CN116990505B - 一种白介素-6aie荧光免疫层析试纸条、试剂盒及其应用 - Google Patents

一种白介素-6aie荧光免疫层析试纸条、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种白介素‑6AIE荧光免疫层析试纸条、试剂盒及其应用，本发明属于免疫检测领域，所述试纸条包括衬底和沿层析方向依次固定于所述衬底上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，结合垫上包被有AIE荧光微球标记的IL‑6单克隆抗体1和AIE荧光微球标记的羊抗鸡IgY；所述硝酸纤维素膜上按样品流动方向从前到后依次具有包被有IL‑6单克隆抗体2的检测线和包被有鸡IgY抗体的质控线；所述IL‑6单克隆抗体1和IL‑6单克隆抗体2为针对IL‑6抗原不同表位的两种抗体。本发明试纸条或试剂盒能够实现对IL‑6标志物进行快速、准确的检测，使得检测具有高灵敏度和宽的线性范围。

Description

一种白介素-6AIE荧光免疫层析试纸条、试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于免疫检测领域，涉及一种白介素-6AIE荧光免疫层析试纸条、试剂盒及其应用。
背景技术
白介素-6（Interleukin-6，IL-6）是一种多功能细胞因子，是由纤维母细胞、单核或巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、上皮细胞、角质细胞以及多种瘤细胞所产生。IL-6具有调节免疫应答、急性期反应及造血功能，并在机体的抗感染免疫反应中起重要作用。
目前临床应用和研究最广泛的感染标志物是降钙素原（PCT）、C反应蛋白（CRP）。而白介素-6（IL-6）在自身的多种临床用途中，其作为感染标志物的意义正在逐渐为业内所研究和重视，并越来越多地应用于临床，其具有如下特点：（1）当感染和炎症发生后，IL-6率先生成且水平迅速升高，可在2h达高峰，其升高水平与感染的严重程度相一致，并诱导PCT和CRP分别在感染2h和6h后开始升高。（2）IL-6是急性感染早期诊断的灵敏指标，尤其可作为对新生儿早期脓毒症的鉴别诊断指标，并对制定患儿治疗方案和改善预后具有重要的参考意义。（3）IL-6升高与疾病的严重程度呈正相关，增高幅度反应病情的严重程度。在危重患者中可持续长时间高水平的表达，可作为评估脓毒症和多器官功能障碍综合征患者严重程度和预后的敏感指标，并能更快反映抗生素治疗的效果。（4）IL-6鉴别感染与非感染的敏感性高于PCT和CRP，还可用来评价感染严重程度和评估预后，当IL-6>1000μg/L时预警重症感染患者预后不良，提示临床医师及时调整诊疗方案。因此近年来IL-6作为一种炎症标志物在临床应用上越来越广泛。
目前在国内，白介素-6的检测在临床应用上主要以化学发光试剂和荧光免疫层析试剂为主，化学发光试剂价格昂贵，对于患者来说经济负担较大，不利于基层推广；而传统的荧光免疫层析方法检测灵敏度较低，线性范围较窄。由于白介素-6在健康人群中的含量极低＜7pg/mL，现有的荧光免疫层析试剂盒无法满足该项目灵敏度的要求；同时脓毒血症患者体内的白介素-6会出现＞5000pg/mL的现象，所以试剂盒需具备宽线性范围。因此当前亟需设计一种新型的白介素-6的检测方法及试剂盒来满足高灵敏度、宽线性范围的需求。
CN111856041A公开了一种PCT/IL-6荧光定量快速检测试纸条及其制备方法和应用，该发明中所述检测试纸条由背衬卡以及粘贴在背衬卡上的滤血膜样品垫、荧光微球结合垫、硝酸纤维素膜检测垫和吸水垫组成，所述硝酸纤维素膜检测垫上沿长度方向依次平行间隔设置有第一检测线、第二检测线和质控线，所述第一检测线和第二检测线上分别包被有IL-6特异性纳米抗体和PCT特异性纳米抗体，质控线上包被有羊抗兔IgG。该试纸条可同时检测IL-6、PCT两个标靶，有效避免单一指标对感染类别判断的误差，且具有检测范围宽、灵敏度高、准确度高、检测快速简便等特点，能及时帮助临床医师尽快确定患者的治疗方案，进而提高患者治疗成功率，具有重要的临床应用价值。该发明未对试剂的IL-6的灵敏度做出说明，仅说明了检测0~1000pg/mL的临床样本40例，相关系数R2＝0.9912(R2≥0.95)，回归方程为y＝0.9863x+1.8596。该发明制备的检测试剂与对比试剂相关性较好。
CN109975557A公开了IL-6/PCT联合检测时间分辨检测试剂盒及方法，该发明涉及一种利用时间分辨荧光免疫层析技术的灵敏性，利用稀土钒酸盐纳米荧光标记材料，结合干式免疫荧光分析仪实现高灵敏度、可准确定量、简便快捷的IL-6/PCT联合检测时间分辨荧光免疫层析定量检测试剂盒及检测方法。该发明检测试剂盒能够准确定量检测人血清、血浆和全血样本中白介素6和降钙素原的含量，通过滤血膜样品垫的处理可实现样本无需预处理和稀释液稀释，利用时间分辨荧光微球检测技术，可避免样本本身荧光干扰，稀土钒酸盐纳米材料具有背景低，荧光信号强，信噪比高等优势，标记通过共价键将稀土钒酸盐纳米颗粒与抗体连接，标记产物稳定，具有检测范围宽、灵敏度高、准确度高、检测快速简便等特点。该发明的有益效果主要体现在：本发明检测卡及试剂盒能够准确定量检测人血清、血浆和全血样本中IL-6和PCT的含量，样本无需进行预处理和稀释液稀释，利用时间分辨荧光微球检测技术，可避免样本本身荧光干扰，标记通过共价键将微球与抗体连接，标记产物稳定，具有检测范围宽(PCT为0.05～100ng/mL，IL-6为1.5～1000pg/mL)、灵敏度高(PCT检出限0.05ng/mL，IL-6检出限为1.5pg/mL)、准确度高、检测快速简便等特点。但是该发明的IL-6检测范围较窄，检测上限1000pg/mL，容易产生假阴性结果，影响疾病的诊断。
