JP2005283572A - 選択結合性物質固定化担体 - Google Patents

Abstract

【課題】検出時のシグナルを増幅させる選択結合性物質固定化担体を提供する。
【解決手段】高分子表面に選択結合性物質を固定化した選択結合性物質固定化担体であって、担体表面に樹状分子があり、その末端の官能基と選択結合性物質が共有結合にて固定化されている。樹状分子末端の官能基がアシル基であり、樹状分子末端のアシル基がアミノ酸もしくはアミノ酸誘導体由来のものである。高分子は下記一般式（１）を構造単位とする。

【選択図】なし

Description

本発明は、被検物質と選択的に結合する物質（本明細書において「選択結合性
物質」）を固定化した担体に関する。

各種生物の遺伝情報解析の研究が始められており、ヒト遺伝子をはじめとして、多数の遺伝子とその塩基配列、また遺伝子配列にコードされる蛋白質およびこれら蛋白質から二次的に作られる糖鎖に関する情報が急速に明らかにされつつある。配列の明らかにされた遺伝子、蛋白質、糖鎖などの高分子体の機能については、各種の方法で調べることができる。主なものとしては、核酸についてはノーザンハイブリダイゼーション、あるいはサザンハイブリダイゼーションのような、各種の核酸／核酸間の相補性を利用して各種遺伝子とその生体機能発現との関係を調べることができる。蛋白質については、ウエスタンブロッティング法に代表されるような、蛋白質／蛋白質間の反応を利用し蛋白質の機能および発現について調べることができる。

近年、多数の遺伝子発現を一度に解析する手法としてＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）と呼ばれる新しい分析法、ないし方法論が開発され、注目を集めている。これらの方法は、いずれも核酸／核酸間ハイブリダイゼーション反応に基づく核酸検出・定量法である点で原理的には従来の方法と同じであり、蛋白質／蛋白質間あるいは糖鎖／糖鎖間や糖鎖／蛋白質間の相互作用に基づく蛋白質や糖鎖検出・定量にも応用が可能ではある。また、抗原-抗体相互作用ではELISA法(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)という、抗体と抗原及び酵素標識された抗原との結合により、標識酵素の活性を測定することで抗原を定性・定量分析する方法が主に用いられている。この手法においても標識体として蛍光物質が用いられ、この標識体からの蛍光を検出することで定性・定量が行われている。他には蛍光分子から他の分子へ励起エネルギーが移動する現象を利用した分析法、例えば、蛍光エネルギー移動法（FRET）や、分子ビーコン法などが挙げられるが、いずれも、検体に蛍光標識を施し、微弱な蛍光を高感度に検出することが必要不可欠になっている。これらの技術は、マイクロアレイ又はチップと呼ばれるガラスの平面基板片上に、多数のＤＮＡ断片や蛋白質、糖鎖が高密度に整列固定化されたものが用いられている点に大きな特徴がある。マイクロアレイ法の具体的使用法としては、例えば、研究対象細胞の発現遺伝子等を蛍光色素等で標識したサンプルを平面基板片上でハイブリダイゼーションさせ、互いに相補的な核酸（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）同士を結合させ、その箇所を高解像度解析装置で高速に読みとる方法や、電気化学反応にもとづく電流値等の応答を検出する方法が挙げられる。こうして、サンプル中のそれぞれの遺伝子量を迅速に推定できる。

核酸を基板上に固定化するための技術としては、スライドガラス等の平坦な基板の上にポリ−Ｌ−リジン、アミノシラン等をコーティングして、スポッターと呼ばれる点着装置を用い、各核酸を固定化する方法などが開発されている（例えば、特許文献１参照）。

