JP2013137299A - タンパク質固定ゲルマイクロアレイ - Google Patents
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Abstract
生体試料中の微量タンパク質を感度よく検出するマイクロアレイを提供すること。
【解決手段】
複数の貫通孔を有し、当該貫通孔内にタンパク質又は当該タンパク質のエピトープが固定化されたゲルを有するマイクロアレイ。タンパク質がアレルゲンタンパク質であるマイクロアレイ。マイクロアレイと検体とを接触させることにより、マイクロアレイに固定化されたタンパク質と検体中の標的物質とを結合させる工程、及び、当該タンパク質に結合している標的物質の量を定量する工程を含む、生体関連物質の検出方法。
【選択図】 図1
Description
線条体又は貫通孔を含むブロックとは、同軸方向に配向した線条体又は貫通孔を有するブロックである。貫通孔を形成する方法に特に限定はなく、例えば、特許文献8に記載されたような中空繊維を同軸方向に配列させた後、樹脂で固める方法を利用することができる。
中空繊維は、種々の材料を用いることができるが、有機材料が好ましい。
ブロックに貫通孔を形成させるには、上記中空繊維の複数本を、中空繊維の各繊維軸が同一方向となるように3次元に配列し、その配列が乱れないように接着剤等の樹脂で固定する方法が利用できる。
上記の方法で得られた貫通孔を有するブロックの各貫通孔中に、標的物質と結合するタンパク質を、ゲルを介して保持させた後、貫通孔が配向する方向と垂直方向に切断することにより、基板に貫通孔が配列されたマイクロアレイを得ることができる。
(3−1)タンパク質又は当該タンパク質のエピトープ
本発明のマイクロアレイでは、標的物質と結合する(標的物質を捕捉するための)タンパク質又は当該タンパク質のエピトープを、ゲルを介して貫通孔に保持させる。
本発明に用いるゲルの種類は、特に限定されず、天然物から得られるゲルであれば、アガロース、アルギン酸ナトリウムなどの多糖類の他、ゼラチン、ポリリジン等のタンパク質などが利用できる。
本発明のマイクロアレイの使用方法は、検体中の標的物質が検出できれば特には限定されない。
例えば、まず、マイクロアレイと検体とを接触させる。このとき、マイクロアレイに検体を滴下するなどしてマイクロアレイに検体を接触させても良いし、検体にマイクロアレイを浸漬することにより検体をマイクロアレイに接触させても良い。
その後、必要に応じて、マイクロアレイを洗浄すればよい。洗浄することにより、マイクロアレイ中のゲルやタンパク質等に非特異的に結合した検体中の標的物質以外の物質が洗い流され、プローブに特異的に結合している標的物質だけを検出することができる。
洗浄後、マイクロアレイに結合した標的物質を種々の標識剤で標識する。例えば、標識剤の水溶液を調整し、標識剤溶液中に洗浄後のマイクロアレイを10分間から30分間浸漬させることで標識することができる。標識剤溶液の濃度は任意に決めることができる。標識剤は限定されず、例えば一般に市販されている西洋ワサビペルオキシダーゼのような発光性の標識剤、Cy3、Cy5、アレクサ680などの蛍光標識剤を利用することができる。また蛍光や発光を検出することができる機器、例えば蛍光顕微鏡または蛍光スキャナーなどが利用できる。ただし、検出する場合は、検出環境を暗室にするなど遮光することが好ましい。外部からの光が検出環境に照射されると、それがノイズとなり、標識剤の光量を正確に検出できないことがあるからである。
本実施例では、タンパク質としてBSA(牛血清アルブミン、分子量約66kDa)をゲルに固定化したマイクロアレイを製造した。
BSAをゲルに固定するためにBSAへのビニル基の導入を以下の方法で行った。
和光純薬製特級試薬ジメチルスルホキシド(998.5μL)をマイクロピペットで1cc容量のマイクロチューブに計り取り、そこにアルドリッチ社製メタクリル酸無水物(無水メタ酸)を同じくマイクロピペットで1.5μL加えて、無水メタ酸のジメチルスルホキシド溶液(10mM)を調製した(ビニル化剤)。
次にアルドリッチ社製BSAの結晶を0.01035g秤量し、マイクロチューブに入れ、超純水(ミリQ水)1.5mLに溶解させた。
このようにして得られた反応液40μLをスピンカラム(ミリポア社製MICROCON(登録商標)、YM−30)に移し、超純水60μLを添加して総量を100μLにした。次に、反応液を入れたスピンカラムを遠心分離機にセットし、10000Gで10分間処理した。その後、スピンカラムの濃縮部に超純水100μL添加して、更に10000Gで10分間遠心分離する処理を5回繰り返した。
