CN107942051A - 一种d‑二聚体检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

一种d‑二聚体检测试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于体外诊断试剂盒领域，具体涉及一种D‑二聚体检测试剂盒及其使用方法，所述D‑二聚体检测试剂盒包括：校准品、试剂R1、酶结合物工作液R2、磁珠结合物工作液M、清洗液及化学发光底物，所述试剂R1含有咪唑成分，其可以快速消除全血中的血细胞，有效避免血细胞吞进磁珠的可能。本发明的试剂盒可直接使用手指末梢全血或抗凝静脉全血作为待检样品，无需预先对全血样本进行预处理，就可直接进行检测，大大提高了检测速度，简化了操作步骤，扩大了试剂盒的适用范围，便于大范围推广应用。

Description

一种D-二聚体检测试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明属于体外诊断试剂盒领域，具体涉及一种D-二聚体检测试剂盒及其使用方法。
背景技术
纤维蛋白溶解系统是人体最重要的抗凝系统，它对保持血管壁的正常通透性及维持血液的流动状态和组织修复起着重要作用，该系统由4种主要部分组成：纤溶酶原、纤溶酶原激活剂、纤溶酶和纤溶酶抑制物。当纤维蛋白凝结块形成时，在纤溶酶原激活剂的存在下，纤溶酶原激活转化为纤溶酶，纤维蛋白溶解过程开始，纤溶酶降解纤维蛋白凝结块形成各种可溶片段，形成纤维蛋白降解产物(FDP)。其中，D-二聚体是降解产物中最小的片段，是交联纤维蛋白的特异性降解产物，分子量约62ku，在体内半衰期约3h，主要经肾脏排泄与网状内皮系统破坏。
在正常生理状态下，人体正常D-二聚体含量小于200ug/L，但一旦机体血管内有活化的血栓形成及纤维溶解活动，凝血与纤溶的动态平衡遭到破坏，凝血倾向增强，从而纤维蛋白降解产物增加，导致D-二聚体含量增加。因此，D-二聚体的生成和增高反映了凝血和纤溶系统的激活，故临床上其可作为血液高凝状态和继发性纤溶亢进的特异性指标，D-二聚体含量的变化可以用来检测具有凝血和纤溶过程的一类疾病，如深静脉血栓(DVT)、肺栓塞(PE)、弥散性血管内凝血(DIC)、重症肝炎等疾病的检测。因此，血液中D-二聚体的检测对多种疾病的诊断及治疗具有非常重要的临床意义。
目前临床常用的D-二聚体检测方法主要有：乳胶凝集法、酶联免疫吸附法、胶体金免疫渗滤法和免疫比浊法，这些检测方法都是基于抗原抗体特异性结合的原理而设计。如中国专利文献CN104360072B公开了一种粒子稳定剂和悬浮稳定剂配合使用的D-二聚体乳胶增强免疫比浊检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2两种组分，所述试剂R2中的稳定剂采用粒子稳定剂和悬浮稳定剂配合使用，该试剂盒采用胶乳增强免疫比浊法，可在400～800nm的波长下进行检测。然而，上述文献公开的技术中采用的样本为血浆或血清，需要静脉取血且采血量大，样本使用前还需离心，无法直接采用手指微量全血作为检测样本，检测速度慢，因此不能很好的满足医院急诊和门诊快速诊断的需求；另外，该试剂盒的检测范围为0.01～27.3ng/mL，检测范围窄，不利于临床大范围的推广应用。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题是现有的D-二聚体检测试剂盒采用血浆或血清为样本，操作繁琐且检测范围窄的缺陷，从而提供一种可以直接使用全血作为样本且检测范围宽的D-二聚体检测试剂盒；进一步地，本发明还提供了所述检测试剂盒的使用方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种D-二聚体检测试剂盒，包括：
(1)校准品；
(2)试剂R1；
(3)酶结合物工作液R2；
(4)磁珠结合物工作液M；
(5)清洗液；
(6)化学发光底物；
所述试剂R1含有咪唑成分。
优选地，所述试剂R1包括：25～100mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、150mmol/L NaCl、1～5％蔗糖、1～5％甘油、0.1％牛血清白蛋白、0.4～2mmol/L咪唑、0.05～0.2％吐温20和0.05～0.2％Proclin300，pH为7.0～7.5。
优选地，所述校准品是在校准品稀释液中加入D-二聚体配制而成，所述校准品稀释液包括：20～50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、150～300mmol/L NaCl、1％牛血清白蛋白、0.5～5mmol/L Proclin300，pH为7.0～7.5。
优选地，所述酶结合物工作液R2的浓度为0.5～2μg/mL，由酶结合物溶液加入酶结合物稀释液配制而成，其中，所述酶结合物稀释液包括：20～50mmol/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸、150～300mmol/L NaCl、1％牛血清白蛋白、5％蔗糖、5％甘油、0.1％吐温20、0.05～5mmol/LZnCl2、0.05～5mmol/L MgCl2、0.05～0.2％Proclin300，pH为6.0～6.5。
优选地，所述磁珠结合物工作液M的浓度为0.1～0.5mg/mL，由磁珠结合物溶液加入磁珠结合物稀释液配制而成，其中，所述磁珠结合物稀释液包括：20～50mmol/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸、150～300mmol/L NaCl、1％牛血清白蛋白、1％蔗糖、1％明胶、0.1％吐温20、1％聚乙烯吡咯烷酮、0.5～5％Proclin300，pH为5.5～6.5。
优选地，所述酶结合物的主要成分是碱性磷酸酶标记的D-二聚体标记抗体。
优选地，所述磁珠结合物的主要成分是D-二聚体包被抗体偶联的羧基磁珠，所述羧基磁珠的粒径为1.3～4μm。
优选地，所述碱性磷酸酶标记的D-二聚体标记抗体是通过将活化的D-二聚体标记抗体与活化的碱性磷酸酶按摩尔比为1：(1～2)混合，于2～8℃环境下在pH为7.3的三乙醇胺缓冲液中反应18～24h得到。
