WO2007086619A1 - 不飽和官能基を有する修飾糖タンパク質 - Google Patents

不飽和官能基を有する修飾糖タンパク質 Download PDF

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glycoprotein
antibody
protein
group
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Inventor
Kaoru Terazawa
Original Assignee
Mitsubishi Rayon Co., Ltd.
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/248—IL-6
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2318/00—Antibody mimetics or scaffolds
    • C07K2318/10—Immunoglobulin or domain(s) thereof as scaffolds for inserted non-Ig peptide sequences, e.g. for vaccination purposes

Definitions

  • glycoprotein having an unsaturated functional group having an unsaturated functional group
  • the present invention relates to a glycoprotein, particularly a modified glycoprotein suitable for immobilization on a support or the like.
  • DNA microarray a DNA chip
  • a DNA chip for example, between a cell with a certain physiological characteristic and a control cell, the gene information expressed in the cell is compared by mRNA amount, and the physiological characteristic and the gene expression are compared. The correlation is analyzed.
  • a method for directly analyzing the target information at the protein level is also attracting attention. For example, protein-pharmaceutical interactions and protein-protein interactions are important information in the development of new drugs and the reduction of side effects.
  • protein immobilization methods include a method in which a carboxyl group is exposed on a carrier and coupled with a protein amino group (amino coupling method: JP-A-5-340948). There is known a method of coupling a protein modified with PDEA or the like through a disno-refin bond (thiol force coupling method). In addition, there is also known a method in which His-Tag is introduced into a protein and Ni2 + is bonded to a carrier treated with NTA (Nitrilotriacetic acid) instead of the covalent bond fixing.
  • the immobilization method can be applied, for example, when a device for examining an interaction with an immobilized protein, represented by a protein chip, is produced. So In this case, the device is required to reliably fix a minute amount of protein, and it is desired that the obtained device has high detection sensitivity. Disclosure of the invention
  • the above-described protein immobilization method using amino coupling imposes a limitation that acidic proteins cannot be immobilized.
  • acidic proteins can be immobilized, but a large amount of protein is required.
  • the immobilization method using His-Tag has a problem that although it is initially immobilized, it gradually dissociates.
  • chemical modification of the protein at random positions may impair the original functions of the protein (enzyme activity, ability to bind to other molecules, etc.).
  • the present invention provides a modified glycoprotein that solves the above problems.
  • the present inventor has introduced a minute amount of protein by introducing an unsaturated functional group into the sugar chain portion of a glycoprotein represented by an antibody.
  • the glycoprotein can be immobilized with the active center exposed and retaining its function, and this effort has been completed.
  • the present invention is as follows.
  • a modified glycoprotein having an unsaturated functional group in the sugar chain of the glycoprotein having an unsaturated functional group in the sugar chain of the glycoprotein.
  • glycoprotein examples include antibodies.
  • a method for producing a modified glycoprotein having an unsaturated functional group in a sugar chain part of a glycoprotein comprising causing a vinylating agent to act on the glycoprotein.
  • a method for producing a modified glycoprotein having an unsaturated functional group in the sugar chain portion of the glycoprotein which comprises imparting a reducing end to the glycoprotein and then allowing a vinylating agent to act.
  • a high molecular weight material obtained by polymerizing the modified glycoprotein and a polymerizable monomer obtained by polymerizing the modified glycoprotein and a polymerizable monomer.
  • a protein sensor comprising the protein chip or ⁇ - ⁇ A S chip.
  • glycoprotein is a general term for proteins linked to a sugar chain, and means a complex protein in which the sugar moiety is composed of 2 to 6 types of monosaccharides and covalently bound to the protein.
  • Specific examples include serum proteins such as albumin, hematopoietic factors such as erythropoietin, immunomodulators such as antibodies and interferons, enzymes such as TPA, fibronectin and collagen.
  • the present invention is not limited to these types, and any glycoprotein can be used in the present invention.
  • an unsaturated functional group is introduced at the reducing end of the sugar chain portion of the glycoprotein.
  • Unsaturated functional groups to be introduced include (meth) atalinole group, (meth) atalyloyl group, maleoi / le group, fumaroidole group, benzoyl group, 2-naphthoinole group, phthaloinore group, isophthaloinore group, terephthaloyl group, nicotinoyl group, Examples thereof include isonicotinoinole group, 2-fluoroinole group, oleoyl group, cinnamoinore group, benzilinore group, anthra-leoyl group, propioroyl group and the like.
  • the burizing agent include (meth) atallyl hydrazide, maleic monohydrazide, maleic dihydrazide, fumanoleic monohydrazide, fumanoleic dihydrazide, benzohydrazide, propio hydrazide, oleohydrazide, cinnamohydrazide, 2- Naphthoyl hydrazide, Phthalic acid monohydrazide, phthalic acid dihydrazide, isophthalic acid monohydrazide, isophthalic acid dihydrazide, terephthalic acid monohydrazide, terephthalic acid dihydrazide, nicotinic acid hydrazide, isonicotinic acid hydrazide, 2-fluoronohydrazide, anthraniloyl And hydrazide.
  • the burizing agent include (meth) atallyl hydrazide, maleic monohydrazide, maleic dihydra
  • the amount of bulling agent to be used may be determined in consideration of the reaction rate. In view of economic efficiency, it is preferable to use equimolar to 50 molar equivalents with respect to the glycoprotein. Moreover, the reaction rate, reaction yield, etc. improve by using a basic compound as a catalyst in the case of reaction. However, when using a basic compound, it is preferable to determine the basic compound in consideration of the stability of the glycoprotein into which the unsaturated functional group is introduced.
  • Basic compounds are: Al earth (earth) metals such as sodium, potassium and calcium, Al earth (earth) metals such as sodium hydroxide, potassium hydroxide and calcium hydroxide, hydroxides, sodium carbonate, Al strength such as sodium hydrogen carbonate, lithium carbonate, hydrogen bicarbonate (earth) metal carbonate, sodium methylate, magnesium methyl, etc.
  • (earth) metal alkoxy compound, hydrogenation Examples include alkali (earth) metal hydrides such as sodium and calcium hydride, and organic tertiary amines such as triethinoleamine and diazabicene undecene. It is also possible to use them in combination.
  • sodium carbonate, sodium hydrogen carbonate, sodium hydroxide, and hydroxy hydroxide is preferable to use.
  • the amount used is preferably in the range of equimolar to 100-fold molar relative to the glycoprotein.
  • the reaction temperature can be arbitrarily set in consideration of the reaction rate, reaction rate, and the like, and is not limited, but for example, 10 ° C to 30 ° C is preferable.
  • the present invention it is also possible to give a reducing end to the glycoprotein and then act on a burizing agent. It is also possible to pre-modify the glycoprotein during the above-mentioned bur group introduction reaction. For example, some of the sugars that make up glycoproteins Is oxidized and opened with periodate to synthesize glycoproteins with exposed aldehyde groups. Details of the ring-opening reaction with periodic acid are described in, for example, general experimental documents, and the reaction conditions can be set in consideration of the stability of glycoprotein. Next, an excess amount of periodic acid is removed with ethylene or the like, and dialysis is performed for purification.
  • the Bier group can be introduced into the glycoprotein by reacting the purified glycoprotein with a compound having the Bier group (for example, a hydrazine derivative).
  • a compound having the Bier group for example, a hydrazine derivative.
  • the modified glycoprotein prepared by the above reaction can be isolated and purified by a method such as dialysis.
  • the method for confirming that an unsaturated functional group has been introduced at the reducing end of the sugar chain is not particularly limited, and can be confirmed, for example, by MALDI / TOF mass spectrometry.
  • the modified glycoprotein of the present invention since an unsaturated functional group is introduced into the sugar chain part, it is possible to firmly fix the modified glycoprotein to the support by a copolymerization reaction using the unsaturated functional group. is there.