CN110596404A公开了一种IL-6生物素-链霉亲和素免疫层析检测卡，包括PVC底板、样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸，所述样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸从前到后依次设置在PVC底板上，所述包被膜上设有检测T线和质控C线，所述结合垫上设有偶联示踪标记物的抗IL-6单克隆抗体以及偶联生物素的抗IL-6单克隆抗体；所述检测T线包被链霉亲和素，所述质控C线包被多克隆抗体。该发明依据双抗体夹心法原理，利用免疫层析技术定量检测人血清、血浆、全血样本中IL-6的含量，可以准确获知样本中IL-6的浓度，提高检测灵敏度，尤其是大大提高低端值的检测敏感度。该发明提供的技术与传统荧光免疫层析法比较，提高了灵敏度和检出率，检测范围为2～4000pg/ml，且本底更低，性能得以明显提升。但该发明采用的示踪物为胶体金、荧光素、荧光微球以及量子点中的一种，所选用的荧光材料容易荧光淬灭，光稳定性较差，试剂稳定性较差。
CN109374903A公开了一种超灵敏IL-6荧光免疫层析测定试剂盒和测定方法，试剂盒由荧光微球标记的IL-6单克隆抗体溶液和免疫层析试纸条组成，IL-6单克隆抗体溶液包含特定浓度的荧光微球，抗体与荧光微球通过生物素-亲和素偶联。该发明提供的测定方法，测定线性范围1.72~1000pg/mL，线性相关系数为0.997；灵敏度为1.72pg/mL；精密度平均CV<10%；准确度平均回收率为97.5%。但该发明采用的荧光微球分别是亲和素-时间分辨荧光微球、亲和素-量子点微球中的至少一种，所选用的荧光材料容易荧光淬灭，光稳定性较差，试剂稳定性较差。再者该发明的IL-6检测范围较窄，检测上限1000pg/mL，容易产生假阴性结果，影响疾病的诊断。
因此，在本领域，期望提供一种材料光稳定性好、具有高灵敏度、宽检测范围的IL-6荧光免疫层析试剂盒。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种白介素-6AIE荧光免疫层析试纸条、试剂盒及其应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种白介素-6AIE荧光免疫层析试纸条，所述试纸条包括衬底和沿层析方向依次固定于所述衬底上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述结合垫上包被有荧光标记物Ⅰ和荧光标记物Ⅱ，所述荧光标记物Ⅰ为AIE荧光微球标记的IL-6单克隆抗体1，所述荧光标记物Ⅱ为AIE荧光微球标记的羊抗鸡IgY；所述硝酸纤维素膜上按样品流动方向从前到后依次设置包被有IL-6单克隆抗体2的检测线和包被有鸡IgY抗体的质控线；所述IL-6单克隆抗体1和IL-6单克隆抗体2为针对IL-6抗原不同表位的两种抗体。
在本发明中，所述白介素-6AIE荧光免疫层析试纸条中使用AIE荧光微球标记的IL-6单克隆抗体的荧光标记物和AIE荧光微球标记的羊抗鸡IgY的荧光标记物，能够实现对IL-6标志物进行快速、准确的检测，使得检测具有高灵敏度和宽的线性范围。
优选地，所述AIE荧光微球为基态下稳定，在365～450nm的激发光源作用下发射出波长范围在510～620nm的荧光的AIE荧光微球。
优选地，所述AIE荧光微球的粒径为100nm～300nm，例如100nm、130nm、150nm、180nm、200nm、230nm、250nm、280nm或300nm。
优选地，所述AIE荧光微球中AIE分子选自下列AIE-1~AIE-5分子中的至少一种：
。
优选地，所述AIE荧光微球为聚合物包裹AIE分子得到的微球。
优选地，所述聚合物是由羧基功能单体和疏水单体聚合得到的聚合物，所述羧基功能单体为丙烯酸、甲基丙烯酸、马来酸酐、甲基丙烯酸二甲氨基丙酯、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、甲基丙烯酸二乙氨基丙酯或丙烯酸二甲氨基丙酯中的任意一种或至少两种的组合；所述疏水单体为苯乙烯、丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯中的至少一种。
优选地，所述聚合物为羧基化聚苯乙烯。
优选地，所述AIE荧光微球中相对于100mg聚合物，AIE分子的装载量为5~15mg，例如5mg、6mg、7mg、8mg、10mg、12mg、14mg或15mg。
在一个实施方案中，本发明所述AIE荧光微球的制备方法包括以下步骤：
S1.将乳化剂Ⅰ溶于水中制得乳化剂水溶液作为反应介质；加入疏水单体，通惰性气体排除体系氧气，升高体系温度至75℃~85℃（例如75℃、78℃、80℃、83℃或85℃），加入引发剂，在搅拌下聚合反应3h~5h（例如3h、3.5h、4h、4.5h或5h）后，加入羧基功能单体，在惰性气体氛围下继续反应8h~10h（例如8h、8.5h、9h、9.5h或10h），反应结束后洗涤去除未反应的单体，制得羧基化聚合物微球；
S2.将羧基化聚合物微球、乳化剂Ⅱ加入水中分散得到羧基化聚合物微球乳液；将AIE分子溶于溶胀剂，在搅拌条件下逐滴加入到羧基化聚合物微球乳液中，密封反应容器，在温度30~50℃（例如30℃、35℃、40℃、45℃或50℃）搅拌1~3h（例如1h、1.5h、2h、2.5h或3h），反应结束后通过减压蒸馏除去溶胀剂，洗涤去除多余的AIE分子，然后超声分散在蒸馏水中保存，制得AIE荧光微球乳液。优选地，所述AIE荧光微球乳液的固含量为1%~4%（例如1%、2%、3%或4%）。
