CZ2000983A3 - Způsob čištění antithrombinu III - Google Patents

Abstract

Způsobu čištění antithrombinu III z výchozího materiálu, obsahujícího komplex AT III/heparin, popřípadě AT III/heparinoid, při kterém se komplex adsorbuje na aniontoměničový materiál, ze kterého se AT III odštěpí eluci.

Description

Oblast technikv

Vynález se týká nového způsobu čištění antithrombinu

III .

Dosavadní stav technikv

Antithrombin III (AT III) je plasmatický protein, který působí inhibičně proti srážení tak, že inhibuje thrombin a faktory IXa, Va, Xla a XIla.

Nedostatek AT III nebo hereditární thrombofilie je autosomáldominantní značné onemocnění se sklonem k thrombose, popřípadě embolii v důsledku snížené tvorby AT III .

Získaný nedostatek AT III může nastat například u pacientů DIC, při sepsi, cirrhose jarter nebo při nefrotickém syndromu.

Rovněž může docházet k projevům nedostatku AT III při náhradách srdečních chlopní, pooperačních thromboembolytických komplikacích, při estrogenové terapii nebo při asparaginásové terapii.

AT III má vysokou afinitu k heparinu a heparinoidům a proto je při výrobě čistých preparátů antithrombinu III potřebné oddělování heparinu nebo heparinoidů.

Podle EP 0 307 002-A1 se provádí štěpení tohoto AT III/heparinového, popřípadě AT III/heparinoidového komplexu pomocí imobilisovaného protaminu, přičemž se heparin váže na imobilisovaném protaminu a AT III se získává z proteklé kapaliny. AT III/heparinový, popřípadě AT III/heparinoidový komplex se před zpracováním s imobilisovaným protaminem čistí adsorpci na iontoměniči a eluci od nežádoucích proteinů pomocí roztoku soli při pH 7,5. Ukázalo se, že se pomocí iontoměničové chromatografie nedosáhne štěpení komplexu, ale oddělení nežádoucích doprovodných proteinů, přičemž komplex zůstane dsorbovaný jako takový v nezměněné formě.

Další možnost čištění AT III představuje afinitní chromatografie přes heparinsepharosu.

V Prep. Biochem. 13 (1)(1983), str. 1 až 20 je například popsán způsob čištění AT III , při kterém se AT III nejprve čistí pomocí afinitní chromatografie s heparinsepharosou a potom pomocí iontoměničové chromatografie a gelové chromatografie, přičemž eluce AT III z heparinsepharosy se provádí při pH 7,4 . Iontoměničová chromatografie se provádí na DEAE-sepharose, přičemž AT III je vázán při pH 8,6 .

V Thrombosis Research 5 (1974), str. 431 až 452 je rovněž popsáno čištění AT III přes heparinsepharosu, přičemž adsorpce se provádí při pH 8,5 a desorpce, tedy štěpení komplexu z imobilisovaného heparinu a AT III , se dosahuje při pH 7,5 . Při následující iontoměničové chromatografií na DEAE-sephadexu se AT III váže při pH 8,0 a eluuje se při pH 7,4 .

·« · ♦ · · ·· • · · « · • · · · · · ·

Podobný způsob je popsán v DE 2 243 688. Také zde se popisuje čištění AT III na zesítěném heparinovém agarosovém gelu, přičemž adsorpce na heparinovém gelu se provádí při pH 8,5 a desorpce, tedy odštěpení AT III z imobilisovaného heparinu, se provádí při pH 7,3 .

Úkolem předloženého vynálezu tedy je vypracování nového způsobu výroby preparátů antithrombinu III o vysoké čistotě a s vysokými výtěžky, při kterém by se získal AT III pokud možno prostý heparinu, popřípadě heparinoidů.

Podstata vynálezu

Výše uvedený úkol byl podle předloženého vynálezu vyřešen vypracováním způsobu čištění antithrombinu III z výchozího materiálu, obsahujícího komplex AT III/heparin nebo AT III/heparinoid, jehož podstata spočívá v tom, že se komplex AT III/heparin nebo AT III/heparinoid adsorbuje na aniontoměničový materiál a potom se AT III z adsorbovaného komplexu odštěpí a eluuje. Heparin zůstává při tomto odštěpení na aniontoměniči, probíhá tedy selektivní eluce AT III.

Výhodně se provádí štěpení podle předloženého vynálezu pomocí pufru při hodnotě pH v rozmezí 8,5 až 10,5 .

Překvapivě se totiž zjistilo, že se daří štěpení komplexu heparin/AT III, popřípadě heparinoid/AT III, v průběhu aniontoměničové chromatografie a to dokonce při hodnotě pH, která je vyšší než 8,5 .

