CN101918840A - 检测对象的检测方法和定量方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于提供：可快速、廉价且简便地检测、定量检测对象的检测、定量用试剂盒以及检测、定量方法。检测检验体中的检测对象50的试剂盒含有第1结合物10和第2结合物20，所述第1结合物10是含有刺激响应性聚合物11的第1物质与抗检测对象50的第1抗体13结合的结合物，所述第2结合物20是亲水性的第2物质21与抗检测对象50的第2抗体23结合的结合物。第1抗体13和第2抗体23可以在检测对象50的不同部位同时与检测对象结合。

Description

检测对象的检测方法和定量方法
技术领域
一直以来，作为检测被检体中的检测对象的方法，采用胶乳凝集法。所谓胶乳凝集法，是指在检测生物体样品等流体中的抗原时，通过将担载有与抗原特异性结合的抗体或其片段的胶乳和流体混合，测定胶乳的凝集程度，来检测或定量抗原的方法(例如参照专利文献1)。
根据该胶乳凝集法，作为检验体添加的抗原使多个胶乳结合抗体交联，促进胶乳的凝集。这样，由于程序简单，因此能够简便且快速地检测抗原。但是，当抗原为微量时，不易发生交联，因此胶乳不能充分凝集。因此，难以检测微量的抗原。在手动测定中，还存在测定结果偏差大等问题。
于是，人们还广泛采用ELISA法或CLEIA法这样的利用酶底物反应的方法。这些方法中，例如使与抗原特异性结合的一次抗体与抗原结合，并使具有酶的二次抗体与该一次抗体结合。其中，通过添加酶底物，测定酶催化反应的程度，来检测或定量抗原。
根据这些方法，例如使用发光试剂作为底物时，底物添加后的发光检测灵敏度高，因此也可以检测微量的抗原。
专利文献1：特公昭58-11575号公报
发明内容
发明所要解决的课题
但是，在利用酶底物反应的方法中，必须使用二次抗体、发光试剂、发光检测装置等特殊的试剂、仪器，作业成本高。
此外，如图8所示，该方法包括：培育试样和各试剂的步骤(ST110、ST130)、清洗系统的步骤(ST120)、测定发光的步骤(ST140)等多个阶段，操作繁杂。而且，各阶段所需的时间非常长，不适合大规模处理。
本发明鉴于上述情况而设，其课题在于：提供能够快速、廉价且简便地检测、定量检测对象的检测、定量用试剂盒、以及可以高精度地进行检测、定量的方法。
解决课题的方法
本发明人等发现：若使亲水性化合物接近，则会阻碍刺激响应性聚合物的凝集，从而完成了本发明。具体而言，本发明提供以下内容。
[1]试剂盒，该试剂盒用于检测和/或定量检测对象，其中含有第1结合物和第2结合物，
第1结合物：含有刺激响应性聚合物的第1物质与对上述检测对象亲和的第1亲和性物质结合的结合物；
第2结合物：亲水性的第2物质与对上述检测对象亲和的第2亲和性物质结合的结合物，
第1亲和性物质和第2亲和性物质可以在上述检测对象的不同部位同时与上述检测对象结合。
[2][1]所述的试剂盒，其中第1物质含有微粒状磁性物质。
[3][1]或[2]所述的试剂盒，其中第2物质为亲水性聚合物。
[4][1]～[3]中任一项所述的试剂盒，其中第2物质为多元醇。
[5][1]～[3]中任一项所述的试剂盒，其中第2物质为含有聚氧化亚烷基作为构成单元的聚合物。
[6]检测检验体中的检测对象的方法，该方法包括以下步骤：
将第1结合物、第2结合物和上述检验体混合，并将该混合物置于刺激响应性聚合物凝集的条件下，判定上述刺激响应性聚合物是否分散，所述第1结合物为含有刺激响应性聚合物的第1物质与对上述检测对象亲和的第1亲和性物质结合的结合物；所述第2结合物为亲水性的第2物质与对上述检测对象亲和的第2亲和性物质结合的结合物；
第1亲和性物质和第2亲和性物质可以在上述检测对象的不同部位同时与上述检测对象结合。
[7][6]所述的方法，其中第1物质含有微粒状磁性物质，
上述方法还包括：通过施加磁力来分离凝集的磁性物质的步骤。
[8]定量检验体中的检测对象的方法，该方法包括以下步骤：
将第1结合物、第2结合物和上述检验体混合，并将该混合物置于刺激响应性聚合物凝集的条件下，所述第1结合物为含有刺激响应性聚合物的第1物质与对上述检测对象亲和的第1亲和性物质结合的结合物；所述第2结合物为亲水性的第2物质与对上述检测对象亲和的第2亲和性物质结合的结合物；
测定上述混合物的浊度，根据上述检测对象的量与浊度在上述预定条件下的关系式，算出上述检验体中检测对象的量。
[9][8]所述的方法，其中，第1物质含有微粒状磁性物质，
上述方法还包括：通过施加磁力来分离凝集的磁性物质的步骤。
发明效果
根据本发明，若存在检测对象，则第1亲和性物质和第2亲和性物质与该检测对象结合，因此与第1亲和性物质结合的刺激响应性聚合物和与第2亲和性物质结合的第2物质接近。由此，由于亲水性部分配置在刺激响应性聚合物的附近，所以会阻碍对刺激作出响应的刺激响应性聚合物的凝集。因此，通过观察有无该凝集阻碍，即可检测是否存在检测对象。此外，通过测定凝集阻碍的程度，即可定量检测对象。
以上程序均无需特别使用特殊试剂、仪器即可进行，廉价且简便。此外，由于只测定凝集阻碍的程度，而不是利用被酶催化的反应的系统，所以可以快速进行。另外，第2物质所具有的亲水性部分高度阻碍刺激响应性聚合物的凝集，因此可以以高灵敏度检测、定量检测对象。
附图说明
图1是本发明一实施方式的方法中使用的结合物的概略构成图。
图2是显示上述实施方式所涉及的结合物的使用状态的模式图。
图3是显示在本发明一实施例的方法中磁力的施加方式的图。
图4是本发明一实施例的方法的流程图。
