CN102854314A - 一种胶乳免疫比浊法进行幽门螺杆菌抗体检测的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开一种采用胶乳免疫比浊法检测幽门螺杆菌抗体含量的试剂盒。本发明所述试剂盒包含幽门螺杆菌抗体校准品、pH值6.5-8.5的缓冲液以及幽门螺杆菌基因重组抗原胶乳试剂。本发明所述试剂盒采用胶乳免疫比浊法检测样品中幽门螺杆菌抗体含量，灵敏度高，可达到0.10μg/ml；稳定性好，操作简单、快速；特异性强，不易受干扰；定量准确，具有广泛的应用前景。

Description

一种胶乳免疫比浊法进行幽门螺杆菌抗体检测的试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及应用基因重组抗原制备胶乳免疫试剂以及含有该试剂的胶乳免疫比浊法进行幽门螺杆菌抗体检测的试剂盒。

背景技术

幽门螺杆菌，Helicobacter pylori，简称Hp，由巴里·马歇尔（BarryJ.Marshall）和罗宾·沃伦（J.Robin Warren）二人首次发现，此二人因此获得2005年的诺贝尔生理学或医学奖。幽门螺杆菌是一种单极、多鞭毛、末端钝圆、螺旋形弯曲的细菌，长2.5～4.0μm，宽0.5～1.0μm。在胃粘膜上皮细胞表面常呈典型的螺旋状或弧形。

幽门螺杆菌感染是慢性活动性胃炎、消化性胃溃疡以及胃黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤的主要致病因素，并且与胃癌的发生密切相关，1994年世界卫生组织/国际癌症研究机构(WHO/IARC)将幽门螺杆菌定为I类致癌原。在亚洲地区，中国内地、中国香港、越南、印度等少年幽门螺杆菌的感染率分别60%、50%、40%、70%，慢性胃炎患者的胃粘膜活检标本中幽门螺杆菌检出率可达80％～90％，而消化性胃溃疡患者更高，可达95％以上，甚至接近100％。胃癌由于局部上皮细胞已发生异化，因此其检出率高低报道不一。幽门螺杆菌的感染已是个世界性问题，对其进行准确诊断有利于控制HP传播与流行及根除HP感染治疗的监测。

1983年通过胃镜取活检标本分离培养成功以来，对幽门螺杆菌感染的诊断已发展出了许多方法，包括有细菌学、病理学、血清学、同位素示踪、分子生物学等。但总的讲来，从标本采集角度看，可以分为侵袭性和非侵袭性两大类。

侵入性方法主要指必需通过胃镜取活检标本检查的方法，是目前消化病学科的常规方法。它包括细菌的分离培养和直接涂片、快速尿素酶试验，药敏试验。

非侵入性方法主要指不通过胃镜取活检标本诊断幽门螺杆菌标本感染的方法。这类方法包括抗体检测、抗原检测、尿素13C/14C呼气试验等。抗体检测目前已有的方法包括酶联免疫法、免疫印迹法、胶体金法和胶乳增强免疫比浊法等，为HP的流行病学调查提供了有利便捷手段。胶乳增强免疫比浊法，是将一定量的抗原或者抗体标记到一定粒径大小的胶乳颗粒上制备成胶乳溶液，与相应的抗体或者抗原溶液混合后会引起抗原抗体反应，而形成一定的浊度，检测浊度的变化从而用以判定抗体或抗原浓度的方法。幽门螺杆菌抗体检测方法则是应用幽门螺杆菌特异性抗原标记胶乳颗粒，从而检测人血清样本中相应抗体含量的一种方法。胶乳增强免疫比浊法使用自动生化分析仪，能够简便、快速、大批量且定量的进行样本检测，对于疾病的防治意义重大。

发明内容

本发明的目的在于克服目前使用天然抗原制备胶乳试剂的缺点，天然抗原之间批次间差异大，且制备过程繁琐、周期长，提供一种使用基因重组抗原制备胶乳免疫试剂盒，以测定幽门螺杆菌抗体以及使用该试剂进行临床样本检测的方法。