进一步的，在步骤S1中：
所述乳化剂Ⅰ优选为十二烷基磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠或Tween20；所述反应介质优选为质量浓度0.1%~0.25%（例如0.1%、0.15%、0.2%、0.22%或0.25%）的乳化剂水溶液。
所述疏水单体优选为苯乙烯、丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯中的至少一种，更优选为苯乙烯；所述疏水单体加入反应介质中浓度为2wt%~6wt%（例如2wt%、3wt%、4wt%、5wt%或6wt%）。
所述羧基功能单体优选为丙烯酸、甲基丙烯酸、马来酸酐、甲基丙烯酸二甲氨基丙酯、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、甲基丙烯酸二乙氨基丙酯或丙烯酸二甲氨基丙酯中的至少一种，更优选为甲基丙烯酸；所述羧基功能单体的质量优选为疏水单体质量的6%~20%（例如6%、8%、10%、15%、18%或20%）。
所述引发剂优选为过硫酸钾、过硫酸铵或过硫酸钠；所述引发剂的用量优选为疏水单体质量的1%~3%（例如1%、1.5%、2%、2.5%或3%）。
所述惰性气体优选为氮气。
进一步的，在步骤S2中：
所述乳化剂Ⅱ优选为十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、聚乙烯醇或Tween20中的至少一种，更优选为Tween20；乳化剂Ⅱ加入水中的浓度为0.1wt%~10wt%（例如0.1wt%、0.5wt%、1wt%、3wt%、5wt%、8wt%或10wt%）。
所述溶胀剂优选为二氯甲烷（CH2Cl2）、四氢呋喃（THF）或乙腈（CH3CN）中的至少一种，更优选四氢呋喃（THF）；相对于10mg的AIE分子，所述溶胀剂的用量为1~5mL（例如1mL、2mL、3mL、4mL或5mL）。
优选的，相对于100mg羧基化聚合物微球，AIE分子用量可以为5~15mg，例如5mg、7mg、9mg、10mg、12mg、14mg或15mg，优选12.5mg。
优选地，所述结合垫上包被的AIE荧光微球标记的IL-6单克隆抗体1的量为0.00002~0.0004mg/cm2（例如0.00002mg/cm2、0.00005mg/cm2、0.0001mg/cm2、0.0002mg/cm2、0.0003mg/cm2或0.0004mg/cm2、），包被的AIE荧光微球标记的羊抗鸡IgY的量为0.000002~0.000032mg/cm2（例如0.000002mg/cm2、0.000005mg/cm2、0.000008mg/cm2、0.00001mg/cm2、0.00002mg/cm2、0.00003mg/cm2、或0.000032mg/cm2）。
在本发明中，所述检测线和质控线相互平行，间隔距离为3～7mm，例如3mm、4mm、5mm、6mm或7mm。
优选地，所述检测线上包被的IL-6单克隆抗体2的量为0.5～2.25μg/cm，例如0.5μg/cm、0.8μg/cm、1.0μg/cm、1.2μg/cm、1.5μg/cm、1.8μg/cm、2.0μg/cm或2.25μg/cm。
优选地，所述质控线上包被的鸡IgY抗体的量为0.25～1.5μg/cm，例如0.25μg/cm、0.4μg/cm、0.5μg/cm、0.8μg/cm、1.0μg/cm、1.2μg/cm、1.4μg/cm或1.5μg/cm。
优选地，所述硝酸纤维素膜的孔径为3μm~12μm（例如3μm、5μm、7μm、9μm、10μm或12μm），长度为2cm~3cm（例如2cm、2.5cm、2.8cm或3cm），宽度为3.0mm~4.0mm（例如3.0mm、3.2mm、3.5mm、3.8mm或4.0mm）。
优选地，所述样品垫上喷涂有包含抗红细胞抗体（RBC抗体）和异嗜性抗体的样品垫处理液。
优选地，所述样品垫处理液的组分包括缓冲液、0.1~0.3mg/mL（例如0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL、0.25mg/mL或0.3mg/mL）抗红细胞抗体、0.1~0.5mg/mL（例如0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL或0.5mg/mL）异嗜性抗体阻断剂、0.2wt%~0.5wt%（例如0.2wt%、0.3wt%、0.4wt%或0.5wt%）表面活性剂、0.5wt%~2wt%（例如0.5wt%、0.8wt%、1wt%、1.5wt%或2wt%）惰性蛋白和0.5wt%~1.5wt%（例如0.5wt%、0.8wt%、1wt%、1.2wt%、1.4wt%或1.5wt%）糖类物质。
所述缓冲液优选为磷酸盐缓冲液（PBS）、Tris-HCl、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液或碳酸盐缓冲液中的任意一种，更优选为磷酸盐缓冲液。
所述表面活性剂优选为吐温20（Tween20）、吐温80（Tween80）或Tetronic1307中的任意一种，更优选为Tween20。
所述惰性蛋白优选为牛血清白蛋白（BSA）、酪蛋白或鸡卵白蛋白中的任意一种，更优选为牛血清白蛋白。
所述糖类物质包括蔗糖、海藻糖或葡聚糖中的任意一种或至少两种的组合，更优选为蔗糖。
在本发明中，所述结合垫的材质为玻璃纤维素膜。
在本发明中，所述衬底选自聚氯乙烯（PVC）板、聚氨酯（PU）板、聚乙烯（PE）板或聚酰亚胺（PI）板。
