中に懸濁させて、200gのNaHS(一水化
物、商品番号17.150 78(Jansen Chimica、DE))を攪
拌しながら加えて、混合物を1時間攪拌する。次いで生
産物を吸引濾過して、それぞれ200mlの水で3回洗浄し
て、500mlの0.5M硫酸中に再懸濁する。懸濁液を60℃に
攪拌しながら加熱して、2時間攪拌する。生産物を吸引
濾過して、それぞれ200mlの水で5回およびそれぞれ200
mlのアセトンで3回洗浄して、次いで乾燥する(60℃で
16時間)。
の付加 7gのビニルジメチルアズラクトンを35mlのジメチルホ
ルムアミドに溶解して、ステップ2で得られる3.5gのチ
オール−誘導体化したFractogel(登録商標)をこの溶
液に懸濁させる。600μlの1、8−ジアザビシクロ
(5.4.0)ウンデク−7−エン(商品番号803282、E.Mer
ck/DE)を加えて、混合物を室温で24時間攪拌する。ゲ
ルを吸引濾過して、それぞれ50mlのジオキサンで3回洗
浄して、300mlの酢酸エチルを用いてソクスレー抽出装
置中で16時間抽出する。ゲルを再び吸引濾過して、それ
ぞれ50mlのジオキサンで3回、それぞれ50mlのアセトン
で3回洗浄して、60℃で16時間乾燥する。
た、アズラクトン−活性化支持体へのプロテインAの固
定化 50mgのプロテインAを10mlの緩衝液A(25mM燐酸ナト
リウム、pH7.5、1M硫酸ナトリウム)に溶解して、2gの
実施例10からのアズラクトン−誘導体化したFractogel
(登録商標)をこの溶液に懸濁させる。懸濁液を振盪機
上で24時間振盪する。次いでゲルを吸引濾過して、それ
ぞれ20mlの緩衝液B(25mM燐酸ナトリウム、pH9.0、1M
エタノールアミン)で3回洗浄して、50mlの緩衝液Bに
懸濁して、再度5分間振盪する。再びゲルを吸引濾過し
て、それぞれ20mlの緩衝液C(50mMトリス、pH7.4、9g/
リットルNaCl)で3回洗浄して、50mlの緩衝液Cに懸濁
する。
液: a)スターター溶液: 3gの硝酸セリウム(IV)アンモニウムおよび3gの硝酸
(含量65%)を190mlの水に溶解する。
1、4−ジオキサンに溶解する。
チレングリコール。
ングリコール。
l(登録商標)TSK HW65(S)へのグラフト 100mlの沈澱させたFractogel(登録商標)TSK HW65
(S)を66mlの水に懸濁する。攪拌しながらスターター
溶液を加えて、混合物を1分間攪拌する。次いで、攪拌
しながらモノマー溶液を加える。室温で180回転/分で
1時間攪拌した後、ゲルをガラスフィルター吸引フィル
ター上で吸引濾過して、それぞれ150mlの次の洗浄溶液
で処理する。水で4回、アセトンで3回、水で3回、10
%硫酸で1回、水で2回、0.2M燐酸塩緩衝液(pH7)で
1回、水で3回、アセトンで3回、ジエチルエーテルで
1回。活性化ゲルを35℃で真空乾燥キャビネット中で乾
燥させる。
衝液Iに溶解する。2.5gのステップ1からの活性化ゲル
をこの溶液に懸濁する。反応混合物を三角フラスコ中で
室温で20時間振盪する(200回転/分)。ゲルをガラス
フィルター吸引フィルター上で吸引濾過して、それぞれ
20mlの次の洗浄溶液で処理する。緩衝液Iで2回、水で
1回、緩衝液Lで2回。ゲルを吸引濾過して、それぞれ
20mlの新鮮滅菌緩衝液Lで3回洗浄して、緩衝液L中で
4℃で保存する。
化 溶液: a)スターター溶液: 15gの硝酸セリウム(IV)アンモニウムおよび15gの硝
酸(含量65%)を950mlの水に溶解する。
の1、4−ジオキサンに溶解する。
