JP2009031061A

JP2009031061A - 標的物質の検出方法およびラテックス凝集反応用試薬

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Publication number: JP2009031061A
Application number: JP2007193688A
Authority: JP
Inventors: Kakun Han; 可君范; Koji Tamori; 功二田守
Original assignee: JSR Corp
Current assignee: JSR Corp
Priority date: 2007-07-25
Filing date: 2007-07-25
Publication date: 2009-02-12
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Also published as: CN101354400A; EP2019319A2; JP5088471B2; CN101354400B; EP2019319B1; EP2019319A3; US20090029483A1

Abstract

【課題】免疫ラテックス凝集測定法において、バックグラウンドの上昇および非特異反応の発生を抑制することができる標的物質の検出方法および試薬を提供。
【解決手段】標的物質の検出方法は、下記一般式（１）で表される繰り返し単位を有する水溶性高分子と、所定の標的物質に対する抗体または抗原が固定化された粒子と、検体とを混合する工程、および前記混合する工程により生じた前記粒子の凝集の度合いを光学的に検出する工程を含む。

・・・・・（１）（式中、Ｒ^１およびＲ^２はそれぞれ独立に、水素原子、または、炭素数１〜８の置換または非置換のアルキル基を表す。）
【選択図】なし

Description

本発明は、標的物質の検出方法およびラテックス凝集反応用試薬に関する。

抗原−抗体による凝集反応を利用して特定の抗原または抗体（標的物質）を測定するためには、抗体、抗原などの免疫反応物質を担体粒子に担持させ、特異的反応によって対応する抗原、抗体などの標的物質を検出する免疫ラテックス凝集測定法は、臨床検査、生化学研究等の領域において広く使用されている（例えば、特開２００６−２６６９７０号公報）。

免疫ラテックス凝集測定法においては、一般に、測定対象の抗原（抗体）に対する抗体（抗原）を固定化させた担体粒子を、標的物質を含む可能性のある検体と接触させ、標的物質が存在する場合に抗原抗体反応の結果として混合液中で起こる該粒子の凝集反応を検出する。

しかしながら、免疫ラテックス凝集測定法では、光吸収の検出に測定限界があり、他の測定方法（例えば、酵素増幅法、化学発光測定法）と比較して、粒子凝集の検出感度不足が指摘されている。

免疫ラテックス凝集測定法において、より高感度の測定を行うためには、通常、より粒径の大きい担体粒子を使用する。しかしながら、測定波長の制約から、担体粒子の粒径がある上限を超えると、測定範囲が著しく小さくなるうえに、担体粒子の沈降性が実際測定時間内において無視できない程度に大きくなることから、担体粒子の粒径を著しく大きくすることは困難である。

一方、粒径が小さい担体粒子を用いて、大きな測定感度を得るための多くの研究がなされてきた。例えば、特開平８−２７８３０８号公報、特開２００３−２９４７５３号公報、特開２００６−１０５９１０号公報などにおいては、担体粒子の免疫反応を促進するために、ある一定の条件下で、担体粒子の凝集促進機能を有する水溶性高分子が開示されている。このような水溶性高分子としては、例えば、ポリエチレングリコール、多価アルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、サッカロース、デキストラン、ポリアミノ酸、アルギン酸、アミノエタンスルホン酸誘導体、アミノプロパンスルホン酸誘導体等が挙げられる。

しかし、これらの水溶性高分子はいずれも、粒子凝集反応において、増感効果が限定的であり、多くの場合、抗原抗体反応以外の別因子によって、粒子の凝集を引き起こすという致命的な欠点を有する。このため、上述した水溶性高分子の用途および使用条件は限定される。しかも、上述の水溶性高分子の溶液は、濃度が低い場合であっても溶液の粘性が高いため、免疫反応系で担体粒子が不均一に存在する。このため、測定結果にバラつきが生じたり、測定精度が低かったりする場合がある。
特開２００６−２６６９７０号公報特開平８−２７８３０８号公報特開２００３−２９４７５３号公報特開２００６−１０５９１０号公報

本発明は、免疫ラテックス凝集測定法において、抗体または抗原が固定化された粒子と、抗原または抗体との免疫反応を促進し、該粒子の凝集を促進でき、かつ、バックグラウンドの上昇および非特異反応の発生を抑制することができる標的物質の検出方法およびラテックス凝集反応用試薬を提供する。