为实现本发明的目的，本发明提供一种采用胶乳免疫比浊法检测幽门螺杆菌抗体含量的试剂盒，包含试剂R1、试剂R2、幽门螺杆菌抗体校准品；所述试剂R1为pH值6.5-8.5的缓冲液，所述试剂R2为幽门螺杆菌基因重组抗原胶乳试剂。

作为优选，所述R2试剂中幽门螺杆菌基因重组抗原胶乳试剂与幽门螺杆菌的尿素酶B亚单位UreB、幽门螺杆菌黏附素HpaA、空泡毒素VacA、细胞毒素相关蛋白CagA、热休克蛋白HspB、鞭毛蛋白A亚单位FlaA和B亚单位FlaB中的一种特异性结合。

幽门螺杆菌特异性蛋白抗原包括是尿素酶B亚单位(UreB)、幽门螺杆菌黏附素(HpaA)、空泡毒素(VacA)、细胞毒素相关蛋白(CagA)、热休克蛋白（HspB）、鞭毛蛋白A亚单位(FlaA)和B亚单位(FlaB)等。其中尿素酶B亚单位(UreB)、幽门螺杆菌黏附素(HpaA)、热休克蛋白（HspB）、鞭毛蛋白A亚单位(FlaA)和B亚单位(FlaB)几乎在所有的幽门螺杆菌中都有表达。尿素酶蛋白对细菌在体内的定植及致病发挥着重要作用。尿素酶B亚单位(ureB)是尿素酶的两个亚单位之一，已证实是幽门螺杆菌的一个重要保护性抗原。

本发明所述胶乳为聚苯乙烯胶乳，是一种核壳形式的胶乳颗粒，其胶乳核是甲苯乙烯聚合物，胶乳壳是甲基丙烯酸甲酯聚合物，是一种亲水性胶乳。在壳的表面具有高密度的羧基基团，经活化后在水溶液中可以与预标记蛋白分子，如抗体的氨基基团反应，产生一种稳定的共价化合物。通过加入适当的表面活性剂，胶乳颗粒的表面形成机械性或电性的保护膜，可以抑制胶乳颗粒的絮凝；根据胶乳颗粒的比重，通过适当助悬剂调节缓冲液比重和粘度，能够使胶乳颗粒稳定悬浮而不会沉降。

作为优选，所述缓冲液选自Tris/HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液、巴比妥缓冲液、MOPSO缓冲液、DIPSO缓冲液、HEPPS缓冲液中的一种，并含有0.7%-0.9%的NaCl、1%-6%的PEG 6000、0.01%-0.1%的Tween80。所述缓冲液中含有促凝剂PEG6000，质量体积百分比浓度为1%-6%，可以加快抗原抗体的免疫反应速度，缩短检测时间。并含有无机盐NaCl，可以调节离子强度，质量体积百分比浓度为0.7%-0.9%。

作为优选，所述R2试剂中所述基因重组抗原的氨基酸序列如SEQID No.2所示。

在本发明的具体实施方式中，公开了所述的幽门螺杆菌基因重组抗原胶乳试剂的制备包括如下步骤：

步骤1：聚苯乙烯胶乳溶液的准备：以pH为5的MES溶液分散胶乳，用EDC活化12-15分钟形成粒径为90nm-300nm，具有羧基官能团的胶乳；

步骤2：14000转/分钟，离心10分钟收集胶乳沉淀，分散胶乳，调整胶乳浓度；

步骤3：加入基因重组抗原，室温搅拌后加入封闭液，混合均匀，室温搅拌以10，000rpm的速度离心10-20分钟，去除上清液；

步骤4：以缓冲液洗涤分散步骤3所得沉淀，加入含0.1％BSA的PB S缓冲液洗涤分散即得。

作为优选，步骤2所述分散为以PBS震荡分散或超声分散。

步骤3所述基因工程抗原加入胶乳溶液中后，在2小时之内通过活化的羧基与胶乳颗粒溶液化学交联致敏，形成共价抗原-胶乳复合物。

步骤3所述封闭剂为0.1％B SA的磷酸盐缓冲液，封闭胶乳颗粒表面未结合抗原的表面活性基团。

更优选地，步骤3所述基因重组抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明所述的试剂盒，还包含稳定剂和防腐剂：所述稳定剂选自蛋白质、氨基酸、无机盐、表面活性剂、助悬剂或抗氧剂中的一种或多种；所述防腐剂选自本领域技术人员已知的适当防腐剂，包括0.1％(g/ml)的叠氮钠、Proclin-300、庆大霉素。

