WO2004011948A1 - タンパク質の分析方法 - Google Patents

タンパク質の分析方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2004011948A1
WO2004011948A1 PCT/JP2003/009305 JP0309305W WO2004011948A1 WO 2004011948 A1 WO2004011948 A1 WO 2004011948A1 JP 0309305 W JP0309305 W JP 0309305W WO 2004011948 A1 WO2004011948 A1 WO 2004011948A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
sample
membrane
staining
bsa
Prior art date
Application number
PCT/JP2003/009305
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Naoyuki Yamada
Shinichi Ozawa
Naoko Kageyama
Hiroshi Miyano
Original Assignee
Ajinomoto Co., Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ajinomoto Co., Inc. filed Critical Ajinomoto Co., Inc.
Priority to DE60326740T priority Critical patent/DE60326740D1/de
Priority to AU2003252235A priority patent/AU2003252235A1/en
Priority to EP03771282A priority patent/EP1544618B1/en
Priority to JP2004524123A priority patent/JPWO2004011948A1/ja
Publication of WO2004011948A1 publication Critical patent/WO2004011948A1/ja
Priority to US11/039,791 priority patent/US20050147720A1/en

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6827—Total protein determination, e.g. albumin in urine

Definitions

  • the present invention relates to a novel method for analyzing proteins contained in foods and drinks, food additives, pharmaceuticals, feeds, and the like.
  • ELISA method is generally used to detect trace amounts of allergic substances contained in foods or food additives.
  • Nippon Ham Co., Ltd. released ELISA kits for the five main products.
  • Snow Brand Milk Products Co., Ltd. announced an ELISA method for soybean protein at the Japan Society of Agricultural Chemistry (2002 Annual Meeting of the Japanese Society of Agricultural Chemistry).
  • a protein is extracted from the raw material with a physiological saline solution, immunized to a heron, and an ELISA system is established using IgG roughly purified on a protein A column.
  • the sensitivity is so high as lng / ml for soybeans, but the selectivity for soybean protein is low due to the low purity of raw materials and antibodies. Also, there is no information about the antigen. As described above, in the ELISA method, it is necessary to first produce an antibody against an allergen (antigen), and it takes time to establish an analytical method, and there is no guarantee that all the allergens can be detected. Furthermore, the antibody used There is a problem that sensitivity and specificity vary depending on the nature. In addition, since the ELISA method uses an antigen-antibody reaction, a neutral solution in which the antigen and the antibody bind must be used as the sample solution. However, some solid samples do not always have high solubility near neutrality.
  • a method combining a dot plotting method with a staining method is also known.
  • the dot plot method generally, the protein concentrated and retained on the membrane is visualized by staining with the Coomassie brilliant blue method or the like.
  • a colloidal gold staining method is also known as a high-sensitivity staining method, but has many drawbacks, such as a high background, uneven staining, and complicated operations.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a simple, reproducible and highly sensitive analysis method for trace proteins such as allergic substances contained in foods and drinks, food additives, pharmaceuticals, feeds, etc. .
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, by combining the dot blot method and the fluorescent staining method, which have been conventionally used in the field of biochemistry, in the test object (sample).
  • the present inventors have found that simple and highly sensitive analysis of contained trace proteins is possible, and based on this finding, have completed the present invention.
  • the present invention resides in a method for analyzing a protein contained in a sample, which is characterized in that after subjecting the sample to a dot plot method, the sample is subjected to a fluorescent staining method for protein staining. .
  • the analysis method of the present invention quantitative analysis and limit analysis (limit test) of a protein contained in a sample are possible.
  • the sample is subjected to the dot plot method in a solution state to immobilize the protein on a protein immobilization membrane contained in the sample, and immobilized on the membrane by the fluorescent staining method. And a staining step for the converted protein.
  • sample foods and drinks, food additives, pharmaceuticals and feeds, and intermediate products thereof can be used.
  • Preferred examples include amino acids. This method has sufficient sensitivity for detecting trace proteins contained in such products.
  • At least 0.1 ppm of protein can be analyzed if preferred.
  • Preferred examples of the protein immobilizing membrane include a nitrocellulose membrane and a PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane.
  • the present invention includes, as another embodiment, products whose proteins have been analyzed by the method of the present invention, for example, foods and drinks, food additives, pharmaceuticals and feeds, intermediates thereof, and amino acids. . Further, products (products) containing or using the products analyzed in this way are also naturally included in the present invention.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a dot mouth device used in Example 1.
  • FIG. 2 illustrates an example of image data of a BSA (bovine serum albumin) sample and an amino acid + BSA sample in Example 1.
  • BSA bovine serum albumin
  • Lanes 1 and 2 amino acid + BSA sample; lanes 3 and 4: BSA standard.
  • FIG. 3 shows a method for calculating the protein concentration in amino acids by the standard addition method in Example 1. Hata: Amino acid; Image: BSA .; Arrow: Protein concentration in amino acid solution.
  • Horizontal axis BSA addition amount; vertical axis: fluorescence intensity.
  • Figure 4 shows the results of the protein measurement in Glu-Na (sodium L-glutamate monohydrate) and The (L-theanine) using dot blot-fluorescence staining in Example 1. ).
  • Horizontal axis BSA concentration (ppm); Vertical axis: fluorescence intensity.
  • FIG. 5 shows the results of protein measurement of BSA, lysozyme, ubiquitin, insulin, and oxidized insulin B chain using dot plot fluorescence staining in Example 2.
  • Horizontal axis protein concentration (ppm); vertical axis: fluorescence intensity.
  • the protein contained in the sample to be analyzed is immobilized on a protein immobilization membrane by dot blotting. In this case, it is usually immobilized in a solution state.
  • a typical example of the dot plot method is that, for example, a nitrocellulose membrane, a polyvinylidene difluoride membrane (PVDF membrane), etc. is sandwiched between acrylic plates with many holes, and the protein in the holes on the membrane.
  • the protein is immobilized on the membrane by injecting the solution and performing suction filtration with a water flow pump. This makes it possible to simultaneously concentrate and desalinate many types of protein samples while keeping them fixed on the membrane (protein structure analysis for gene cloning, blotting and sequencing, Hisashi Hirano, Tokyo Chemical Doujinshi) Issue, p. 62.).