本発明の一態様に係る標的物質の検出方法は、下記一般式（１）で表される繰り返し単位を有する水溶性高分子と、所定の標的物質に対する抗体または抗原が固定化された粒子と、検体とを混合する工程、および
前記混合する工程により生じた前記粒子の凝集の度合いを光学的に検出する工程
を含む。

・・・・・（１）
（式中、Ｒ^１およびＲ^２はそれぞれ独立に、水素原子、または、炭素数１〜８の置換または非置換のアルキル基を表す。）
本発明において、「水溶性高分子」とは、２５℃において１％の固形分となるように純水に高分子を添加・混合したときに、目視で透明な溶液が得られる高分子をいう。

上記標的物質の検出方法において、前記水溶性高分子は、下記一般式（２）で表される繰り返し単位をさらに有することができる。

・・・・・（２）
（式中、Ｒ^３は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ^４は炭素数１〜１２の置換または非置換のアルキル基、脂環式炭化水素基、または芳香族炭化水素基を表す。）
上記標的物質の検出方法において、前記水溶性高分子は、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、およびアクリルアミド系モノマーと（メタ）アクリレートモノマーとの共重合体から選ばれる少なくとも１種であることができる。

本発明の一態様に係るラテックス凝集反応用試薬は、下記一般式（１）で表される繰り返し単位を有する水溶性高分子を含有する。

・・・・・（１）
（式中、Ｒ^１およびＲ^２はそれぞれ独立に、水素原子、または、炭素数１〜８の置換または非置換のアルキル基を表す。）
上記ラテックス凝集反応用試薬において、前記水溶性高分子は、下記一般式（２）で表される繰り返し単位をさらに有することができる。

・・・・・（２）
（式中、Ｒ^３は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ^４は炭素数１〜１２の置換または非置換のアルキル基、脂環式炭化水素基、または芳香族炭化水素基を表す。）
上記ラテックス凝集反応用試薬において、前記水溶性高分子は、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、およびアクリルアミド系モノマーと（メタ）アクリレートモノマーとの共重合体から選ばれる少なくとも１種であることができる。

上記標的物質の検出方法によれば、上記一般式（１）で表される繰り返し単位を有する水溶性高分子と、所定の標的物質に対する抗体または抗原が固定化された粒子と、検体とを混合する工程、および前記混合する工程により生じた前記粒子の凝集の度合いを光学的に検出する工程を含むことにより、測定範囲が広く、高い測定感度および定量性を実現することができる。

また、免疫ラテックス凝集測定法において、上記一般式（１）で表される水溶性高分子を含有するラテックス凝集反応用試薬を用いて標的物質の検出を行うことにより、粒子の凝集反応が増幅され、標的物質の検出感度を高めることができ、かつ、増感剤として他の水溶性高分子を用いた場合と比較して、非特異反応の発生を抑制することができる。その結果、ラテックス凝集反応測定の再現性および精度を向上させることができる。

さらに、上記ラテックス凝集反応用試薬は取り扱いが容易であり、かつ、経時劣化が非常に少ないため、保存安定性が良好である。

以下、本発明の一実施形態に係る標的物質の検出方法およびラテックス凝集反応用試薬について、具体的に説明する。

１．ラテックス凝集反応用試薬
本発明の一実施形態に係るラテックス凝集反応用試薬は、下記一般式（１）で表される繰り返し単位を有する水溶性高分子を含有する。

・・・・・（１）
（式中、Ｒ^１およびＲ^２はそれぞれ独立に、水素原子、または、炭素数１〜８の置換または非置換のアルキル基を表す。）

１．１．水溶性高分子
本実施形態に係るラテックス凝集反応用試薬において、水溶性高分子は増感剤としての機能を有する。

上記一般式（１）において、Ｒ^１およびＲ^２で表される炭素数１〜８の置換または非置換のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ならびにこれらの基が例えば水酸基、アルコキシ基等の官能基で置換された基が挙げられる。Ｒ^１およびＲ^２としては、水素原子またはメチル基がより好ましい。

また、水溶性高分子は、下記一般式（２）で表される繰り返し単位をさらに有することができる。

・・・・・（２）
（式中、Ｒ^３は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ^４は炭素数１〜１２の置換または非置換のアルキル基、脂環式炭化水素基、または芳香族炭化水素基を表す。）
上記一般式（２）において、Ｒ^４で表される炭素数１〜１２の置換または非置換のアルキル基としては、例えば、上記一般式（２）において、Ｒ^１およびＲ^２として例示した基が挙げられる。Ｒ^４としては、メチル基、エチル基、およびメトキシエチル基から選ばれる少なくとも１種であるのがより好ましく、メトキシエチル基であるのがさらに好ましい。