  • a polymer material in which the glycoprotein is immobilized (included) on the support can be obtained.
  • a polymer material in which the modified glycoprotein is immobilized on a polymer network by subjecting the gel precursor containing the polymerizable monomer, the cross-linking agent, and the modified glycoprotein of the present invention to a copolymerization reaction. (Gel-like material) can be produced.
  • a treatment with a silane coupling agent having a methacrylic terminal can be mentioned.
  • These supports may have any form such as a planar shape, a linear shape, and a circular shape.
  • a force exemplifying a method for fixing one kind of sputum protein to a support can also be used when manufacturing devices called protein chips and biochips.
  • the tubular body can be used as a protein analysis tool by filling the hollow portion of the tubular body with the above-described gel and producing the tubular body filled with the gel.
  • a protein chip in which immobilized gels are arranged in a plurality of sections on a planar substrate can be manufactured by mounting a gel on which a protein is immobilized on a planar surface.
  • the planar substrate one having a plurality of grooves or through holes can be used. In that case, the monomer solution containing the protein before polymerization or immediately after the start of polymerization is added to the partition formed by the groove or the through-hole, the polymerization reaction is carried out in the partition, and the protein is formed on the substrate by crosslinking.
  • a chip on which a fixed gel is placed can be produced.
  • the type of protein retained in each compartment may vary from compartment to compartment.
  • multiple fixed gels of the same type can be grouped and placed on the chip.
  • the tubular body can be exemplified by a glass tube, a stainless tube, a hollow fiber, and the like. Considering the workability and ease of handling, it is preferable to use a fiber.
  • the fiber that can be used in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include synthetic fibers, semi-synthetic fibers, recycled fibers, chemical fibers such as inorganic fibers, and natural fibers.
  • Medium fibers other than natural fibers can be produced by a known method using a special nozzle, for example, a spinning method using a horseshoe type, C type nozzle, double tube nozzle or the like.
  • the tubular body prepared as described above becomes a basic unit for holding a protein.
  • a tubular body for example, a plurality of the hollow tubular bodies described above are converged, a gel in which a protein is immobilized is filled in the hollow portion of each tubular body of the aggregate, and the longitudinal direction of the tubular body is crossed. Thin slices can be produced by slicing the focused object in the direction of cutting. This method for producing flakes can be applied in the same manner as the method for producing microarrays in which biological materials such as DNA are immobilized (see WO 00/53736).
  • the tubular bodies may be converged after filling the individual tubular bodies with gel.
  • the tubular bodies may be randomly arranged, but by arranging them regularly and fixing them with an adhesive or the like, for example, an array body in which the tubular bodies are regularly arranged in the vertical and horizontal directions can be obtained.
  • Regularly means that the converging objects are arranged in order so that the number of tubular bodies contained in a frame of a certain size is constant.
  • the array is produced as follows. That is, two perforated plates that regularly form holes are prepared, and the hollow tubular bodies are formed in both the holes so that the positions of the holes of one perforated plate correspond to the positions of the holes of the other perforated plate. Pass through. Next, the interval between the perforated plates is adjusted. However, the order of the operation of passing the tubular body through the hole and the operation of adjusting the interval between the perforated plates may be reversed. Then, tension is applied to the tubular bodies, and in the state where the tension is applied, resin is filled between the tubular bodies (gap between the tubular body converging objects) to fix the converged tubular bodies to obtain an array (Japanese Patent Laid-Open No. 200239239). Issue gazette).
  • the cross-sectional shape of the array is not particularly limited.
  • the cross-section may be formed into a square or a rectangle by regularly arranging the tubular bodies, and the hollow tubular bodies are arranged concentrically.
  • the cross section may be circular.
  • a thin piece is obtained by cutting the above-mentioned arrayed body in a direction intersecting the longitudinal direction (axial direction of the hollow tubular body), preferably in a direction perpendicular to the longitudinal direction.
  • the cutting method include a method of cutting a slice from the array using a Mikuguchi tome.
  • the thickness of the flakes force normally 1 ⁇ 5,000 ⁇ ⁇ which can be arbitrarily adjusted, the good Mashiku 10 to 2, a ⁇ ⁇ ⁇ .
  • the obtained flakes are used as a protein chip for holding a gel on which the modified glycoprotein is immobilized.
  • the modified glycoprotein immobilized on the gel in the protein chip functions as a capillary probe for a substance that binds to the protein (referred to as a measurement target). Therefore, the present protein chip can be used as a kit for detecting a substance to be measured. For example, a specimen containing a target substance to be detected is prepared, and this is added to a protein chip and reacted with a modified glycoprotein immobilized on a gel.
  • the modified glycoprotein immobilized on the protein chip is an antibody
  • the antigen to be measured is fluorescently labeled and the antibody in the protein chip is React with. Thereafter, washing is performed to remove unreacted antigen, and fluorescence intensity is detected.
  • the fluorescence intensity can be detected using any apparatus (for example, a commercially available detector).
  • the gel to which the modified glycoprotein of the present invention is immobilized has good reactivity, and the fluorescence intensity per section of the protein chip is uniform. As a result, a highly sensitive detection result can be obtained.
  • the modified sugar protein of the present invention can be applied to a microfluidic device called ⁇ -TAS (Micro Total Analysis System).
  • ⁇ -TAS is a device that miniaturizes and integrates the components necessary for fluid analysis, such as mechanical parts that inject, mix, agitate, separate, and extract fluid samples, and flow paths and reservoirs. Since ⁇ -TAS can be produced with a size smaller than the palm size, it is possible to reduce the amount of measurement sample, shorten the reaction time, make it disposable, and reduce costs.
  • ⁇ -TAS is an analysis standard solution storage compartment, flow cell, sensor compartment, etc. on silicon wafer, glass, and various plus-chip materials. Therefore, ⁇ -TAS can be used as a chip in which all the components of the analyzer are integrated on a support.
  • the ⁇ -TAS can be manufactured by pattern design by CAD, pattern formation by various etching methods, various valves, pumps, mixers, dispensers, sensor members, and the like.
  • the modified glycoprotein to the sensor compartment can be firmly fixed by using a silane coupling agent or the like.
  • the protein chip and ⁇ -TAS chip produced as described above can be used as a protein sensor that is a protein detection device.
  • the present invention will be described in more detail by way of examples.
  • IL 6 antibody (R & D Systems® # MAB206) was dissolved in 5 O m 1 in 0.1 M citrate buffer at pH 4.5. Next, 5 O mg of sodium periodate was added, and the mixture was reacted at room temperature for 45 minutes with stirring. Further ethylene glycol was added to a concentration of 0.1M, and the mixture was stirred at 5 ° C for 7 hours to be reacted. After the reaction, the reaction solution was dialyzed once at 5 ° C using the above buffer solution at night to obtain an aldehyde IL-6 antibody solution.
  • a 1 mM hydrazine aqueous solution (1 ⁇ m) and a 10 mM methacrylic anhydride solution (dissolved in DMSO) 5 ⁇ 1 were used. These were mixed with 5 ⁇ 1 of 1 O OmM sodium carbonate aqueous solution and reacted at room temperature for 1 hour.
  • the molar ratio of hydrazine and methacrylic anhydride in the reaction solution is 1: 5.
  • the pH was adjusted to 9.0 by adding 25 mM carbonate buffer to the aldehyde I L 6 anti-plum solution prepared in (1).
  • 1 g of methacrylic acid hydrazide prepared in (2) was added and stirred at 5 ° C. for 20 hours to form a Schiff base.
  • the reaction mixture was filtered to collect the product, washed thoroughly, and added with charcoal pH 8.0, 50 ml of impregnation solution, 20 Omg of hydrogen fluoride sodium sodium, and reduced at 5 ° C for 7 hours. .