另一方面，本发明提供一种白介素-6AIE荧光免疫层析试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的白介素-6AIE荧光免疫层析试纸条。
优选地，所述试剂盒还包括设置在试纸条外侧的卡壳，所述卡壳包括相互卡接的上卡壳和下卡壳，所述下卡壳设有放置试纸条的卡槽，所述上卡壳对应于试纸条的样品垫处设有加样口、对应于试纸条的硝酸纤维素膜处设有观察窗，硝酸纤维素膜上的检测线和质控线均暴露于观察窗处。
优选地，所述试剂盒还包括含有定标曲线的ID卡。
在本发明中，所述白介素-6AIE荧光免疫层析试纸条以及试剂盒可以通过如下方法制备：
（1）样品垫的制备
用样品垫处理液处理玻璃纤维膜，用量为0.03~0.05mL样品垫处理液/cm2玻璃纤维膜，平铺玻璃纤维素膜，然后用滚轮涂抹液体至均匀，反面再涂抹均匀。处理后的样品垫置于烘箱中，37~50℃下烘24~72h。
（2）结合垫的制备
先将AIE荧光微球经过交联剂活化后，分别标记IL-6单克隆抗体1和羊抗鸡IgY，得到AIE荧光微球标记的IL-6单克隆抗体1和AIE荧光微球标记的羊抗鸡IgY，用微球稀释液将AIE荧光微球标记的IL-6抗体稀释10～20倍、将AIE荧光微球标记的羊抗鸡IgY稀释125~200倍后，均匀喷涂在结合垫上，37~50℃烘干24~72h，制得包被有AIE荧光微球标记的IL-6单克隆抗体1和AIE荧光微球标记的羊抗鸡IgY的结合垫。
优选的，所述交联剂选自N-（3-二甲基氨基丙基）-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐（Sulfo-NHS）。
优选地，所述微球稀释液为含0.5%BSA、20%海藻糖的20mMTris-HCl缓冲液。
作为一种优选的实施方式，AIE荧光微球的活化包括以下步骤：
a.取0.1mLAIE荧光微球乳液（固含量为1%）加入到0.1mL0.05M的pH6.0的2-(N-吗啉基)乙磺酸（MES）溶液中，旋涡震荡混匀，用20000×g在4℃离心15min，去上清，用0.225mL0.05M的pH6.0的2-(N-吗啉基)乙磺酸（MES）溶液复溶，超声分散（2%功率，超声2秒，间隔3秒，超声5次）；
b.取交联剂N-（3-二甲基氨基丙基）-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）与N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐（Sulfo-NHS），分别溶解于0.05MpH6.0MES中至终浓度各为100mg/mL，先添加0.05mLSulfo-NHS溶液，充分混匀后，迅速添加0.025mLEDC溶液，涡旋混匀后置于圆盘旋转混匀仪中混匀30min。用20000×g在4℃离心20min，去上清，用0.3mL0.05M的pH6.0MES复溶，超声分散。再次用20000×g在4℃离心20min，去上清，用0.3mL0.05M的pH6.0MES复溶，重复超声分散。
作为一种优选的实施方式，AIE荧光微球标记的IL-6单克隆抗体IL-6-1和AIE荧光微球标记的羊抗鸡IgY的制备包括以下步骤：
在活化的AIE荧光微球中分别加入0.01~0.05mg的IL-6-1和羊抗鸡IgY，涡旋混匀，置圆盘旋转混匀仪上反应2h，用20000×g在4℃离心20min，去上清，用0.3mL含1%BSA、1%甘氨酸的0.01M的pH7.0PB缓冲液（磷酸盐缓冲液）超声复溶，圆盘旋转混匀1h。用20000×g在4℃离心15min，去上清，用0.1mL含2.5%海藻糖、0.5%酪蛋白钠盐、0.1%Tween20的0.05M的pH8.0Tris-Hcl的保存液超声复溶，2~8℃保存。
（3）包被膜的制备
分别用包被缓冲液（含5.0%蔗糖的20mMPBS缓冲液）将IL-6单克隆抗体和鸡IgY抗体调整浓度到0.5～1.0mg/mL，用量为0.5～1.5μL包被液量/cm膜，分别作为检测线和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，质控线与检测线间隔3～7mm，置于烘箱中，37~50℃烘干24~72h。
（4）试纸条的组装
在底衬上顺次相互搭接地粘贴包被膜、结合垫、样品垫和吸水纸得到试纸大板，用可编码切条机切割得到所述试纸条。所述测试卡由检测试纸条固定在塑料底卡上，试纸表面用卡面压紧，且卡面在对应样品垫和硝酸纤维素膜的部分分别预留加样孔和观察窗。
（5）ID卡的制备
通过AIE荧光测试卡测定不同浓度的企业参考品，以企业参考品浓度为横坐标，以荧光信号的T/C值作为纵坐标，绘制成标准曲线，写入并生成相应信息存储在ID卡中获得。通过干式荧光免疫分析仪可读取测试卡上对应的ID卡信息并测得相应浓度。
另一方面，本发明还提供了如上所述白介素-6AIE荧光免疫层析试纸条在定量检测IL-6中的应用。
另一方面，本发明还提供了如上所述白介素-6AIE荧光免疫层析试剂盒在定量检测IL-6中的应用。
优选地，利用白介素-6AIE荧光免疫层析试剂盒进行定量检测IL-6的方法包括以下步骤：
（1）将检测试剂盒和样品置于室温下，待恢复至室温后使用；
（2）打开仪器（仪器为：苏州和迈精密仪器有限公司的干式荧光免疫分析仪，型号：FIC-Q100N），插入与试剂批号相同的ID卡，在仪器上正确选择相应的“样本类型”和“测试项目”；
（3）打开试剂盒包装，取出试剂盒，水平放置，测试前试剂、样本应平衡至室温；
（4）用玻璃毛细管或移液枪吸取85µL的血清、血浆或100μL全血样本，加入到试剂盒的加样孔中；
（5）将试剂盒放入到仪器的卡槽中，依据选定的测定模式测定，选择“标准检测”，仪器将自动在10min时测试，并显示结果；或室温反应10min后，选择“快速检测”，仪器开始测试，并显示结果；