また、上記一般式（２）において、Ｒ^４で表される脂環式炭化水素基としては、例えば、イソボニル基、シクロヘキシル基が挙げられ、Ｒ^４で表される芳香族炭化水素基としては、例えばベンジル基が挙げられる。

水溶性高分子は、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド等の上記一般式（１）で表される繰り返し単位のみからなるホモポリマーであってもよく、あるいは、上記一般式（１）で表される繰り返し単位と、他の繰り返し単位とを含むヘテロポリマー（共重合体）であってもよい。

例えば、水溶性高分子は、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、およびアクリルアミド系モノマーと（メタ）アクリレートモノマーとの共重合体から選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。アクリルアミド系モノマーと（メタ）アクリレートモノマーとの共重合体としては、例えば、ジメチルアクリルアミド−メトキシエチルアクリレート共重合体が挙げられる。

水溶性高分子として、ジメチルアクリルアミド−メトキシエチルアクリレート共重合体を使用する場合、上記一般式（１）で表される繰り返し単位（ジメチルアクリルアミド：Ｒ^１およびＲ^２がともにメチル基）と、上記一般式（２）で表される繰り返し単位（メトキシエチルアクリレート：Ｒ^３が水素原子、Ｒ^４がメトキシエチル基）との比が１／９〜９／１であることが好ましい。

水溶性高分子は、一般的な重合反応により調製することができる。重合条件の制御によって、得られる水溶性高分子の分子量、分子量分布、および重合組成等を調節することができる。重合体純度を上げるために、水溶性高分子を通常の透析、限外濾過、溶媒沈殿等方法によって精製することもできる。

水溶性高分子の好ましい重量平均分子量（Ｍｗ）は２，０００〜５００，０００、より好ましくは５，０００〜１００，０００であり、好ましい分子量分布は、Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜４．０、より好ましくは１．０〜２．５である。

また、本実施形態に係るラテックス凝集反応用試薬に使用される水溶性高分子の好ましい純度は９０％以上である。

水溶性高分子の重量平均分子量、分子量分布、または純度が上記範囲外であると、粒子凝集の増感効果に支障をきたしたり、粘度上昇によりハンドリングしにくかったりする場合がある。

水溶性高分子は粉末であってもよい。この場合、使用時に水溶性高分子を水性媒体に溶解して使用してもよい。ここで、水性媒体としては、蒸留水や、生化学分野において通常使用され得る、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、グッド緩衝液、トリス緩衝液、アンモニア緩衝液等の各種緩衝液等が挙げられる。水性媒体としては、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、グッド緩衝液等がより好ましい。

１．２．その他の成分
本実施形態に係るラテックス凝集反応用試薬は、上記水溶性高分子を単独で使用してもよいし、あるいは、他の水溶性高分子と併用してもよい。

他の水溶性高分子には、例えば、背景技術の欄で上述したポリエチレングリコール、多価アルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、サッカロース、デキストラン、プルラン、ポリアミノ酸、アルギン酸、アミノエタンスルホン酸誘導体、アミノプロパンスルホン酸誘導のほか、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ブロックエース、アラビアゴム、蛋白質分解物、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、界面活性剤等が含まれる。

さらに、本実施形態に係るラテックス凝集反応用試薬は、必要に応じて、ｐＨ緩衝剤、塩類、界面活性剤等の付加的成分を含んでいてもよい。

本実施形態に係るラテックス凝集反応用試薬における水溶性高分子の濃度は、０．０１〜３０質量％であることが好ましく、０．１〜５質量％がより好ましい。水溶性高分子の濃度が０．０１質量％未満であると、所望の増感効果が得られない場合がある。一方、水溶性高分子の濃度が３０質量％を超えると、粘性増加のため、秤量誤差が増えるとともに、副作用による非特異反応の増加が大きくなる場合がある。

本実施形態に係るラテックス凝集反応用試薬において、水溶性高分子の濃度が０．０１〜３０質量％の範囲にある場合、該試薬は通常、無色透明な液体である。なお、ラテックス凝集反応の測定にあたり、本実施形態に係るラテックス凝集反応用試薬の使用量は、測定項目毎によって調整すればよい。