图5是显示在本发明一实施例的方法中测定时间与浊度的关系的图。
图6是显示在本发明另一实施例的方法中测定时间与浊度的关系的图。
图7是显示在图6的实施例的方法中检测对象的量与浊度的关系式的图。
图8是以往例的方法的流程图。
符号说明
10  第1结合物
11  刺激响应性聚合物
13  第1抗体(第1亲和性物质)
15  抗生物素蛋白
17  生物素
19  磁性物质
20  第2结合物
21  第2物质
23  第2抗体(第2亲和性物质)
50  检测对象
71  比色皿
73  永久磁石
具体实施方式
以下，参照附图对本发明一实施方式进行说明。
<试剂盒>
本发明的试剂盒是用于检测或定量检测对象的试剂盒，含有第1结合物和第2结合物。以下对各构成进行详细说明。
[第1结合物]
第1结合物是含有刺激响应性聚合物的第1物质与对检测对象亲和的第1亲和性物质结合的结合物。
(第1物质)
本发明所使用的第1物质是含有刺激响应性聚合物的物质，该刺激响应性聚合物是对外部刺激作出响应而发生结构变化，从而可以调整凝集和分散的聚合物。对刺激没有特别限定，可以是温度变化、光照射、酸或碱的添加(pH的变化)、电场变化等。
在本发明中，刺激响应性聚合物特别优选为根据温度变化能够凝集和分散的温度响应性聚合物。需要说明的是，作为温度响应性聚合物，可以是具有下限临界溶液温度(以下也称作LCST)的聚合物或具有上限临界溶液温度的聚合物(以下也称作UCST)。
作为本发明所使用的具有下限临界溶液温度的聚合物，可以列举：包含N-正丙基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N-乙基丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、N-丙烯酰基吡咯烷、N-丙烯酰基哌啶、N-丙烯酰基吗啉、N-正丙基甲基丙烯酰胺、N-异丙基甲基丙烯酰胺、N-乙基甲基丙烯酰胺、N，N-二甲基甲基丙烯酰胺、N-甲基丙烯酰基吡咯烷、N-甲基丙烯酰基哌啶、N-甲基丙烯酰基吗啉等N取代(甲基)丙烯酰胺衍生物的聚合物；羟丙基纤维素、聚乙烯醇部分乙酰化物、聚乙烯基甲基醚、(聚氧乙烯-聚氧丙烯)嵌段共聚物、聚氧乙烯月桂基胺等聚氧乙烯烷基胺衍生物；聚氧乙烯脱水山梨糖醇月桂酸酯等聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯衍生物；(聚氧乙烯壬基苯基醚)丙烯酸酯、(聚氧乙烯辛基苯基醚)甲基丙烯酸酯等(聚氧乙烯烷基苯基醚)(甲基)丙烯酸酯类；以及(聚氧乙烯月桂基醚)丙烯酸酯、(聚氧乙烯油烯基醚)甲基丙烯酸酯等(聚氧乙烯烷基醚)(甲基)丙烯酸酯类等聚氧乙烯(甲基)丙烯酸酯衍生物等。并且，还可以利用包含这些聚合物和它们中的至少2种单体的共聚物。此外，还可以使用N-异丙基丙烯酰胺与N-叔丁基丙烯酰胺的共聚物。使用含有(甲基)丙烯酰胺衍生物的聚合物时，可以在该聚合物中以具有下限临界溶液温度的范围共聚其他可共聚的单体。在本发明中，其中可以优选使用包含选自N-正丙基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N-乙基丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、N-丙烯酰基吡咯烷、N-丙烯酰基哌啶、N-丙烯酰基吗啉、N-正丙基甲基丙烯酰胺、N-异丙基甲基丙烯酰胺、N-乙基甲基丙烯酰胺、N，N-二甲基甲基丙烯酰胺、N-甲基丙烯酰基吡咯烷、N-甲基丙烯酰基哌啶、N-甲基丙烯酰基吗啉的至少1种单体的聚合物或N-异丙基丙烯酰胺与N-叔丁基丙烯酰胺的共聚物。
作为本发明所使用的具有上限临界溶液温度的聚合物，可以使用包含选自丙烯酰基甘氨酰胺、丙烯酰基哌啶甲酰胺、丙烯酰基天冬酰胺(アクリロイルアスパラギンアミド)和丙烯酰基谷氨酰胺等的至少1种单体的聚合物。另外，可以是包含它们中的至少2种单体的共聚物。这些聚合物中，可以以具有上限临界溶液温度的范围共聚丙烯酰胺、乙酰基丙烯酰胺、生物素醇丙烯酸酯(biotinol acrylate)、N-生物素基-N’-甲基丙烯酰基三亚甲基酰胺、丙烯酰基肌氨酰胺、甲基丙烯基肌氨酰胺、丙烯酰基甲基尿嘧啶等、其他可共聚的单体。
另外，在本发明中，作为刺激响应性聚合物，可以使用根据pH变化能够凝集和分散的pH响应性聚合物。对pH响应性聚合物发生结构变化的pH没有特别限定，但从给予刺激时可以抑制由第1结合物、第2结合物和检验体的变性等引起的检测、定量精度的降低的角度考虑，优选pH4～10，进一步优选为pH5～9。
作为这样的pH响应性聚合物，可以例示：含有羧基、磷酸、磺酰基、氨基等基团作为官能团的聚合物。更具体而言，可以是(甲基)丙烯酸、马来酸、苯乙烯磺酸、2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸、(甲基)丙烯酸磷酰基乙酯、甲基丙烯酸氨基乙酯、氨基丙基(甲基)丙烯酰胺、二甲基氨基丙基(甲基)丙烯酰胺等具有解离基团的单体聚合的聚合物，还可以是这些具有解离基团的单体以不损及pH响应能力的程度与其他乙烯基单体、例如(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丁酯等(甲基)丙烯酸酯类、乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯等乙烯基酯类、苯乙烯、氯乙烯、N-乙烯吡咯烷酮等乙烯基化合物、(甲基)丙烯酰胺类等共聚的共聚物。