（6）点击“打印”，可打印检测结果报告。
本发明的试剂盒检测范围为0.5～5000pg/mL。
本发明试剂盒的检测原理是双抗体夹心法，定量测定人血清、血浆和全血样本中IL-6的含量。样本中的待测物与结合垫上的AIE荧光微球标记的IL-6单克隆抗体1结合形成反应复合物，通过毛细效应，反应复合物沿着硝酸纤维素膜向前移动，被硝酸纤维素膜检测线上包被的IL-6单克隆抗体2所捕获。样本中的待测物越多，检测线上积聚的复合物越多，荧光信号越强，荧光抗体的信号强度反映了待测物浓度。通过配套的荧光免疫分析仪，可检测出样本中白介素-6（IL-6）的浓度。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
测试卡及试剂盒能够准确定量检测人血清、血浆和全血样本中IL-6的含量，样本无需进行预处理和稀释液稀释，利用AIE荧光微球，通过共价键将微球与抗体连接，标记产物稳定，具有检测范围宽（0.5～5000pg/mL）、灵敏度高（检出限为0.5pg/mL）、准确度高、检测快速（10min出结果）简便等特点。
附图说明
图1为实施例1制备的聚合物微球的扫描电子显微镜图，标尺为300nm。
图2为本发明试剂盒中的浓度-T/C值的标准曲线。
图3为AIE荧光微球的最大荧光强度随AIE分子装载量的变化曲线。
图4为本发明试剂盒与罗氏化学发光法临床检测的相关关系图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1：IL-6AIE荧光免疫层析试剂盒1的制备
在该实施例中，IL-6AIE荧光免疫层析试剂盒的制备包括以下步骤：
1.AIE荧光微球制备：
S1.将50mL超纯水中加入0.125g十二烷基磺酸钠（SDS）倒入烧瓶中作为反应介质，用移液枪移取3mL苯乙烯（Styrene）加入到烧瓶中，用氮气吹扫10min。然后将烧瓶浸入油浴锅中，待温度达到85℃时，加入0.04g过硫酸钾作为引发剂，转速为450r/min。聚合反应2h后，向反应器中加入0.2mLα-甲基丙烯酸（MAA），且该聚合反应在氮气氛围下继续反应8h。反应结束后，将制备的羧基化聚苯乙烯微球乳液分别用50mL水和50mL无水乙醇各洗三次，离心去除未反应的苯乙烯和MAA，将洗涤后的羧基化聚苯乙烯微球保存在冰箱中已备后续实验使用。聚合物微球的表面形貌可以用扫描电子显微镜（SEM）进行观察，其结果如图1所示，微球具有规则球形，光滑的表面，良好的单分散性和均匀的粒径。
S2.将制备好的羧基化聚苯乙烯微球(100mg)、Tween20（0.1mL）分散在10mL水中，将溶有AIE-1分子（12.5mg）的四氢呋喃溶液（1mL）在不断搅拌条件下逐滴加入微球乳液中，将混合溶液密封在烧瓶中，在40℃搅拌3h使微球溶胀，搅拌转速450r/min，AIE分子进入微球中，然后通过减压蒸馏除去四氢呋喃。制备的AIE荧光微球首先用乙醇清洗到离心后上层清液中不再有荧光，以除去残留的AIE分子，然后继续用30mL去离子水洗涤，最终超声分散在蒸馏水中并保存，制得AIE荧光微球乳液（固含量为1%，AIE荧光微球的粒径为300nm）。
2.样品垫的制备
用样品垫处理液（含0.3mg/mL抗红细胞抗体、0.5mg/mL异嗜性抗体阻断剂、0.5%Twee20、1.0%BSA、1.5%蔗糖的10mM、pH7.4的PBS）处理玻璃纤维膜，用量为0.04mL样品垫处理液/cm2样品垫，在不锈钢托盘内平铺玻璃纤维素膜，然后用滚轮涂抹液体至均匀，反面再涂抹均匀。处理后的样品垫置于烘箱中，50℃烘干24h。
3.结合垫的制备
（S1）AIE荧光微球的活化
a.取0.1mLAIE荧光微球乳液（固含量为1%）加入到0.1mL0.05MpH6.0MES中，旋涡震荡混匀，用20000×g在4℃离心15min，去上清，用0.225mL0.05M的pH6.0MES复溶，超声分散（2%功率，超声2秒，间隔3秒，超声5次）。
b.取交联剂N-（3-二甲基氨基丙基）-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）与N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐（Sulfo-NHS），分别溶解于0.05M的pH6.0MES中至终浓度各为100mg/mL，先添加0.05mLSulfo-NHS，充分混匀后，迅速添加0.025mLEDC，涡旋混匀后置于圆盘旋转混匀仪中混匀30min。用20000×g在4℃离心20min，去上清，用0.3mL0.05M的pH6.0MES复溶，超声分散。再次用20000×g在4℃离心20min，去上清，用0.3mL0.05M的pH6.0MES复溶，重复超声分散。
（S2）活化的AIE荧光微球分别标记IL-6单克隆抗体IL-6-1和羊抗鸡IgY
在活化的AIE荧光微球中分别加入0.03mg的IL-6-1（购自厦门同仁心生物技术有限公司，货号GR214）和羊抗鸡IgY，涡旋混匀，置圆盘旋转混匀仪上反应2h，用20000×g在4℃离心20min，去上清，用0.3mL含1%BSA、1%甘氨酸的0.01M的pH7.0PB缓冲液超声复溶，圆盘旋转混匀1h。用20000×g在4℃离心15min，去上清，用0.1mL含2.5%海藻糖、0.5%酪蛋白钠盐、0.1%Tween20的0.05M的pH8.0Tris-Hcl的保存液超声复溶，2~8℃保存。
（S3）在结合垫上将AIE荧光微球标记的IL-6单克隆抗体IL-6-1和羊抗鸡IgY用微球稀释液（含0.5%BSA、20%海藻糖的20mMTris-Hcl缓冲液）分别稀释10倍和200倍后，均匀喷涂在结合垫上，置于烘箱中，37℃烘干24h，制得结合垫上包被的AIE荧光微球标记的IL-6-1的量为0.00018mg/cm2，包被的AIE荧光微球标记的羊抗鸡IgY的量为0.000009mg/cm2。