优选地，所述活化的D-二聚体标记抗体是通过将Traut’s溶液与D-二聚体标记抗体溶液按摩尔比为1：(15～30)混合，于室温条件下在pH为8.5的三乙醇胺缓冲液中反应12～18min得到；所述活化的碱性磷酸酶是通过将4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐溶液与碱性磷酸酶溶液按摩尔比为1：(10～15)混合，于室温条件下在N,N-二甲基甲酰胺溶液中反应12～18min得到。
更优选地，所述Traut’s溶液的浓度为1.3～1.5mg/mL；所述D-二聚体标记抗体溶液的浓度为2～5mg/mL；所述4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐溶液的浓度为16～18mg/mL；所述碱性磷酸酶溶液的浓度为16～20mg/mL。
优选地，所述碱性磷酸酶标记的D-二聚体标记抗体的制备，还包括：在所述活化的D-二聚体标记抗体中加入甘氨酸溶液，所述甘氨酸的物质的量是Traut’s试剂物质的量的10～20倍，充分混匀后于室温下反应8～12min。
优选地，所述碱性磷酸酶标记的D-二聚体标记抗体的制备，还包括：在所述活化的碱性磷酸酶中加入甘氨酸溶液，所述甘氨酸的物质的量是4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐物质的量的10～20倍，充分混匀后于室温下反应8～12min。。
优选地，所述碱性磷酸酶标记的D-二聚体标记抗体的制备，还包括：在所述碱性磷酸酶标记的D-二聚体标记抗体中加入N-乙基顺丁烯二酰亚胺溶液，所述N-乙基顺丁烯二酰亚胺的物质的量是所述碱性磷酸酶标记的D-二聚体标记抗体物质的量的5～20倍，充分混匀后于室温下反应25～35min。
优选地，所述碱性磷酸酶标记的D-二聚体标记抗体的制备，还包括：在纯化后的所述碱性磷酸酶标记的D-二聚体标记抗体中加入甘油并于-25～-15℃下保存。
优选地，所述D-二聚体包被抗体偶联的羧基磁珠是通过将D-二聚体包被抗体溶液与羧基磁珠溶液按照质量比为1:(80～120)混合，于室温条件下在pH为5.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中交联反应16～24h得到。
更有选地，所述D-二聚体包被抗体溶液的浓度为1～5mg/mL；所述羧基磁珠溶液的浓度为100mg/mL。
优选地，所述D-二聚体包被抗体偶联的羧基磁珠的制备，还包括：交联反应前对羧基磁珠进行活化处理，所述活化处理包括：
(1)将羧基磁珠置于磁架上静置2min，磁分离弃上清液，用pH为5.0的100mmol/L2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液洗涤二次后加入2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中，超声至羧基磁珠完全溶解；
(2)向步骤(1)的体系中分别加入N-N-羟基琥珀酰亚胺溶液和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液，所述N-N-羟基琥珀酰亚胺溶液的质量为所述羧基磁珠质量的0.20～0.25倍，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液的质量是所述羧基磁珠质量的0.08～0.12倍，混合均匀，于室温条件下搅拌反应25～35min。。
更有选地，所述N-N-羟基琥珀酰亚胺溶液浓度为10mg/mL；所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液浓度为10mg/mL。
优选地，所述D-二聚体包被抗体偶联的羧基磁珠的制备，还包括：在D-二聚体包被抗体偶联的羧基磁珠中加入磁珠封闭液，于室温条件下反应16～24h。
更有选地，所述磁珠封闭液为CE210。
优选地，所述试剂盒还包括D-二聚体质控品。
本发明还提供了上述D-二聚体检测试剂盒的使用方法，包括：
(1)取三支试管分别加入10μL校准品、10μL质控品、10μL待测样品；
(2)每支试管中分别加入0～40μL试剂R1、50μL酶结合物工作液R2及50μL磁珠结合物工作液M，充分混合后于40～45℃下反应5～10min；
(3)磁分离，倒出上清液，每支试管中分别加入300μL清洗液，混匀后磁分离，倒出上清液；
(4)每支试管中加入100μL化学发光底物，混匀，用化学发光仪检测发光强度。
本发明的技术方案，具有如下优点：
(1)本发明提供的D-二聚体检测试剂盒，所述试剂盒含有试剂R1，所述试剂R1含有咪唑成分，其可以快速消除全血中的血细胞，有效避免血细胞吞进磁珠的可能。本发明的试剂盒可直接使用手指末梢全血或抗凝静脉全血作为待检样品，无需预先对全血样本进行预处理，就可直接进行检测，大大提高了检测速度，简化了操作步骤，扩大了试剂盒的适用范围；可全自动、一键式操作，15分钟左右即可出检测结果，能很好的满足医院急诊和门诊快速诊断的需求，便于大范围推广应用。
(2)本发明提供的D-二聚体检测试剂盒，该试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，并且采用了一步法反应模式，使得检测灵敏度和精密度大大提高，线性范围也得到极大的扩展；采用羧基磁珠作为固相载体，其大小和形状的均一性，使靶物质迅速且有效地结合在磁珠上，且其球形结构还可消除与不规则形状粒子有关的非特异性结合物，提高了试剂盒产品的特异性。
(3)本发明提供的D-二聚体检测试剂盒，包括酶结合物，所述酶结合物主要成分是碱性磷酸酶标记的D-二聚体标记抗体，其制备过程中加入甘氨酸溶液以终止活化反应，以及N-乙基顺丁烯二酰亚胺溶液封闭多余的巯基以终止标记反应，有效避免了非特异性反应的发生，保证了碱性磷酸酶标记的D-二聚体标记抗体的稳定性；对标记反应中各反应物质的使用量以及温度、pH条件等进行限定，优化了标记反应的条件。
(4)本发明提供的D-二聚体检测试剂盒，所述酶结合物置于甘油中保存，有效地保证了酶的活性。
(5)本发明提供的D-二聚体检测试剂盒，包括酶结合物磁珠结合物，所述酶结合物磁珠结合物为D-二聚体包被抗体偶联的羧基磁珠，其制备过程中先采用N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化羧基磁珠，提高了D-二聚体包被抗体与羧基磁珠的偶联效率；羧基磁珠活化处理时采用超声方式加速了羧基磁珠的溶解，使其更加均匀地分散在体系中，有效防止了因磁珠的凝结而影响检测信号，保证了试剂盒检测结果的准确性；偶联反应结束后加入磁珠封闭液，有效地降低了交叉反应的概率，提高了试剂盒的特异性，进一步保证了检测结果的准确性；对偶联反应中各反应物质的使用量以及温度、pH条件进行限定，优化了偶联反应的条件。