また、ＤＮＡチップに用いられる核酸プローブ（基板上に固定化された核酸）は、従来の数百〜数千塩基の長さのｃＤＮＡおよびその断片から、検出の際のエラーを下げることと、合成機で容易に合成できるという理由から、核酸プローブとしてオリゴＤＮＡ（オリゴＤＮＡとは塩基数が１０〜１００塩基までのものをいう）を用いようとしている。この際、オリゴＤＮＡとガラス基板とを共有結合にて、結合させている（例えば特許文献２参照）。樹状分子を用いたＤＮＡの固定化手法としてガラス基板上にポリアミドアミンのデンドリマーを用い、樹状分子表面にスクシンイミド基、チオシアネート基、グリシジル基を結合させ、末端アミノ化ＤＮＡと共有結合させて固定化する方法がある。（例えば非特許文献１）
特表平１０−５０３８４１号公報（特許請求の範囲） 特開２００１−１０８６８３号公報（特許請求の範囲および実施例） ヌクレイック アシッズ リサーチ（Nucleic Acids Research）、英国, 2002, Vol. 30, No.2, e10

しかし、検体DNAの濃度が非常に薄い場合、ハイブリダイゼーション後のシグナルが微弱になり、検出が困難になるという問題点がある。本発明が解決しようとする課題は、上記のような樹状分子を高分子表面に固定化し、その末端アシル基と末端アミノ化されたＤＮＡとを共有結合させることにより、樹状ＤＮＡが固定化された担体を作製し、ハイブリダイゼーションのシグナルを増幅する担体を提供することである。

（１）高分子表面に選択結合性物質を固定化した選択結合性物質固定化担体であって、該高分子表面に樹状分子があり、該樹状分子の末端の官能基と選択結合性物質が共有結合にて固定化されていることを特徴とする選択結合性物質固定化担体。
（２）該樹状分子末端の官能基がアシル基である請求項１に記載の選択結合性物質固定化担体。
（３）該高分子が下記一般式（１）を構造単位として有する請求項１または２に記載の選択結合性物質固定化担体。

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３はそれぞれ炭素数１から２０のアルキル基、炭素数６から１８のアリール基、又は水素原子を表す。また、Ｘは、Ｏ、ＮＲ^３またはＣＨ₂を表す。）
（４）該樹状分子末端のアシル基がアミノ酸もしくはアミノ酸誘導体由来のものである請求項２または３のいずれかに記載の選択結合性物質固定化担体
（５）該樹状分子末端のアシル基がグルタミン酸、グルタミン酸誘導体、アスパラギン酸もしくはアスパラギン酸誘導体由来のものである請求項２または３のいずれかに記載の選択結合性固定化担体。
（６）該樹状分子が少なくともアミノ酸もしくはエチレングリコールを含む請求項１に記載の選択結合性物質固定化担体
（７） 選択結合性物質が核酸である請求項１から６のいずれかに記載の選択結合性固定化担体。

本発明により、
高分子表面に樹状分子を介して選択結合性物質を固定化された選択結合性固定化担体を提供でき、選択結合性物質の選択的結合シグナルを増幅させることが可能となる。

本発明は、高分子表面に選択結合性物質を固定化した選択結合性物質固定化担体であって、該高分子表面に樹状分子があり、該樹状分子の末端の官能基と選択結合性物質が共有結合にて固定化されていることを特徴とする選択結合性物質固定化担体である。

本発明の選択結合性物質固定化担体およびその製造方法を具体的に以下に述べる。

本発明者らは、鋭意実験を重ねた結果、樹状分子を高分子表面に形成させ、その樹状分子の末端カルボキシル基と核酸を共有結合により固定化し、ハイブリダイゼーションのシグナルを増幅させることを見いだした。

本発明で樹状分子とはデンドリマー、デンドロン、ハイパーブランチ構造などの様に繰り返し単位で枝分かれ構造を持つもので、分子形態が三次元的広がりを持つことが知られている（図１、２、３参照）。この樹状分子を次に挙げる反応経路で表面に形成することが可能である。まず、高分子表面に足がかりとなる官能基を生成する。ついでこの官能基を核として１つの分子中にこの官能基と結合できる官能基Ａと、担体上の官能基とは結合しない官能基Ｂを２つ以上有する分子を結合させる。官能基Ｂは活性化することにより官能基Ａと結合可能となる。例えば１分子中に官能基ＢがＸ個の場合、このような官能基ＢとＡを結合させるステップをｎ回繰り返すと、理論上、担体上の１つの官能基を足がかりに、Ｘのｎ乗個の官能基Ｂを生成することが可能となる。