l(登録商標)TSK HW65(S)へのグラフト 500mlの沈澱させたFractogel(登録商標)TSK HW65
(S)を330mlの水に懸濁する。攪拌しながらスタータ
ー溶液を加えて、混合物を1分間攪拌する。次いで、攪
拌しながらモノマー溶液を加える。室温で180回転/分
で1時間攪拌した後、ゲルをガラス吸引フィルター上で
吸引濾過して、それぞれ500mlの次の洗浄溶液で処理す
る。水で4回、アセトンで3回、水で3回、10%硫酸で
1回、水で2回、0.2燐酸塩緩衝液(pH7)で2回、水で
3回。
k、DE)を5000mlの緩衝液Iに溶解する。ステップ1か
らの活性化ゲルをこの溶液に懸濁する。反応混合物を三
つ首フラスコ中で室温で22時間攪拌する。18時間後に、
pHを水酸化ナトリウム溶液で9.2に調整する。ゲルをガ
ラスフィルター吸引フィルター上で吸引濾過して、それ
ぞれ500mlの次の洗浄溶液で処理する。緩衝液Iで2
回、5mM CaCl2水溶液で1回、1M NaClおよび5mM CaCl2
を含む水溶液で2回、5mM CaCl2水溶液で1回、0.1M酢
酸ナトリウム(pH4)および5mM CaCl2を含む水溶液で2
回、5mM CaCl2水溶液で1回、6M尿素水溶液で2回、5mM
CaCl2水溶液で3回、緩衝液Lで2回。ゲルを吸引濾過
して、それぞれ500mlの新鮮滅菌緩衝液Lで3回洗浄し
て、緩衝液L中で4℃で保存する。
アフィニティー支持体の調製に著しく適していること、
そしてそれから調製されるアフィニティー支持体はアフ
ィニティークロマトグラフィーのための改善された特性
を有することが認められる。さらに、本発明による活性
化支持体材料は酵素の固定化に著しく適していること、
そしてその活性はとくに高分子量基質に対しての活性
が、十分に保持されることが認められる。
結合能 クロマトグラフィー条件: 装置:メルク−日立HPLC不活性システム カラム:Superformance(登録商標)50−10mm(E.Merc
k) 流速:1ml/分 溶出液:20mM Na燐酸塩緩衝液(pH=7)および1M NaCl 試料:10mg/mlのリゾチーム、溶出液に溶解 波長:280nm 結果を表2に要約する。
合能 クロマトグラフィー条件: 装置:メルク−日立HPLC不活性システム カラム:Superformance(登録商標)50−10mm(E.Merc
k) 流速:0.25ml/分 溶出液:20mM Na燐酸塩緩衝液(pH=7)および0.8M硫酸
アンモニウム 試料:5mg/mlのγ−グロブリン、溶出液に溶解 波長:280nm 結果を表3に要約する。
ヒト血清アルブミン(HSA)とヒトIgG(免疫グロブリン
G)の分離 クロマトグラフィー条件: 装置:メルク−日立HPLC不活性システム カラム:Superformance(登録商標)25−10mm(E.Merc
k) 吸着体:Fractogel(登録商標)TSK HW 65(S)に基づ
くアフィニティー支持体(実施例9により調製) 流速:1ml/分 溶出液A:50mMトリス(pH7.4)+NaCl(9g/リットル) 溶出液B:1M酢酸 段階勾配:10分後、溶出液Bに替える。
溶液 波長:280nm 結果: ヒト血清アルブミンは前溶媒中に2分後に溶出され、
一方、ヒトIgGは溶出液Bによって14分後に初めて溶出
される。
る、ヒト血清からのヒトIgG(免疫グロブリンG)のク
ロマトグラフィーによる分離 固定化プロテインAを有するふたつの生産物の結合特
性を比較した。
る(支持体:セファロース):吸着体A b)プロテインAが実施例12によって結合されている:
吸着体B それぞれの場合、緩衝液A(25mMトリス/HCl、pH8.