  • SyproRuby a fluorescent staining reagent recently developed for proteome analysis, is a fluorescent staining reagent for gels from which proteins have been separated by SDS electrophoresis.
  • This reagent advantages such as quick and easy staining, high sensitivity and high quantitativeness can be obtained as compared with the conventional method.
  • This can be used for, for example, detection or quantification of a protein immobilized on a PVDF membrane. The higher the sensitivity of protein quantification, the greater the loss due to adsorption to a container or the like in ordinary operations, and the more difficult it is to detect.
  • a combination of the dot plot method and the fluorescent staining method can provide a method for analyzing trace proteins with high sensitivity and high quantification in a relatively short time (approximately 415 hours from sample preparation to image analysis).
  • the method of the present invention is slightly inferior in sensitivity as compared with the ELISA method, but is excellent in that all proteins that can be retained on the membrane can be measured. Furthermore, even smaller proteins can be detected if their hydrophobicity is high, and they can be detected by selecting or developing a preferred protein-immobilizing membrane. In the case of a solid sample, the higher the solubility, the higher the detection sensitivity per weight.
  • any of acidic, neutral and alkaline solvents can be used, so that the sample can be dissolved and used in a solvent having a pH value most suitable for the solubility of the sample. As a result, the detection sensitivity can be improved.
  • the quantification and specificity of the ELISA method largely depend on the properties of the antibody used, and it is very difficult to measure a protein or peptide that can serve as an antigen without completely leaking it. Moreover, it is not possible to detect antigens for which no antibodies have been prepared.
  • the dot plot method—fluorescent staining method according to the present invention which detects total protein, can be evaluated irrespective of the presence or absence of antigenicity of a protein, and is a more reliable measurement method. I can say that there is.
  • a sample In the case of a solution sample, dissolve the sample at the highest possible concentration in the form of a highly soluble solution for a solid sample. Since amino acids have high solubility in acidic solutions, it is desirable to dissolve them in 3.5% aqueous hydrochloric acid.
  • a standard protein for example, bovine serum albumin: BSA
  • BSA bovine serum albumin
  • the protein in the sample is adsorbed on the protein immobilization membrane by aspirating all the time.
  • a PVDF membrane with high adsorption capacity is desirable.
  • water can be injected and aspirated several times to remove any remaining analytes remaining on the membrane.
  • amino acid sample it is possible to remove amino acids that react with the staining solution and small molecules that interfere with the stain, hydrochloric acid, and the like.
  • the washed membrane is taken out from a blotter (dot plotting device; see FIG. 1) and dried sufficiently.
  • the membrane dried as described above is stained with a fluorescent staining reagent.
  • Fluorescent staining reagent SyproRuby manufactured by Molecular Dynamics developed for proteome analysis is a highly sensitive and quantitative reagent, and this reagent can be preferably used.
  • the protein is immobilized, and then the protein is stained with a fluorescent staining reagent, and then the membrane is washed, preferably for fluorescence image detection. Analyze using the instrument.
  • each sample and the sample added with BSA are observed as spots.
  • the area intensity of each spot is determined, and the standard protein addition amount is plotted on the horizontal axis, and the fluorescence area intensity on the vertical axis.
  • the Y-axis section of the blank sample is the background, it is drawn as a horizontal line.
  • the specimen sample was extrapolated, and the section was used as the protein concentration in the specimen.
  • BSA was used as a standard protein, at least 0.1 ppm of BSA could be detected.
  • this detection sensitivity is applied as it is.
  • the detection sensitivity depends on the solubility of the sample. The highest detection sensitivity can be obtained by dissolving the sample in the highest solvent.
  • an acid or an alkali can be removed after the protein is adsorbed on the membrane, so that the method is excellent in that it is not limited by the type of the solvent.
  • solubility of neutral and low solubility tyrosine and cystine can be improved by making them acidic.
  • Example 1 Protein in amino acids for food additives The equipment used was as follows.
  • Fluorescence image analyzer (Amersham's Biotech Fluor Imager 595 or Tyhoon 8600);
  • PVDF membrane PVDF SEQUENCING MEMBRANE I s obi lon—P SQ );
  • Siliconized chips 250, 1000 1;
  • the reagents used are as follows.
  • the experimental operation procedure that is, the analysis procedure and the experimental operation are shown below.
  • L-Asp L-Cys 2 2, L-Glu, L-Tyr, L-Trp, L-Gin, L-Asp-Na, L-Glu-Na.
  • Fig. 1 shows the outline of the blottering device (dot plot device) used here. 7. Apply sample to membrane
  • Sens i t ivity Normal Measurement procedure:
  • the spot is surrounded by a circle, and the integrated value of the fluorescence intensity in the spot is obtained.
  • FIG. 2 An example of an image obtained by the dot blot method is shown in FIG.
  • the spot concentration increases with the addition amount. Since the amount of BSA added is clearly observed at 0.1 zg / ml (0.1 ppm), the present invention can detect at least 0.1 ppm of protein.
  • the spot concentration was observed in the same manner, but further, fluorescence was observed in a donut shape concentrically with the sample spot. This is thought to be because when the amino acids were removed under reduced pressure, the infiltration around the well reacted with the fluorescent reagent. Therefore, when performing quantitative analysis, the product (polym) of the fluorescence intensity of the spot portion was adopted.
  • Dilution ratio Asp, Cys, Glu, Phe, Tyr, Gin, Trp 14.3 times; and 8.3 times other than the above.
  • BSA bovine serum albumin
  • FIG. 3 shows a method for calculating the protein concentration in amino acids by the standard addition method, and the arrows indicate the protein concentration in the amino acid solution.
  • Figure 4 shows the results of measurement of protein in amino acids for food additives, GluNa (0 (sodium L-glutamate monohydrate) and The (L-theanine) using dot blot-fluorescence staining (standard Addition method).
  • the amino acid concentration was fixed, but in the case of highly soluble amino acids, the detection sensitivity can be further improved by increasing the concentration.
  • the present invention provides a method for analyzing proteins, which allows simple and highly sensitive analysis of trace proteins such as allergic substances contained in foods and drinks, food additives, pharmaceuticals, cosmetics, feeds, and the like. Can be performed. Therefore, the present invention can be widely practiced industrially, particularly in the fields of foods, pharmaceuticals, cosmetics, feeds and the like, and its usefulness is clear.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