１．３．使用方法
免疫ラテックス凝集測定にあたり、反応系での水溶性高分子の濃度は０．０００１〜１０質量％であることが好ましく、０．０００５〜５質量％であることがより好ましい。反応系での水溶性高分子の濃度が０．０００１質量％未満であると、増感効果が発現しない場合があり、一方、反応系での水溶性高分子の濃度が５質量％を超えると、増感効果がほぼ定常となり、むしろ、非特異反応を引き起こす副作用が顕著になる場合がある。

本実施形態に係るラテックス凝集反応用試薬は、予め試薬として調製したものであってもよいし、あるいは、免疫反応の開始直前に、水溶性高分子を反応系に加えることにより調製されたものであってもよい。

本実施形態に係るラテックス凝集反応用試薬の調製方法は、試薬構成、実際診断項目の要求スペック、および臨床現場の使用状況に合わせて適宜選択すればよい。

さらに、本実施形態に係るラテックス凝集反応用試薬は、水溶性高分子とともに、検体希釈液の成分および凝集試薬の必須成分を含み、検体希釈液と凝集試薬との両方の用途を兼ねた試薬であってもよい。このような試薬を使用することにより、検体を予め希釈することなく、この試薬と直接混合するだけで適正な凝集反応を生じさせることができる。

２．標的物質の検出方法
本発明の一実施形態に係る標的物質の検出方法は、上記水溶性高分子と、所定の標的物質に対する抗体または抗原が固定化された粒子（以下、「抗体または抗原固定化粒子」ともいう。）と、検体とを混合する工程、および前記混合する工程により生じた前記粒子の凝集の度合いを光学的に検出する工程を含む。

２．１．混合する工程
上記混合する工程においては、抗体または抗原固定化粒子、検体、および水溶性高分子を共存させることが必須であるが、これらを混合する順序は特に限定されない。

したがって、抗体または抗原固定化粒子、検体、および水溶性高分子を同時に混合してもよく、あるいは、上記３つを混合する工程の前に、抗体または抗原固定化粒子と水溶性高分子、抗体または抗原固定化粒子と検体、および水溶性高分子と検体のいずれかを予め混合しておいてもよい。

上記混合する工程では、混合温度は、通常４〜５０℃の範囲である。上記温度が４℃未満であると、抗原と抗体との衝突が低減する場合があり、一方、上記温度が５０℃を超えると、抗体と抗原との複合体の安定性が低下する場合がある。上記温度は１５〜４０℃が好ましく、３０〜４０℃がより好ましい。

上記混合する工程では、混合時間は、通常６０分以下である。混合液のｐＨは、通常５〜１０の範囲であり、抗体と抗原との複合体の安定性がより良好である点で、混合液のｐＨは６〜９であるのがより好ましい。

本実施形態に係る標的物質の検出方法において、上記混合する工程では、上記水溶性高分子は、標的物質を光学的に検出する直前に、抗体または抗原固定化粒子と混合するのが好ましい。その理由を以下に説明する。

一般に、粒子の凝集反応の感度とコロイドの安定性とは、トレードオフの関係にある。このため、例えば、粒子の粒径を小さくして凝集反応の感度を高めると、粒子のコロイド安定性が低下する。その結果、粒子の保管が難しくなり、試薬の保存安定性が低下する。このため、本実施形態に係る標的物質の検出方法において、上記水溶性高分子を、標的物質の検出の直前に粒子と混合することにより、粒子の凝集反応の感度およびコロイドの安定性の低下を小さくすることができる。

２．２．粒子の凝集の度合いを光学的に検出する工程
本実施形態に係る標的物質の検出方法において、上記水溶性高分子と、抗体または抗原固定化粒子と、標的物質を含む可能性のある検体とを混合する工程によって、上記水溶性高分子を、抗体または抗原固定化粒子および検体と接触させる。

本実施形態に係る標的物質の検出方法では、上記混合する工程により生じた前記粒子の凝集の度合いを光学的に検出する工程において、粒子の凝集反応が増幅され、標的物質の検出感度を高めることができる。