(微粒状磁性物质)
在此使用的微粒状磁性物质可以由多元醇和磁铁矿构成。该多元醇只要是构成单元中具有至少2个羟基且可与铁离子结合的醇结构体即可，没有特别限定，例如有葡聚糖、聚乙烯醇、甘露醇、山梨醇、环糊精。例如，在日本特开2005-82538公报中公开了使用葡聚糖的微粒状磁性物质的制造方法。此外，还可以使用如甲基丙烯酸缩水甘油酯聚合物那样具有环氧基、且开环后形成多元醇结构体的化合物。使用这样的多元醇制备的微粒状磁性物质(磁性微粒)，优选其平均粒径为0.9nm以上且不足1000nm，以具有良好的分散性。为了提高目标检测对象的检测灵敏度，平均粒径特别优选为2.9nm以上且不足200nm。
[第2结合物]
第2结合物是亲水性的第2物质与对检测对象亲和的第2亲和性物质结合的结合物。
(第2物质)
亲水性的第2物质例如为水溶性聚合物，可以列举：聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化乙烯、聚氧化丙烯等含有聚氧化亚烷基作为构成单元的聚合物；聚乙烯醇等含醇性羟基的聚合物；葡聚糖、环糊精、琼脂糖、羟丙基纤维素等水溶性多糖类等多元醇。这些亲水性物质在聚合物链中或末端可以具有用于结合第2亲和性物质的官能团等。
(第1亲和性物质、第2亲和性物质)
第1结合物的第1亲和性物质和第2结合物的第2亲和性物质在检测对象的不同部位可以同时与检测对象结合。第1亲和性物质和第2亲和性物质例如可以是识别检测对象的不同抗原决定簇的单克隆抗体。
在此使用的抗体可以是任意类型的免疫球蛋白分子，也可以是Fab等具有抗原结合位点的免疫球蛋白分子片段。此外，抗体可以是单克隆抗体也可以是多克隆抗体，优选为具有不同的抗原识别位点的2种单克隆抗体。
[制作方法]
对上述试剂盒的制作方法进行说明。
[第1结合物的制作]
第1结合物通过将第1物质和第1亲和性物质结合来制作。对该结合方法没有特别限定，例如在第1物质侧(例如刺激响应性聚合物部分)和第1亲和性物质(例如第1抗体)侧这两侧结合相互具有亲和性的物质(例如抗生物素蛋白和生物素、谷胱甘肽和谷胱甘肽S转移酶)，经由这些物质使第1物质和第1亲和性物质结合。
具体而言，如国际公开WO01/09141号小册子所述，生物素与刺激响应性聚合物的结合，可以通过使生物素等与甲基丙烯基或丙烯基等聚合性官能团结合形成加成聚合性单体，再与其他单体共聚来进行。另外，抗生物素蛋白等与第1亲和性物质的结合可以按照常规方法来进行。接下来，将生物素结合刺激响应性聚合物和抗生物素蛋白结合第1亲和性物质混合，则经由抗生物素蛋白与生物素的结合，第1亲和性物质和刺激响应性聚合物结合。
作为另外的方法，可以采用在聚合物聚合时使具有羧基、氨基或环氧基等官能团的单体与其他单体共聚，经由该官能团，按照本技术领域周知的方法使抗体亲和性物质(例如Melongel(メロンゲル)、蛋白A、蛋白G)与聚合物结合的方法。通过使第1抗体与如此操作得到的抗体亲和性物质结合，制作刺激响应性聚合物与抗检测对象抗原的第1抗体的第1结合物。
或者，可以在聚合物聚合时使具有羧基、氨基或环氧基等官能团的单体与其他单体共聚，按照常规方法使抗检测对象抗原的第1抗体与这些官能团直接结合。
或者，可以使第1亲和性物质和刺激响应性聚合物与微粒状磁性物质结合。
也可以将第1物质置于刺激响应性聚合物凝集的条件下，之后通过离心进行分离，从而纯化第1结合物。第1结合物的纯化还可以通过以下方法来进行：使微粒状磁性物质与刺激响应性聚合物结合，再使其与第1亲和性物质结合，之后施加磁力来回收磁性物质。
微粒状磁性物质与刺激响应性聚合物的结合，可以通过经由反应性官能团进行结合的方法、或向磁性物质中的多元醇上的活性氢或多元醇中导入聚合性不饱和键进行接枝聚合的方法等本技术领域周知的方法来进行(例如参照ADV.Polym.Sci.、第4卷、第111页、1965和J.Polymer Sci.、Part-A、3、第1031页、1965)。
接下来，对使亲水性的第2物质与抗检测对象抗原的第2抗体结合来制作第2结合物的方法进行阐述。
[第2结合物的制作]
第2结合物通过使第2物质与第2亲和性物质直接或间接结合来制作。没有特别限定，例如在第2物质侧和第2亲和性物质(例如第2抗体)侧这两侧结合相互具有亲和性的物质(例如抗生物素蛋白和生物素、谷胱甘肽和谷胱甘肽S转移酶)，经由这些物质使第2物质和第2亲和性物质间接结合。
使第2物质和第2亲和性物质直接结合时，可以经由官能团使之结合，例如在使用官能团时，可以按照Ghosh等人的方法(Ghosh等人.：Bioconjugate Chem.、1、71-76、1990)的马来酰亚胺-硫醇偶联进行结合。
如此操作制造的试剂盒，例如可以通过以下方法用于检测或定量检测对象。
<检测方法>
本发明的检测方法包括以下步骤：首先，将第1结合物、第2结合物和检验体混合，并将该混合物置于刺激响应性聚合物凝集的条件下，判定刺激响应性聚合物是否分散。程序的细节说明如下。
(混合、凝集)
首先，将第1结合物和第2结合物在容器内混合，再添加检验体，得到混合物。接着，将该混合物置于刺激响应性聚合物凝集的条件下。这样，当存在检测对象时，刺激响应性聚合物被第2结合物中的亲水性部分阻碍凝集而分散。另一方面，当不存在检测对象时，刺激响应性聚合物的凝集没有被阻碍而发生凝集。
参照图1～图2来说明该现象。