  • the reaction mixture was filtered to recover the product and washed thoroughly to obtain a methacrylated IL6 antibody.
  • the gel precursor aqueous solutions (three types) shown in Table 1 were prepared, and each 0.1 ⁇ m of each was dropped onto a glass slide with a micropipette.
  • the above protein chip was evaluated by the following method.
  • the evaluation method used here is a method generally used as an evaluation method of protein interaction used in a protein chip (Science, 2000, vol.289, p.1760).
  • Cy5 TM Labeled Anti-Antibody purchased from a molecular probe
  • fluorescence 4 A igigZml solution
  • the fluorescence value resulting from the spot where the IL6 antibody into which the methacryl group was introduced was immobilized was approximately 50-100 times the fluorescence value resulting from the spot where the IL6 antibody into which the methacryl group was not introduced was immobilized. It was.
  • the IL6 antibody introduced with a methacryl group is immobilized by co-polymerization with an acrylamide monomer so that the active center is exposed and the function is retained. Is done.
  • IL3 antibody (R & D Systems 3 ⁇ 4 fc) was dissolved in 0.1 M citrate buffer fc 5 Oml at pH 4.5. Next, 50 mg of sodium periodate was added and allowed to react for 45 minutes at room temperature with stirring. Further, ethylene glycol was added so as to have a concentration of 0.1M, and the mixture was reacted at 5 ° C for 7 hours with stirring. After the reaction, the reaction solution was dialyzed overnight at 5 ° C. using the above buffer solution as an external solution to obtain an aldehyde-treated IL 3 antiseptic solution.
  • a 1 mM hydrazine aqueous solution (10 ⁇ l) and a 10 mM methacrylolic anhydride anhydrous (dissolved in DMSO) (5 ⁇ l) were used. These were mixed with 5 ⁇ 1 of a 100 mM aqueous sodium carbonate solution and reacted at room temperature for 1 hour.
  • the molar ratio of hydrazine and methacrylic anhydride in the reaction solution is 1: 5.
  • the pH was adjusted to 9.0 by adding 25 mM carbonate buffer to the acetylated IL 3 anti-serum prepared in (1).
  • 1 g of methacrylic acid hydrazide prepared in (2) was added and stirred at 5 ° C. for 20 hours to form a Schiff base.
  • the reaction mixture was filtered to recover the product, washed thoroughly, pH 8.0 carbonate buffer 50m 1, hydrogenated phosphate. 200 mg of sodium sodium was added and a reduction reaction was performed at 5 ° C for 7 hours.
  • the reaction mixture was filtered to recover the product and washed thoroughly to obtain a methacrylated IL3 antibody.
  • Aldehydated IL3 antibody without metathalylation treatment is the force that molecular ion of [M + H] + appeared at m / z 150,500 in MALDI / TOF mass spectrometry.
  • Methacrylated IL3 antibody obtained by the above method is In MALDI / TOF mass spectrometry, CM + H] + molecular ion appeared in mlz 151,000. This result suggests that a methacryl group has been introduced into the IL 3 antibody by the method described above.
  • IL 3 body 20 mg was adjusted to pH 9.0 by adding 25 mM carbonate buffer.
  • 1 g of methacrylic hydrazide prepared in (1) was added and stirred at 5 ° C. for 20 hours to form a Schiff base.
  • pH 8.0 aqueous carbonate solution 5 Om 1 and sodium borohydride 20 Omg were added to the dialyzed solution, and a reduction reaction was performed at 5 ° C. for 7 hours.
  • the IL 3 antibody introduced with the methacryl group obtained in Examples 5 and 6 was immobilized on an acrylamide gel and evaluated. Also, immobilization and evaluation of IL 3 antibody introduced with an aldehyde group (Comparative Example 3) and an unmodified IL 3 antibody (Comparative Example 4) on acrylamide gel were performed.
  • the gel precursor aqueous solutions (3 types) shown in Table 3 were prepared, and each 0.1 ⁇ was dropped onto a glass slide with a micropipette. '
  • the dropped gel precursor aqueous solution is allowed to stand at room temperature under nitrogen gas for 15 minutes to form an acrylamide gel with an immobilized IL 3 antibody.
  • a protein chip on which the IL3 antibody was immobilized was prepared. Table 3
  • the above protein chip was evaluated by the following method.
  • the evaluation method used here is a method generally used as an evaluation method of the protein interaction used in the above-described protein chip (Sci ence, 2000, vol. 289, p. 1760).
  • the fluorescence value due to the spot where the IL3 antibody having the methallyl group introduced was immobilized was about 40 to 80 times the fluorescence value resulting from the spot having the IL3 antibody not introduced with the methacryl group introduced. It was.
  • the IL3 antibody introduced with a methacryl group can be immobilized while co-polymerizing with the acrylamide monomer so that the active center is exposed and the function is retained.
  • IL 6 antibody (R & D Systems Nering) was dissolved in 50 ml of 0.1 M citrate buffer at pH 4.5. Next, 50 mg of sodium periodate was added, and the mixture was allowed to react at room temperature for 45 minutes with stirring. Further, ethylene glycol was added so as to have a concentration of 0.1M, and the mixture was reacted at 5 ° C for 7 hours with stirring. After the reaction, the reaction solution was dialyzed once at 5 ° C using the above-mentioned buffer solution at night to obtain an aldehyde-treated IL-6 solution.
  • the pH was adjusted to 9.0 by adding 25 mM carbonate buffer to the aldehyde-treated IL6 antibody solution prepared in (1).
  • 1 g of phthalic acid monohydrazide prepared in (2) was added and stirred at 5 ° C for 20 hours to form a Schiff base.
  • the reaction mixture was filtered to recover the product, washed thoroughly, and 5 Oml carbonate buffer solution with pH 8.0 and 200 mg sodium borohydride were added, followed by a reduction reaction at 5 ° C for 7 hours. It was.
  • the reaction mixture was filtered to recover the product and washed thoroughly to obtain phthaloylated IL6 antibody.
  • ImM hydrazine aqueous solution 10 ⁇ 1 5 mM phthalic anhydride 5 g 1 dissolved in DMSO was used. These were mixed with 5 ⁇ 1 of 10 OmM aqueous sodium carbonate solution and reacted at room temperature for 1 hour.
  • the molar ratio of hydrazine to phthalic anhydride in the reaction solution is 1: 2.5.
  • IL 6 antibody manufactured by R & D Systems
  • the IL 6 antibody into which the phthaloyl group obtained in Examples 9 and 10 was introduced was immobilized on an acrylamide gel and evaluated.
  • the IL 6 antibody (Comparative Example 5) into which the phthaloyl grave was introduced and the unmodified IL 6 antibody (Comparative Example 6) were immobilized and evaluated on acrylamide gels.
  • the gel precursor aqueous solutions (3 types) shown in Table 5 were prepared, and each 0.1 ⁇ m droplet was dropped onto a glass slide with a micropipette.
  • the dropped gel precursor aqueous solution is allowed to stand for 15 minutes at room temperature under nitrogen gas to form an acrylamide gel in which the IL6 antibody is immobilized.
  • a protein chip on which the IL6 antibody was immobilized was prepared.
  • the above protein chip was evaluated by the following method.
  • the evaluation method used here is a method generally used as an evaluation method of protein interaction used in the above-mentioned protein chip (Science, 2000, vol. 289, p. 1760).
  • the fluorescence value attributable to the spot to which the IL6 antibody to which the phthaloyl group was introduced was immobilized was about 35 to 70 times the fluorescence value attributable to the spot to which the IL6 antibody to which the phthaloyl group had not been introduced was immobilized. It was.