在具体实施例中，公开了一种制备幽门螺杆菌基因重组抗原的方法，其制备步骤包括：

1)步骤1：特异性抗原的基因序列合成、基因工程表达载体的构建、蛋白表达；

2)步骤2：蛋白纯化及蛋白浓度测定。

步骤1中，基因序列来源于公开的Genbank数据库;构建的基因工程载体带有选择性蛋白标签，如His、GST等。

本发明所述校准品是一种用来与样本比较，进行结果计算和质量控制的幽门螺杆菌抗体溶液，包括PBS缓冲液、适量稳定剂、适量防腐剂以及一定浓度的幽门螺杆菌特异性抗体。在使用时用水稀释成多个不同浓度的参考校准品。校准品的浓度可以是高浓度单点参考校准品，使用时用水稀释成多个不同浓度的参考校准品。在具体实施例中，公开了一种制备校准品的方法。

本发明测定样本的原理是胶乳增强免疫比浊法，所选样本为人体血清，样本与试剂R1(pH值为6.5-8.5的缓冲液)预孵育3-5分钟后(使样本中的抗体结合位点充分暴露)，加入试剂R2(幽门螺杆菌特异性抗原胶乳试剂)，继续孵育3-5分钟，人体血清中的幽门螺杆菌特异性抗体的两个Fab片段分别与不同胶乳颗粒的幽门螺杆菌特异性抗原结合，形成不溶性的胶乳抗原-抗体-胶乳抗原复合物，产生一定的浊度，其浊度高低与检测样本中的特异性抗体浓度成正比。在规定波长下测定该不溶性抗原-抗体复合物的吸光度值，与已知浓度的幽门螺杆菌特异性抗体校准品进行比较，则可计算出样本中幽门螺杆菌抗体的浓度。

本发明所述试剂盒采用胶乳免疫比浊法检测幽门螺杆菌抗体含量，灵敏度高，可达到分析灵敏度为3AU/mL；稳定性好，操作简单、快速；特异性强，不易受干扰；定量准确，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明所述试剂盒线性范围相关性示意图。

具体实施方式

本发明公开了幽门螺杆菌抗体检测试剂盒及应用胶乳试剂检测幽门螺杆菌抗体含量的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，通过适当改进工艺参数而实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明所要求保护的技术方案之内。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例1：幽门螺杆菌基因重组抗原的制备（以尿素酶B抗原为例）

(a)蛋白表达

以GeneBank数据库中幽门螺杆菌尿素酶B公开的核酸序列（AAU21200.1 GI:51989332）为模板，借鉴蛋白序列分析软件保留C端富含抗原决定簇的碱基序列，而将N端截去450个碱基后送Invitrogen公司进行基因序列合成，将合成后的基因序列（序列如SEQID No.1所示）插入带6X His Tag的表达载体pET30a中，以此表达载体转化大肠杆菌BL21。当培养物达到OD600值为80时，将诱导剂IPTG加到培养物中以诱导蛋白质表达。将培养物进一步培养40-45小时，直至600nm的OD值增加到100至120。

(b)步骤2：蛋白纯化及蛋白浓度测定。

超声破碎自发酵液收集的大肠杆菌细胞，澄清过滤后，采用Ni-NTA亲和层析柱（BioColor）纯化此重组蛋白。纯化的幽门螺杆菌尿素酶B抗原重组蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

以Bio-Rad蛋白测定试剂盒定量幽门螺杆菌抗原蛋白浓度，首先将胎牛血清蛋白(BSA)溶于PBS中制备下列各浓度之标准品：0mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml，然后以二次水5倍稀释分析缓冲液(含考马斯亮兰R-250)，接着在96微孔盘中加入100μl稀释后的分析缓冲液，最后分别加入10μl各浓度标准品及(2)中所获幽门螺杆菌抗原蛋白质溶液，于室温反应5分钟，以可见分光光度计或酶标仪在595nm波长下读取OD值，绘制标准曲线，并计算幽门螺杆菌抗原蛋白质浓度。