　試料をドットブロット法に供した後、タンパク質染色のための蛍光染色法に付して試料中に含まれる微量のタンパク質を分析することによりタンパク質の分析を行う。この方法により、飲食品、食品添加物、医薬品、飼料等の中に含まれるアレルギー性物質等の微量タンパク質を簡便かつ高感度に分析することができる。　上記目的とする分析方法を提供し、試料中に含まれるタンパク質の定量分析及び限度分析を可能とする。

Description

タンパク質の分析方法 技術分野
本発明は、 飲食品、 食品添加物、 医薬品、 飼料等に含まれるタンパク質の新規 分析方法に関する。
明
背景技術 田
食品や、 食品添加物中に含まれる不純物の一つにアレルギー性物質があり、 近 年問題となっている。 このアレルギー性物質を含む食品に起因する健康危機を防 止するために、 2001年 4月、 衛生法の関連法令が改定され、 特定原材料 5品目 （卵 、 乳、 小麦、 そば、 落花生） 中のアレルギー物質の表示が義務化された。 また、 アレルギー性物質はタンパク質であることから、 厚生労働省は、 総タンパク質が 数 g/g以上含有する食品は表示が必要との方針を出している （平成 13年 10月 29 日付け厚生労働省医薬局食品保険部企画課 「食品表示研究班ァレルギ一表示検討 会中間報告」 参照。 ） 。 .
このような背景の下、 食品、 或いは食品添加物中に微量に含まれるアレルギー 性物質の検出には、 一般的にはェンザィムィムノアツセィ法 （ELISA法） が用い られている。 省令施行直前の平成 14年 3月に、 日本ハム （株） から主要 5品目に対 する ELISAキットが発売されている。 同じく、 平成 14年 3月 27日に、 雪印乳業 （株 ) が大豆タンパク質の ELISA法について、 日本農芸化学会で発表している （平成 1 4年日本農芸化学会年会） 。 この方法では、 原料から生理食塩水でタンパク質を 抽出し、 これをゥサギに免疫し、 プロテイン Aカラムで粗精製した IgGを用いて、 ELISAの系を確立している。 その感度は、 大豆で lng/mlと、 高感度であるが、 原 料と抗体の精製度が低いことから、 大豆タンパク質に対する選択性は低い。 また 、 抗原に関する情報が全く無い。 このように ELISA法は、 先ずアレルゲン （抗原 ) に対する抗体を作成する必要があり、 分析法確立までに時間を要することに加 えて、 また全てのアレルゲンを検出できる保証も無い。 更には、 使用する抗体の 性質により、 感度や、 特異性にばらつきがあるといった問題点がある。 また、 EL ISA法は抗原一抗体反応を用いているために、 抗原と抗体が結合する中性溶液を 試料溶液に採用しなくてはならない。 しかしながら、 固形試料の場合には必ずし も中性付近の溶解度が高くないものもある。 例えば、 アミノ酸にも中性付近で溶 け難いものがある。 チロシンの場合、 中性付近での溶解度が非常に低いため、 重 量あたりのタンパク質検出感度は、 ELISAでも数十〜数百 ppmとなってしまう。 一方、 ドットプロット法に染色法を組み合わせた方法も知られている。 例えば 、 ドットプロット法で、 一般に、 膜上に濃縮、 保持されたタンパク質は、 クーマ シ一ブリリアントブルー法等で染色することにより、 視覚化される。 他に高感度 の染色法としては、 金コロイド染色法が知られているが、 バックグラウンドが高 くなること、 染色ムラが起こること、 操作が煩雑である等、 欠点が多い。
以上のような情況下に、 微量のタンパク質を簡便かつ再現性良く高感度に分析 する方法が求められている。 発明の開示
1 . 発明が解決しょうとする課題
本発明が解決しょうとする課題は、 飲食品、 食品添加物、 医薬品、 飼料等の中 に含まれるアレルギー性物質等の微量タンパク質の簡便かつ再現性良い高感度の 分析方法を提供することにある。
2 . 課題を解決するための手段
本発明者等は、 上記課題を解決するために鋭意研究を行なった結果、 従来生化 学分野で用いられてきたドットブロット法と蛍光染色法を組み合わせることによ り、 検査対象 （試料） 中に含まれる微量タンパク質の簡便かつ高感度の分析が可 能であることを見出し、 この知見に基づいて本発明を完成するに到った。
即ち、 本発明は、 一つの形態として、 試料をドットプロット法に供した後、 夕 ンパク質染色のための蛍光染色法に付することに特徴を有する試料中に含まれる タンパク質の分析方法に存する。
この発明の分析方法においては、 試料中に含まれるタンパク質の定量分析及び 限度分析 （限度試験） が可能である。 上記方法においては、 当該試料を溶液状態で当該ドットプロット法に供し、 試 料中に含まれるタンパク質固定用膜上にタンパク質を固定化するための工程と、 当該蛍光染色法による当該膜上に固定化したタンパク質用の染色工程とを含める ことができる。
当該試料としては、 飲食品、 食品添加物、 医薬品及び飼料、 並びにこれ等の中 間品を使用することができる。 好ましい例としてアミノ酸を挙げることができる 。 このような製品中に含まれる微量タンパク質の検出には十分な感度を、 この方 法は有している。
この方法においては、 好ましい場合少なくとも 0. lppmのタンパク質を分析する ことができる。
上記タンパク質固定用膜の好ましい例として、 ニトロセルロース膜及び PVDF ( ポリビニリデンジフルオリド） 膜を挙げることができる。
本発明は、 別の形態として、 上記本発明の方法でタンパク質が分析された製品 、 例えば飲食品、 食品添加物、 医薬品及び飼料、 並びにこれ等の中間品、 並びに アミノ酸等も本発明に含まれる。 更に、 このように分析された製品を含み、 又は 使用したもの （製品） も、 当然本発明に含まれる。 図面の簡単な説明
[図 1 ]
図 1は、 実施例 1で使用したドッ卜ブ口ット装置の概略図である。
1 . 試料テンプレート； 2 . ガスケット； 3 . ガスケットサポートプレート； 4. バキュームマニフォ一ルド； 5 . 膜；及び 6 . 濾紙。
[図 2 ]
図 2は、 実施例 1において BSA (牛血清アルブミン） 標品とアミノ酸 +BSA試料 の画像データの 1例を図示したものである。
レーン 1 , 2 ：アミノ酸 +BSA試料；レーン 3， 4 : BSA標品。
[図 3 ]
図 3は、 実施例 1において標準添加法によるアミノ酸中のタンパク質濃度算出 法を示したものである。 秦：アミノ酸；画 ： BSA. ；矢印：アミノ酸溶液中のタンパク質濃度。
横軸： BSA添加量；縦軸：蛍光強度。
園 4 ]