本発明でいう「粒子の凝集」とは、抗原または抗体との反応によって、抗体または抗原固相化粒子同士の反発力が弱められ、該粒子同士が結合することを意味する。

該粒子同士の結合は多点的であり、初期段階では、２つの抗体または抗原固相化粒子が結合し、反応の進行とともに複数の該粒子が結合し、最終的には多数の該粒子からなる粒子複合体が形成される。

２．３．検体
本実施形態に係る標的物質の検出方法においては、通常、検体（例えば、血清、血漿等の各種生物学的液体サンプル）は適当な濃度に希釈される。この場合、検体希釈液に水溶性高分子を添加することにより、水溶性高分子と検体とを混合することができる。

検体希釈液は、通常、ｐＨ緩衝剤、アルブミンやグロブリン等のタンパク質、アミノ酸、および／または界面活性剤等の成分を含有する水性溶液である。

２．４．抗体または抗原
抗原としては、例えば、レセプター、酵素、血中タンパク（例えばガン胎児性タンパク）、感染症関連抗原（例えばＢ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、梅毒病原体、ヒト免疫不全ウイルス、病原性大腸菌等の抗原）が挙げられ、抗体としては、これらの抗原に対する抗体が挙げられる。ここで、「抗体」というときは、特定の抗原に対する結合性を有する限りにおいて、各種の抗体のフラグメント等をも含む。

２．５．標的物質
本発明において、「標的物質」とは、通常、抗原、ウイルス、病原体、抗体、自己抗体など免疫反応を引き起こすおそれがあり、検出する対象となるものをいう。

２．６．抗体または抗原固定化粒子
抗体または抗原固定化粒子は、通常、平均粒子径が０．１〜１０μｍである水不溶性担体粒子に抗体または抗原を固定化したものをいう。抗体または抗原固定化粒子の平均粒子径が０．１μm未満である場合、粒子による光学シグナルの増感効果が小さい場合がある。一方、抗体または抗原固定化粒子の平均粒子径が１０μｍを超えると、粒径が測定波長に比べて大きすぎて、凝集による吸光度変化が小さくなり、検出感度が低下する場合がある。

抗体または抗原固定化粒子に使用する担体粒子としては、例えば、赤血球、炭素粉末、ベントナイト、カオリン、レシチンのミセル、ゼラチン粒子、合成ラテックス等が挙げられる。特に、粒径および粒径制御が厳密にできる点で、担体粒子としては、主成分がポリスチレンであるラテックス粒子が好適に使用される。

担体粒子としてラテックス粒子を使用する場合、必要に応じて、表面に化学修飾し、または官能基を導入し、抗体または抗原と化学結合させてもよい。

担体粒子の調製方法、ならびに、標的物質に対する抗原または抗体を担体粒子に担持させる方法は、当業者には周知である。

２．７．測定装置
本実施形態に係る標的物質の検出方法では、粒子の凝集の度合いを光学的に検出する工程において、公知の検査機を用いることができる。粒子凝集の度合いを自動的に追跡できる装置としては、例えば、散乱光強度、透過光強度、吸光度等を検出できる光学機器が挙げられる。

粒子の凝集の度合いを光学的に測定する方法としては、公知の方法を用いることができ、例えば、凝集の形成を濁度の増加としてとらえる比濁法、凝集の形成を粒度分布または平均粒径の変化としてとらえる方法、凝集の形成による前方散乱光の変化を、積分球を用いて測定し、透過光強度との比を比較する積分球濁度法等が挙げられる。上記の測定法においては、異なる時点で少なくとも２つの測定値を得、これらの時点間における測定値の増加分、すなわち、増加速度に基づき凝集の度合いを求める速度試験（レートアッセイ）、および、通常は反応の終点と考えられるある時点で１つの測定値を得、この測定値に基づき凝集の度合いを求める終点試験（エンドポイントアッセイ）を利用できるが、測定の簡便性、迅速性の点から、比濁法による速度試験が好ましい。

本実施形態に係る標的物質の検出方法を用いた免疫ラテックス凝集反応測定に適する臨床検査自動機としては、例えば、日立７０７０、７１５０、７１７０、ＬＰＩＡ−Ａ７００、Ｓ５００などの市販の自動分析機が挙げられる。

本実施形態に係る標的物質の検出方法によれば、上記水溶性高分子と、抗体または抗原固定化粒子と、検体とを接触させる工程、および上記混合する工程により生じた前記粒子の凝集の度合いを光学的に検出する工程を含むことにより、濁度または吸光度の計測において、低値領域の吸光度変化とバックグラウンドとの差が明瞭である。これにより、標的物質の検出感度を高めることができる。