如图1所示，第1结合物10含有刺激响应性聚合物11，该刺激响应性聚合物11经由抗生物素蛋白15和生物素17与抗检测对象50的第1抗体13结合。另外，第1结合物10含有微粒状磁性物质19，在该磁性物质19的表面结合有刺激响应性聚合物11。另一方面，第2结合物20含有亲水性的第2物质21，该第2物质21与抗检测对象50的第2抗体23结合。而且，第1抗体13和第2抗体23可以在检测对象50的不同部位同时与检测对象50结合。
如图2所示，若将第1结合物10、第2结合物20和检验体的混合物置于预定条件下，则当存在检测对象50时，刺激响应性聚合物11被第2结合物20中的亲水性部分阻碍凝集而分散(图2(A))。另一方面，当不存在检测对象50时，刺激响应性聚合物11的凝集没有被阻碍而发生凝集(图2(B))。
为了使刺激响应性聚合物11凝集，例如在使用温度响应性聚合物时，将装有混合液的容器移入温度响应性聚合物凝集的温度的恒温槽内即可。温度响应性聚合物中存在具有上限临界溶液温度(以下有时简称为“UCST”)的聚合物和具有下限临界溶液温度(以下有时简称为“LCST”)的聚合物这两种。例如，使用具有LCST为37℃的下限临界溶液温度的聚合物时，通过将装有混合液的容器移入37℃以上的恒温槽内，可以使温度响应性聚合物凝集。当使用具有UCST为5℃的上限临界溶液温度的聚合物时，通过将装有混合液的容器移入低于5℃的恒温槽内，可以使温度响应性聚合物凝集。
使用pH响应性聚合物时，向装有混合液的容器中加入酸溶液或碱溶液即可。具体而言，向装有处于pH响应性聚合物发生结构变化的pH范围外的分散混合液的容器中加入酸溶液或碱溶液，使容器内变为pH响应性聚合物发生结构变化的pH范围即可。例如，使用在pH5以下凝集、超过pH5则分散的pH响应性聚合物时，向装有超过pH5则分散的混合液的容器中加入酸溶液使pH达到5以下即可。此外，使用在pH10以上凝集、不足pH10则分散的pH响应性聚合物时，向装有低于pH10则分散的混合液的容器中加入碱溶液使pH达到10以上即可。对pH响应性聚合物发生结构变化的pH没有特别限定，但优选pH4～10，进一步优选为pH5～9。
使用光响应性聚合物时，对装有混合液的容器照射能够凝集聚合物的波长的光即可。用于使聚合物凝集的优选的光根据光响应性聚合物所含的光响应性官能团的种类和结构而不同，但通常可以优选使用波长为190～800nm的紫外光或可见光。此时，光强度优选0.1～1000mW/cm2。需要说明的是，从可以提高测定精度的角度考虑，光响应性聚合物优选为照射用于测定浊度的光时不易发生分散、换言之发生凝集的光响应性聚合物。作为光响应性聚合物，当使用照射用于测定浊度的光时发生分散的光响应性聚合物时，通过缩短照射时间，可以提高测定精度。
需要说明的是，温度响应性聚合物的凝集可以在第1结合物和第2结合物与检测对象结合后进行，也可以同时并列进行，但从可以缩短处理时间的角度考虑，优选后者。但是，当温度响应性聚合物凝集的条件、与第1结合物和第2结合物与检测对象结合的条件差别甚大时，优选前者。
其中，下限临界溶液温度如下确定。首先，将试样装入吸光光度计的比色皿中，以1℃/分钟的速度将试样升温。其间，记录550nm处的透过率变化。其中，将聚合物溶解至透明时的透过率作为100％、将完全凝集时的透过率作为0％时，求出透过率达到50％时的温度，作为LCST。
另外，上限临界溶液温度的情形如下确定。以1℃/分钟的速度将试样冷却，同样记录550nm处的透过率变化。其中，将聚合物溶解至透明时的透过率作为100％、将完全凝集时的透过率作为0％时，求出透过率达到50％时的温度，作为UCST。
(判定)
判定是否分散例如可以通过目视或浊度测定来进行。浊度可以由光散射装置测得的光透过率算出，若浊度低，则刺激响应性聚合物的凝集被阻碍，暗示检测物质的存在。其中，使用的光的波长可以根据磁性物质的粒径等适当设定，以得到所期望的检测灵敏度。从可以利用以往通用的装置的角度考虑，光的波长优选为可见光范围内(例如550nm)。
目视或浊度测定可以在一定时刻断续地进行，也可以随时间连续进行。还可以根据某时刻的浊度测定值与其他时刻的浊度测定值之差进行判定。
<定量方法>
根据本发明的定量方法，首先，将第1结合物、第2结合物和检验体混合，并将该混合物置于刺激响应性聚合物凝集的预定条件下，接下来测定混合物的浊度，根据检测对象的量与浊度在预定条件下的关系式，算出检验体中检测对象的量。前半部分的程序与前述的检测方法类似，因此省略说明。
(关系式)
制作与上述预定条件相同条件下的、检测对象的量与浊度的关系式。构成该关系式的检测对象的量与浊度的测定，其数据越多则得到可靠性越高的关系式。因此，数据只要涉及2个以上检测对象的量即可，优选涉及3个以上检测对象的量。
其中，检测对象的量与浊度的关系式，不仅是显示检测对象的量与浊度的直接相关的关系式，而且还可以是检测对象的量与反映浊度的参数之间的关系式。
(计算)
将混合物的浊度测定值代入制作好的关系式中，由此可以算出检验体中检测对象的量。
(分离)
第1物质含有微粒状磁性物质时，本发明的检测方法或定量方法优选进一步包括：通过施加磁力来分离凝集的磁性物质的步骤。由此，凝集的磁性物质从含有非凝集状态的磁性物质的夹杂物中分离出来。因此，分离的磁性物质的量、分散于溶剂时的光透过率等测定值排除了夹杂物的影响，更忠实地反映了检测物质的存在。
磁力的施加可以通过使磁石接近磁性物质来进行。该磁石的磁力根据使用的磁性物质所具有的磁力大小而不同。作为磁石，例如有MAGNA社制钕(ネオジ)磁石。