Bylo zjištěno, že se AT III z aniontoměniče selektivně • A • AAA

A A ·A A · • · • ··· eluuje vůči heparinu, popřípadě se může štěpit vazba komplexu mezi AT III a heparinem, popřípadě heparinoidem, zatímco současně vazba heparinu s adsorpčním materiálem (na rožnil od heparinsepharosy ne kovalentní) zůstává stálá. Ačkoliv podle stavu techniky byla afinita AT III k heparinu pokládána především při takovémto pH za velmi silnou (viz Thrombosis Research (1974) nebo DE 2 243 688) a štěpení komplexu (odštěpení AT III z imobilisovaného heparinu) při kovalentně vázaném heparinu se vždy provádělo při nižších hodnotách pH, ukázalo se, že pomocí aniontoměničové chromatografie je možná selektivní eluce AT III z adsorbovaného komplexu AT III/heparin, popřípadě AT III/heparinoid.

V rámci předloženého vynálezu se ale ukázalo, že dokonce při takto vysokých hodnotách pH se může dosáhnout štěpení komplexu a přesto zůstane heparin v podstatě vázaný na aniontoměniči.

Výhodně se při způsobu podle předloženého vynálezu provádí eluce pufrem, který má vodivost v rozmezí 15 až 50 mS . Při této vodivosti se dosahuje optima specifity eluce, to znamená, že je na jedné straně dostatečná k tomu, aby se umožnilo v podstatě úplné štěpení komplexu a na druhé straně ne tak vysoká, aby se spolueluoval heparin, popřípadě heparinoid. Podmínky adsorpce, popřípadě desorpce, závisí všeobecně na použitém aniontoměničovém materiálu a j sou v podstatě funkcí vodivosti a hodnoty pH pufru.

Obzvláště je souvislost mezi hodnotou pH a vodivostí taková, že při nižší vodivosti, například okolo 20 mS, může být také hodnota pH roztoku pufru nižší, například 8,5, a naopak. Jako pufry se používají například roztoky, obsahující tris, fosfát nebo glycin.

» 4 4

4 4 444

4444 » 4 4 » 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4444

444 44 44 444 44 44

Výhodně se před adsorpcí ppřidává heparin, popřípadě heparinoid, v množství v rozmezí 30 až 3000 E/ml. Tímto opatřením je zaručeno, že se veškerý AT III ve výchozím materiálu vyskytuje jako komplex a tím nedochází ke ztrátám výtěžku, způsobeným volným AT III .

Způsob podle předloženého vynálezu se výhodně provádí dvoustupňovým chromatografickým čištěním, přičemž se v prvním stupni adsorbuje komplex na aniontoměničový materiál a při hodnotě pH v rozmezí 6,0 až 7,5 se stabilní komplex eluuje. Potom se provádí adsorpce komplexu podle předloženého vynálezu a štěpení, popřípadě eluce AT III z komplexu. Při hodnotě pH v rozmezí 8,5 až 10,5 se nastaví výhodně při eluci vyšší vodivost pufru, například 10 až 60 mS , výhodně v rozmezí 15 až 50 mS a obzvláště výhodně v rozmezí 20 až 35 mS.

Vzhledem k tomu, že se AT III výhodně používá jako terapeutikum, je většinou nutné zpracování pro inaktivaci virů. Toto zpracování se výhodně provádí na stupni komplexu AT III/heparin, popřípadě AT III/heparinoid, neboř AT III je ve formě komplexu stabilnější než ve volné formě. Výhodně se zpracováni pro inaktivaci virů provádí také dvoustupňové a sice pomocí dvou na sobě nezávislých způsobů pro inaktivaci virů.

Toto inaktivační zpracování se výhodně provádí zpracováním tensidem a/nebo teplem, například zpracováním teplem v pevném stavu, obzvláště zpracováním parou podle EP-0 159 311, EP-0 519 901 nebo EP-0 674 531.

Další způsoby inaktivace virů zahrnují také zpracová- 6 » φφ • · • ··· • φ φφφ φ • · φφ φ · φ φ • φ φ φ φφφφφ φφφφφ φφ φφ ní pomocí chemických a/nebo fyzikálně chemických metod, například pomocí chaotropních látek podle V094/13329, DE 44 34 538 nebo EP-0 131 740 (rozpouštědlo) nebo pomocí fotoinaktivace.

Nanofiltrace představuje rovněž výhodný způsob pro odstranění virů v rámci předloženého vynálezu.