  • the IL6 antibody introduced with a phthaloyl group can be immobilized while co-polymerizing with an acrylamide monomer so that the active center is exposed and its function is retained. Is done. Industrial applicability
  • a modified glycoprotein having an unsaturated functional group is provided.
  • a modified glycoprotein with an unsaturated functional group introduced in the sugar chain of the glycoprotein a small amount of protein is oriented with the active center exposed, and the function is retained and retained. Can do.

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Abstract

タンパク質、特に糖タンパク質の糖鎖部に、不飽和官能基を導入した修飾糖タンパク質を固定化の際に使用する。具体的には、例えば、導入された不飽和官能基との共重合反応に強固にタンパク質を固定することができる。

Description

明細書 不飽和官能基を有する修飾糖タンパク質 技術分野
本発明は、糖タンパク質、 とりわけ支持体等に固定するのに適した、修飾された 糖タンパク質に関する。 背景技術
ゲノムプロジェクトの進展により、生物の膨大な遺伝子情報が明らかとなり、そ の機能の解析が進められている。その機能解析のツールとして、 DNAチップ (DNA マイクロアレイ） と呼ばれるデバイスを使用する方法が一般ィ匕しつつある。 現在、
DNAチップでは、 例えば、 ある生理的特徴を備えた細胞とコント口ール細胞との 間で、 細胞内で発現している遺伝子情報を mRNA量で比較し、 その生理的特徴と 遺伝子発現との相関を解析している。 し力 し、実際に細胞内で機能的に発現してい るタンパク質と mRNA量との相関は必ずしも高くないことから、 目的情報をタン パク質レベルで直接、解析する手法も注目されている。例えば、 タンパク質一医薬 品の相互作用、 タンパク質一タンパク質間の相互作用は、新規の医薬品開発、副作 用の減弱化において重要な情報となる。
一方、タンパク質を直鶴祈するには、適当な担体にタンパク質を固定する必要 がある。 タンパク質の固定化方法としては、担体にカルボキシル基を露呈させ、 タ ンパク質のアミノ基とカップリングさせる方法 （ァミノカップリング法：特開平 5-340948号公報） 、 担体をチオール化し、 カルボキシル基を P D E A等で修飾し たタンパク質とジスノレフィド結合を通してカツプリングさせる方法（チオール力ッ プリング法） 等が知られている。 また、上記共有結合による固定ではなく、 タンパ ク質に H i s— T a gを導入し、 それを NTA (Nitrilotriacetic acid) で処理した 担体に Ni2+を通して結合させる方法も知られている。
上記固定化方法は、例えば、プロテインチップに代表される、固定されたタンパ ク質との相互作用を調べるためのデバイスを製造する際に適用することできる。そ の場合、前記デバイスは微量のタンパク質を確実に固定できることが要求され、且 つ、 得られるデバイスの検出感度が高いことが望まれる。 発明の開示
しかし、上述のァミノカツプリングによるタンパク質の固定化方法では、酸性タ ンパク質は固定することができないという制限が生じる。また、チオールカツプリ ングによる固定化方法では、酸性タンパク質は固定化できるものの、多量のタンパ ク質を必要とする。 さらには、 His-Tagを用いる固定化方法では、最初は固定され るものの徐々に解離するという問題があった。 さらには、タンパク質のランダム位 置への化学修飾により、 タンパク質が本来の機能（酵素活性、他分子への結合能力 等） を損なう虞もある。
したがって、上述の方法は、微量のタンパク質を活性中心が露呈した状態で配向 させ、 且つその機能を保持したままで支持体に固定するには未だ不十分といえる。 そこで本発明は、 上記問題点を解決した修飾糖タンパク質を提供する。
本発明者は、上述した問題点を解決するために鋭意検討を行った結果、抗体に代 表される糖タンパク質の糖鎖部に、不飽和官能基を導入することにより、微量のタ ンパク質を活性中心が露呈した状態で配向させ、且つその機能を保持したままで糖 タンパク質を固定できることを見出し、 本努明を完成させた。
すなわち、 本発明は以下の通りである。
( 1 ) 糖タンパク質の糖鎖部に不飽和官能基を有する修飾糖タンパク質。
上記糖タンパク質としては、 例えば抗体が挙げられる。
( 2 )糖タンパク質にビニル化剤を作用させることを含む、糖タンパク質の糖鎖部 に不飽和官能基を有する修飾糖タンパク質の製造方法。
( 3 )糖タンパク質に還元末端を付与し、次いでビニル化剤を作用させることを含 む、糖タンパク質の糖鎖部に不飽和官能基を有する修飾糖タンパク質の製造方 法。
( 4) 前記修飾糖タンパク質が固定された高分子材料。
( 5 )前記修飾糖タンパク質と重合性モノマーとを重合することにより得られる高 分子材料。 ( 6 ) 前記修飾糖タンパク質が搭載されたプロティンチップ。
( 7 ) 前記修飾糖タンパク質が搭載された ;z - T A Sチップ。
( 8 ) 前記プロテインチップ又は μ -Τ A Sチップを含むプロテインセンサー。 発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。 なお、本明細書において引用した文献、および 公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとす る。 また、 本明細書は、 本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願である特願 2006-020449号及び特願 2006-249844号の内容を包含する。 本発明は、 「糖タンパク質の糖鎖部に不飽和官能基を有する修飾糖タンパク質」 である。
本発明において、 「糖タンパク質」 とは、糖鎖を結合したタンパク質の総称であ り、糖部分が 2〜6種類の単糖から構成され、タンパク質と共有結合した複合タン パク質を意味する。具体的にはアルブミン等の血清タンパク質、エリスロポエチン 等の造血因子、 抗体やインターフェロン等の免疫調節物質、 TPA等の酵素類、 フ イブロネクチン、 コラーゲン等、様々な種類を例示することができる。伹し、 これ らの種類に限定されるものではなく、あらゆる糖タンパク質を本発明におレヽて使用 することができる。