(6)本发明提供的D-二聚体检测试剂盒，所述检测试剂盒中的各组分均是该反应体系下的最优配方，给该检测试剂盒的检测性能提供了有力的保障。
(7)本发明提供的D-二聚体检测试剂盒，可以在全自动化学发光仪上同时测定多个样本，实现D-二聚体的高通量快速化测定，且准确度和检测效率都得到极大地提高。
(8)本发明提供了D-二聚体检测试剂盒的使用方法，该方法是采用一步法的反应模式，反应体系均一，极大提高了反应的速率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明的试剂盒与贝克曼公司的试剂盒检测临床血清的相关性。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
下述实施例中，D-二聚体标记抗体购自Roche公司；D-二聚体包被抗体购自Roche公司；Traut′s Reagent试剂购自Thermo公司；碱性磷酸酶购自Roche公司；羧基磁珠购自日本JSR株式会社；CE210购自日本JSR株式会社。
实施例1酶结合物的制备
1.称取3mg Traut′s试剂，用100mmol/L的三乙醇胺缓冲液(pH＝8.5±0.05)配制成浓度为1.376mg/mL的溶液；称取0.5mg D-二聚体标记抗体，用100mmol/L的三乙醇胺缓冲液(pH＝8.5±0.05)配制成浓度为2mg/mL的溶液，并向其中加入浓度为1.376mg/mL的Traut′s溶液，D-二聚体标记抗体与Traut′s试剂的摩尔比为1:15，立刻混匀，室温下反应15分钟。加入1mmol/L的甘氨酸溶液，甘氨酸的物质的量是4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐物质的量的10倍，立刻混匀，室温下反应10分钟。脱盐，置换到100mmol/L的三乙醇胺交联缓冲液中(pH＝7.3±0.05)。
2.称取3mg 4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐，用二甲基甲酰胺配制成浓度为17.5mg/mL的溶液；向16mg/mL的碱性磷酸酶溶液中加入浓度为17.5mg/mL的4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐溶液，碱性磷酸酶与4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐的摩尔比为1:10，立刻混匀，室温下反应15分钟。加入1mmol/L的甘氨酸溶液，甘氨酸的物质的量是Traut′s试剂物质的量的10倍，立刻混匀，室温下反应8分钟。脱盐，置换到100mmol/L的三乙醇胺交联缓冲液中(pH＝7.3±0.05)。
3.将步骤1的活化D-二聚体标记抗体溶液与步骤2的活化碱性磷酸酶溶液混合，活化的D-二聚体标记抗体与活化的碱性磷酸酶的摩尔比为1：1，充分混匀，并于2～8℃下反应18小时。
4.称取3mg N-乙基顺丁烯二酰亚胺，用100mmol/L的三乙醇胺缓冲液(pH＝7.3±0.05)配成成12.5mg/mL溶液。
5.向步骤3的体系中加入步骤4中的N-乙基顺丁烯二酰亚胺溶液，碱性磷酸酶标记的D-二聚体标记抗体与N-乙基顺丁烯二酰亚胺的摩尔比为1：10，充分混匀，室温下反30分钟，以封闭多余的巯基。反应结束后，用分子筛层析的方法纯化得到最终碱性磷酸酶标记的D-二聚体标记抗体结合物。测定纯化后的酶结合物浓缩液测定浓度，添加等体积甘油，充分混匀，-20℃保存备用。
实施例2酶结合物的制备
1.称取3mg Traut′s试剂，用100mmol/L的三乙醇胺缓冲液(pH＝8.5±0.05)配制成浓度为1.3mg/mL的溶液；称取0.5mg D-二聚体标记抗体，用100mmol/L的三乙醇胺缓冲液(pH＝8.5±0.05)配制成浓度为5mg/mL的溶液，并向其中加入浓度为1.3mg/mL的Traut′s溶液，D-二聚体标记抗体与Traut′s试剂的摩尔比为1:10，立刻混匀，室温下反应12分钟。加入1mmol/L的甘氨酸溶液，甘氨酸的物质的量是4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐物质的量的20倍，立刻混匀，室温下反应12分钟。脱盐，置换到100mmol/L的三乙醇胺交联缓冲液中(pH＝7.3±0.05)。
2.称取3mg 4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐，用二甲基甲酰胺配制成浓度为16mg/mL溶液；向20mg/mL的碱性磷酸酶溶液中加入16mg/mL的4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐溶液，碱性磷酸酶与4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐的摩尔比为1:15，立刻混匀，室温下反应15分钟。加入1mmol/L的甘氨酸溶液，甘氨酸的物质的量是Traut′s试剂物质的量的20倍，立刻混匀，室温下反应12分钟。脱盐，置换到100mmol/L的三乙醇胺交联缓冲液中(pH＝7.3±0.05)。
3.将步骤1的活化D-二聚体标记抗体溶液与步骤2的活化碱性磷酸酶溶液混合，活化的D-二聚体标记抗体与活化的碱性磷酸酶的摩尔比为1：2，充分混匀，并于2～8℃下反应24小时。
4.称取3mg N-乙基顺丁烯二酰亚胺，用100mmol/L的三乙醇胺缓冲液(pH＝7.3±0.05)配成成12.5mg/mL溶液。
5.向步骤3的体系中加入步骤4中的N-乙基顺丁烯二酰亚胺溶液，碱性磷酸酶标记的D-二聚体标记抗体与N-乙基顺丁烯二酰亚胺的摩尔比为1：20，充分混匀，室温下反35分钟，以封闭多余的巯基。反应结束后，用超滤浓缩方法纯化得到最终碱性磷酸酶标记的D-二聚体标记抗体结合物。测定纯化后的酶结合物浓缩液测定浓度，添加等体积甘油，充分混匀，-20℃保存备用。
实施例3酶结合物的制备