4.包被膜的制备
分别用包被缓冲液（含5.0%蔗糖的20mMPBS缓冲液）将IL-6单克隆抗体IL-6-2（购自厦门同仁心生物技术有限公司，货号GR215）和鸡IgY抗体调整浓度到1.0mg/mL，分别作为检测线和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，质控线与检测线间隔5mm，置于烘箱中，37℃烘干48h，制得硝酸纤维素膜检测线上包被的IL-6-2的量为1.0μg/cm、质控线上包被的鸡IgY抗体的量为1.0μg/cm。
5.试纸条的组装
在底衬上顺次相互搭接地粘贴包被膜、结合垫、样品垫和吸水纸得到试纸大板，用可编码切条机切割为4mm宽的试纸条。将试纸条固定在塑料底卡上，试纸表面用卡面压紧。
6.ID卡的制备
通过IL-6测试卡测定不同浓度的企业参考品（0、0.5、3、10、100、500、1000、2500、5000，单位pg/mL），每个浓度进行三次重复测试，以企业参考品浓度为横坐标，以荧光信号的T/C值（T线即为检测线，C线为质控线，T/C即为检测线与质控线的比值）作为纵坐标，绘制成标准曲线，写入并生成相应信息存储在ID卡中。测试结果如表1所示，绘制的标准曲线如图2所示。
表1
实施例2：IL-6AIE荧光免疫层析试剂盒2的制备
在该实施例中，IL-6AIE荧光免疫层析试剂盒的制备包括以下步骤：
1.AIE荧光微球制备：与实施例1的区别仅在于将AIE-1分子替换为AIE-2分子。
试剂盒其他组分的制备步骤同实施例1。
实施例3：IL-6AIE荧光免疫层析试剂盒3的制备
在该实施例中，IL-6AIE荧光免疫层析试剂盒的制备包括以下步骤：
1.AIE荧光微球制备：与实施例1的区别仅在于将AIE-1分子替换为AIE-3分子。
试剂盒其他组分的制备步骤同实施例1。
实施例4：IL-6AIE荧光免疫层析试剂盒4的制备
在该实施例中，IL-6AIE荧光免疫层析试剂盒的制备包括以下步骤：
1.AIE荧光微球制备：与实施例1的区别仅在于将AIE-1分子替换为AIE-4分子。
试剂盒其他组分的制备步骤同实施例1。
实施例5：IL-6AIE荧光免疫层析试剂盒5的制备
在该实施例中，IL-6AIE荧光免疫层析试剂盒的制备包括以下步骤：
1.AIE荧光微球制备：与实施例1的区别仅在于将AIE-1分子替换为AIE-5分子。
试剂盒其他组分的制备步骤同实施例1。
实施例6：AIE荧光微球的制备的关键影响因素
在该实施例中，AIE荧光微球的制备包括以下步骤：
步骤S1制备过程同实施例1。
将制备好的羧基化聚苯乙烯微球（100mg）、Tween20（0.1mL）分散在10mL水中，将分别溶有不同浓度的AIE-1、AIE-2、AIE-3、AIE-4、AIE-5分子的四氢呋喃溶液（1mL）在不断搅拌条件下逐滴加入微球乳液中，AIE分子用量分别设定为5mg、7.5mg、10mg、15mg、20mg分别进行实验。探究AIE分子的用量对微球荧光强度的影响。
将混合溶液密封在烧瓶中，在40℃搅拌3h使微球溶胀，搅拌转速450r/min，AIE分子进入微球中，然后通过减压蒸馏除去四氢呋喃。制备的AIE荧光微球首先用乙醇清洗到离心后上层清液中不再有荧光，以除去残留的AIE分子，然后继续用30mL去离子水洗涤，最终超声分散在蒸馏水中并保存。
观察制备微球的荧光强度，结果如图3所示，AIE荧光微球随AIE分子装载量的增加，其最大发射荧光强度增加至较高水平后进入平台期，达到饱和状态。因此，AIE分子的最适装载量为5~15mg。
对比例1：其他AIE分子制备的试剂盒
与实施例1不同之处仅在于将其中AIE-1分子替换为TPE-4DCS，制备AIE荧光微球，将上述制备的AIE荧光微球制备成IL-6试剂盒，制备过程同实施例1。
对比例2：商品化AIE荧光微球制备的试剂盒
购买长沙美牛科技有限公司的粒径为200nm的AIE荧光微球，按照实施例1中的结合垫制备过程制备成结合垫，与其他组分组装成试纸条。
对比例3：IL-6时间分辨荧光免疫层析试剂盒的制备
IL-6时间分辨荧光免疫层析试剂盒的制备包括样品垫的制备、包被膜的制备、试纸条的组装、ID卡的制备，这些步骤同实施例1。下面仅说明结合垫的制备。
1.结合垫的制备
（S1）时间分辨荧光微球的活化
a.取0.1mL时间分辨荧光微球（Merk公司，产品名称：F1-Eu-030，货号：80380624，固含量：1%）加入到0.1mL0.05M的pH6.0MES中，旋涡震荡混匀，用20000×g在4℃离心15min，去上清，用0.225mL0.05M的pH6.0MES复溶，超声分散（2%功率，超声2秒，间隔3秒，超声5次）。
b.取交联剂N-（3-二甲基氨基丙基）-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）与N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐（Sulfo-NHS），分别溶解于0.05M的pH6.0MES中至终浓度各为100mg/mL，先添加0.05mLSulfo-NHS，充分混匀后，迅速添加0.025mLEDC，涡旋混匀后置于圆盘旋转混匀仪中混匀30min。用20000×g在4℃离心20min，去上清，用1.0mL0.05M的pH6.0MES复溶，超声分散。再次用20000×g在4℃离心20min，去上清，用1.0mL0.05M的pH6.0MES复溶，重复超声分散。
（S2）活化的时间分辨荧光微球分别标记IL-6单克隆抗体IL-6-1和羊抗鸡IgY