本発明では、 上記糖タンパク質の糖鎖部の還元末端に不飽和官能基を導入する。 導入される不飽和官能基としては、 （メタ）アタリノレ基、 （メタ）アタリロイル基、 マレオイ/レ基、 フマロイノレ基、 ベンゾィル基、 2—ナフトイノレ基、 フタロイノレ基、 イソフタロイノレ基、 テレフタロイル基、 ニコチノイノレ基、 イソニコチノイノレ基、 2 ーフロイノレ基、ォレオイル基、 シンナモイノレ基、ベンジロイノレ基、 アントラ-ロイ ル基、プロピオロイル基等が挙げられる。 これら不飽和官能基の導入は、 ビニルイ匕 剤を反応させることにより実施することができる。ビュル化剤としては、例えば（メ タ）アタリル酸ヒドラジド、マレイン酸モノヒドラジド、マレイン酸ジヒドラジド、 フマノレ酸モノヒドラジド、 フマノレ酸ジヒドラジド、ベンゾヒドラジド、 プロピオ口 ヒドラジド、ォレオヒドラジド、シンナモヒドラジド、 2—ナフトイルヒドラジド、 フタル酸モノヒドラジド、 フタル酸ジヒ ドラジド、 ィソフタル酸モノヒ ドラジド、 イソフタル酸ジヒドラジド、 テレフタル酸モノヒ ドラジド、 テレフタル酸ジヒ ドラ ジド、ニコチン酸ヒドラジド、イソニコチン酸ヒドラジド、 2—フロイノレヒドラジ ド、アントラニロイルヒドラジドなどが挙げられる。 したがって、例えば糖鎖部の 還元末端に （メタ） アクリル基を導入する場合は、糖タンパク質の還元末端に （メ タ）アタリル酸ヒドラジドを反応させることにより、不飽和官能基を導入すること が可能となる。
ここで、 糖タンパク質とビュル化剤との反応において、 使用するビュル化剤は、 反応率を考慮してその使用量を決定すればよい。経済性を考慮すると、糖タンパク 質に対して、 等モル〜 5 0倍モルを使用することが好ましい。 また、 反応に際し、 触媒として塩基性化合物を利用することにより、反応速度、反応収率等が向上する。 但し、塩基性化合物の使用に際しては、不飽和官能基が導入される糖タンパク質の 安定性等を加味して当該塩基性化合物を決定することが好ましい。
塩基性化合物は、ナトリウム、カリゥム、カルシウム等のアル力リ （土類）金属、 水酸化ナトリウム、水酸化力リウム、水酸化カルシウム等のアル力リ （土類）金属 水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸力リウム、炭酸水素力リゥ ム等のアル力リ （土類）金属炭酸化合物、ナトリウムメチラート、マグネシウムメ チラ一ト等のアル力リ (土類) 金属アルコキシ化合物、水素化ナトリゥム、水素化 カルシウム等のアルカリ (土類) 金属水素化物、 さらにはトリエチノレアミン、 ジァ ザビシク口ゥンデセン等の有機 3級ァミン等が挙げられる。また、それらを組み合 わせて用いることも可能である。
経済性の観点から、好ましくは炭酸ナトリゥム、炭酸水素ナトリゥム、水酸化ナ トリゥム、水酸化力リゥムを使用することが好ましい。 また、使用量は糖タンパク 質に対して等モル〜 1 0 0倍モルの範囲が好ましい。
反応温度は、反応速度、反応率等を考慮して任意に設定することができ、限定さ れるものではないが、 例えば 1 0°C〜3 0 °Cが好ましレ、。
また、本発明においては、糖タンパク質に還元末端を付与し、次にビュル化剤を 作用させることも可能である。上記ビュル基の導入反応に際し、糖タンパク質を予 め修飾しておくことも可能である。例えば、糖タンパク質を構成している糖の一部 を過ヨウ素酸により酸化、開環し、アルデヒド基を露呈させた糖タンパク質を合成 する。過ヨウ素酸による開環反応の詳細に関しては、例えば、一般的な実験書等に 記載されており、糖タンパク質の安定性を考慮し、反応条件を設定することができ る。次いで、過剰量の過ヨウ素酸をェチレン等で除去し、透析処理を行レ、精製する。 次に精製した糖タンパク質に上記ビエル基を有する化合物 (例えばヒドラジン誘導 体） を反応させることにより、 糖タンパク質にビエル基を導入することができる。 上記の反応により調製された修飾糖タンパク質は、透析等の方法により単離'精 製することができる。
糖鎖の還元末端に不飽和官能基が導入されたことの確認手法は特に限定される ものではなく、 例えば MALDI/TOFマススぺクトロメトリーにより確認すること ができる。
本発明の修飾糖タンパク質は、糖鎖部に不飽和官能基が導入されているため、不 飽和官能基を利用して共重合反応により、強固に修飾糖タンパク質を支持体に固定 できることが可能である。
例えば、アクリルアミドに代表される重合性モノマーと、本努明の修飾糖タンパ ク質とを共重合することにより、糖タンパク質が支持体に固定（包含） された高分 子材料を得ることができる。 より具体的には、前記重合性モノマー、架橋剤及び本 発明の修飾糖タンパク質を含むゲル前駆体溜夜を共重合反応に供することにより、 修飾糖タンパク質がポリマーのネットワークに固定された高分子材料 （ゲル状物） を作製することができる。
さらに、 （メタ） アクリル基、 （メタ） アタリロイル基等の官能基が表面に露呈 したプラスチック、ガラス、金属等の支持体に対して、本発明の修飾糖タンパク質 を反応させることにより、 糖タンパク質の固定が可能となる。
例えば、ガラス表面にメタクリル基を導入する方法としては、メタクリル末端を 有するシランカツプリング剤による処理等が挙げられる。これらの支持体としては、 例えば平面状、 線状、 円状等、 いずれの形態でも良い。
上述では、 1種類の糠タンパク質を支持体に固定する方法を例示した力 本発明 は、例えば、複数種の糖タンパク質を同一支持体に固定したもの、いわゆるタンパ ク質チップ（プロテインチップ）、バイオチップと総称されるデバイスを製造する 際に使用することもできる。
また、マイクロ化学チップ、各種センサー等を製造する際にも使用することもで きる。
本発明においては、上述のゲルを管状体の中空部に充填し、ゲルを充填した管状 体を作製することにより、その管状体をタンパク質の解析ツールとして使用するこ とができる。 また、本発明においては、 タンパク質が固定されたゲルを平面 ¾ ^上 に搭載することにより、平面基盤上の複数の区画に固定化ゲルが配置されたプロテ ィンチップを製造することができる。平面基盤としては、複数の溝又は貫通孔を有 するものを使用することもできる。その場合、溝又は貫通孔によって形成された区 画に、重合前又は重合開始直後のタンパク質を含むモノマー溶液を添加し、区画内 で重合反応を実施させ、架橋することにより、基盤上にタンパク質を固定したゲル を配置させたチップを作製することできる。
各区画に保持されるタンパク質の種類は、 区画毎に異なっていてもよい。 また、 同一種類の固定化ゲルを複数個、 グループ化してチップ上に配置しても良レ、。
本発明において、管状体は、ガラス管、 ステンレス管、 中空繊維等を例示するこ とができる。加工性、取り扱いの容易さを考慮すると中 維を使用することが好 ましい。本発明において用いることができる繊維としては特に限定されるものでは なく、合成繊隹、 半合成繊锥、再生繊維、無機 «のごとき化学繊維、及び天然繊 維等が挙げられる。
天然繊锥以外の中 ¾»锥は、特殊なノズルを用いて公知の方法、例えば、馬蹄型 や C型ノズル、 2重管ノズルなどを用いた紡糸法で製造することができる。
上記の通り調製された管状体は、タンパク質を保持する基本単位となる。管状体 を使用する場合、例えば、上記の中空管状体を複数本集束し、該集束物の各管状体 の中空部にタンパク質を固定化したゲルを充填し、管状体の長手方向に対して交差 する方向に集束物を輪切りする要領でスライスすることにより、薄片を作製するこ とができる。 この薄片の製法は、 DNAなどの生体関連物質を固定化したマイクロア レイの製法と同様に適用することが可能である （W0 00/53736号公報参照)。 なお、 本発明にお 、ては、個々の管状体にゲルを充填させた後に管状体を集束しても良レ、。 この際、管状体はランダムに配列させてもよいが、規則的に配列させて接着剤等 で固定することにより、例えば縦横に管状体が規則的に配列した配列体を得ること ができる。 「規則的に」 とは、 一定の大きさの枠の中に含まれる管状体の本数が一 定となるように、 集束物を順序よく配列させることをいう。