本発明において、高分子表面に樹状分子があるとは、表面の官能基と共有結合を介して樹状分子が固定化されていることを意味する。

樹状分子の末端に結合されている官能基としては、特にアシル基（ＲＣＯ−：Ｒは炭化水素）が、その作製の容易さや選択結合性物質の固定化の観点から好ましく用いることができる。

樹状分子末端の官能基として好ましいアシル基を有するアシル化合物としては、カルボキシル基（ＲＣＯＯＨ）カルボシキル基の水素原子が置換した各種カルボン酸塩（ＣＯＯＭ：ＭはＮａやＫなどの金属）やエステル（ＲＣＯＯＲ’：Ｒ’は炭化水素）があり、またカルボキシル基のヒドロキシ基が置換した酸アミド（ＲＣＯＮＨ_２）、酸アジド（ＲＣＯＮ_３）、酸塩化物（ＲＣＯＣｌ）酸無水物、ニトリル（ＲＣＮ）などが挙げられる。また、アミノ基やチオール基と縮合反応を促進するアシル化合物としてアシル基にマレイミド基やスクシイミド基などが挙げられる。

この樹状分子の作製方法は、具体的には、例えば、以下のようになる。すなわち、カルボキシル基を高分子の表面に生成し、エステル活性化剤などでカルボキシル基を活性化し、その後、アミノ基およびカルボキシル基を持つアミノ酸のアミノ基を、表面の活性化カルボキシル基と反応させることにより、高分子表面に多数のカルボキシル基を生成させることができる。ここでエステル活性化剤の例としてはスクシンイミジル４−［マレイミドフェニル］ブチレート（ＳＭＰＢ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチロキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、ｍ−マレイミドプロピオニックアシド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＰＳ）及びＮ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、Ｎ−ヒドロキシスルフォスクシンイミド（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などが挙げられる。すなわち、これらのエステル活性化剤を用い、１分子に２つのカルボキシル基を有するアミノ酸を反応物として用いた場合、カルボキシル基の活性化とアミノ酸との反応をｎサイクル行うと、２のｎ乗個のカルボキシル基が樹状の末端に形成される。

本発明では、該樹状分子末端のアシル基がアミノ酸もしくはアミノ酸誘導体由来のものであることが好ましく、該樹状分子が少なくともアミノ酸もしくはエチレングリコールを含むことが好ましい。さらに、樹状分子末端のアシル基がグルタミン酸、グルタミン酸誘導体、アスパラギン酸もしくはアスパラギン酸誘導体由来のものであることが好ましい。

１分子に２つのカルボキシル基を持つアミノ酸の例として、グルタミン酸やその誘導体、アスパラギン酸やその誘導体などが挙げられ、これらを好ましく用いることができる。その後、高分子樹状分子の末端にアミノ基や水酸基を有する選択結合性物質を共有結合により固定化することが可能となる。一般的には、これらの結合の反応を助長するため、ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３'−スルホナートなどの様々な縮合剤が用いられている。これらの中でも、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(ＥＤＣ)や４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロライド（ＤＭＴ−ＭＭ）は、毒性が少ないことや、反応系からの除去が比較的容易なことから、選択結合性物質と表面のカルボキシル基との縮合反応にはもっとも有効な縮合剤の１つである。これらＥＤＣなどの縮合剤は、選択結合性物質の溶液と混ぜて使用しても良いし、カルボキシル基が表面に生成された高分子表面を予めＥＤＣの溶液に作用させておき、樹状分子末端のカルボキシル基を活性化しておいても良い。樹状分子中もしくは末端の運動性の高い分子を挿入することにより、末端に固定化された選択結合性物質の運動性を助長して、結果として選択結合性物質の反応性を向上させることが可能である。挿入分子としては特に制限はないが、両末端にアミノ基とカルボキシル基を有する分子が好ましく用いることができる。具体的にはアミノ酸やエチレングリコール、アルキル鎖、糖鎖などが挙げられる。

本発明の選択結性物質固定化担体の高分子としては特には限定されないが、例えば、ポリメチルメタクリレート、ポリエチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリアクリルニトリル、ポリ酢酸ビニル、ポリカーボネートなどが挙げられ、これらの高分子が表面に露出していれば、他の成分が高分子中に混入していても良い。