1.称取3mg Traut′s试剂，用100mmol/L的三乙醇胺缓冲液(pH＝8.5±0.05)配制成浓度为1.5mg/mL的溶液；称取0.5mg D-二聚体标记抗体，用100mmol/L的三乙醇胺缓冲液(pH＝8.5±0.05)配制成浓度为2.5mg/mL的溶液，并向其中加入浓度为1.5mg/mL的Traut′s溶液，D-二聚体标记抗体与Traut′s试剂的摩尔比为1:15，立刻混匀，室温下反应18分钟。加入1mmol/L的甘氨酸溶液，甘氨酸的物质的量是4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐物质的量的15倍，立刻混匀，室温下反应10分钟。脱盐，置换到100mmol/L的三乙醇胺交联缓冲液中(pH＝7.3±0.05)。
2.称取3mg 4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐，用二甲基甲酰胺配制成浓度为18mg/mL的溶液；向18mg/mL的碱性磷酸酶溶液中加入18mg/mL的4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐溶液，碱性磷酸酶与4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐的摩尔比为1:12，立刻混匀，室温下反应12分钟。加入1mmol/L的甘氨酸溶液，甘氨酸的物质的量是Traut′s试剂物质的量的15倍，立刻混匀，室温下反应10分钟。脱盐，置换到100mmol/L的三乙醇胺交联缓冲液中(pH＝7.3±0.05)。
3.将步骤1的活化D-二聚体标记抗体溶液与步骤2的活化碱性磷酸酶溶液混合，活化的D-二聚体标记抗体与活化的碱性磷酸酶的摩尔比为1：1.5，充分混匀，并于2～8℃下反应20小时。
4.称取3mg N-乙基顺丁烯二酰亚胺，用100mmol/L的三乙醇胺缓冲液(pH＝7.3±0.05)配成成12.5mg/mL溶液。
5.向步骤3的体系中加入步骤4中的N-乙基顺丁烯二酰亚胺溶液，碱性磷酸酶标记的D-二聚体标记抗体与N-乙基顺丁烯二酰亚胺的摩尔比为1：5，充分混匀，室温下反25分钟，以封闭多余的巯基。反应结束后，用超滤浓缩方法纯化得到最终碱性磷酸酶标记的D-二聚体标记抗体结合物。测定纯化后的酶结合物浓缩液测定浓度，添加等体积甘油，充分混匀，-20℃保存备用。
实施例4磁珠结合物的制备
1.称取3mg N-N-羟基琥珀酰亚胺，用100mmol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液(pH＝5.0±0.05)配制成浓度为10mg/mL的溶液；称取3mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，用100mmol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液(pH＝5.0±0.05)配制成浓度为10mg/mL的溶液；
2.将粒径为3μm的羧基磁珠置于磁架上静置2min，磁分离弃上清液，用100mmol/L2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液(pH＝5.0±0.05)洗涤二次后加入2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中，超声至羧基磁珠完全溶解；分别加入10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺溶液和10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸溶液，两者的质量分别为羧基磁珠质量的0.23倍和0.1倍，混合均匀，于室温条件下搅拌反应30分钟。反应结束后，用磁板沉淀磁珠去上清液，后再重复一次，将活化后的羧基磁珠溶解于100mmol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液(pH＝5.0±0.05)中，待用；
3.称取0.5mg D-二聚体包被抗体，用100mmol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液(pH＝5.0±0.05)配制成浓度为2mg/mL的溶液；
4.将步骤3中的D-二聚体包被抗体溶液与步骤2中的羧基磁珠溶液按质量比为1:100混合，在混匀仪上室温交联反应20小时。反应结束后，用磁板沉淀磁珠去上清，重复该步骤2次。加入磁珠封闭液CE210，混匀仪上室温反应20小时。反应结束后，用磁板沉淀磁珠去上清液，用磁珠清洗液清洗磁珠3次，得到的磁珠中重悬于磁珠保存液(pH＝6.0±0.05，30mmol/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸、200mmol/L NaCl、1％牛血清白蛋白、1％蔗糖、1％明胶、0.1％吐温20、1％聚乙烯吡咯烷酮、3％Proclin300)中，于2～8℃保存备用。
实施例5磁珠结合物的制备
1.称取3mg N-N-羟基琥珀酰亚胺，用100mmol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液(pH＝5.0±0.05)配制成浓度为10mg/mL的溶液；称取3mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，用100mmol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液(pH＝5.0±0.05)配制成浓度为10mg/mL的溶液；
2.将粒径为1.3μm的羧基磁珠置于磁架上静置2min，磁分离弃上清液，用100mmol/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液(pH＝5.0±0.05)洗涤二次后加入2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中，超声至羧基磁珠完全溶解；分别加入10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺溶液和10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸溶液，两者的质量分别为羧基磁珠质量的0.20倍和0.08倍，混合均匀，于室温条件下搅拌反应25分钟。反应结束后，用磁板沉淀磁珠去上清液，后再重复一次，将活化后的羧基磁珠溶解于100mmol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液(pH＝5.0±0.05)中，待用；