図 4は、 実施例 1においてドットブロットー蛍光染色法を用いた Glu-Na (L-グ ル夕ミン酸ナトリウム 1水和物） 及び The (L-テアニン） 中のタンパク質の測定 結果 （標準添加法） を示したものである。
秦： BSA；豳： Glu-Na；▲： The。
横軸： BSA濃度 （ppm) ；縦軸：蛍光強度。
[図 5 ]
図 5は、 実施例 2においてドットプロットー蛍光染色法を用いた BSA、 リゾチ ーム、 ュビキチン、 インスリン及び酸化型インスリン B鎖のタンパク質測定結果 を示したものである。
•： BSA； 園 ：インスリン；▲：ュビキチン； X ：インスリン酸化型 B； +： リ ゾチーム。
横軸：タンパク質濃度 （ppm) ；縦軸：蛍光強度。 発明の実施の形態
以下に、 本発明の実施の形態について説明する。
本発明においては、 分析すべき試料をドットブロット法によりタンパク質固定 用の膜上に、 試料中に含まれるタンパク質を固定化する。 この場合通常は溶液状 態で固定化される。
ドットプロット法とは、 その代表例を示すと、 多数の穴の空いたアクリル板の 間に、 例えばニトロセルロース膜、 ポリビニリデンジフルオリド膜 （PVDF膜） 等 を挟んで、 膜上の穴にタンパク質溶液を注入し、 水流ポンプによって吸引濾過す ることにより、 タンパク質を膜上に固定する方法である。 これにより、 多種類の タンパク質試料を同時に濃縮及び脱塩しながら、 膜上に固定保持することができ る （遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析、 ブロッテイングとシーク ェンシング、 平野久著、 東京化学同人発行、 p. 62参照。 ) 。
次に、 前記膜上に固定されたタンパク質を蛍光染色法により染色後、 これを測 定する。
近年、 プロテオ一ム解析用として開発された蛍光染色試薬 SyproRubyは、 SDS電 気泳動法でタンパク質を分離したゲルの蛍光染色試薬である。 この試薬を使用す ることにより、 従来法に比較して染色が迅速かつ簡単で、 高感度かつ定量性が高 い等の利点が得られる。 これを、 例えば PVDF膜に固定化したタンパク質の検出或 いは定量に用いることができる。 高感度のタンパク質定量であればあるほど、 通 常の操作では、 容器への吸着等によるロスが大きく、 検出することは困難である 。 そこで、 微量タンパク質の取り扱いを更に検討した結果、 希釈操作は可能な限 り減らすこと、 容器、 チップ等はシリコナイズ処理をしたものを使用することに より、 0. lppmのタンパク質を検出できる高感度タンパク質定量分析法を確立する に到った。
本発明方法によれば、 ドットプロット法一蛍光染色法の組み合わせで、 比較的 短時間 （サンプル調製から画像解析までおよそ 4一 5時間） 、 高感度でかつ定量 性の高い微量タンパク質の分析方法を提供することができる。 本発明方法を、 EL ISA法と比べると、 感度の面で若干劣るところもあるが、 膜に保持され得るタン パク質全てを測定対象とすることができる点で優れている。 更に、 これよりも小 さな夕ンパク質についても疎水性が高ければ検出可能であるし、 好ましいタンパ ク質固定用の膜を選択又は開発したりすることでもそれが検出可能となる。 また 、 固形試料の場合は、 溶解度が高いほど、 重量あたりの検出感度が高くなる。 本 発明では、 溶媒の pH値を選ばないため酸性、 中性及びアルカリ性何れの溶媒でも 使用することができるので、 試料の溶解度に最適な pH値の溶媒に試料を溶解して 使用することが可能であり、 この結果検出感度を向上させることができる。
ELISA法の定量性及び特異性は、 用いる抗体の性質に大きく左右されるし、 ま た抗原となり得るタンパク質或いはペプチドを完全に漏らさずに測定することは 非常に困難である。 その上、 抗体が用意されていない抗原を検出することはでき ない。 これに対し、 本発明によるドットプロット法—蛍光染色法は、 総タンパク 質を検出することから、 タンパク質の抗原性の有無を問わず評価することが可能 であり、 より信頼性の高い測定法であると言うことができる。
次に、 本発明の手順を簡単に説明する。 代表的かつ好ましい例を中心に説明す るが、 これは代表例を示すものであり故にこの代表例の説明により本発明が何等 制限を受けるものではない。
溶液試料の場合はそのまま、 固体試料の場合は、 溶解度の高い溶液の形態で試 料を可能な限り高い濃度で溶解する。 アミノ酸の場合は、 酸性溶液での溶解度が 高いことから、 3 . 5 %塩酸水溶液で溶解することが望ましい。 標準添加法によ り、 正確に試料中のタンパク質量を求めるために、 標準タンパク質 （例えば、 牛 血清アルブミン： BSA) を適宜添加した試料を調製する。 次に、 ドットプロット 法を用いて、 例えば、 ニトロセルロース膜或いは PVDF膜に試料中のタンパク質を 捕捉させると同時に、 試料中の測定妨害物質の除去を行なう。 9 6穴のドットブ ロット用装置が市販されており、 これを使用すると、 同時に多検体を処理するこ とができる。
試料を注入後、 ァスピレ一夕一で吸引することにより、 試料中のタンパク質を 、 タンパク質固定用膜に吸着させる。 膜の材質には、 吸着能の高い PVDF膜が望ま しい。 液体が全て吸引された後、 数回水を注入し、 吸引することで、 膜に残った 分析妨害物質を除去することができる。 アミノ酸試料の場合では、 染色液に反応 するアミノ酸と妨害する低分子や塩酸等を除去することができる。 続いて、 洗浄 後の膜をブロッテリング装置 （ドットプロット装置；図 1参照。 ） より取り出し 、 十分に乾燥させる。
上記の如く乾燥した膜は、 蛍光染色試薬を用いて染色する。 プロテオーム解析 用として開発された蛍光染色試薬 SyproRuby (モレキュラー ·ダイナミクス社製 ) は、 感度と定量性の高い試薬であり、 この試薬を好ましく使用することができ る。
このように乾燥して得られた膜に対して酢酸—メタノール溶液処理を施すこと により、 タンパク質を固定化した後に、 蛍光染色試薬でタンパク質を染色、 その 後膜を洗浄し、 好ましくは蛍光画像検出装置を用いて解析する。
得られた画像データで、 各試料及びそれに BSAを添加した試料がスポットとし て観測される。 各スポットのエリア強度を求め、 標準タンパク質添加量を横軸に 、 蛍光エリア強度を縦軸にとり、 プロットするとよい。 後述の実施例ではブラン ク試料の Y軸切片がバックグラウンドとなることから、 それを水平に引いた線に 検体試料を外挿し、 その切片を検体中のタンパク質濃度とした。 標準タンパク質 として、 BSAを用いた場合、少なくとも 0. lppmの BSAを検出することができた。 溶液 試料の場合においては、 この検出感度がそのまま適用される。 一方、 固体試料の 場合においては、 試料の溶解度に検出感度が依存する。 検体の最も高い溶媒で溶 解することにより、 最大の検出感度を得ることができる。