此外，磁力的施加可以在判定前或与判定同时并列进行，从可以缩短步骤所耗费的时间的角度考虑，优选同时并列进行。需要说明的是，若施加磁力，则凝集的磁性物质以卷入夹杂物的形式被分离，因此推测分离后的混合物的浊度在夹杂物存在时反而变小。
需要说明的是，检测方法或定量方法中的“浊度测定”，不仅包括直接测定浊度，还包括测定反映浊度的参数。作为所述参数，可以列举：在多个时刻的浊度测定值的差异、所分离的凝集物量、分离后的非凝集物的浊度等。其中，多个时刻中的1点，例如在对不存在检测对象的阴性对照施加磁力时，优选为浊度达到最大值的时刻附近。由此，与在其他时刻的浊度测定值的差异变大，可以更正确地定量检测对象的量。
(检测对象)
作为检验体中的检测对象，可以列举用于临床诊断的物质，具体可以列举：体液、尿、咳痰、粪便中等所含的人免疫球蛋白G、人免疫球蛋白M、人免疫球蛋白A、人免疫球蛋白E、人白蛋白、人纤维蛋白原(纤维蛋白及其分解产物)、α-甲胎蛋白(AFP)、C反应性蛋白(CRP)、肌红蛋白、癌胎儿性抗原、肝炎病毒抗原、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、人胎盘性催乳素(HPL)、HIV病毒抗原、变态反应原、细菌毒素、细菌抗原、酶、激素(例如人甲状腺刺激激素(TSH)、胰岛素等)、药物等。
[试剂盒的构成及其使用方法的例子]
以下，针对检测对象为抗原的情形，说明用于利用本发明的方法的试剂盒的构成及其使用方法的例子。
试药试剂盒例如由下述试剂构成。
抗原检测用试药试剂盒：
试剂A：与检测对象抗原特异性结合的第1抗体和温度响应性聚合物所结合的微粒状磁性物质
试剂B：识别不同于第1抗体的部位、且能够同时与检测对象抗原结合的第2抗体所结合的亲水性物质
试剂C：被测物质的标准品(具体例子有纯化抗原)
试剂D：稀释用缓冲液(用于稀释上述试剂、并可用于稀释被测试样的缓冲液，可以列举Tris盐酸缓冲液、磷酸缓冲液等)
作为测定浊度的装置，可以使用能够将容器内保温在聚合物凝集的温度、能够照射200nm～900nm的透过光的以往周知的装置。
包含上述试剂的试剂盒，例如可以按以下方法使用。
首先，将5～1000征试剂A和5～1000μL试剂B混合。准备在装有试剂A和试剂B的溶液中：(1)添加被测物质的标准品的阳性对照、(2)不添加任何物质的阴性对照、(3)添加5～1000μL被检液的样品，使之在聚合物分散的温度(例如约0～30℃)下反应一定时间。使用温度响应性聚合物时，反应后将反应液加入保温在该聚合物的凝集温度(例如42℃)的容器中，照射550nm的透过光，测定浊度，进行是否存在抗原的判定或抗原的定量。
作为与上述不同的使用方法，可以使试剂A与上述(1)、(2)和(3)在聚合物分散的温度下反应一定时间后添加试剂B、或者使试剂B与上述(1)、(2)和(3)反应后在聚合物分散的温度下添加试剂A，反应一定时间后，向保温在凝集温度的容器中加入反应液，照射550nm的透过光，测定浊度，进行是否存在抗原的判定或抗原的定量。
[实施例]
本发明的实施例中使用的代表性的试剂如下。
PBS缓冲液：用纯净水将10倍浓度的市售PBS(8.1mM Na2HPO4、1.5mM KH2PO4、2.7mM KCl、137mM NaCl、pH7.4、ニツポンジ一ン(株)制)稀释至1/10(V/V)后使用。
硼酸缓冲液ポリサイエンス社制硼酸盐缓冲液、100mM硼酸、pH8.5。
纯净水：经MILLIPORE社制“Direct-Q”(商品名)纯化的水。
<实施例1>
本实施例中，使用生物素结合-温度响应性聚合物表面修饰磁性颗粒作为第1结合物，使用生物素结合聚乙烯醇作为第2结合物，给出检测、定量链霉抗生物素蛋白的例子。
(第1结合物的制备)
作为生物素结合-温度响应性聚合物表面修饰磁性颗粒，使用Magnabeat(社)制的Therma-Max LB生物素(0.4％(质量))。取500μLTherma-Max LB生物素到1.5mL微管中，将该微管加热至42℃，使Therma-Max LB生物素凝集，用磁石回收后除去上清。向除去后的微管中加入500μL含有0.5％(w/v)BSA(シグマ社制)、0.5％(w/v)Tween(注册商标)20、10mM EDTA的PBS缓冲液(pH7.4)，通过冷却使之分散，制成第1结合物的分散溶液。
(第2结合物的制备)
[制造例1]生物素结合聚乙烯醇的制备方法
将1mL 1％(w/v)聚乙烯醇(クラレ社制、M205、单侧末端含有巯基)水溶液和10μL 1％(w/v)生物素-PEAC5-马来酰亚胺(同仁化学研究所社制)水溶液混合，在37℃下静置1小时。使用2根旋转柱(MILLIPORE社制、Microcon YM-10)纯化该反应液，用纯净水调节总量为1mL。将其中的100μl与900μl含有0.5％(w/v)BSA(シグマ社制)、0.5％(w/v)Tween(注册商标)20、10mM EDTA的PBS缓冲液(pH7.4)混合，由此制成第2结合物的分散溶液。
(使用生物素结合-温度响应性聚合物表面修饰磁性颗粒和生物素结合聚乙烯醇的链霉抗生物素蛋白的定量)
[试样的制备]
用纯净水溶解链霉抗生物素蛋白(和光纯药工业社制)使达到10mg/mL。将该溶液用含有0.5％(w/v)BSA(シグマ社制)、0.5％(w/v)Tween(注册商标)20、10mM EDTA的PBS缓冲液(pH7.4)分别稀释成13.3μg/mL、6.7μg/mL和0μg/mL，作为试样。
[定量]
如图3所示，在通用的分光光度计用SEMIMICROCELL 71的光路外安装尺寸为5mm×9mm×2mm的钕(ネオジム)永久磁石73(西兴产业社制)。将该比色皿71设置在设有比色皿温度控制仪的紫外可见分光光度计V-660DS(日本分光社制)内，在37℃下保持10分钟以上。