また、高分子表面に官能基を生成する方法としては、プラズマ処理などで、強制的に酸化させることにより担体表面にカルボキシル基や、水酸基等を生成することもできる。その他の方法としては、高分子表面の側鎖を加水分解するなどの方法を用いることができ、この方法は簡便な方法であることから好ましく用いることができる。

したがって、本発明の選択結合性物質固定化担体の高分子としては、側鎖構造を有する樹脂であることが好ましく、側鎖構造を有する樹脂としては、具体的にはポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリ酢酸ビニル等のビニル系樹脂等が挙げられるが、特に下記一般式（１）で表せられる構造を持つ樹脂が特に好ましい。

（一般式（１）のＲ¹、Ｒ²、Ｒ³は、アルキル基、アリール基もしくは水素原子を表す。）
上記の構造単位を持つ樹脂であると、酸やアルカリの加水分解にて、容易に側鎖がカルボキシル基となる。

本発明において、一般式（１）で表せられる樹脂の平均重合度の好ましい範囲は、１００から１万である。特に好ましくは、２００以上、５０００以下である。なお、数平均重合度はＧＰＣ（ゲルパーメイションクロマトグラフ）を用い定法にて樹脂の分子量を測定することにより、容易に測定できる。

一般式（１）において、Ｒ¹およびＲ²はアルキル基、アリール基または水素原子を表し、それぞれ同一であっても異なっていても良い。前記アルキル基は直鎖状であってもまたは枝別れしていても良く、好ましくは１から２０の炭素数を有する。前記アリール基は、好ましくは６から１８、さらに好ましくは６から１２の炭素数を有する。官能基ＸはＯ、ＮＲ³ 、またはＣＨ₂の中から任意に選ばれる。Ｒ³は前記Ｒ¹およびＲ²と同様に定義される官能基である。

前記各種のような官能基を含む樹脂で、好ましいものとしては、例えば、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリエチルメタクリレート（ＰＥＭＡ）またはポリプロピルメタクリレートのポリメタクリル酸アルキル（ＰＡＭＡ）等がある。これらの中で特に好ましいものは、ポリメチルメタクリレートである。さらに、ポリ酢酸ビニル、ポリメタクリル酸シクロヘキシルまたはポリメタクリル酸フェニル等も用いることができる。また、前記樹脂構成要素を組み合わせた、または前記樹脂の構成要素に他の一種または複数種の樹脂の構成要素を加えた構造の共重合体も用いることができる。前記他の樹脂としては、ポリスチレン、ポリアクリロニトリルまたはポリアミド等がある。

このような材質からなる高分子表面にカルボキシル基を生成する手段としては、アルカリ、酸などで処理するほか、温水中での超音波処理、酸素プラズマ、アルゴンプラズマ、放射線に高分子表面を晒す方法などが挙げられるが、表面の損傷が少なく、また、容易に実施できるという点からアルカリ、もしくは酸を高分子表面に作用させ、表面にカルボキシル基を生成させることが好ましい。具体的な例としては、水酸化ナトリウムや硫酸の水溶液（好ましい濃度は、１Ｎ〜２０Ｎ）に高分子表面を作用させ、好ましくは３０℃から８０℃の温度にして、１時間から１００時間保持すればよい。