Jako aniontoměníče přicházejí v principu v úvahu všechny aniontoměníče, které vykazují afinitu k heparinu, popřípadě heparinoidům, jako jsou například aniontoměníče na basi celulosy s diethylaminoethylovými skupinami (DEAE-Sephacell^R, DE32, DE52 a podobně, popřípadě Express Ion D ; vše firma Vhatman) nebo se skupinami CF^N+ÍCH-p^ (QA52, popřípadě Express Ion Q ; firma Vhatman), aniontoměníče na basi příčně zesítěného dextrinu s diethylaminoethylovými skupinami (DEAE-Sephadex^R), aniontoměníče na basi agarosy s diethylaminoethylovými skupinami (DEAE-Sepharose CL6B , DEAESepharose Fast Flow^R), aniontoměníče na basi příčně zesítěného dextranu s diethyl-(2-hydroxypropyl)-aminoethylovými skupinami (QAE-Sephadex^R), aniontoměníče na basi agarosy se skupinami CK^N+ÍCH^)^ (Q-Sepharose Fast Flow^R,

R R\

Q-Sepharose High Performance , Q-Sepharose Big Beads ) nebo kopolymery agarosy a dextranu (Q-Sepharose XL)(vše firma Pharmacia), sférické chromatografické gely, vyrobené kopolymerací N-akryloyl-2-amino-2-hydroxymethyl-l,3-propandiolu a anionického akrylového derivátu s diethylamino-ethylovými skupinami jako funkčním aniontoměničem (DEAE-Tris-Acryl^R), nekompresibilní silica-dextran-matrice, u kterých je poresní silikagel zabudován do příčně zesítěné dextranové matrice, s reaktivními diethylaminoethylovými aniontoměničovými skupinami (DEAE-Spherodex^R), gely z rigidních polystyrénových částic, jejichž póry jsou zaplněny hydrogelem, který nese ·· ·· ·· ··»· ·· ·* ··· · · · · · · · • · ·· · · · · · · ·· · ······ ······

-/- ····· 9 9 9 9 9

9999 99 99 999 99 99 kvarternární aminoskupiny se silným aniontoměničovým účinkem (Q-Hyper-D^)(vše firma Sepracor); rigidní makroporesní hydrofilní povrchy se skupinami 1^+(6^2^5)2 ^nebo N+(CHg)j (Macroprep DEAE^, Macroprep Q^)(vše firma BioRad); aniontoměniče s diethylaminoethylovými skupinami, diethyl-(2-hydroxypropyl)-aminoethylovými skupinami a skupinami (DEAE-Toyopearlh QAE-Toyopearl^, Toyopearl Super-Q^)(vše firma Tosohaas), aniontoměničové pryskyřice, sestávající z poresního polymethakrylát/polyakrylátového gelu (Protein PAK DEAE^, firma Vaters); aniontoměniče na basi kopolymerů, sestávajících z oligoethylenglykol-dimethylakrylátu, glycidyl-methakrylátu a pentaerythritoldimethylakrylátu s hydrofobním povrchem (Fractogel EMD-TMAE^, Fractogel EMD-DEAE^, Fractogel EMD-DMAE^), aniontoměniče na basi silikagelu s poresními, kulovitými, tlakově stabilními chromatografickými částicemi (Licrospher 1000 TMAE^, Licrospher 1000 DEAE^ a Licrospher 4000 DMAE^) (vše firma Merck).

Při obzvláště výhodné formě provedení způsobu podle předloženého vynálezu se smísí lidská plasma nebo frakce plasmy, obsahující AT III , s heparinem nebo heparinoidem, přičemž se vytvoří komplex AT III/heparin, popřípadě AT III/heparinoid a tento komplex se podrobí tepelnému zpracování pro inaktivaci infekčních agens. Toto zpracování se provádí popřípadě za přítomnosti stabilisujících, organických vícemocných soli, jako je například citrát a/nebo amoniumsulfát, výhodně při teplotě v rozmezí 40 °C až 70 °C po dobu 3 až 30 hodin, přičemž obzvláště výhodné je zpracování při teplotě okolo 60 °C po dobu asi 10 hodin.

Výhodně se při způsobu podle předloženého vynálezu vychází z lidské plasmy nebo z frakce (lidské) plasmy, ob- 8 »1 44 • · 4 · · • ··· a · • · · · · · a · a · · ···· ·· 44 a · ···· • e a· • · · · · •44 4 44 4

4 4 4 4 ·

4 4 4 4 • 44 «4 4 · sáhující AT III , výhodně z plasmy, chudé na kryoprecipitát, nebo z Cohnovy frakce, výhodně Cohnovy frakce IV .

Předložený vynález je blíže objasněn pomocí následujících příkladů provedení, avšak bez toho, že by byl na ně omezen.