0)で平衡にしておいた250μlのゲルをミニカラム(50
0μl、Mobitec/DE)に充填する。250μlのヒト血清と
250μlの緩衝液Aの混合物を供して、カラムを2mlの緩
衝液Aで洗浄する。次いで、2mlの緩衝液B(50mMグリ
シン/HCl、pH3.0)で溶出する。血清試料および溶出液
中の免疫グロブリンG(IgG)の量を、免疫濁度測定法
によって測定する。結果を表4に要約する。
IIIフラグメント、pBr:プラスミドpBr322、LAMBDA:ラム
ダ−ファージのDNA)を、実施例13によって調製された
固定化ベンゾナーゼとともにインキュベート(37℃で振
盪)して、反応上清液中の高分子量基質の含量をいろい
ろな時間(1、4、16分)にアガロースゲル(0.8%)
上での電気泳動によって測定する。固定化ベンゾナーゼ
はトリス緩衝液pH8.0(50mMトリス、1mM MgCl2、50容量
%グリセリン、0.5容量%メルカプトエタノール)中に
懸濁する。それぞれ10μlの懸濁液を用いる。50μl各
DNA溶液をベンゾナーゼ懸濁液に加えて、混合物をイン
キュベートする。
Claims (18)
- 【請求項1】水酸基を含む基部支持体と、セリウム(I
V)塩とを、重合しうるモノマーの存在下で反応させ、
モノマーを重合させることにより得られる活性化支持体
材料。 ここで、ポリマーは前記基部支持体の表面に共有結合で
結合しており、 さらに、 a)基部支持体は前記セリウム(IV)塩によるラジカル
生成によって活性化された脂肪族水酸基を含み、 b)共有結合したポリマーは末端モノマーユニットを介
して基部支持体に結合され、 c)ポリマーは一般式Iのモノマーユニットを含み、 そして d)モノマーユニットは線状に結合している。 [式中、 R1、R2およびR3は互いに独立してHまたはCH3であり、
そして Xは、アズラクトン基またはオキシラン基を含む活性化
グループである] - 【請求項2】一般式I中のX基が一般式IIによる基であ
ることを特徴とする、請求項1に記載の活性化支持体材
料。 [式中、 R4はH、1〜5個のC原子を有するアルキルまたは6〜
12個のC原子を含むアリールであり、そして nは1から5までの整数である] - 【請求項3】一般式I中のX基が一般式IIIによる基で
あることを特徴とする、請求項1に記載の活性化支持体
材料。 [式中、 R5およびR6は互いに独立して、Hまたは1〜5個のC原
子を有するアルキルである] - 【請求項4】表面にポリマーがグラフト重合によって共
有結合されている水酸基を含む基部支持体から出発する
活性化支持体材料の調製法であって、水酸基を含む基部
支持体粒子を懸濁させて、セリウム(IV)イオンの存在
下で一般式IVのモノマーからなる溶液中で重合させ、 [式中、 R1、R2およびR3は互いに独立してHまたはCH3であり、 そしてYは、オキシラン基またはアズラクトン基または
それからアズラクトン基を生じることができる基を含
む、活性化または活性化が可能なグループである] そして、適宜、前駆体化合物をアズラクトン環系に変換
することを特徴とする。 - 【請求項5】一般式IVの異なるモノマーが共重合されて
いることを特徴とする、請求項4に記載の調製法。 - 【請求項6】一般式IVによるモノマーに加えて、一般式
Vのモノマーが共重合されていることを特徴とする請求
項4または5に記載の調製法。 [式中、 R1、R2およびR3は互いに独立して、HまたはCH3であ
る] - 【請求項7】一般式VII aまたはVII bのひとつに対応す
る基を活性化グループとして含むことを特徴とする活性
化支持体材料の調製法において、 チオール基を含む基部支持体を一般式VIIIのビニルアズ
ラクトンと反応させることを特徴とする、活性化支持体
材料の調製法。 [式中、 R1、R2およびR3は、互いに独立してHまたはCH3であ
り、そしてR5およびR6は、それぞれ互いに独立してHま
たは1〜5個のC原子を有するアルキルである] - 【請求項8】アフィニティーリガンドの結合のための、
請求項1〜3のいずれか1項に記載の活性化支持体材料
の使用。 - 【請求項9】酵素の固定化のための、請求項1〜3のい
ずれか1項に記載の活性化支持体材料の使用。 - 【請求項10】アフィニティーリガンドが請求項1〜3
のいずれか1項に記載の活性化支持体材料に結合してい
ることを特徴とする、アフィニティー支持体の調製法。 - 【請求項11】請求項10に記載の調製法によって調製さ
れるアフィニティー支持体。 - 【請求項12】プロテインAを含む請求項11に記載のア
フィニティー支持体。 - 【請求項13】アフィニティークロマトグラフィーによ
るバイオポリマーの精製における、請求項11または12に
記載のアフィニチイー支持体の使用。 - 【請求項14】免疫グロブリンの分離のための、請求項
11または12に記載のアフィニティー支持体の使用。 - 【請求項15】請求項1〜3のいずれか1項に記載の活
性化支持体材料に結合していることを特徴とする、酵素
固定化の方法。 - 【請求項16】請求項15に記載の調製法によって調製さ
れる固定化酵素。 - 【請求項17】請求項15に記載の調製法によって調製さ
れる固定化ベンゾナーゼ。 - 【請求項18】核酸の加水分解のための請求項17に記載
の固定化ベンゾナーゼ。
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