ついで、本発明の選択結合性物質固定化担体の具体的な使用方法の好ましい形態についてのべる。本発明の選択結合性物質固定化担体は、選択結合性物質が多数固定化されている、マイクロアレイと呼ばれる担体に用いることが好ましい。ここで、「選択結合性物質」とは、被検物質と直接的又は間接的に、選択的に結合し得る物質を意味し、代表的な例として、核酸、タンパク質、糖類及び他の抗原性化合物を挙げることができる。核酸は、ＤＮＡやＲＮＡでもＰＮＡでもよい。特定の塩基配列を有する一本鎖核酸は、該塩基配列又はその一部と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイブリダイズして結合するので、本発明でいう「選択結合性物質」に該当する。また、タンパク質としては、抗体及びFabフラグメントやF(ab')2フラグメントのような、抗体の抗原結合性断片、並びに種々の抗原を挙げることができる。抗体やその抗原結合性断片は、対応する抗原と選択的に結合し、抗原は対応する抗体と選択的に結合するので、「選択結合性物質」に該当する。糖類としては、多糖類が好ましく、種々の抗原を挙げることができる。また、タンパク質や糖類以外の抗原性を有する物質を固定化することもできる。本発明に用いる選択結合性物質は、市販のものでもよく、また、生細胞などから得られたものでもよい。「選択結合性物質」として、特に好ましいものは、核酸である。この核酸の中でも、オリゴ核酸と呼ばれる、長さが１０塩基から１００塩基までの核酸は、合成機で容易に人工的に合成が可能であり、また、核酸末端のアミノ基修飾が容易であるため、担体表面への固定化が容易となることから好ましい。さらに、２０塩基未満ではハイブリダイゼーションの安定性が低いという観点から２０〜１００塩基がより好ましい。ハイブリダイゼーションの安定性を保持するため、特に好ましくは４０〜１００塩基の範囲である。

本発明の高分子表面に固定化された樹状分子とこのような選択結合性物質とを固定化するためには、先に述べたＥＤＣやＤＭＴ−ＭＭのような縮合剤を用いて固定化すればよい。そして高分子表面の樹状分子末端のアシル基と選択結合性物質のアミノ基とを反応させた場合は、アミド結合により高分子表面の樹状分子と選択結合性物質が固定化されることになり、高分子表面の樹状分子のカルボキシル基と選択結合性物質の水酸基とを反応させた場合は、エステル結合により高分子表面と選択結合性物質とが固定化されることになる。選択結合性物質を含む試料を高分子表面に作用させる際の温度は、５℃〜９５℃が好ましく、１５℃〜６５℃が更に好ましい。処理時間は通常５分〜２４時間であり、１時間以上が好ましい。

前述した方法により、高分子表面に樹状分子のアシル基を介して選択結合性物質を固定化することにより、高密度に選択結合性物質を固定化でき、さらに、高分子表面に直接固定化した場合に比べ、固定化された選択結合性物質の空間的な自由度が高いという推定理由のために、検体と高いハイブリダイゼーション効率を提供する高分子表面を得ることができる。

以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１
（樹状分子固定化ＰＭＭＡ基板の作製１）
樹状分子固定化PMMA基板の作製スキームを図２に示す。ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）板（（株）クラレ製；コモグラス押し出し板、厚さ１mm、平均分子量１５万）を１０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に７０℃で１５時間浸漬した。次いで、純水、０．１Ｎ ＨＣｌ水溶液、純水の順で洗浄した。このようにして、基板表面のＰＭＭＡの側鎖を加水分解して、カルボキシル基を生成した。次いでＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（以降Sulfo-NHSと略す）１００ｍｇ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(ＥＤＣ)３５０ｍｇを２−モルホリノエタンスルホン酸・一水和物（ＭＥＳ）バッファー（０．１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ４．０に調整）に溶解させた。これらの混合溶液に上記加水分解後のＰＭＭＡ基板を浸漬し、マイクロスターラーで撹拌した。１時間撹拌後、上記基板をグルタミン酸もしくはアスパラギン酸をそれぞれ８０ｍｇ含むＭＥＳ溶液（１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ７．０に調整）に浸漬し、マイクロスターラーで撹拌した。１時間攪拌後、この溶液にＥＤＣを１００ｍｇ加え１５時間撹拌し、グルタミン酸を成長させ、ＤＮＡ固定化基板１（グルタミン酸を用いた場合）、２（アスパラギン酸を用いた場合）を作製した。