3.称取0.5mg D-二聚体包被抗体，用100mmol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液(pH＝5.0±0.05)配制成浓度为5mg/mL的溶液；
4.将步骤3中的D-二聚体包被抗体溶液与步骤2中的羧基磁珠溶液按质量比为1:80混合，在混匀仪上室温交联反应16小时。反应结束后，用磁板沉淀磁珠去上清液，重复该步骤2次。加入磁珠封闭液CE210，混匀仪上室温反应16小时。反应结束后，用磁板沉淀磁珠去上清液，用磁珠清洗液清洗磁珠3次，得到的磁珠中重悬于磁珠保存液(pH＝6.0±0.05，30mmol/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸、200mmol/L NaCl、1％牛血清白蛋白、1％蔗糖、1％明胶、0.1％吐温20、1％聚乙烯吡咯烷酮、3％Proclin300)中，于2～8℃保存备用。
实施例6磁珠结合物的制备
1.称取3mg N-N-羟基琥珀酰亚胺，用100mmol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液(pH＝5.0±0.05)配制成浓度为10mg/mL的溶液；称取3mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，用100mmol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液(pH＝5.0±0.05)配制成浓度为10mg/mL的溶液；
2.将粒径为4μm的羧基磁珠置于磁架上静置2min，磁分离弃上清液，用100mmol/L2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液(pH＝5.0±0.05)洗涤二次后加入2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中，超声至羧基磁珠完全溶解；分别加入10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺溶液和10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸溶液，两者的质量分别是羧基磁珠质量的0.25倍和0.12倍，混合均匀，于室温条件下搅拌反应35分钟。反应结束后，用磁板沉淀磁珠去上清液，后再重复一次，将活化后的羧基磁珠溶解于100mmol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液(pH＝5.0±0.05)中，待用；
3.称取0.5mg D-二聚体包被抗体，用100mmol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液(pH＝5.0±0.05)配制成浓度为5mg/mL的溶液；
4.将步骤3中的D-二聚体包被抗体溶液与步骤2中的羧基磁珠溶液按质量比为1:120混合，在混匀仪上室温交联反应24小时。反应结束后，用磁板沉淀磁珠去上清液，重复该步骤2次。加入磁珠封闭液CE210，混匀仪上室温反应24小时。反应结束后，用磁板沉淀磁珠去上清液，用磁珠清洗液清洗磁珠3次，得到的磁珠中重悬于磁珠保存液(pH＝6.0±0.05，30mmol/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸、200mmol/L NaCl、1％牛血清白蛋白、1％蔗糖、1％明胶、0.1％吐温20、1％聚乙烯吡咯烷酮、3％Proclin300)中，于2～8℃保存备用。
实施例7本发明的D-二聚体检测试剂盒
D-二聚体检测试剂盒，包括：D-二聚体校准品，试剂R1，酶结合物工作液R2、磁珠结合物工作液M、清洗液及化学发光底物。
其中：D-二聚体校准品是通过校准品稀释液将具有溯源性的校准品稀释至1200ng/mL，所述校准品稀释液的成分为：30mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、250mmol/L NaCl、1％牛血清白蛋白、3mmol/L Proclin300，pH为7.2±0.05；
其中：试剂R1具体成分为：60mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、150mmol/L NaCl、3％蔗糖、3％甘油、0.1％牛血清白蛋白、1.2mmol/L咪唑、0.15％吐温20和0.15％Proclin300，pH为7.3±0.05；
其中：酶结合物工作液R2的浓度为1.3μg/mL，其是通过在酶结合物溶液加入酶结合物稀释液配制而成。酶结合物稀释液的具体成分为：35mmol/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸、250mmol/L NaCl、1％牛血清白蛋白、5％蔗糖、5％甘油、0.1％吐温20、2.5mmol/LZnCl2、2.5mmol/L MgCl2、0.15％Proclin300，pH为6.35±0.05；
其中：磁珠结合物工作液M的浓度为0.25mg/mL，其是通过将磁珠结合物溶液加入磁珠结合物稀释液配制而成。磁珠结合物稀释液的具体成分为：35mmol/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸、250mmol/L NaCl、1％牛血清白蛋白、1％蔗糖、1％明胶、0.1％吐温20、1％聚乙烯吡咯烷酮、3％Proclin300，pH为6.0±0.05。
其中：清洗液的配制过程为：依次向容器内加入三羟甲基氨基甲烷1211.4mg，NaCl9g，吐温20 1g，水900mL，混匀至各组分溶解，用氢氧化钠溶液调节溶液pH至8.0±0.5，补加水定容至1000mL，混匀30分钟，0.22μm过滤即得到清洗液。
其中：化学发光底物的配制过程为：
准确称取3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐(AMPPD)0.5g、三羟甲基氨基甲烷18g、NaCl 100g、十六烷基三甲基氯化铵0.02g、水定容至1000mL，调整化学发光底物溶液pH为9.4±0.05；本化学发光底物为针对碱性磷酸酶的环二氧乙烷类底物，需要再2～8℃条件下避光保存，用时缓慢混匀。