实施例2：幽门螺杆菌抗体胶乳免疫试剂盒的制备

1、试剂R1的制备

先以双蒸水溶解NaCl(7.0～9.0g)，再加入Tris-HCl缓冲液，最后加双蒸水至1000ml，使Tris终浓度为0.05mol/L，充分摇匀，再加入少量PEG 6000和Tween80，混合均匀即可。

本领域技术人员也可选择其他的常规缓冲液，如磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液、巴比妥缓冲液中的一种或多种。

2、试剂R2的制备

以pH=5的MES溶液分散胶乳，使之浓度为1%，加入EDC混合均匀后震荡12-15分钟，活化为粒径为90nm-300nm，具有羧基官能团的胶乳。14000转/分钟，离心10分钟收集胶乳沉淀，以1XPBS震荡或超声分散胶乳，调整胶乳浓度至2%。在活化的胶乳溶液中加入基因重组抗原，室温搅拌2小时后，加入封闭剂（10%BSA 1XPBS溶液）少许，混合均匀，室温搅拌0.5小时以10，000rpm的速度离心10-20分钟，去除上清液。所得沉淀中加入含0.1％BSA的1XPB S缓冲液洗涤分散胶乳使之浓度为0.1%。

3、校准品的制备（也可选用市售的已知浓度的幽门螺杆菌抗体）

用幽门螺杆菌基因重组抗原多次免疫纽西兰兔，免疫完毕后取颈动脉血，于室温静置4小时，待血液凝结完全，析出血清，以3，000rpm离心10分钟，取上清以PBS稀释后，经Protein A(Zymed)管柱层析纯化，获得抗体蛋白溶液。

用实施例一中(b)所述方法测定幽门螺杆菌抗体浓度，再以1XPBS加入幽门螺杆菌抗体溶液，使其最终浓度为1mg/ml(转换成活性单位为80AU/ml)，置于4℃备用。

实施例3：幽门螺杆菌抗体检测试剂的测定方法

本试剂盒适用于贝克曼、日立、奥林巴斯、东芝、罗氏、雅培、西门子、迈瑞等品牌的全自动或半自动生化分析仪，测定方法如下：

1、测定条件

本发明所述试剂盒的测定条件

温度：37℃

主波长：548nm

副波长：800nm

样本量：5μL

R1用量：200μL

R2用量：50μL

分析类型：两点终点法

2、测定方法如下：

测定空白吸光度，在200ul R1试剂中加入5μL样本，预孵育5分钟，测定空白吸光度后，加入50μLR2试剂，孵育5分钟，测定反应吸光度。

样本量、R1用量及R2用量可按不同型号生化分析仪的要求，按“测定条件”中规定的样本与试剂用量的比例进行调整。如仪器内无指定波长，可选择与指定波长最接近的数值输入。

(3)定标、质量控制及样本测定

使用试剂盒中的校准品按所使用分析仪器说明书中的校准程序要求定标，模式为多点定标，以去离子水将80AU/mL校准品按倍比稀释1:3、1:1、2:1，以水为零点，校准品为高值点建立工作曲线。

定标后，测定血清样本，依据工作曲线可算出样本中的抗体浓度。实施例4：幽门螺杆菌抗体胶乳免疫试剂的分析性能评估

1、分析灵敏度或最低检出限

以零标准品为样本，按实施例三所述方法进行测定，重复测定20次，计算结果平均值为0.7AU/mL，标准偏差SD为0.53，平均值与3倍标准偏差之和为2.29AU/mL，因此本发明试剂盒的分析灵敏度为3AU/mL。

2、准确度和重复性

以80.1AU/ml的校准品和标示值为36AU/ml的人血清作为样本，按实施例三所述方法分别重复测定20次，分别计算测定平均值X、标准偏差SD及变异系数CV。结果显示变异系数分别为1.71%和1.93%。