実施例２
（樹状分子固定化ＰＭＭＡ基板の作製２）
樹状分子固定化PMMA基板の作製スキームを図３に示す。
実施例１と同様の方法でＰＭＭＡ基板表面にカルボキシル基を生成させた。次いで（Ａ）Sulfo-NHS１００ｍｇ、ＥＤＣ３５０ｍｇをＭＥＳバッファー（ｐＨ４．０）に溶解させた。これらの混合溶液に上記加水分解後のＰＭＭＡ基板を浸漬し、マイクロスターラーで１時間撹拌撹拌した。（Ｂ）上記基板をグリシンを８０ｍｇ含むＭＥＳ溶液（ｐＨ７．０）に浸漬し、マイクロスターラーで撹拌した。（Ｃ）再び操作（Ａ）を行い、（Ｄ）このＰＭＭＡ基板をグルタミン酸８０ｍｇ含むＭＥＳ溶液（ｐＨ７．０）に浸漬し、マイクロスターラーで撹拌した。
これら（Ａ）から（Ｄ）の操作を合計２回繰り返し、ＤＮＡ固定化基板３を得た。

実施例３
（樹状分子固定化ＰＭＭＡ基板の作製３）
実施例２で作製した樹状分子固定化ＰＭＭＡ基板に再び操作（Ａ）を施し、樹状分子末端にスクシンイミド基を修飾し、ＤＮＡ固定化基板４を得た。

実施例４
（樹状分子固定化ＰＭＭＡ基板の作製４）
実施例２で作製したDNA固定化基板３に再び（Ａ）、（Ｂ）の操作を施し、樹状分子末端にグリシン分子を結合させ、DNA固定化基板５とした。

実施例５
（樹状分子固定化ＰＭＭＡ基板の作製５）
実施例３の作製したDNA固定化基板４にロイシン８０ｍｇを含むＭＥＳ溶液（ｐＨ７．０）に浸漬し、マイクロスターラーで撹拌して、末端にロイシン分子を固定化させDNA固定化基板６とした。

実施例６
（樹状分子固定化ＰＭＭＡ基板の作製６）
実施例１と同様の方法でＰＭＭＡ基板表面にカルボキシル基を生成させた。次いで実施例２の操作（Ａ）から（Ｄ）を行い、再び操作（Ａ）を施した後アミノ基とカルボキシル基を両末端に有するエチレングリコール誘導体（Amino-dPEG, Quanta BioDesign 商品コード 10244）５０ｍｇを含むＭＥＳ溶液（ｐＨ７．０）に浸漬し、マイクロスターラーで撹拌した。さらに操作（Ｃ）、（Ｄ）を施し、エチレングリコールを含むＤＮＡ固定化基板７とした。

比較例１
（樹状分子固定化ガラス基板の作製およびプローブDNAの固定化）
ガラス基板への樹状カルボン酸の固定化およびプローブDNAの固定化は非特許文献（Nucleic Acids Research, 2002, Vol. 30, No.2, e10）に従って行った。スライドガラスをピラハ溶液（濃硫酸と過酸化水素水を２：１の割合で混合したもの）に３０分間浸漬した。ついで、ＡＰＳ（３−アミノプロピルトリエトキシシラン；信越化学工業（株）製）を２重量％の割合で純水に溶解した後、上記のスライドガラスを１時間浸漬し、この溶液から取り出した後に１１０℃で１０分間乾燥した。このようにして、ガラスの表面にアミノ基を導入した。（Ｅ）このアミノ化ガラス基板を無水グルタル酸（ＧＡ）の飽和N,N-ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液に浸漬し、一晩放置した。ついで、（Ｆ）１ｍｏｌ／ｌのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）と１ｍｏｌ／ｌのＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）をＤＭＦに溶解させ、上記基板を２時間浸漬した。ついでこの基板をＤＭＦで洗浄後、ポリアミドアミン（アルドリッチ社製：１０重量％）のメタノール溶液に浸漬した。その後、上記（Ｅ）および（Ｆ）と同じ操作を行い、ＤＮＡ固定化基板８を作製した。

（プローブＤＮＡの固定化）
配列番号１（６０塩基、５'末端アミノ化）、のＤＮＡを合成した。5'-ACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCATCTGGA-3この配列番号１のＤＮＡは５'末端がアミノ化されている。