配列体の作製は、例えば以下の通り行う。すなわち、規則的に孔を形成する多孔 板を 2枚用意して、一方の多孔板の孔の位置と他方の多孔板の孔の位置とが対応す るように両方の孔に中空管状体を通す。 次に、 当該多孔板同士の間隔を調整する。 但し、管状体を孔に通す作業と多孔板同士の間隔を調整する作業の順序は逆でもよ い。 そして、管状体に張力を与え、張力を与えた状態で管状体間 （管状体集束物の 隙間）に樹脂を充填して集束した管状体を固定し、配列体を得る（特開 200卜 239594 号公報)。
配列体の断面形状は特に限定されるものではなく、例えば、管状体を規則的に配 列させることにより断面を正方形又は長方形に形成してもよく、中空管状体を同心 円状に配列させて断面を円形に形成してもよい。
本発明においては、上述の配列体を長手方向 （中空管状体の軸方向） と交差する 方向、 好ましくは長手方向に対して垂直方向に切断することにより、 薄片を得る。 切断方法として、例えばミク口トームを用いて配列体から薄片を切り出す方法等が 挙げられる。 薄片の厚みは任意に調整することができる力 通常 1〜5，000 μ ιη、 好 ましくは 10〜2， ΟΟΟ μ ιηである。
得られた薄片は、修飾糖タンパク質を固定化したゲルを保持するプロティンチッ プとして使用する。
プロテインチップ中のゲルに固定されている修飾糖タンパク質は、該タンパク質 と結合する物質（これらを測定対象という）のキヤプチヤープローブとして機能す る。従って、本宪明のプロテインチップは、測定対象物質を検出するためのキット として使用することができる。例えば、検出の目的物質を含む検体を調製し、 これ をプロテインチップに添加してゲルに固定されている修飾糖タンパク質と反応さ せる。
より具体的には、プロティンチップに固定される修飾糖タンパク質が抗体である とすると、測定対象となる抗原を蛍光標識しておいて、プロテインチップ中の抗体 と反応させる。 その後洗浄して未反応の抗原を除去し、蛍光強度を検出する。蛍光 強度は、任意の装置 （例えば市販の検出器） を用いて検出することができる。 本発 明の修飾糖タンパク質が固定されたゲルは、反応性が良好であり、プロテインチッ プの一区画あたりの蛍光強度が均一になる。その結果、高感度な検出結果を得るこ とができる。
さらに、本発明の修飾糖タンノ ク質は、 μ -TAS (Micro Total Analysis System) と呼ばれるマイクロ流体デバイスに適用することができる。 μ -TASとは、 流体試 料の注入、混合、撹拌、 分離及び抽出を行う機構部品、 並びに流路及ぴ溜池などの 流体分析に必要な要素を小型化及び集積化したデバイスである。 μ -TAS は手のひ らサイズ以下のサイズで作製できるため、測定試料の微量化、反応時間の短縮、デ イスポーザプル化、 低コスト化等が可能である。
^ -TASは、 シリコンウェハー、 ガラス、 各種プラスチップ材料上に分析標準液 貯蔵区画、フローセル、センサー区画等を設けたものである。 したがって、 μ -TAS は、分析装置のすべての構成要素を支持体上に集積させたチップとして使用するこ とができる。
前記 μ -TASは、 CAD等によるパターン設計、 各種エッチング法によるパターン 形成、 各種バルブ、 ポンプ、 ミキサー、 ディスペンサー、 センサー部材の設置等に より製造することができる。センサー区画への修飾糖タンパク質は、シランカップ リング剤等を利用することにより強固に固定することができる。
上記のようにして作製されたプロティンチップ及び μ -TASチップは、 タンパク 質の検出用デパイスであるプロティンセンサーとして使用することができる。 以下、 実施例により本発明をより詳細に説明する。
[実施例 1 ]
糖タンパク質の糖鎖部に不飽和官能基を導入した修飾糖タンパク質の調製 ( 1 ) 糖鎖への還元末端付与 （アルデヒドィ匕 I L 6抗体の作製）
I L 6抗体（R&D Systems據 #MAB206) 2 0 m gを p H 4. 5の 0. 1 M クェン酸緩衝液に 5 O m 1に溶解した。 次いで過ョゥ素酸ナトリウム 5 O m gを添加して、攪拌下、 室温で 4 5分間、反応させた。 さらにエチレングリコール を 0. 1M濃度になるように添加し、 5 °Cで 7時間攪拌して反応させた。 反応後、 反応液を上記緩衝液を 夜として 5 °Cで一晚透析を行ない、アルデヒド化 I L 6抗 体溶液を得た。
(2) メタクリル酸ヒドラジドの調製
1 mMヒドラジン水溶液 1 Ομ 1、 10 mMのメタクリル酸無水物溶液 (DM SOに溶解） 5μ1を用いた。 これらを 1 O OmMの炭酸ナトリウム水溶液 5μ1 と混合し、室温で 1時間反応を行つた。反応液中のヒドラジンとメタクリル酸無水 物のモル比は、 1 ： 5である。
(3) メタクリル化 I L 6抗体の調製
(1) で調製したアルデヒドィ匕 I L 6抗梅液に、 25mM炭酸緩衝液を添 加して pHを 9. 0に調整した。 次に （2) で調製したメタクリル酸ヒドラジド 1 gを加えて、 5 °Cで 20時間攪拌してシッフ塩基を形成させた。反応混合物を濾過 して生成物を回収し、十分に洗浄して p H 8. 0の炭,衝液 50ml , 水素化ホ ゥ素ナトリゥム 20 Omgを加えて 5 °Cで 7時間還元反応を行った。反応混合物を 濾過して生成物を回収し、 十分に洗浄してメタクリル化 IL6抗体を得た。
メタタリル化処理を行わないアルデヒドィ匕 IL6抗体は、 MALDI/TOFマスス ぺクトロメトリーで [M+H]+の分子イオンが mlz 150,500に現れたが、上述の方法 で得られたメタクリル化 IL6抗体は、 MALDI/TOFマススぺクトロメトリーで [M+H]+の分子イオンが m/z 151,000に現れた。 本結果は上述の方法により、 I L 6抗体にメタクリル基が導入されたことを示唆する。
[実施例 2]
糖タンパク質の糖鎖部に不飽和官能基を導入した修飾糖タンパク質の調製 (1) メタクリル酸ヒドラジドの調製
1 mMヒドラジン水溶液 10 μ 1、 10 mMのメタタリル酸無水物溶液 (DM SOに溶解） 5μ1を用いた。 これらを 10 OmMの炭酸ナトリウム水溶液 5μ1 と混合し、室温で 1時間反応を行つた。反応液中のヒドラジンとメタクリル酸無水 物のモル比は、 1 ： 5である。
( 2 ) メタクリノレイ匕 I L 6抗体の調製
I L 6抗体 （R&D Systems ± ) 2 0 m gを、 2 5 mM炭薩衝液を添 加して p Hを 9. 0に調整した。 次に （1 ) で調製したメタクリル酸ヒドラジド 1 gを加えて、 5 °Cで 2 0時間攪拌してシッフ塩基を形成させた。反応後、反応液を 2 O mM燐酸锾衝液 p H= 7. 3を 夜として 5。Cでー晚透析を行った。その後、 透析内液に！) H 8. 0の炭 ^^衝液 5 O m l , 水素ィ匕ホウ素ナトリゥム 2 0 O m g を力!]えて、 5 °Cで 7時間還元反応を行った。 反応後、 反応液を 2 O mM燐酸緩衝 液 p H = 7. 3を外液として 5 °Cで一晚透析を行レ、、 メタクリル化 IL6抗体を得 た。
メタクリル化処理を行わないアルデヒド化 IL6抗体は、 MALDI/ OFマススぺ クトロメ トリーで [M+H]+の分子ィオンが m/z 150,500に現れたが、上述の方法で 得られたメタクリルイヒ IL6抗体は、 MALDI/TOFマススぺク トロメ トリーで [Μ+Η]+の分子ィオンが m/z 150,700現れた。 本結果は上述の方法により、 I L 6 抗体にメタクリル基が導入されたことを示唆する。