实施例8本发明的D-二聚体检测试剂盒
D-二聚体检测试剂盒，包括：D-二聚体校准品，试剂R1，酶结合物工作液R2、磁珠结合物工作液M、清洗液及化学发光底物。
其中：D-二聚体校准品是通过校准品稀释液将具有溯源性的校准品稀释至2.5ng/mL，所述校准品稀释液的成分为：20mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、150mmol/L NaCl、1％牛血清白蛋白、0.5mmol/L Proclin300，pH为7.0±0.05；
其中：试剂R1具体成分为：25mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、150mmol/L NaCl、1％蔗糖、1％甘油、0.1％牛血清白蛋白、0.4mmol/L咪唑、0.05％吐温20和0.05％Proclin300，pH为7.3±0.05；
其中：酶结合物工作液R2的浓度为0.5μg/mL，其是通过在酶结合物溶液加入酶结合物稀释液配制而成。酶结合物稀释液的具体成分为：20mmol/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸、150mmol/L NaCl、1％牛血清白蛋白、5％蔗糖、5％甘油、0.1％吐温20、0.05mmol/LZnCl2、0.05mmol/LMgCl2、0.05％Proclin300，pH为6.0±0.05；
其中：磁珠结合物工作液M的浓度为0.1mg/mL，其是通过将磁珠结合物溶液加入磁珠结合物稀释液配制而成。磁珠结合物稀释液的具体成分为：20mmol/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸、150mmol/L NaCl、1％牛血清白蛋白、1％蔗糖、1％明胶、0.1％吐温20、1％聚乙烯吡咯烷酮、0.5％Proclin300，pH为5.5±0.05。
本实施例中，清洗液及化学发光底物的成分及配制过程同实施例7。
实施例9本发明的D-二聚体检测试剂盒
D-二聚体检测试剂盒，包括：D-二聚体校准品，试剂R1，酶结合物工作液R2、磁珠结合物工作液M、清洗液及化学发光底物。
其中：D-二聚体校准品是通过校准品稀释液将具有溯源性的校准品稀释至2500ng/mL，所述校准品稀释液的成分为：100mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、150mmol/LNaCl、1％牛血清白蛋白、5mmol/L Proclin300，pH为7.5±0.05；
其中：试剂R1具体成分为：100mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、150mmol/L NaCl、5％蔗糖、5％甘油、0.1％牛血清白蛋白、2mmol/L咪唑、0.2％吐温20和0.2％Proclin300，pH为7.5±0.05；
其中：酶结合物工作液R2的浓度为2μg/mL，其是通过在酶结合物溶液加入酶结合物稀释液配制而成。酶结合物稀释液的具体成分为：50mmol/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸、300mmol/L NaCl、1％牛血清白蛋白、5％蔗糖、5％甘油、0.1％吐温20、5mmol/LZnCl2、5mmol/L MgCl2、0.2％Proclin300，pH为6.5±0.05；
其中：磁珠结合物工作液M的浓度为0.5mg/mL，其是通过将磁珠结合物溶液加入磁珠结合物稀释液配制而成。磁珠结合物稀释液的具体成分为：50mmol/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸、300mmol/L NaCl、1％牛血清白蛋白、1％蔗糖、1％明胶、0.1％吐温20、1％聚乙烯吡咯烷酮、5％Proclin300，pH为6.5±0.05。
本实施例中，清洗液及化学发光底物的成分及配制过程同实施例7。
实施例10本发明的D-二聚体检测试剂盒
D-二聚体检测试剂盒，包括：D-二聚体校准品，质控品，试剂R1，酶结合物工作液R2、磁珠结合物工作液M、清洗液及化学发光底物。
其中：D-二聚体校准品或质控品是通过校准品稀释液将具有溯源性的校准品或质控品稀释至1200ng/mL，所述校准品稀释液的成分为：30mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、250mmol/L NaCl、1％牛血清白蛋白、3mmol/L Proclin300，pH为7.2±0.05；
其中：试剂R1具体成分为：60mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、150mmol/L NaCl、3％蔗糖、3％甘油、0.1％牛血清白蛋白、1.2mmol/L咪唑、0.15％吐温20和0.15％Proclin300，pH为7.3±0.05；
其中：酶结合物工作液R2的浓度为1.3μg/mL，其是通过在酶结合物溶液加入酶结合物稀释液配制而成。酶结合物稀释液的具体成分为：35mmol/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸、250mmol/L NaCl、1％牛血清白蛋白、5％蔗糖、5％甘油、0.1％吐温20、2.5mmol/LZnCl2、2.5mmol/L MgCl2、0.15％Proclin300，pH为6.35±0.05；
其中：磁珠结合物工作液M的浓度为0.25mg/mL，其是通过将磁珠结合物溶液加入磁珠结合物稀释液配制而成。磁珠结合物稀释液的具体成分为：35mmol/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸、250mmol/L NaCl、1％牛血清白蛋白、1％蔗糖、1％明胶、0.1％吐温20、1％聚乙烯吡咯烷酮、3％Proclin300，pH为6.0±0.05。
本实施例中，清洗液及化学发光底物的成分及配制过程同实施例7。
实施例11本发明的试剂盒检测手指末梢全血中D-二聚体的步骤
1.向试管中加入10μL手指末梢全血、校准品或质控品；
2.向试管中加入20μL试剂R1，轻轻往复震荡试管；
3.向试管中加入50μL酶结合物工作液R2；
4.向试管中加入50μL磁珠结合物工作液M；