これらのＤＮＡを、純水に０．２７ｎｍｏｌ／μｌの濃度で溶かして、ストックソリューションとした。基板に点着する際は、ＰＢＳ(ＮａＣｌを８ｇ、Ｎａ_２ＨＰＯ４・１２Ｈ_２Ｏを２．９ｇ、ＫＣｌを０．２ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４を０．２ｇ純水に溶かし１ｌにメスアップしたものにｐＨ調整用の塩酸を加えたもの、ｐＨ５．５)でプローブの終濃度を０．０２７ｎｍｏｌ／μｌとし、かつ、担体表面のカルボキシル基とプローブＤＮＡの末端のアミノ基とを縮合させるため、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(ＥＤＣ)を加え、この終濃度を５０ｍｇ／ｍｌとした。そして、これらの混合溶液をおよそ２００ｎｌ取り出して、これを基板に点着した。次いで、基板を密閉したプラスチック容器入れて、３７℃、湿度１００％の条件で２０時間程度インキュベートして、純水で洗浄した。

（検体ＤＮＡの調整）
検体ＤＮＡとして、上記ＤＮＡ固定化基板とハイブリダイズ可能な塩基配列を持つ配列番号５のＤＮＡ（９６８塩基）を用いた。調整方法を以下に示す。

検体DNAとして、上記DNA固定化基板とハイブリダイズ可能な塩基配列を持つDNA（９６８ｂ.ｐ.）を用いた。調整方法を以下に示す。
以下の配列の核酸を合成した。
5'-GGGCGAAGAAGTTGTCCATA-3' （配列番号２：20塩基）
5'-GCAGAGCGAGGTATGTAGGC-3' （配列番号３：20塩基）
これを純水にとかして濃度を１００μＭとした。次いで、ｐKＦ３ プラスミドＤＮＡ（タカラバイオ（株）製品番号；３１００）（配列番号４：２２６４塩基）を用意して、これをテンプレートとし、配列番号２および配列番号３のＤＮＡをプライマーとして、ＰＣＲ反応（Polymerase Chain Reaction）により増幅を行った。

ＰＣＲの条件は以下の通りである。すなわち、ExTaq ２μｌ、 10×ExBuffer ４０μｌ、 dNTP Mix ３２μｌ（以上はタカラバイオ（株）製；製品番号ＲＲ００１Ａに付属）、配列番号２の溶液を２μｌ、配列番号３の溶液を２μｌ、 テンプレート（配列番号４）を０．２μｌ加え、純水によりトータル４００μｌにメスアップした。これらの混合液を、４つのマイクロチューブに分け、サーマルサイクラーを用いてＰＣＲ反応を行った。これを、エタノール沈殿により精製し、４０μｌの純水に溶解した。

次いで、９塩基のランダムプライマー（タカラバイオ（株）製；製品番号３８０２）を６ｍｇ／ｍｌの濃度に溶かし、上記のＰＣＲ反応後精製したＤＮＡ溶液に２μｌ加えた。この溶液を１００℃に加熱した後、氷上で急冷した。これらにＫｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ（株）製；製品番号２１４０ＡＫ）付属のバッファーを５μｌ、ｄＮＴＰ混合物（dATP、dTTP、dGTPの濃度はそれぞれ２．５ｍＭ、dCTPの濃度は４００μＭ）を２．５μｌ加えた。さらに、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ（アマシャムファルマシアバイオテク製；製品番号ＰＡ５３０２１）を２μｌ加えた。この溶液に１０ＵのＫｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔを加え、３７℃で２０時間インキュベートし、Ｃｙ３で標識された検体ＤＮＡ（配列番号５：９６８塩基）を得た。さらにこれをエタノール沈殿により精製し、乾燥した。

この標識化された検体DNAを、１重量％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、５×ＳＳＣ（５×ＳＳＣとはＮａＣｌを４３．８ｇ、クエン酸３ナトリウム水和物を２２．１ｇの純水にとかし、２００ｍｌにメスアップしたもの。またＮａＣｌを４３．８ｇ、クエン酸３ナトリウム水和物を２２．１ｇ純水にとかし、１ｌにメスアップしたものを１×ＳＳＣと表記し、これの１０倍濃縮液を１０×ＳＳＣ、５倍希釈液を０．２×ＳＳＣと表記する。）、０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．０１重量％サケ精子ＤＮＡの溶液（各濃度はいずれも終濃度）、４００μｌに溶解し、ハイブリダイゼーション用の溶液とした。