在活化的微球中分别加入0.03mg的IL-6-1和羊抗鸡IgY，涡旋混匀，置圆盘旋转混匀仪上反应2h，用20000×g在4℃离心20min，去上清，用0.3mL含1%BSA、1%甘氨酸的0.01M的pH7.0PB缓冲液超声复溶，圆盘旋转混匀1h。用20000×g在4℃离心15min，去上清，用0.1mL含2.5%海藻糖、0.5%酪蛋白钠盐、0.1%Tween20的0.05M的pH8.0Tris-Hcl的保存液超声复溶，2~8℃保存。
（S3）在结合垫上将时间分辨荧光微球标记的IL-6单克隆抗体IL-6-1和羊抗鸡IgY用微球稀释液(含0.5%BSA、20%海藻糖的20mMTris-Hcl缓冲液)分别稀释10倍和200倍，均匀喷涂在结合垫上，置于烘箱中，37℃烘干24h，制得结合垫上包被的时间分辨荧光微球标记的IL-6-1的量为0.00018mg/cm2，包被的时间分辨荧光微球标记的羊抗鸡IgY的量为0.000009mg/cm2。
应用例1
对如上实施例1~5以及对比例1~3进行试剂盒性能评价，评价结果见表2~6。试剂盒性能评价方法如下：
1.检出限
收集5个低浓度临床样本，在同一台仪器上，分别使用三个批次的试剂盒对每个样本重复测试4次，连续测试3天，记录每个批次60个测试数据。所得数据呈正态分布，利用参数分析法计算检出限。
2.准确度
将标示值在7pg/mL和2000pg/mL浓度水平的参考品重复测定各3次，计算浓度实测值与标示值的相对偏差，需满足偏差在±10%以内的要求。
3.线性范围
取白介素-6浓度为5000pg/mL临床血清样本，采用接近线性范围下限的低值血清样本进行稀释，分别得到浓度为0.5pg/mL、3pg/mL、10pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、2500pg/mL、5000pg/mL；将每一浓度的样品重复检测3次，计算其平均值，将测定浓度的平均值与理论浓度用最小二乘法进行直线拟合，得到线性回归方程，并计算线性相关系数r。结果在0.5~5000pg/mL范围内，其相关系数为应＞0.9999，表明线性较好。
4.重复性
用同一批号的试剂盒，对2个不同浓度7pg/mL、2000pg/mL的企业参考品分别重复 测定10次，计算10次测定结果平均值、标准差SD及变异系数（CV）值，其CV＜10%，表明重复 性较好。
5.批间差
用三个不同批号试剂盒，对2个不同浓度7pg/mL、2000pg/mL的企业参考品分别重 复测定10次，计算每个浓度企业参考品30次测定结果的平均值、标准差SD和批间变异系 数（CV）值，批间变异系数CV＜10%，表明批间差较好。
表2：实施例1~5与比对例1~3试剂盒的检出限比较
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表3：实施例1~5与比对例1~3试剂盒的准确度比较
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表4：实施例1~5与比对例1~3试剂盒的线性范围比较
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表5：实施例1~5与比对例1~3试剂盒的重复性比较
表6：实施例1~5与比对例1~3试剂盒的批间差比较
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/>
表6中Lot1-3分别表示：第1批、第2批和第3批试剂。
由如上表2~表6的测试结果可以看出，对比例1的检出限为9.929pg/mL，大于实施例1~5的检出限，因此对比例1的灵敏度低于实施例1~5；准确度大于10%不满足要求；线性范围为10~3800pg/mL，小于实施例1~5；重复性和批间差的CV均大于10%，不满足要求。
对比例2的检出限为10.112pg/mL，大于实施例1~5的检出限，因此对比例2的灵敏度低于实施例1~5；准确度偏倚大于10%不满足要求；线性范围为10~4000pg/mL，小于实施例1~5；重复性和批间差的CV均大于10%，不满足要求。
对比例3的检出限为10.235pg/mL，大于实施例1~5的检出限，因此对比例3的灵敏度低于实施例1~5；准确度大于10%不满足要求；线性范围为10~4000pg/mL，小于实施例1~5；重复性和批间差的CV均大于10%，不满足要求。
应用例2：荧光免疫层析试剂盒临床样本检测
采集医院检测IL-6血清样本120例，用本发明的实施例1的试剂盒与罗氏电化学发光法（罗氏公司全自动电化学发光免疫分析系统，仪器型号：cobase801）检测IL-6试剂盒检测血清样本。本发明试剂盒中，取血清样本85μL加入到测试卡加样孔中，层析10min后通过干式荧光免疫分析仪读取浓度，同一样本采用对比系统罗氏电化学发光法检测IL-6试剂盒进行浓度检测。两种方法检测结果进行线性分析，如图4所示，其相关性较好，r＝0.9965，P>0.05，平均相对偏差小于10%，结果符合临床分析要求，适合用于临床检测。
应用例3：AIE荧光微球与时间分辨荧光微球光稳定性比较
将1%固含量的AIE荧光微球与1%固含量的时间分辨荧光微球母液用PBS缓冲液稀释到不同浓度，用喷金划膜仪分别划线到硝酸纤维素膜上，划线参数为1.0μL/cm，置于烘箱中，37℃烘干48h。
将含有AIE荧光微球与时间分辨荧光微球的硝酸纤维素膜组装成测试卡，制备成标准色卡。用干式荧光免疫分析仪读取数值，每张测试卡读取30次，观察荧光信号的变化，结果见表7，可以看出，对于第30次与第1次测试标准色卡的荧光偏倚，AIE荧光微球的偏倚≤±5%，时间分辨荧光微球的偏倚＞-10%，发生明显荧光信号衰减。因此AIE荧光微球光稳定性优于时间分辨荧光微球。