本発明方法においては、 酸、 アルカリでも、 膜にタンパク質を吸着させた後に 、 除去することができるため、 溶媒の種類により制限を受けない点でも優れてい る。
アミノ酸の場合、 中性で溶解度の低いチロジンやシスチン等も、 酸性にするこ とにより溶解度が向上する。
最近、 米国を始めとして日本でも、.遺伝子組み替え生物、 植物を用いた食品及 び食品添加物が市場に出回るようになつたが、 依然として消費者の GM0 (遺伝子 組換え作物） に対する不安が根強く存在している。 GM0を利用して生産された食 品添加物中の残存タンパク質を可能な限り高感度で定量或いは検出し、 製品の品 質を保証することは、 今後益々必要になってくると考えられる。
更に、 最近脚光を浴び始めた再生医療の分野においては、 人の組織や臓器を in vi troで再生し、 移植する最先端の医療技術であり、 今後更なる発展が期待され ている分野である。 これ等組織や臓器を再生する際に用いる培地は、 異種 ·他人 の夕ンパク質がァレルゲンとなり得るため、 無タンパク質培地が一般的に用いら れる。 従って、 再生医療の分野においても、 培地中のタンパク質を可能な限り高 感度で分析或いは定量する方法、 手段が待ち望まれている。 この他にも、 医薬品 、 化粧品、 サプリメント （栄養補助剤、 栄養補助食品） や健康食品中のタンパク 質の高感度測定も今後益々重要になってくると考えられる。
以上のような多くの各種要請に対して本発明は極めて有用であり、 期待が大き い。 好適な実施の形態
以下に、 実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、 本発明はこの実施 例により何等限定されるものではない。 (実施例 1 ) 食品添加物用アミノ酸中のタンパク質定 使用した器具は下記の通りである。
微量 96検体同時濾過装置（アト一 (株) AE- 6190型） ；
蛍光画像解析装置 （アマシャム 'バイオテク製 Fluor Imager 595 又は Tyhoon 8 600) ；
PVDF膜（ミリポア製 PVDF SEQUENCING MEMBRANE I讓 obi lon— PS Q ) ；
振とう機 (東京理化 (株)丽 LTI SHAKER匪 S) ；
クリーンドラフト（ャマト科学製） ；
ァスピレーター；
ポリメスフラスコ（100ml) ；
シリコナイズエツペン（1. 5ml) ；
シリコナイズチップ（250， 1000 1) ；及び
使用した試薬は下記の通りである。
蛍光染色液（モレキュラープローブ社 Ruby prote in blot stain 200ml入り） BSA標品（SIGMA製 PROTEIN STANDARD lOOOppm ) ；
塩酸 (関東化学 (株） 超高純度試薬 250ml入り） ；
酢酸 (純正化学 (株） 特級 500ml入り） ；及び
メタノ一ル (純正化学 (株） 高速液体クロマトグラフィー用 3L入り）。 実験操作手順
実験操作手順、 即ち分析手順と実験操作を以下に示す。
分析手順
1. 器具洗浄 (ゥエルの洗浄）
1
2. 試薬の調製（3. 6%塩酸，固定液） I
3. 試料調製
(アミノ酸溶解， BSA標品の希釈,アミノ酸に標品添加）
I
4. PVDF膜の切断と活性
4
5. 3. 6WIC1に 30分間浸潤
I
6. 膜をブロッターにセットし、 洗浄
1
7. 試料を膜に添加
Ϊ
8. 膜を洗浄
I
9. 膜を乾燥
I
10. タンパク質を膜に固定
1
11. 膜を洗浄
I
12. 膜を染色
I
13. 膜を洗浄
4 .
14. 蛍光画像装置での測定と解析 実験操作
1. サンプルゥエル、 シールガスケット、 及びガスケット保持プレートを純水 で器具を洗浄する。 2. 試薬の調製
2-1. 3. 6%塩酸； 36%塩酸 （関東化学 (株） 超高純度試薬 250πι1入り） から、 マ イク口ピぺッ夕一で 10ml採取し、 100mlポリメスフラスコに入れ純水でメスァッ プ (100ml) する。
2- 2. 固定液
メタノール （純正化学 (株） 高速液体クロマトグラフィー用 3L入り） 10mlと酢 酸 （純正化学 (株） 特級 500ml入り） 7mlをマイクロピペットでとり、 100mlポリ メスフラスコに入れ、 純水でメスアップ （100ml) する。
3. 試料調製
3- 1. ァミノの秤量と溶解
下記アミノ酸を 120mg/mlになるように、 3. 6%塩酸で溶解する。 （1. 5mlシリコナ ィズエツペンを用いる。 ）
L - Asp, (L-Cys) 2, L-Glu, L-Tyr, L-Trp, L - Gin, L-Asp-Na, L - Glu- Na。
L-Pheについては、 70mg/mlになるように、 3. 6%塩酸に溶解する。
3-2. スタンダード（標準試薬： BSA)の調製
0, 0. 1， 0. 2， 0. 5 g/mlになるように、 3. 6%塩酸で希釈する。 尚、 0 g/mlは、 3. 6%塩酸とする。
3-3. 測定試料アミノ酸溶液 （SA) の調製
SA中の BSA濃度が、 0, 0. 1, 0. 2, 0. 5 g/mlになるように、 アミノ酸溶液で希釈す る。 尚、 0 /x g/mlは、 アミノ酸溶液とする。
4. PVDF膜の切断と活性化
PVDF膜を約 12cmx 9cmになるようにハサミで切り、 裏表が分かるように右上と 鉛筆で書く。 容器に、 メタ一ルを入れ 1分間浸ける。
5. 3. 6%HC1に 30分間浸潤
容器に塩酸を入れ、 活性処理後の PVDF膜を 3. 6%塩酸に 30分間浸ける。
6. 膜をブロッターにセットし、 洗浄
膜をプロッターにセットし、 3. 6%塩酸 350 lをアプライし、 ァスピレ一夕で吸 引しながら洗浄する。 尚、 ここで使用したブロッテリング装置 （ドットプロット 装置） の概略を図 1に示している。 7. 試料を膜にアプライ
SA350 /Uをアプライし、 ァスピレー夕で吸引する。
8. 膜の洗浄
3. 6%塩酸 350 M iをアプライし、 ァスピレ一夕で吸引しながら洗浄する。 次に、 純水 350 lをアプライし、 ァスピレー夕で吸引しながら洗浄する。
9. 膜の乾燥
膜をプロッターから外し、 クリーンドラフト内で 1時間乾燥する。
10. タンパク質を膜に固定