表1本发明所述试剂盒的准确度和重复性

以相对偏差来考察测定准确度，相对偏差均在±15％范围内，以变异系数考察批内精密度，低值质控物和高值质控物的变异系数分别为5.9％和5.3％。

3、批间精密度

用3个批号的本发明所述试剂，按实施例三所述方法分别测定同一个血清样本，5次，计算5次测定结果的变异系数(CV)以考察批间精密度，结果显示变异系数为5.7％。

4、线性范围

将接近线性范围上限的高值样本(浓度为185AU/mL).以去离子水按1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32稀释，共得6个不同浓度的溶液，按实施例三所述方法每个浓度测定3次，对实测平均值与相应理论值作回归分析，计算回归方程为y＝0.9851x+1.9343，相关系数r＝0.9992，表明本发明试剂盒在(5～180)AU/mL线性范围内相关性较好，见附图1。

5、干扰物质的影响

将标示浓度为80AU/mL的校准品，分别加入相同体积的各干扰物质溶液与去离子水、浓度为1mg/mL的胆红素溶液、浓度为5mg/mL的血红蛋白溶液、浊度为3000FTU的乳糜按9∶1的比例混合均匀，按实施例三所述方法测试每个样本3次，取均值。观察加入干扰物质与加入去离子水后测定结果的相对偏差。结果表明：加入上述浓度干扰物质样本与加入同体积去离子水的样本测定结果的相对误差不超过8％，可以认为在中轻度溶血、黄疸或乳糜时，此测定方法的检测结果基本不受干扰。

6、稳定性

将本发明所述试剂盒开瓶后置于2-8℃保存2周后，取出按实例三所述方法测定标示值为80AU/mL的校准品，各重复测定3次，计算检测平均值与标示值的相对偏差。实验结果表明，开瓶2周后本发明所述试剂盒检测平均值与标示值的相对偏差均小于4％，开瓶稳定性较好。

将本发明所述试剂盒置于2-8℃保存16个月后，取出按实例三所述方法测定标示值为80AU/mL的校准品，各重复测定3次，计算检测均值与标示值的相对偏差。结果显示检测值与标示值的相对偏差均小于4％，表明本发明试剂盒在2-8℃保存16个月是比较稳定的。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种采用胶乳免疫比浊法检测幽门螺杆菌抗体含量的试剂盒，其特征在于，包含试剂R1、试剂R2、幽门螺杆菌抗体校准品；所述试剂R1为pH值6.5-8.5的缓冲液，所述试剂R2为幽门螺杆菌基因重组抗原胶乳试剂。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述R2试剂中幽门螺杆菌基因重组抗原胶乳试剂与幽门螺杆菌的尿素酶B亚单位UreB、幽门螺杆菌黏附素HpaA、空泡毒素VacA、细胞毒素相关蛋白CagA、热休克蛋白HspB、鞭毛蛋白A亚单位FlaA和B亚单位FlaB中的一种特异性结合。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述缓冲液选自Tris/HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液、巴比妥缓冲液、MOPSO缓冲液、DIPSO缓冲液、HEPPS缓冲液中的一种，并含有0.7%-0.9%的NaCl、1%-6%的PEG 6000、0.01%-0.1%的Tween80。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述R2试剂中所述基因重组抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

5.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于：所述的幽门螺杆菌基因重组抗原胶乳试剂的制备包括如下步骤：

步骤1：聚苯乙烯胶乳溶液的准备：以pH为5的MES溶液分散胶乳，用EDC活化12-15分钟形成粒径为90nm-300nm，具有羧基官能团的胶乳；

步骤2：14000转/分钟，离心10分钟收集胶乳沉淀，分散胶乳，调整胶乳浓度；

步骤3：加入基因重组抗原，室温搅拌后加入封闭液，混合均匀，室温搅拌以10，000rpm的速度离心10-20分钟，去除上清液；

步骤4：以缓冲液洗涤分散步骤3所得沉淀，加入含0.1％BSA的PBS缓冲液洗涤分散即得。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：步骤2所述分散为以PB S震荡分散或超声分散。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：步骤3所述基因重组抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：步骤3中所述封闭液为用0.1％BSA的PBS缓冲液。

9.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：还包含稳定剂和防腐剂。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述稳定剂选自蛋白质、氨基酸、无机盐、表面活性剂、助悬剂或抗氧剂中的一种或多种；所述的防腐剂选自0.1％的叠氮钠、Proclin-300或庆大霉素。

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