表7：应用例3AIE荧光微球与时间分辨荧光微球光稳定性比较
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的白介素-6AIE荧光免疫层析试纸条、试剂盒及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (9)

1.一种白介素-6AIE荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述试纸条包括衬底和沿层析方向依次固定于所述衬底上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述结合垫上包被有荧光标记物Ⅰ和荧光标记物Ⅱ，所述荧光标记物Ⅰ为AIE荧光微球标记的IL-6单克隆抗体1，所述荧光标记物Ⅱ为AIE荧光微球标记的羊抗鸡IgY；所述硝酸纤维素膜上按样品流动方向从前到后依次设置包被有IL-6单克隆抗体2的检测线和包被有鸡IgY抗体的质控线；所述IL-6单克隆抗体1和IL-6单克隆抗体2为针对IL-6抗原不同表位的两种抗体；
所述AIE荧光微球中AIE分子选自下列AIE-1或AIE-3分子：
、/>。
2.根据权利要求1所述的白介素-6AIE荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述AIE荧光微球为基态下稳定，在365～450nm的激发光源作用下发射出波长范围在510～620nm的荧光的AIE荧光微球；
所述AIE荧光微球的粒径为100nm～300nm。
3.根据权利要求1所述的白介素-6AIE荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述AIE荧光微球为聚合物包裹AIE分子得到的微球；
所述聚合物是由羧基功能单体和疏水单体聚合得到的聚合物，所述羧基功能单体为丙烯酸、甲基丙烯酸、马来酸酐、甲基丙烯酸二甲氨基丙酯、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、甲基丙烯酸二乙氨基丙酯或丙烯酸二甲氨基丙酯中的任意一种或至少两种的组合；所述疏水单体为苯乙烯、丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯中的至少一种；
所述AIE荧光微球中相对于100mg聚合物，AIE分子的装载量为5~15mg。
4.根据权利要求3所述的白介素-6AIE荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述AIE荧光微球的制备方法包括以下步骤：
S1.将乳化剂Ⅰ溶于水中制得乳化剂水溶液作为反应介质；加入疏水单体，通惰性气体排除体系氧气，升高体系温度至75℃~85℃，加入引发剂，在搅拌下聚合反应3h~5h后，加入羧基功能单体，在惰性气体氛围下继续反应8h~10h，反应结束后洗涤去除未反应的单体，制得羧基化聚合物微球；
S2.将羧基化聚合物微球、乳化剂Ⅱ加入水中分散得到羧基化聚合物微球乳液；将AIE分子溶于溶胀剂，在搅拌条件下逐滴加入到羧基化聚合物微球乳液中，密封反应容器，在温度30~50℃搅拌1~3h，反应结束后通过减压蒸馏除去溶胀剂，洗涤去除多余的AIE分子，然后超声分散在蒸馏水中保存，制得AIE荧光微球乳液。
5.根据权利要求1所述的白介素-6AIE荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述结合垫上包被的AIE荧光微球标记的IL-6单克隆抗体1的量为0.00002~0.0004mg/cm2，包被的AIE荧光微球标记的羊抗鸡IgY的量为0.000002~0.000032mg/cm2；
所述检测线和质控线相互平行，间隔距离为3～7mm；
所述检测线上包被的IL-6单克隆抗体2的量为0.5～2.25μg/cm，所述质控线上包被的鸡IgY抗体的量为0.25～1.5μg/cm。
6.根据权利要求1所述的白介素-6AIE荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述硝酸纤维素膜的孔径为3μm~12μm，长度为2cm~3cm，宽度为3.0mm~4.0mm；
所述样品垫上喷涂有样品垫处理液，所述样品垫处理液包括缓冲液、0.1~0.3mg/mL抗红细胞抗体、0.1~0.5mg/mL异嗜性抗体阻断剂、0.2wt%~0.5wt%表面活性剂、0.5wt%~2wt%惰性蛋白和0.5wt%~1.5wt%糖类物质；
所述结合垫的材质为玻璃纤维素膜；
所述衬底选自聚氯乙烯板、聚氨酯板、聚乙烯板或聚酰亚胺板。
7.一种白介素-6AIE荧光免疫层析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-6中任一项所述的白介素-6AIE荧光免疫层析试纸条。
8.根据权利要求7所述的白介素-6AIE荧光免疫层析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括设置在试纸条外侧的卡壳，所述卡壳包括相互卡接的上卡壳和下卡壳，所述下卡壳设有放置试纸条的卡槽，所述上卡壳对应于试纸条的样品垫处设有加样口、对应于试纸条的硝酸纤维素膜处设有观察窗，硝酸纤维素膜上的检测线和质控线均暴露于观察窗处；
所述试剂盒还包括含有定标曲线的ID卡。
9.根据权利要求1-6中任一项所述的白介素-6AIE荧光免疫层析试纸条或权利要求7或8所述的白介素-6AIE荧光免疫层析试剂盒在定量检测IL-6中的应用。
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