３．実施例
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、本実施例において、％および部は、重量基準である。

なお、本実施例では、重量平均分子量（Ｍｗ）および数平均分子量（Ｍｎ）は，東ソー社製ＴＳＫｇｅｌ α−Ｍカラムを用い、流量１ミリリットル／分、溶出溶媒は０．１ｍＭ塩化ナトリウム水溶液／アクリロニトリル混合溶媒、カラム温度４０℃の分析条件で、単分散ポリエチレングリコールを標準とするゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定された。

３．１．実施例１（ポリアクリルアミドの合成）
アクリルアミド１００ｇ、ならびに、連鎖移動剤としてシステアミン塩酸塩２ｇを水９００ｇに混合して攪拌機付きセパラブルフラスコに入れた。これに窒素を吹き込みながら７０℃まで昇温し、開始剤として２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）ジハイドロクロライド１ｇを添加した後、２時間重合を続け、さらに８０℃に昇温して３時間エージングした後、室温まで冷却した。得られた水溶液を透析により精製し、６％ポリアクリルアミド水溶液を得た。得られたポリアクリルアミドのＧＰＣによる重量平均分子量（Ｍｗ）は４６，６００であり、Ｍｗ／Ｍｎは１．９であった。

３．２．実施例２（ジメチルアクリルアミド−メトキシエチルアクリレート共重合体の合成）
実施例１において、アクリルアミド１００ｇの代わりにジメチルアクリルアミド８０ｇおよびメトキシエチルアクリレート２０ｇを、システアミン塩酸塩２ｇの代わりにシステアミン塩酸塩４ｇを用いた以外は実施例１と同様にして、６％ジメチルアクリルアミド−メトキシエチルアクリレート共重合体水溶液を得た。この共重合体のＧＰＣによる重量平均分子量（Ｍｗ）は２３，６００であり、Ｍｗ／Ｍｎは２．４であった。

３．３．実施例３（ラテックス粒子への抗体の固定化）
免疫診断用ラテックス粒子（品番：コートＧ０３０５（平均粒子径：０．３１μｍ、表面ＣＯＯＨ基の含有量：０．２１ｍｍｏｌ／ｇ−ＬＴｘ、ＪＳＲ株式会社製））の１０％溶液１ｍｌ、１／１５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）１０ｍｌ、および生理食塩水１０ｍｌの混合液（以下ＰＢＳと記す）に、該粒子の濃度が１質量％になるように分散させた。

次に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（同仁化学、以降「ＷＳＣ」と略す）を、最終濃度が０．０５％となるように添加した。これらの粒子分散液に抗ＣＲＰ（Ｃ反応性蛋白）抗体（ウサギ）の１ｍｇ／ｍｌ液をそれぞれ等量加え、５６℃で３時間ゆっくり回転しながら、抗体（抗ＣＲＰ抗体）を該粒子の表面に固定化した。その後、それぞれの粒子分散液に１％牛血清アルブミン／０．０５％ＲａｐｉｇｅｓｔＳＦ０．５ｍｌを加え、室温で１０時間ゆっくり回転攪拌した。これらの操作後、粒子分散液を遠心管に移し替え、１０，０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離して、粒子を沈殿として回収し、未反応の抗体およびＷＳＣ等が含まれる上澄を除去した。続いて、ｐＨ７．４の５０ｍＭのトリス緩衝液に該粒子を再懸濁させ、超音波で１０分間分散させた。この操作を２回繰り返し、最終的に該粒子を超音波分散させ、０．８μｍディスクフィルターに通してから、１０ｍＭＰＢＳ緩衝液／０．０２％牛血清アルブミン／０．０１％ポリビニルピロリドン（分子量３６万）溶液を用いて粒子固形分が０．０５％となるように調製して、抗体（抗ＣＲＰ抗体）固定化ラテックス粒子の分散液を得た。

３．４．実施例４（ラテックス凝集反応用試薬の調製および性能評価）
上記実施例１および２で合成されたアクリルアミド（ＡＡＭ）およびジメチルアクリルアミド−メトキシエチルアクリレート共重合体（ＤＭＡＡ／ＭＥＡ）を増感剤として、蒸留水でそれぞれ表１に示す条件で試薬に添加した。また、調製されたラテックス凝集反応用試薬を用いて、表１の条件にて免疫ラテックス凝集測定法を実施した。