5.将试管防止在涡旋混匀仪上混匀30秒，然后置于42℃反应8分钟；
6.将试管放置在磁架上静置2分钟后倒掉上清液，拍干，加入清洗液300μL，该步骤重复3次；
7.将反应管转移到发光检测仪上进行检测，发光检测仪会加入100μL化学发光底物并读取对应试管中的发光值。
8.使用标准品或质控品的浓度以及发光值作出剂量-反应曲线；
9.将手指末梢全血的发光值代入曲线得到全血中的D-二聚体的含量。
本实施例中提供的D-二聚体检测方法同样适用于抗凝静脉全血、血清或血浆的D-二聚体检测。
实验例1
以10μL抗凝静脉全血为样品，用本发明实施例7的试剂盒检测，显示有发光现象，按照本发明实施例11的检测步骤能得出全血中D-二聚体的含量，而用中国专利文献CN101819202A公开的技术检测，未检测出全血中D-二聚体的浓度。
实验例2线性验证
取具有溯源性的标准品或质控品，浓度尽量高，用生理盐水对样本进行稀释，每点测定3次，取平均值，结果与预期浓度作回归直线，计算得到回归系数r＝0.9992＞0.99，说明本发明提供的试剂盒的稀释线性好。
实验例3精密度验证
取具有溯源性的血清高值质控品、低值质控品各一份，对每份质控品进行10次检测，将共10次检测结果计算平均值、标准值。根据变异系数CV＝(标准偏差/平均值)×100％，计算得到：CV1(500ng/mL)＝2％，CV2(20ng/mL)＝5％。由此可知，本发明提供的试剂盒具有较高的精密度。
实验例4准确度验证
取具有溯源性的血清高值质控品、低值质控品各一份，用本发明的试剂盒分别进行检测，各检测5次，计算平均值，后与质控品靶值进行对照。结果显示，本发明的试剂盒检测值与靶值接近，说明本发明提供的试剂盒具有较高的准确度。
实验例5灵敏度验证
取具有溯源性的质控品稀释至检测范围下限(2.5ng/mL)附近进行测定，重复测定3次，计算平均值，后与质控品靶值进行对照。结果显示，本发明的试剂盒检测值与靶值接近，说明本发明提供的试剂盒具有较高的灵敏度。
实验例6检测范围验证
取具有溯源性的标准品，稀释不同的倍数后分别检测是否有发光现象，结果显示，在浓度为2.5～2500ng/mL的范围内，均有发光现象，表明本发明的试剂盒检测范围为2.5～2500ng/mL。
实验例7相关性验证
取200份血清样本，比较本发明的试剂盒与贝克曼公司的D-二聚体检测试剂盒检测结果的相关性，结果如图1所示。其中：横坐标为贝克曼公司试剂盒的检测结果，纵坐标为本发明试剂盒的检测结果，相关系数R2＝0.9404，回归线方程为：y＝0.8828x+79.1296。由图1可知，本发明样本检测结果与本行业知名公司产品检测结果相比，结果无明显差异。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举，而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (22)

1.一种D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，包括：
(1)校准品；
(2)试剂R1；
(3)酶结合物工作液R2；
(4)磁珠结合物工作液M；
(5)清洗液；
(6)化学发光底物；
所述试剂R1含有咪唑成分。
2.根据权利要求1所述的D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1包括：25～100mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、150mmol/L NaCl、1～5％蔗糖、1～5％甘油、0.1％牛血清白蛋白、0.4～2mmol/L咪唑、0.05～0.2％吐温20和0.05～0.2％Proclin300，pH为7.0～7.5。
3.根据权利要求1或2所述的D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述校准品是在校准品稀释液中加入D-二聚体配制而成，所述校准品稀释液包括：20～50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、150～300mmol/L NaCl、1％牛血清白蛋白、0.5～5mmol/L Proclin300，pH为7.0～7.5。
4.根据权利要求1-3任一项所述的D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述酶结合物工作液R2的浓度为0.5～2μg/mL，由酶结合物溶液加入酶结合物稀释液配制而成，其中，所述酶结合物稀释液包括：20～50mmol/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸、150～300mmol/L NaCl、1％牛血清白蛋白、5％蔗糖、5％甘油、0.1％吐温20、0.05～5mmol/LZnCl2、0.05～5mmol/LMgCl2、0.05～0.2％Proclin300，pH为6.0～6.5。
5.根据权利要求1-4任一项所述的D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述磁珠结合物工作液M的浓度为0.1～0.5mg/mL，由磁珠结合物溶液加入磁珠结合物稀释液配制而成，其中，所述磁珠结合物稀释液包括：20～50mmol/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸、150～300mmol/LNaCl、1％牛血清白蛋白、1％蔗糖、1％明胶、0.1％吐温20、1％聚乙烯吡咯烷酮、0.5～5％Proclin300，pH为5.5～6.5。
6.根据权利要求1-5任一项所述的D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述酶结合物的主要成分是碱性磷酸酶标记的D-二聚体标记抗体。
7.根据权利要求1-6任一项所述的D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述磁珠结合物的主要成分是D-二聚体包被抗体偶联的羧基磁珠，所述羧基磁珠的粒径为1.3～4μm。
8.根据权利要求6所述的D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶标记的D-二聚体标记抗体是通过将活化的D-二聚体标记抗体与活化的碱性磷酸酶按摩尔比为1：(1～2)混合，于2～8℃环境下在pH为7.3的三乙醇胺缓冲液中反应18～24h得到。