固定液を専用用器に入れ、 乾燥した膜の転写面を下にして固定液に浮かべる。 振とう機を用いて 15分間固定を行なう。 （振とう機のスピードは、 50rpmで行なう
11. 膜の洗浄
容器に純水を入れる。 膜の転写面を下にして純水に浮かべる。 振とう機を用い て 5分間洗浄を行なう。 （振とう機のスピードは、 50rpmで行なう。 ）膜を取り出し 容器の純水を交換後洗浄する。 純水よる洗浄操作を、 4回行なう。
12. 膜の染色
容器に染色液を入れる。 膜の転写面を下にして染色液に浮かべる。 振とう機を 用いて 15分間染色を行なう。 （振とう機のスピードは、 50rpmで行なう。 ）
13. 膜の洗浄
15分後、 膜を取り出し容器に純水を入れる。 膜の転写面を下にして純水に浮か ベる。 振とう機を用いて 1分間洗浄を行なう。 （振とう機のスピードは、 50rpmで 行なう。 ）膜を取り出し容器の純水を交換後洗浄する。 純水による洗浄操作を、 2 回行なう。
1 . 蛍光画像装置による測定と解析
14- 1. 蛍光画像処理装置の使用法 測定条件及び測定手順を下記に示す。
測定条件：
Emiss ion Fi l ter ： Rox610BP30 PMT : 4 1 5
Laser ： Green (532皿)
Sens i t ivi ty ： Normal 測定手順：
(ァ） 本体のカバーを開け、 ガラス板に PVDF膜をのせる。 このとき、 染色面を下 向き （ガラス很 !0 にする。
(ィ） 上から無蛍光ガラス板をのせて膜をおさえる。
(ゥ） 本体カバーを閉じる。
(ェ） スキャン （Scan) 範囲を設定し、 測定を開始する。
(ォ) スキャンが終了したら、 デ一夕を保存する。
(力） 感度不足、 蛍光が飽和した場合は、 PMT vol tageの値を変えて、 再度測定 する。
14-2. 画像処理装置
市販のソフトウェアを用いて、 画像処理を行なう。 図 2に示したように、 スポ ットを丸く囲みその中の蛍光強度の積分値を求める。
(結果）
ドットブロッ卜法で得られる画像の一例を図 2に示した。 図 2に示したように 、 BSA標品においては、 添加量に従ってスポット濃度も高くなつている。 BSA添加 量 0. 1 z g/ml (0. lppm) が明らかに観測されていることから、 本発明では、 少な くとも 0. lppmのタンパク質を検出することができる。 実際のアミノ酸試料の場合 も同様にスポット濃度変化が観測されたが、 更にサンプルスポットと同心円状に ドーナツ型に蛍光が観測された。 これは、 アミノ酸を減圧除去する際に、 ゥエル の周りに浸潤したものが蛍光試薬と反応していると考えられる。 従って、 定量分 析をする際は、 スポット部分の蛍光強度の積 （ポリュ一ム） を採用することとし た。 その結果、 BSAと各アミノ酸の添加回収実験では、 傾きが異なるけれども、 共に直線性が見られた。 アミノ酸の種類によって傾きが異なる理由としては、 ① アミノ酸の存在により、 BSAの器具等への吸着量に差が見られる、 ② BS こァミノ 酸が吸着して残存している、 の 2点が考えられる。 そこで、 同じ膜で測定した BSA の線と、 ブランク （BSA無添加） の Y軸を通る線を基準として、 標準添加法による 各アミノ酸の線との交点をタンパク質濃度とした （図 3参照。 ） 。 実試料中の夕 ンパク質濃度は、 各アミノ酸の希釈倍率に従って、 下記の式を用いて算出した。 実試料中のタンパク質濃度 =標準添加法で求めた溶液中のタンパク質濃度 X希 釈倍率。
希釈倍率： Asp、 Cys、 Glu、 Phe、 Tyr、 Gin, Trp 14. 3倍；及び上記以外 8. 3 倍。
この結果、 標品とした牛血清アルブミン （BSA) で 0. lppm、 アミノ酸では試料 換算で lppmを少なくとも検出することができた。
尚、 図 3は標準添加法によるアミノ酸中のタンパク質濃度算出法を示したもの で、 矢印をアミノ酸溶液中のタンパク質濃度とした。
本法を用いて食品添加物用アミノ酸 25品目について分析を実施した。 その結果 の一部を図 4に、 また 25品目の定量結果のうちその一部を表 1に示しているが、 25品目の全てのアミノ酸について、 試料中のタンパク質は lppm以下 （l g/g以下 ) であった。
尚、 図 4にはドットブロットー蛍光染色法を用いて、 食品添加物用アミノ酸、 GluNa¾ 0 (L-グルタミン酸ナトリウム 1水和物） 及び The (L-テアニン） 中の夕 ンパク質測定結果 （標準添加法） を示す。
[表 1 ] 食品添加物用アミノ酸中のタンパク質定』
Figure imgf000015_0001
以上の結果、 この方法によりアミノ酸中のタンパク質を高感度に分析できるこ とが示された。 特に、 タンパク質固定用の膜としての PVDF膜及び蛍光染色試薬を 用いたドッ卜ブロット法が有効であることも分かった。 この方法を用いて食品添 加物アミノ酸 25品目を測定した結果では、 全ての品目について、 試料中のタンパ ク質は lppm以下であることも明らかとなった。
本実施例では、 アミノ酸濃度を一定としたが、 溶解性が高いアミノ酸の場合に おいては、 濃度を高くすることにより、 更に検出感度を向上させることができる
(実施例 2 ) 検出できるタンパク質の分子量範囲
分子量の大きなタンパク質が抗原となり易い為、 EL ISAでは高分子量のタンパ ク質が検出され易い。 一方、 低分子量のタンパク質であってもアレルゲンとなり うる為、 より低分子量タンパク質や、 ペプチドを高感度で検出することが望まし い。 本発明の手法で、 分子量の異なるタンパク質 BSA (66kDa) 、 リゾチーム （14 kDa) 、 ュビキチン （8. 6kDa) 、 インスリン （5. 7kDa) 、 及び酸化型インスリン B 鎖 （3. 5kDa) を用いて、 検出下限と定量性の評価を行った。 実施例 1の BSAに替 わり、 各タンパク質を適宜希釈し、 ドットブロットー蛍光染色法により、 検量線 を作成した。 その結果 （図 5参照。 ） 、 何れのタンパク質においても、 直線性の 高い検量線を引くことができ、 0. lppm (酸化型インスリン B鎖のみ 0. 2ppm)の検出 下限であり、 低分子量のタンパク質であっても高感度に検出することができた。 発明の効果
以上説明した通り、 本発明によりタンパク質の分析方法が提供され、 この方法 により、 飲食品、 食品添加物、 医薬品、 化粧品、 飼料等に含まれるアレルギー性 物質等の微量タンパク質の分析を簡便かつ高感度に行なうことができる。 従って 、 本発明は産業上、 特に食品、 医薬品、 化粧品、 飼料等の分野で広く実施するこ とができ、 故にその有用性は明らかである。