図1に示す配列固定器具を利用して中空繊維束を製造した。なお、図中のx、y、zは直交の3次元軸であり、x軸は繊維の長手方向と一致する。
表1に示す通り、ビニル化BSAの濃度水準に応じてゲル前駆体溶液を4種類調製し、濃度水準毎に30セットを準備し、ウェルプレートの各ウェルに80μL分注した。当該ウェルプレートをデシゲーター内に設置し、端部から各ウェルに分注したゲル前駆体溶液を吸引し、中空繊維の中空部に導入した。
作製したBSA固定マイクロアレイを使って、抗BSA抗体の検出を試みた。
ABCAM社製ビオチン標識・抗BSA抗体20μLに0.012MのTNT緩衝液(0.012M Tris・HCl/0.012M、NaCl/0.03%、Tween−20)を180μL加えて、ピペッティングにより均一になるように混合して、総量200μLの検体溶液を調製した。
容量8mLのチューブ(SARSTEDT社製)に0.12M Tris・HCl/0.12M NaCl/0.05% Tween−20溶液を6mL注入し、そこに反応後にチャンバーから取り出したBSA固定マイクロアレイを完全に液中に浸漬するように挿入した。
Jackson Immunoresearch Laboratoies,Inc.社製Streptavidin−Cy5(1mg)にNuclease−free waterを1mL加えて、溶解させた。10000Gで3分間遠心処理して、沈殿物を除いた後、Streptavidin−Cy5溶液12μLを調整した。
レーザー式蛍光顕微鏡(横河電機社製 MB−03)の試料台に、標識後のマイクロアレイを載せ、波長633nmの励起光を露光させ、タンパク質マイクロアレイの各スポットの蛍光シグナルを検出した。露光時間は、0.1秒、1秒、4秒、40秒の4条件で測定を行い、単位秒当りの蛍光シグナル強度を蛍光シグナル強度データとして採用した。測定したマイクロアレイの各スポットの蛍光シグナル強度を表2に示した。
アレルゲンタンパク質の調製
ゲルに固定化するアレルゲンタンパク質として、ソバ、小麦、ピーナッツ、ダイズ、コメ、エビ、カニ、ミルク、卵白を選択し、各タンパク質の抽出を以下の方法で行った。
アレルゲンタンパク質のビニル化反応を行うにあたり、反応させるアレルゲンタンパク質とビニル化剤の反応量比をモル比で換算するために、まずアレルゲンタンパク質の分子量を以下の手順で決定した。
BSAの代わりに各アレルゲンタンパク質を使用した以外は、実施例1と同様の方法で、ビニル化タンパク質約100μgを得た。
BSAの代わりに各アレルゲンタンパク質を使用した以外は、実施例1と同様の方法で、表4の通りに重合溶液組成を調整して作製したマイクロアレイを100枚作製した。
作製したマイクロアレイを使って、アレルゲン特異的IgE抗体の検出を試みた。
検体の調製及び反応
MASTII検査により、表5に示すアレルギー判定結果が得られたInternational enzymes社製のヒト血清を三菱レイヨン社製ジェノパール(登録商標)用ハイブリチャンバーに200μL注入し、先に作製したマイクロアレイを1枚挿入し、チャンバーの蓋を閉め、室温で2時間ほど静置反応させた。
容量8mLのチューブ(SARSTEDT社製)に0.12M Tris・HCl/0.12M NaCl/0.05% Tween−20溶液を6mL注入し、そこに反応後にチャンバーから取り出したマイクロアレイを完全に液中に浸漬するように挿入した。
ビオチン標識抗体との反応
KPL社製ビオチン標識・抗ヒトIgE抗体を0.012MのTNT緩衝液を加えて100倍希釈し、ピペッティングにより均一になるように混合して、総量200μLの反応溶液を調製した。
三菱レイヨン社製ジェノパール(登録商標)用ハイブリチャンバーに、この反応溶液を注入し、先に作製したマイクロアレイを1枚ゆっくり挿入し、チャンバーの蓋を閉め、室温で2時間ほど静置反応させた。
反応後の洗浄
容量8mLのチューブ(SARSTEDT社製)に0.12M Tris・HCl/0.12M NaCl/0.05% Tween−20溶液を6mL注入し、そこに反応後にチャンバーから取り出したマイクロアレイを完全に液中に浸漬するように挿入した。
反応後の標識
Jackson Immunoresearch Laboratoies,Inc.社製Streptavidin−Cy5(1mg)にNuclease−free waterを1mL加えて、溶解させた。10000Gで3分間遠心処理して、沈殿物を除いた後、Streptavidin−Cy5溶液12μLを調整した。