9.根据权利要求8所述的D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述活化的D-二聚体标记抗体是通过将Traut’s溶液与D-二聚体标记抗体溶液按摩尔比为1：(15～30)混合，于室温条件下在pH为8.5的三乙醇胺缓冲液中反应12～18min得到；所述活化的碱性磷酸酶是通过将4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐溶液与碱性磷酸酶溶液按摩尔比为1：(10～15)混合，于室温条件下在N,N-二甲基甲酰胺溶液中反应12～18min得到。
10.根据权利要求9所述的D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述Traut’s溶液的浓度为1.3～1.5mg/mL；所述D-二聚体标记抗体溶液的浓度为2～5mg/mL；所述4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐溶液的浓度为16～18mg/mL；所述碱性磷酸酶溶液的浓度为16～20mg/mL。
11.根据权利要求8-10任一项所述的D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，还包括：在所述活化的D-二聚体标记抗体中加入甘氨酸溶液，所述甘氨酸的物质的量是Traut’s试剂物质的量的10～20倍，充分混匀后于室温下反应8～12min。
12.根据权利要求8-11任一项所述的D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，还包括：在所述活化的碱性磷酸酶中加入甘氨酸溶液，所述甘氨酸的物质的量是4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐物质的量的10～20倍，充分混匀后于室温下反应8～12min。
13.根据权利要求8-12任一项所述的D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，还包括：在所述碱性磷酸酶标记的D-二聚体标记抗体中加入N-乙基顺丁烯二酰亚胺溶液，所述N-乙基顺丁烯二酰亚胺的物质的量是所述碱性磷酸酶标记的D-二聚体标记抗体物质的量的5～20倍，充分混匀后于室温下反应25～35min。
14.根据权利要求8-13任一项所述的D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，还包括：在纯化后的所述碱性磷酸酶标记的D-二聚体标记抗体中加入甘油并于-25～-15℃下保存。
15.根据权利要求7所述的D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述D-二聚体包被抗体偶联的羧基磁珠是通过将D-二聚体包被抗体溶液与羧基磁珠溶液按照质量比为1:(80～120)混合，于室温条件下在pH为5.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中交联反应16～24h得到。
16.根据权利要求15所述的D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述D-二聚体包被抗体溶液的浓度为1～5mg/mL；所述羧基磁珠溶液的浓度为100mg/mL。
17.根据权利要求15或16所述的D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，还包括：交联反应前对羧基磁珠进行活化处理，所述活化处理包括：
(1)将羧基磁珠置于磁架上静置2min，磁分离弃上清液，用pH为5.0的100mmol/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液洗涤二次后加入2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中，超声至羧基磁珠完全溶解；
(2)向步骤(1)的体系中分别加入N-N-羟基琥珀酰亚胺溶液和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液，所述N-N-羟基琥珀酰亚胺溶液的质量为所述羧基磁珠质量的0.20～0.25倍，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液的质量是所述羧基磁珠质量的0.08～0.12倍，混合均匀，于室温条件下搅拌反应25～35min。
18.根据权利要求17所述的D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述N-N-羟基琥珀酰亚胺溶液浓度为10mg/mL；所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液浓度为10mg/mL。
19.根据权利要求15-18任一项所述的D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，还包括：在D-二聚体包被抗体偶联的羧基磁珠中加入磁珠封闭液，于室温条件下反应16～24h。
20.根据权利要求19所述的D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述磁珠封闭液为CE210。
21.根据权利要求1-20任一项所述的D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括D-二聚体质控品。
22.权利要求1-21任一项所述的D-二聚体检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括：
(1)取三支试管分别加入10μL校准品、10μL质控品、10μL待测样品；
(2)每支试管中分别加入0～40μL试剂R1、50μL酶结合物工作液R2及50μL磁珠结合物工作液M，充分混合后于40～45℃下反应5～10min；
(3)磁分离，倒出上清液，每支试管中分别加入300μL清洗液，混匀后磁分离，倒出上清液；
(4)每支试管中加入100μL化学发光底物，混匀，用化学发光仪检测发光强度。
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