（ハイブリダイゼーション）
上記で得られたプローブＤＮＡを固定化したそれぞれの基板に上記検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションさせた。具体的には、先に用意したプローブ核酸が固定化されている担体にハイブリダイゼーション用の溶液を１０μｌ滴下し、その上にカバーガラスをかぶせた。また、カバーガラスの周りをペーパーボンドでシールし、ハイブリダイゼーションの溶液が乾燥しないようにした。これを、プラスチック容器の中に入れ、６５℃、湿度１００％の条件で１０時間インキュベートした。インキュベート後、カバーガラスを剥離後に洗浄、乾燥した。

（測定）
ＤＮＡチップ用のスキャナー（Axon Instruments社のGenePix 4000A）に上記処理後のＤＮＡ固定化基板をセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧を５００Ｖに設定した状態で測定を行った。その結果を表１に示す。

ＤＮＡ固定化基板１と２を用いた場合の結果より、末端アシル基がグルタミン酸由来でもアスパラギン酸由来でもハイブリダイゼーション効率に対して同様の効果が得られた。またＤＮＡ固定化基板３のより樹状分子の基本骨格にグリシンが存在しても、末端のアシル基の数が同じであれば、ほぼ同様なハイブリダイゼーション効率を示す結果を得た。また、ＤＮＡ固定化基板４の結果から末端を活性化剤で修飾した場合でも、ハイブリダイゼーション効率は保持された。さらに、DNA固定化基板５および６の結果から、樹状末端がグリシンでもロイシンでも同様なハイブリダイゼーション効率を示した。DNA固定化基板７の結果から、樹状分子がアミノ酸だけでなくエチレングリコール分子を持つ場合にも同様のハイブリダイゼーション効率が得られた。一方、ＤＮＡ固定化基板８の場合ＤＮＡ固定化基板１から７に比べハイブリダイゼーションの効率が低いことが示された。すなわちガラス基板と比較し、樹状分子固定化ＰＭＭＡ基板をＤＮＡ固定化基板として用いることにより、ハイブリダイゼーション効率が飛躍的に向上することが示された。

デンドリマーの構造 デンドロンの構造 ハイパーブランチの構造 ＰＭＭＡ表面への選択結合性物質（ＤＮＡ）の固定化反応スキーム１ ＰＭＭＡ表面への選択結合性物質（ＤＮＡ）の固定化反応スキーム２

符号の説明

１ ＰＭＭＡ膜
２ スクシンイミド基で修飾されたカルボキシル基
３ グルタミン酸もしくはアスパラギン酸
４ 成長
５ 選択結合性化合物（ＤＮＡ）
６ グリシン
７ グルタミン酸
８ 操作（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）（Ｄ）の繰り返し

Claims (7)

1. 高分子表面に選択結合性物質を固定化した選択結合性物質固定化担体であって、該高分子表面に樹状分子があり、該樹状分子の末端の官能基と選択結合性物質が共有結合にて固定化されていることを特徴とする選択結合性物質固定化担体。
2. 該樹状分子末端の官能基がアシル基である請求項１に記載の選択結合性物質固定化担体。
3. 該高分子が下記一般式（１）を構造単位として有する請求項１または２に記載の選択結合性物質固定化担体。
   （式中、Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３はそれぞれ炭素数１から２０のアルキル基、炭素数６から１８のアリール基、又は水素原子を表す。また、Ｘは、Ｏ、ＮＲ^３またはＣＨ₂を表す。）
4. 該樹状分子末端のアシル基がアミノ酸もしくはアミノ酸誘導体由来のものである請求項２または３のいずれかに記載の選択結合性物質固定化担体
5. 該樹状分子末端のアシル基がグルタミン酸、グルタミン酸誘導体、アスパラギン酸もしくはアスパラギン酸誘導体由来のものである請求項２または３のいずれかに記載の選択結合性固定化担体。
6. 該樹状分子が少なくともアミノ酸もしくはエチレングリコールを含む請求項１に記載の選択結合性物質固定化担体
7. 選択結合性物質が核酸である請求項１から６のいずれかに記載の選択結合性固定化担体。