图4是显示实施例的定量方法的程序的流程图。定量方法包括：将上述第1结合物、第2结合物和试样混合的步骤(ST10)；以及测定混合物浊度的步骤(ST20)。
(混合)
将150μL第1结合物的分散溶液、120μL第2结合物的分散溶液和750μL各试样注入微管内，用移液法(ピペツテイング)混合，之后用涡旋混合器搅拌5分钟。
(浊度的测定)
将该搅拌液分别注入比色皿71内，按照附带的使用说明书对分光光度计进行零校正，使用波长420nm的光，直接以谱带(band)宽2.0nm连续测定1000秒。其结果见图5。
如图5所示，直至测定开始约260秒后，链霉抗生物素蛋白的量越多，则浊度越低。这是由于温度响应性聚合物经由链霉抗生物素蛋白而靠近亲水性聚乙烯醇，受到凝集阻碍而分散的缘故。另一方面，自测定开始约260秒后附近起，链霉抗生物素蛋白的量与浊度的关系开始逆转，随着时间的流逝浊度比初期值还低。推测这是由于凝集的磁性物质被吸附在磁石上而分离的缘故。
接下来，显示各试样在测定开始260秒后和1000秒后这2点的测定值的差异。其结果见表1。
[表1]
  链霉抗生物素蛋白浓度(μg/mL)   Δ260-1000
  13.3   1.32
  6.7   1.43
  0   1.47
如表1所示，测定开始260秒后和1000秒后这2点间的测定值之差依赖于链霉抗生物素蛋白的量。即，随着链霉抗生物素蛋白浓度的增加，测定开始260秒后和1000秒后这2点间的测定值之差变小。由此可知：通过测定测定开始260秒后和1000秒后这2点间的测定值之差，可以检测或定量检测物质。
并且，与包括培育时间在内耗时约90分钟的现有技术(参照图8)相比，1000秒以内的检测时间格外短。此外，对实际检验体只需进行ST10和ST20的操作(参照图4)，即可检测或定量检测物质，故程序简便。
以上结果表明：浊度根据链霉抗生物素蛋白的浓度而变化，换言之，通过测定浊度，即可定量链霉抗生物素蛋白的浓度。即，本发明的方法被确认是无需使用二次抗体、发光试剂、发光检测装置等特殊的试剂、仪器，即可快速、廉价且简便地检测、定量检测对象的新方法。
<实施例2>
本实施例中，使用具有保护巯基的温度响应性聚合物表面修饰磁性颗粒(以后也称作TM-LPDP)作为第1结合物，使用结合有N-羟基琥珀酰亚胺的聚乙二醇(以后也称作NHS-PEG)“SUN BRIGHTME-400CS”(日油社制、重均分子量为40000)作为第2结合物，给出检测、定量谷胱甘肽(GSH)的例子。
(第1结合物的制备)
作为氨基结合-温度响应性聚合物表面修饰磁性颗粒，使用0.4％(质量)Magnabeat(社)制的Therma-Max LAm Amine(以后称作TM-LAm)。取2mL TM-LAm到2mL微管中，将该微管加热至42℃，从而使TM-LAm凝集，用磁石回收后除去上清。向除去后的微管中加入2mL硼酸缓冲液以置换溶剂，使TM-LAm充分分散，由此得到含磁性微粒的硼酸缓冲液。
接着，将2mg N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(同仁化学研究所社制、SPDP)溶于100μL二甲基亚砜中，将所得溶液与上述含磁性微粒的硼酸缓冲液混合，在20℃下搅拌一夜。将搅拌的溶液加热至42℃，用磁石回收凝集体，之后除去上清。之后，向凝集体中加入2mL PBS缓冲液，使其充分分散。上述清洗进行2次，除去未反应的SPDP。将分散液再次加热至42℃，用磁石回收凝集体，并除去上清，之后将含保护巯基的温度响应性聚合物表面修饰磁性颗粒分散于PBS缓冲液中，由此制成第1结合物(颗粒含量为0.3％(质量))。
(使用含保护巯基的温度响应性聚合物表面修饰磁性颗粒和N-羟基琥珀酰亚胺结合聚乙二醇的谷胱甘肽的定量)
[试样的制备]
制作以下试样：将还原型谷胱甘肽(和光纯药工业社制)溶于1mL含10mM EDTA的PBS缓冲液中，用含有10mM EDTA的PBS缓冲液分别稀释成12μg/mL、6μg/mL和3μg/mL；以及制备不含谷胱甘肽的试样。
[定量]
(混合)
取500μL上述第1结合物的PBS缓冲液分散液到1.5mL管中，添加10μL 0.5M的EDTA溶液(pH8、ニツポンジ一ン社制)并混合，由此制成溶液。向该溶液中加入200μL上述试样，在4℃下搅拌6小时。之后，向管中加入700μL(200μM)NHS-PEG，在4℃下搅拌12小时。向400μL该搅拌物中加入800μL PBS，得到混合物。
(关系式的制作)
将该混合物分别注入实施例1中使用的比色皿71内，按照与实施例1相同的条件测定浊度。其结果见图6。
如图6所示，测定开始约50秒后起各试样的浊度的差异已经变大。由此可知：可以非常快速地进行检验体中检测对象的检测和定量。另外，各试样的浊度之差在测定开始约450秒后达到最大值，由此确认：优选选择自测定开始时起450秒后作为测定时间点。
将上述第1结合物、第2结合物和试样保存在4℃的暗室内，1日1次连续3天按照相同程序进行浊度测定。其结果见表2。需要说明的是，表2中的数值是指从测定开始时的各试样的浊度中扣除自测定开始时起450秒后各试样的浊度而得到的值(Δ0-450)的平均值。
[表2]
Figure BPA00001174751700191
Figure BPA00001174751700201