[実施例 3、 4 ]
本実施例では、実施例 1及ぴ 2により得られたメタタリル基が導入された I L 6 抗体のァクリルアミドゲルへの固定及び評価を行った。また、アルデヒド基が導入 された I L 6抗体 （アルデヒドィ匕 I L 6抗体） （比較例 1 ) 及ぴ無修飾の I L 6抗 体 （比較例 2 ) のアクリルアミドゲルへの固定及ひ ?価も行った。
表 1に示したゲル前駆体水溶液（3種類） を調製し、マイクロピペットにてガ ラススライド上に各 0. Ι μ ΐ滴下した。
滴下したゲル前駆体水溶液は、室温、窒素ガス下にて 1 5分間静置することに より、 I L 6抗体が固定されたアクリルアミドゲルとなる。上記のごとく I L 6抗 体が固定されたタンパク質チップを作製した。 表 1
Figure imgf000012_0001
上述のタンパク質チップは以下に示す方法で評価を行つた。
ここで利用する評価法は、タンパク質チップに用いるタンパク質の相互作用の 評価法として一般的に用いられる方法である （Science, 2000, vol.289, p.1760) 。
はじめに、 0. 1 w t %Tween 2 0含有 PBS緩衝液にて、 ァクリルァミドゲ ル中に固定されずに存在する I L 6抗体を洗浄、 除去する。
続いて、 蛍光標識化された Cy5™ Labeled Anti-Antibody (モレキュラープ ローブから購入） 4(¾igZm l溶液を上記タンパク質チップに供し、チップ上に固 定された I L 6抗体と結合させる。
さらに、 0 . 1 w t %Tween 2 0含有 PBS緩衝液にて、 未結合の Cy5™ Labeled Anti-Antibodyを洗浄、 除去する。
最後に、 各スポットに起因する蛍光量を蛍光スキャナー [GeneTAC LS IVCGENOMIC SOLUTIONS ¾hM)] を使用し測定した。 結果は表 2に示す。 表 2
Figure imgf000012_0002
以上より、 メタクリル基が導入された IL6抗体が固定されたスポットに起因 する蛍光値は、 メタクリル基を導入していない IL6抗体が固定されたスポットに 起因する蛍光値の約 50〜100倍であった。
よって、 メタクリル基が導入された IL6抗体をァクリルァミドモノマーと共重 合により固定することで、活性中心が露呈した状態配向させ、且つその機能を保持 したままで固定できていることが示唆される。
[実施例 5]
糖タンパク質の糖鎖部に不飽和官能基を導入した修飾糖タンパク質の調製
(1) 糖鎖への還元 ¾付与 （アルデヒド化 I L 3抗体の作製）
I L3抗体 （R&D Systems ¾fc ) 20mgを pH4. 5の 0. 1M クェ ン酸緩衝液 fc 5 Omlに溶解した。次 、で過ョゥ素酸ナトリウム 50mgを添加し て、攪拌下、室温で 45分間、反応させた。 さらにエチレングリコールを 0. 1M 濃度になるように添加し、 5 °Cで 7時間攪拌して反応させた。反応後、反応液を上 記緩衝液を外液として 5 °Cで一晩透析を行ない、アルデヒド化 I L 3抗 ί稱液を得 た。
(2) メタクリル酸ヒドラジドの調製
1 mMヒドラジン水溶液 10μ 1、 10 mMのメタクリノレ酸無水物激夜 (DM S Oに溶角） 5μ1を用いた。 これらを 100 mMの炭酸ナトリゥム水溶液 5μ 1 と混合し、室温で 1時間反応を行った。反応液中のヒドラジンとメタクリル酸無水 物のモル比は、 1 ： 5である。
(3) メタクリル化 I L 3抗体の調製
(1) で調製したアルデヒド化 I L 3抗膽液に、 25mM炭酸緩衝液を添 加して pHを 9. 0に調整した。次に （2) で調製したメタクリル酸ヒドラジド 1 gを加えて、 5°Cで 20時間攪拌してシッフ塩基を形成させた。反応混合物を濾過 して生成物を回収し、十分に洗浄して p H 8. 0の炭酸緩衝液 50m 1 , 水素化ホ ゥ素ナトリウム 200 m gを加えて 5 °Cで 7時間還元反応を行った。反応混合物を 濾過して生成物を回収し、 十分に洗浄してメタクリル化 IL3抗体を得た。
メタタリル化処理を行わないアルデヒド化 IL3抗体は、 MALDI/TOFマスス ぺクトロメトリ一で [M+H]+の分子ィオンが m/z 150,500に現れた力 上述の方法 で得られたメタクリル化 IL3抗体は、 MALDI/TOFマススぺクトロメトリーで CM+H]+の分子イオンが mlz 151,000に現れた。 本結果は上述の方法により、 I L 3抗体にメタクリル基が導入されたことを示唆する。
[実施例 6]
糖タンパク質の糖鎖部に不飽和官能基を導入した修飾糖タンパク質の調製
( 1 ) メタクリル酸ヒ ドラジドの調製
1 mMヒドラジン水溶液 1 0 μ 1、 10 mMのメタクリル酸無水物溶液 (DM SOに溶解） 5μ1を用いた。 これらを 10 OmMの炭酸ナトリウム水溶夜 5μ1 と混合し、室温で 1時間反応を行つた。反応液中のヒドラジンとメタクリル酸無水 物のモル比は、 1 ： 5である。
(2) メタクリノレ匕 I L 3抗体の調製
I L 3体 （R&D Systems社製） 20 m gを、 25 mM炭酸緩衝液を添加 して pHを 9. 0に調整した。 次に （1) で調製したメタクリル酸ヒドラジド 1 g を加えて、 5°Cで 20時間攪拌してシッフ塩基を形成させた。反応後、反応液を 2 0 mM燐酸緩衝液 D H= 7. 3を 夜として 5 °Cで一 B免透析を行った。 その後、 透析内液に pH8. 0の炭酸緩撺 ί液 5 Om 1，水素化ホウ素ナトリゥム 20 Omg を加えて、 5 °Cで 7時間還元反応を行った。 反応後、 反応液を 20 mM憐酸緩衝 液 p H = 7. 3を 夜として 5 °Cでー晚透析を行 、、 メタタリル化 IL3抗体を得 た。
メタタリル化処理を行わないアルデヒドィ匕 IL3抗体は、 MALDI/TOFマススぺ タトロメトリ一で [Μ+Η]+の分子イオンが mz 150,500に現れたが、上述の方法で 得られたメタクリルイ匕 IL3抗体は、 MALDI/TOFマススぺクトロメトリーで [M+H]+の分子イオンが m/z 150,700現れた。 本結果は上述の方法により、 I L 3 抗体にメタクリル基が導入されたことを示唆する。
[実施例 7、 8]
本実施例では、実施例 5ならびに 6により得られたメタクリル基が導入された I L 3抗体のアクリルアミドゲルへの固定及び評価を行った。また、アルデヒド基が 導入された I L 3抗体（比較例 3)及び無修飾の I L 3抗体（比較例 4) のァクリ ルアミドゲルへの固定及び評価も行った。
表 3に示したゲル前駆体水溶液 ( 3種類） を調製し、マイクロピぺットにてガ ラススライド上に各 0. Ιμΐ滴下した。'
滴下したゲル前駆体水溶液は、室温、窒素ガス下にて 15分間静置することに より、 I L 3抗体が固定されたァクリルアミドゲルとなる。上記のごとく I L3抗 体が固定されたタンパク質チップを作製した。 表 3
Figure imgf000015_0001
上述のタンパク質チップは以下に示す方法で評価を行つた。
ここで利用する評価法は、前述記載のタンパク質チップに用いるタンパク質の 相互作用の評価法として一般的に用いられる方法による （S c i enc e, 200 0， vo l. 289, p. 1760) 。
本方法により、各スポットに起因する蛍光量を蛍光スキャナー [GeneTACLS IV(GENOMIC SOLUTIONS !±¾)] を使用し測定した。 結果は表 4に示す。 表 4