Claims

請求 の 範 囲
1 . 試料をドットプロット法に供した後、 タンパク質染色のための蛍光染色 法に付することを特徴とする試料中に含まれるタンパク質の分析方法。
2 . 試料中に含まれるタンパク質の定量分析法又は限度分析法である請求の 範囲 1記載の方法。
3 . 当該試料を溶液状態で当該ドットプロット法に供し、 試料中に含まれる タンパク質固定用膜上にタンパク質を固定化するための工程と、 当該蛍光染色法 による当該膜上に固定化した夕ンパク質用の染色工程とを含む請求の範囲 1又は 2記載の方法。
4. 当該試料が、 飲食品、 食品添加物、 医薬品及び飼料の何れかである請求 の範囲 1記載の方法。
5 . 少なくとも 0. lppmのタンパク質が分析可能な請求の範囲 1記載の方法。
6 . 当該膜がニトロセルロース膜又は PVDF膜である請求の範囲 3記載の方法
7 . 当該試料がアミノ酸である請求の範囲 1記載の方法。
8 . 請求の範囲 1〜 7何れか記載の方法で夕ンパク質が分析されたことを特 徴とする製品、 又はこれを含有又は使用した製品。
PCT/JP2003/009305 2002-07-25 2003-07-23 タンパク質の分析方法 WO2004011948A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE60326740T DE60326740D1 (de) 2002-07-25 2003-07-23 Proteinanalyseverfahren
AU2003252235A AU2003252235A1 (en) 2002-07-25 2003-07-23 Method of analyzing protein
EP03771282A EP1544618B1 (en) 2002-07-25 2003-07-23 Method of analyzing protein
JP2004524123A JPWO2004011948A1 (ja) 2002-07-25 2003-07-23 タンパク質の分析方法
US11/039,791 US20050147720A1 (en) 2002-07-25 2005-01-24 Method of analyzing protein

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2002217099 2002-07-25
JP2002-217099 2002-07-25

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US11/039,791 Continuation US20050147720A1 (en) 2002-07-25 2005-01-24 Method of analyzing protein

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2004011948A1 true WO2004011948A1 (ja) 2004-02-05