如表2所示，在3天中的任一时点间，CV(变动系数)均为3.3以下的低值。由此确认：只要是本实施例的系统即可获得高重现性。其中，CV(％)根据算式CV＝标准偏差(STDEVA)/平均值×100来计算。
此外，显示从0μg/ml谷胱甘肽测定开始时的各试样的浊度中扣除测定开始时起450秒后各试样的浊度而得到的值(GSH 0μg/ml、Δ0-450)的平均值、以及从各试样测定开始时的浊度中扣除测定开始时起450秒后各试样的浊度而得到的值(GSH 3μg/ml、6μg/ml、12μg/ml、Δ0-450)的平均值与谷胱甘肽的量的关系式的图见图7。
如图7所示，求得的关系式为：y＝0.0937x-0.0133(式中，x为谷胱甘肽的量、y为浊度)。另外，可知：相关系数R2高达0.97，通过使用该关系式，可以高精度地定量谷胱甘肽量。由此可知：如本实施例所示，通过使用如聚乙二醇那样通过接近颗粒表面而显示出立体排斥、且不易与机体成分发生非特异性吸附的聚氧化亚烷基作为第2物质，可以以极高的精度定量检验体中的检测对象的量。关于多元醇，也可考虑同样的作用。
本发明并不限于上述实施方式，可达到本发明目的的范围内的变形、改良等也包含在本发明中。另外，在本发明中虽然必须使用刺激响应性聚合物，但并不限于聚合物，也可使用刺激响应性的低分子。作为所述的低分子，例如有专利第3693979号公报、专利第3916330号公报、日本特开2002-85957号公报、专利第4071738号公报、专利第2869684号公报、专利第2927601号公报、专利第3845249号公报、日本特开2006-242597号公报等中公开的低分子。

Claims (9)

1.试剂盒，该试剂盒用于检测和/或定量检测对象，其中含有第1结合物和第2结合物，
第1结合物：含有刺激响应性聚合物的第1物质与对上述检测对象亲和的第1亲和性物质结合的结合物；
第2结合物：亲水性的第2物质与对上述检测对象亲和的第2亲和性物质结合的结合物，
第1亲和性物质和第2亲和性物质可以在上述检测对象的不同部位同时与上述检测对象结合。
2.权利要求1所述的试剂盒，其中第1物质含有微粒状磁性物质。
3.权利要求1或2所述的试剂盒，其中第2物质为亲水性聚合物。
4.权利要求1～3中任一项所述的试剂盒，其中第2物质为多元醇。
5.权利要求1～3中任一项所述的试剂盒，其中第2物质为含有聚氧化亚烷基作为构成单元的聚合物。
6.检测检验体中的检测对象的方法，该方法包括以下步骤：
将第1结合物、第2结合物和上述检验体混合，并将该混合物置于刺激响应性聚合物凝集的条件下，判定上述刺激响应性聚合物是否分散，所述第1结合物为含有刺激响应性聚合物的第1物质与对上述检测对象亲和的第1亲和性物质结合的结合物；所述第2结合物为亲水性的第2物质与对上述检测对象亲和的第2亲和性物质结合的结合物；
第1亲和性物质和第2亲和性物质可以在上述检测对象的不同部位同时与上述检测对象结合。
7.权利要求6所述的方法，其中第1物质含有微粒状磁性物质，
上述方法还包括：通过施加磁力来分离凝集的磁性物质。
8.定量检验体中的检测对象的方法，该方法包括以下步骤：
将第1结合物、第2结合物和上述检验体混合，并将该混合物置于刺激响应性聚合物凝集的条件下，所述第1结合物为含有刺激响应性聚合物的第1物质与对上述检测对象亲和的第1亲和性物质结合的结合物；所述第2结合物为亲水性的第2物质与对上述检测对象亲和的第2亲和性物质结合的结合物；
测定上述混合物的浊度，根据上述检测对象的量与浊度在上述预定条件下的关系式，算出上述检验体中检测对象的量。
9.权利要求8所述的方法，其中第1物质含有微粒状磁性物质，
上述方法还包括：通过施加磁力来分离凝集的磁性物质。
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7981688B2 (en) 2007-03-08 2011-07-19 University Of Washington Stimuli-responsive magnetic nanoparticles and related methods
US9063144B2 (en) * 2009-05-29 2015-06-23 Jnc Corporation Detection method and quantification method for target substance
US8426214B2 (en) 2009-06-12 2013-04-23 University Of Washington System and method for magnetically concentrating and detecting biomarkers
US20110117668A1 (en) * 2009-11-09 2011-05-19 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Self-powered smart diagnostic devices
US9080933B2 (en) 2009-11-09 2015-07-14 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Stimuli-responsive polymer diagnostic assay comprising magnetic nanoparticles and capture conjugates