Figure imgf000016_0001
以上より、 メタタリル基が導入された IL3抗体が固定されたスポットに起因 する蛍光値は、 メタクリル基を導入していない IL3抗体が固定されたスポットに 起因する蛍光値の約 40〜80倍であった。
よって、 メタクリル基が導入された IL3抗体をアクリルアミドモノマーと共重 合により固定することで、活性中心が露呈した状態配向させ、且つその機能を保持 したままで固定できていることが示唆される。
[実施例 9]
糖タンパク質の糖鎖部に不飽和官能基を導入した修飾糖タンパク質の調製
(1) 糖鎖への還元 付与 （アルデヒド化 I L 6抗体の作製）
I L 6抗体 （R&D Systemsネ環） 20mgを pH4. 5の 0. 1M クェ ン酸緩衝液に 50mlに溶解した。次いで過ョゥ素酸ナトリウム 50mgを添加し て、攪拌下、室温で 45分間、反応させた。 さらにエチレングリコールを 0. 1M 濃度になるように添加し、 5°Cで 7時間攪拌して反応させた。反応後、反応液を上 記緩衝液を 夜として 5 °Cで一晚透析を行なレ、、アルデヒド化 I L 6抗 液を得 た。
( 2 ) フタル酸モノヒドラジドの調製
1 mMヒ ドラジン水溶液 10 μ 1、 5 mMのフタル酸無水物溶液 （D M S Oに 溶解） 5μ1を用いた。 これらを 10 OmMの炭酸ナトリウム水激夜 5μ1と混合 し、室温で 1時間反応を行った。反応液中のヒドラジンとフタル酸無水物のモル比 は、 1 : 2. 5である。 ( 3 ) フタノレロイ/レイ匕 I L 6抗体の調製
(1) で調製したアルデヒド化 I L 6抗体溶液に、 25mM炭酸緩衝液を添 加して pHを 9. 0に調整した。 次に （2) で調製したフタル酸モノヒドラジド 1 gを加えて、 5°Cで 20時間攪拌してシッフ塩基を形成させた。反応混合物を濾過 して生成物を回収し、十分に洗浄して p H 8. 0の炭酸緩衝液 5 Oml , 水素化ホ ゥ素ナトリウム 200 m gを加えて 5 °Cで 7時間還元反応を行った。反応混合物を 濾過して生成物を回収し、 十分に洗浄してフタロイル化 IL6抗体を得た。
フタロイノレ化処理を行わないアルデヒドィ匕 IL6抗体は、 MALDI/TOFマスス ぺクトロメトリーで [M+H〗+の分子イオンが m/z 150,500に現れた力 上述の方法 で得られたフタロイル化 IL6抗体は、 MALDI/TOFマススぺクトロメトリーで CM+H1+の分子ィオンが mil 151,500に現れた。 本結果は上述の方法により、 I L 6抗体にフタロイル基が導入されたことを示唆する。
[実施例 10]
糖タンパク質の糖鎖部に不飽和官能基を導入した修飾糖タンパク質の調製
( 1 ) フタノレ酸モノヒドラジドの調製
ImMヒドラジン水溶液 10μ1、 5 mMのフタル酸無水物激夜 （DMSOに 溶解） 5μ1を用いた。 これらを 10 OmMの炭酸ナトリウム水激夜 5μ1と混合 し、室温で 1時間反応を行った。反応液中のヒドラジンとフタル酸無水物のモル比 は、 1 : 2. 5である。
(2) フタロイル化 I L 6抗体の調製
I L 6抗体 （R&D Systems社製） 20 m gを、 25 mM炭酸緩衝液を添 加して pHを 9. 0に調整した。 次に （1) で調製したフタル酸モノヒドラジド 1 gを加えて、 5 °Cで 20時間攪拌してシッフ塩基を形成させた。 反応後、反応液を 20 mM燐酸緩衝液 p H= 7. 3を 夜として 5 °Cで一晚透析を行った。その後、 透析内液に DH8. 0の炭酸緩衝液 5 Om 1，水素化ホウ素ナトリウム 20 Omg を加えて、 5 °Cで 7時間還元反応を行った。 反応後、 反応液を 20 mM燐酸緩衝 液 p H = 7. 3を 夜として 5でで一 B免透析を行い、 フタロイル化 IL6抗体を得 た。
フタロイル化処理を行わないアルデヒド化 IL6抗体は、 MALDI/TOFマススぺ タトロメ トリーで [M+H]+の分子ィオンが m/z 150,500に現れたが、上述の方法で 得られたフタロイル化 IL6抗体は、 MALDI/TOFマススぺクトロメトリーで [M+H]十の分子ィオンが m/z 150,900現れた。 本結果は上述の方法により、 I L 6 抗体にフタロイル基が導入されたことを示唆する。
[実施例 1 1、 1 2 ]
本実施例では、実施例 9ならびに 1 0により得られたフタロイル基が導入された I L 6抗体のアクリルアミドゲルへの固定及ひ，価を行った。 また、 フタロイル墓 が導入された I L 6抗体（比較例 5 ) 及び無修飾の I L 6抗体（比較例 6 ) のァク リルァミ ドゲルへの固定及び評価も行つた。
表 5に示したゲル前駆体水溶液 ( 3種類） を調製し、 マイクロピぺットにてガ ラススライ ド上に各 0. Ι μ ΐ滴下した。
滴下したゲル前駆体水溶液は、室温、窒素ガス下にて 1 5分間静置することに より、 I L 6抗体が固定されたアクリルアミドゲルとなる。上記のごとく I L 6抗 体が固定されたタンパク質チップを作製した。
表 5
Figure imgf000018_0001
上述のタンパク質チップは以下に示す方法で評価を行つた。 ここで利用する評価法は、前述記載のタンパク質チップに用いるタンパク質の 相互作用の評価法として一般的に用いられる方法による （S c i enc e, 200 0， v o l. 289, p. 1760) 。
本方法により、各スポットに起因する蛍光量を蛍光スキャナー [GeneTACLS IV(GENOMIC SOLUTIONSネ ±¾)] を使用し測定した。 結果は表 4に示す。 表 6
Figure imgf000019_0001
以上より、 フタロイル基が導入された IL6抗体が固定されたスポットに起因 する蛍光値は、 フタロイル基を導入していない IL6抗体が固定されたスポットに 起因する蛍光値の約 35〜 70倍であった。
よって、 フタロイル基が導入された IL6抗体をァクリルァミドモノマーと共重 合により固定することで、活性中心が露呈した状態配向させ、且つその機能を保持 したままで固定できていることが示唆される。 産業上の利用可能性
本発明により、不飽和官能基を有する修飾糖タンパク質が提供される。糖タンパ ク質の糖鎖部に、不飽和官能基を導入した修飾糖タンパク質を使用することにより、 微量のタンパク質を活性中心が露呈した状態配向させ、且つその機能を保持したま まで固定することができる。

Claims

請求 の範囲
1 . 糖タンパク質の糖鎮部に不飽和官能基を有する修飾糖タンパク質。
2. 糖タンパク質が抗体である請求項 1記載の修飾糖タンパク質。
3 .糖タンパク質にビュル化剤を作用させることを含む、糖タンパク質の糖鎖部に 不飽和官能基を有する修飾糖タンパク質の製造方法。
4.糖タンパク質に還元末端を付与し、次いでビュル化剤を作用させることを含む、 糖タンパク質の糖鎖部に不飽和官能基を有する修飾糖タンパク質の製造方法。
5 . 請求項 1又は 2記載の修飾糖タンパク質が固定された高分子材料。
6 .請求項 1又は 2記載の修飾糖タンパク質と重合性モノマーとを重合することに より得られる高分子材料。
7. 請求項 1又は 2に記載の修飾糖タンパク質が搭載されたプロティンチップ。
8 . 請求項 1又は 2に記載の修飾糖タンパク質が搭載された μ - T A Sチップ。
9. 請求項 7又は 8に記載のチップを含むプロティンセンサ一。
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