レーザー式蛍光顕微鏡(横河電機社製 MB−03)の試料台に、標識後のマイクロアレイを載せ、波長633nmの励起光を露光させ、マイクロアレイの各スポットの蛍光シグナルを検出した。露光時間は、0.1秒、1秒、4秒、40秒の4条件で測定を行い、単位秒当りの蛍光シグナル強度を蛍光シグナル強度データとして採用した。測定したマイクロアレイの各スポットの蛍光シグナル強度を表6に示した。
マイクロアレイの製造
BSAの代わりに合成ペプチド(C末端側をビニル化したアミノ酸配列(配列(N末端→C末端):DYKDDDDK)からなるペプチド)を使用した以外は、実施例1と同様にしてマイクロアレイを製造した。ゲル前駆体溶液は、表7に示す通りプローブの濃度水準に応じて16種類調製した。
ビオチン標識モノクローナル抗FLAG抗体(アルドリッチ社製:本発明で使用するプローブに特異的に結合する)、及びビオチン標識モノクローナル抗HA抗体(アルドリッチ社製)を表8に示す量を含む検体溶液(溶媒はTNT溶液)が、それぞれ200μLになるように調製した。また、表9に示すように、当該検体中に種々の濃度のNaCl(M)及びTween−20(質量%)を含むように調製し、9種類準備した。
まず、検体溶液に浸漬させた後のマイクロアレイを、表9に示す9種類の洗浄液(表9の「検体溶液」の欄に記載のNaCl,Tween−20及び0.12M Tris−HClの水溶液)に浸漬し、室温で20分間洗浄した。次いで、表9の右欄(洗浄液)に示す9種類の洗浄液(9種類のNaClと0.12M Tris−HClの水溶液)にチップを浸漬させて、室温で10分間洗浄した。
Cy5 Streptavidin(GEヘルスケア社製)を用いて染色を行った。すなわち、ストレプトアビジン−Cy5 1mgを1mLの滅菌水に溶解し、そのうちの10μLを0.12M TNT溶液(0.12M Tris−HCl、0.12M NaCl、0.5%Tween20溶液)5mLに混合し、染色液を作製した。作製した染色液に対し、マイクロアレイを室温で30分間浸漬した。
マイクロアレイを染色液中から取り出し、表9に示す番号1〜9の各濃度水準に基づいて調製した、塩と界面活性剤とを含む洗浄液にチップを浸漬させて、室温で20分間洗浄した。
レーザー式蛍光顕微鏡(横河電機社製 MB−03)の試料台に、標識後のマイクロアレイを載せ、波長633nmの励起光を露光させ、マイクロアレイの各スポットの蛍光シグナルを検出した。露光時間は、50msec、100msec、1sec、4sec、40secの5条件で測定を行い、単位秒当りの蛍光シグナル強度を蛍光シグナル強度データとして採用した。
表8に示す番号1〜6の検体濃度水準に対して、表9に示す番号1〜9の条件での実験をそれぞれn=3で実施し、マイクロアレイの各スポットの蛍光シグナル強度から、定量性の指標となるSN比を算出した。SN比の算出は「入門パラメータ設計」を参考にした。
11 孔部
21 多孔板
31 中空繊維
41 板状物
Claims (6)
- 複数の貫通孔を有し、当該貫通孔内にタンパク質又は当該タンパク質のエピトープが固定化されたゲルを有するマイクロアレイ。
- 固定化されたタンパク質又は当該タンパク質のエピトープの濃度が0.25〜250pmol/μLである、請求項1記載のマイクロアレイ。
- ゲルのモノマー濃度が2質量%以上である、請求項1又は2記載のマイクロアレイ。
- タンパク質がアレルゲンタンパク質である請求項1〜3のいずれかに記載のマイクロアレイ。
- 下記工程を含む、マイクロアレイの製造方法。
(1)複数本の中空繊維を中空繊維の各繊維軸が同一方向となるように3次元に配列し、その配列を樹脂で固定することにより、中空繊維束を製造する工程
(2)タンパク質又は当該タンパク質のエピトープを含むゲル前駆体溶液を中空繊維束の各中空繊維の中空部に導入する工程
(3)中空繊維束の中空部に導入したゲル前駆体溶液を反応させ、タンパク質又は当該タンパク質のエピトープが固定化されたゲルを中空繊維の中空部に保持する工程
(4)中空繊維束を繊維の長手方向に交叉する方向で切断して薄片化する工程 - 請求項1〜4のいずれかに記載のマイクロアレイと検体とを接触させることにより、マイクロアレイに固定化されたタンパク質と検体中の標的物質とを結合させる工程、及び、当該タンパク質に結合している標的物質の量を定量する工程を含む、生体関連物質の検出方法。
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