WO2012099364A2 (en) * 2011-01-17 2012-07-26 Lg Electronics Inc. Kit for amplifying detected signal in immunosensor and method for detecting target antigen using the same
JP5720318B2 (ja) * 2011-03-09 2015-05-20 Jnc株式会社 検出対象の検出方法および定量方法
JP6282819B2 (ja) * 2013-08-12 2018-02-21 オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス株式会社 検出対象を検出又は定量するためのキット、及び方法
JP2016006405A (ja) * 2014-05-28 2016-01-14 オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス株式会社 検出対象の検出方法及び定量方法、キット、並びに試薬の調製方法

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5811575B2 (ja) 1976-08-16 1983-03-03 帝国臓器製薬株式会社 抗原−抗体反応の測定法
JP2927601B2 (ja) 1992-03-01 1999-07-28 科学技術振興事業団 クラウン環を有する刺激応答性コレステロール系化合物
JP2869684B2 (ja) 1992-03-01 1999-03-10 科学技術振興事業団 刺激応答性コレステロール系化合物
JP2000500733A (ja) * 1995-09-01 2000-01-25 ユニバーシティ オブ ワシントン 相互作用分子結合体
JP3916330B2 (ja) 1998-03-13 2007-05-16 独立行政法人科学技術振興機構 糖ベンジリデン誘導体から成るゲル化剤
EP1201667B1 (en) 1999-07-29 2005-09-21 National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Polymerizable biotin derivatives, biotin polymer, and polymer responsive to avidin stimulation
JP3845249B2 (ja) 2000-06-01 2006-11-15 独立行政法人科学技術振興機構 金属ポルフィリン−コレステロール誘導体から成るゲル化剤
US6676904B1 (en) * 2000-07-12 2004-01-13 Us Gov Sec Navy Nanoporous membrane immunosensor
WO2002016571A1 (fr) 2000-08-21 2002-02-28 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Particules magnetiques ayant une temperature de solution critique de limite inferieure
JP4536235B2 (ja) 2000-09-18 2010-09-01 本田技研工業株式会社 ハイドロゲル
JP3693979B2 (ja) 2002-05-13 2005-09-14 独立行政法人科学技術振興機構 グリコシドアミノ酸誘導体から成るヒドロゲル化剤およびヒドロゲル
WO2005019429A2 (en) * 2003-08-22 2005-03-03 Potentia Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhancing phagocytosis or phagocyte activity
JP4518767B2 (ja) 2003-09-09 2010-08-04 チッソ株式会社 刺激応答性ポリマー固定化磁性微粒子及びこれを用いた吸着材
KR100540509B1 (ko) 2004-01-07 2006-01-11 학교법인 포항공과대학교 수화젤레이터로 사용되는 2'-데옥시우리딘 유도체
JP2006242597A (ja) 2005-02-28 2006-09-14 Fuji Photo Film Co Ltd 磁性体ナノ粒子の凝集・分散制御方法、磁性体ナノ粒子の捕集方法及び磁性体ナノ粒子含有液の処理方法
JP2007071832A (ja) * 2005-09-09 2007-03-22 Shiseido Co Ltd 修飾金粒子
JP5234887B2 (ja) 2006-01-13 2013-07-10 独立行政法人科学技術振興機構 核酸応答性ゲルおよびその製造方法ならびにその利用
JP5276980B2 (ja) 2006-06-30 2013-08-28 Ｊｎｃ株式会社 検出対象の検出、定量用キット、及び検出、定量方法
WO2008084571A1 (ja) 2007-01-12 2008-07-17 Japan Science And Technology Agency 核酸応答性ゲルおよびその製造方法ならびにその利用

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