Family

ID=31184595

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2003/009305 WO2004011948A1 (ja) 2002-07-25 2003-07-23 タンパク質の分析方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20050147720A1 (ja)
EP (1) EP1544618B1 (ja)
JP (1) JPWO2004011948A1 (ja)
AT (1) ATE426173T1 (ja)
AU (1) AU2003252235A1 (ja)
DE (1) DE60326740D1 (ja)
WO (1) WO2004011948A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006197925A (ja) * 2004-12-24 2006-08-03 Research Institute Of Biomolecule Metrology Co Ltd 抗変性蛋白質抗体精製キット、抗変性蛋白質抗体の精製方法、蛋白質の検出方法、及び生体分子の検出方法
JP2020526747A (ja) * 2017-06-29 2020-08-31 クワンティシジョン ディアグノスティックス インク 固形腫瘍の診断用のバイオマーカーの絶対定量の方法および装置
US11781991B2 (en) 2017-11-10 2023-10-10 Meiji Co., Ltd. Method for detecting protein

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5024044B2 (ja) * 2005-07-27 2012-09-12 味の素株式会社 試料溶液中のアルブミンの分析方法
US20100210033A1 (en) * 2007-10-07 2010-08-19 Jordan Scott Portable device for detecting food allergens

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08338842A (ja) * 1995-06-12 1996-12-24 Tokuyama Corp 梅毒抗原の製造方法
JPH11503524A (ja) * 1995-04-13 1999-03-26 ドイチェス クレブスフォルシュンクスツェントルム スチフトゥング デス エッフェントリヒェン レヒツ Ｈｉｖ−ｔａｔの検出方法
WO2000025139A1 (en) * 1998-10-27 2000-05-04 Molecular Probes, Inc. Luminescent protein stains containing transition metal complexes

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5705649A (en) * 1992-07-20 1998-01-06 Promega Corporation Protein staining compositions and methods
US5616502A (en) * 1995-05-19 1997-04-01 Molecular Probes, Inc. Non-specific protein staining using merocyanine dyes
WO1998003875A1 (en) * 1996-07-24 1998-01-29 Helena Laboratories Corporation Reagents and methods for fluorescent analysis of serum proteins
JP3069298B2 (ja) * 1996-11-07 2000-07-24 株式会社分子バイオホトニクス研究所 ポリアミン分析方法
US6329205B1 (en) * 1999-08-31 2001-12-11 Molecular Probes, Inc. Detection method using luminescent europium-based protein stains

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11503524A (ja) * 1995-04-13 1999-03-26 ドイチェス クレブスフォルシュンクスツェントルム スチフトゥング デス エッフェントリヒェン レヒツ Ｈｉｖ−ｔａｔの検出方法
JPH08338842A (ja) * 1995-06-12 1996-12-24 Tokuyama Corp 梅毒抗原の製造方法
WO2000025139A1 (en) * 1998-10-27 2000-05-04 Molecular Probes, Inc. Luminescent protein stains containing transition metal complexes

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006197925A (ja) * 2004-12-24 2006-08-03 Research Institute Of Biomolecule Metrology Co Ltd 抗変性蛋白質抗体精製キット、抗変性蛋白質抗体の精製方法、蛋白質の検出方法、及び生体分子の検出方法
JP2020526747A (ja) * 2017-06-29 2020-08-31 クワンティシジョン ディアグノスティックス インク 固形腫瘍の診断用のバイオマーカーの絶対定量の方法および装置
JP7194128B2 (ja) 2017-06-29 2022-12-21 イェンタイ クワンティシジョン ディアグノスティックス インク 固形腫瘍の診断用のバイオマーカーの絶対定量の方法および装置
US11781991B2 (en) 2017-11-10 2023-10-10 Meiji Co., Ltd. Method for detecting protein

Also Published As

Publication number Publication date
DE60326740D1 (de) 2009-04-30
US20050147720A1 (en) 2005-07-07
AU2003252235A1 (en) 2004-02-16
EP1544618B1 (en) 2009-03-18
ATE426173T1 (de) 2009-04-15
EP1544618A4 (en) 2006-07-12
JPWO2004011948A1 (ja) 2005-11-24
EP1544618A1 (en) 2005-06-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Gomara et al. Assessment of synthetic peptides for hepatitis A diagnosis using biosensor technology
JP5202761B2 (ja) 抗体を自己組織化膜上に固定する方法
JP7352831B2 (ja) イムノクロマト試験片および測定キットおよび測定方法
JP2006308321A (ja) 表面プラズモン共鳴センサ用チップ
CN102854314A (zh) 一种胶乳免疫比浊法进行幽门螺杆菌抗体检测的试剂盒
US20030119065A1 (en) Peptide and amine examination method using the same
US20050147720A1 (en) Method of analyzing protein
CN101046479B (zh) 不含目标蛋白质人血清基体物质的制备方法
WO2018181741A1 (ja) イムノクロマト試験片およびキットおよび測定方法
CN109870428A (zh) 一种基于表面等离子共振技术的抗体定量检测方法
KR20100127948A (ko) Ｓａｒｓ 코로나바이러스의 검출 및 억제용 펩타이드 화합물 및 그의 응용
JP6017724B1 (ja) 十二指腸液試料の膵液由来成分検出用試料としての適性評価方法
CN111647642B (zh) 一种基于检测试纸显示的核酸检测方法及核酸检测试剂盒
JP2009031061A (ja) 標的物質の検出方法およびラテックス凝集反応用試薬
JP3960614B2 (ja) 抗ペプチド抗体測定法とペプチドワクチンのワクチン候補選択方法
CN116990505B (zh) 一种白介素-6aie荧光免疫层析试纸条、试剂盒及其应用
TWI322818B (en) Peptide and method for dectecing amine using the same
CN113984863B (zh) 一种基于核酸适配体生物传感器的糖化血红蛋白检测方法
US20240060976A1 (en) Allergen-immobilized carrier and method of detecting allergen-specific antibody
TWI322816B (en) Peptide compounnds, and method of measuring sulfur compound and ammonia therewith
TWI631340B (zh) 檢測神經胺酸酶活性的方法
WO2024057183A1 (en) Micellar mycolate coated carbon electrodes for electrochemical impedance immunoassay
TWI322819B (en) Peptide and method for dectecing amine using the same
TWI322817B (en) Peptide compounnds, and method of measuring sulfur compound and ammonia therewith
JP5685777B2 (ja) バーチャルウエスタンブロッティングシステム

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004524123

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11039791

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003771282

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2003771282

Country of ref document: EP