免疫ラテックス凝集測定においては、日立７０２０型自動分析装置を使用し、使用波長５７０ｎｍおよび測定温度３７℃にて、３μｌの検体（標的物質（ＣＲＰ抗原）の標準液）、１５０μｌの第１試薬（０．１％牛血清アルブミン／ＰＢＳ）、５０μｌの第２試薬（０．０５％ラテックス粒子の分散液）、および５０μｌの第３試薬（増感剤）を用いた。

また、本測定においては、検体（標的物質）、第１試薬、第２試薬、および第３試薬を混合攪拌した後、５０秒経過時の濁度と２００秒経過時の濁度との差（変化量）を計測するレートアッセイ法で評価を行った。ＣＲＰ抗原が各濃度である場合における吸光度変化の結果および増感剤の添加量を表１に示す。

３．５．実施例５（測定安定性評価）
実施例１および２で得られた重合体を用いたラテックス凝集反応用試薬の測定安定性を確認するため、下記表１の試験番号１、２、８，１０を２０回繰り返し測定した。抗原濃度が０．０２ｍｇ／ｄＬの場合に測定されたＣＶ（Coefficient of Variation）値はそれぞれ、８％、６％、１０％、７％であり、抗原濃度が１０ｍｇ／ｄＬの場合に測定されたＣＶ値はそれぞれ、５％，４％，７％，５％であった。

以上の結果から、実施例１および２で得られた重合体を用いたラテックス凝集反応用試薬を使用した場合、測定値の安定性が全く変化せず、むしろ若干改良されたことが理解できる。

３．６．実施例６（経時安定性評価）
実施例１および２で得られた重合体を用いたラテックス凝集反応用試薬の安定性を確認するために、表１の試験番号１、３、８、１２の試薬をそれぞれ４℃および３７℃で１年間保管した。各温度での保管品を同時に１０回測定した。その結果、保管条件の異なる試薬の測定値は、全て同一レベルにあった。これらの値も調製直後の数値と同じであり、各試験番号で得られた測定値を統計処理すると、抗原濃度０．１ｍｇ／ｄＬレベルでのＣＶ値はすべて９％以下であった。その結果、実施例１および２で得られた重合体を増感剤として用いたラテックス凝集反応用試薬の本来の測定精度の範疇にあったことから、実施例１および２で得られた重合体を用いたラテックス凝集反応用試薬では、経時的な性能低下を抑えることができたことが理解できる。

Claims

下記一般式（１）で表される繰り返し単位を有する水溶性高分子と、所定の標的物質に対する抗体または抗原が固定化された粒子と、検体とを混合する工程、および
前記混合する工程により生じた前記粒子の凝集の度合いを光学的に検出する工程
を含む、標的物質の検出方法。

・・・・・（１）
（式中、Ｒ^１およびＲ^２はそれぞれ独立に、水素原子、または、炭素数１〜８の置換または非置換のアルキル基を表す。）
請求項１において、
前記水溶性高分子は、下記一般式（２）で表される繰り返し単位をさらに有する、標的物質の検出方法。

・・・・・（２）
（式中、Ｒ^３は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ^４は炭素数１〜１２の置換または非置換のアルキル基、脂環式炭化水素基、または芳香族炭化水素基を表す。）
請求項１または２において、
前記水溶性高分子は、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、およびアクリルアミド系モノマーと（メタ）アクリレートモノマーとの共重合体から選ばれる少なくとも１種である、標的物質の検出方法。
下記一般式（１）で表される繰り返し単位を有する水溶性高分子を含有する、ラテックス凝集反応用試薬。

・・・・・（１）
（式中、Ｒ^１およびＲ^２はそれぞれ独立に、水素原子、または、炭素数１〜８の置換または非置換のアルキル基を表す。）
請求項４において、
前記水溶性高分子は、下記一般式（２）で表される繰り返し単位をさらに有する、ラテックス凝集反応用試薬。

・・・・・（２）
（式中、Ｒ^３は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ^４は炭素数１〜１２の置換または非置換のアルキル基、脂環式炭化水素基、または芳香族炭化水素基を表す。）
請求項４または５において、
前記水溶性高分子は、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、およびアクリルアミド系モノマーと（メタ）アクリレートモノマーとの共重合体から選ばれる少なくとも１種である、ラテックス凝集反応用試薬。