Příkladv provedení vynálezu

Příklad 1

93,2 1 na kryoprecipitát chudé plasmy se smísí se 7,5 x 10^ E heparinu, míchá se po dobu 30 minut a na jeden litr se přidá 1 g DEAE-Sephadexu A50 (firma Pharmacia). Oddělením gelu a následuj ícím odstraněním nenavázaných proteinů citrátem pufrovaným roztokem chloridu sodného (1 g/1 NaCl, pH 7,5) se získá komplex AT III/heparin eluováním pufrovým roztokem, který má vodivost 44 mS a hodnotu pH 7,5. Potom se roztok zahřívá po dobu 10 hodin při teplotě 60 °C za přítomnosti stabilisujících organických vícemocných solí (160 g/1 citrátu sodného) pro inaktivaci eventuelně přítomných patogenních mikroorganismů.

Vzniklá sraženina se oddělí odstředěním nebo filtrací a vypustí se. Čirý roztok se přepufruje na pH 9,0 a vodivost 12,2 mS . Komplex AT III/heparin se naváže na chromatografické koloně, obsahující 1000 ml Q-Sepharosy Fast Flow^R (firma Pharmacia) a AT III se selektivně eluuje pomocí roztoku pufru při pH 9,0 a vodivosti 26 mS .

Výsledky jsou uvedení v následující tabulce.

·· *· ·* *··» ·· ♦· • · · · · t ···« • ··· · · 999 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 999 9« ··

Tabulka

	AT III E/ml	heparin E/ml	AT III/protein
DEAE-Sephadex	7,3	30,5	1,6 E/mg
eluát
Q-Sepharose	7,2	0,5	3,9
eluát

Příklad 2 (Současně podle názoru přihlašovatele nej lepší způsob provedení vynálezu)

24,5 1 plasmy se po odstranění kryoprecipitátu a prothrombinového komplexu smísí s 1,85 x 10° E heparinu. Pro adsorpci komplexu AT III/heparin se použije 15 g DE 52 Cellulose (firma Vhatman) na litr a produkt se získá eluci pomocí roztoku pufru, který má vodivost 45 mS a hodnotu pH 8,0 . Po pasteurisaci (60 °C , 10 h) se roztok přepufruje a zpracuje se pomoci Tritonu^ X 100 (polyethylenglykolterc.oktylfenylether), Tweenu^ 80 (polyoxyethylensorbitanmonooleát), jakož i tri-(n-butyl)fosfátu (TNBP) při teplotě 25 °C podle US-P-4 540 573.

AT III se čistí chromatograficky přes kolonu 25 ml Q-Sepharose Fast Flow^ (firma Pharmacia) a získá se eluci pomocí roztoku pufru při pH 9,8 a vodivosti 23 mS . Ultrafiltraci a diafiltraci se AT III upraví na 100 E/ml, načež se za filtrace sterilně naplní a popřípadě se lyofilisuje.

to to to to toto·· toto·· ··· ·· ··

Výsledky po lyofilisaci

AT III heparin

AT III/protein

Triton, Tween, TNB heparinová vazba AT III podle Europ. Pharmacopoeia.

Příklad 3

E/ml 0,8 E/ml 6,2 E/mg < hranice důkazu > 95 % *)

Opakuje se postup podle příkladu 2 , avšak namísto Q-Sepharosy se použije Toyopearl^R Q-650 Th^R (Toso Haas).

Výsledky (eluát)

AT III heparin

AT III/protein

Příklad 4

4,5 E/ml 0,1 E/ml 3,2 E/mg .

Opakuje se postup podle příkladu 2 , avšak namísto Q-Sepharosy se použije Express Ion Q (Vhatman).

Výsledky (eluát) :

AT III heparin

AT III/protein

8,0 E/ml 0,8 E/ml 5,5 E/mg .

ft y>oo -qtg • ·

I • · · · · • · «4

advokát

Claims (8)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob čištění antithrombinu III z výchozího materiálu, obsahujícího komplex AT III/heparin, popřípadě AT III/heparinoid, vyznačující se tím, že se komplex adsorbuje na aniontoměničový materiál, ze kterého se AT III odštěpí eluci.
2. 2. Způsob podle nároku 1 , vyznačující se tím, že se eluce provádí pomocí pufru při hodnotě pH v rozmezí 8,5 až 10,5 .
3. 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2 , vyznačující se tím, že pufr pro eluci má vodivost v rozmezí 10 až 60 mS , výhodně 15 až 50 mS a obzvláště 20 až 35 mS .
4. 4. Způsob podle některého z nároků 1 až 3 , vyznačující se tím, že se do výchozího materiálu, obsahujícího AT III , přidá heparin, popřípadě heparinoid, v množství v rozmezí 30 až 3000 E/ml, přičemž se vytvoří komplex AT III/heparin, popřípadě AT III/heparinoid.
5. 5. Způsob podle některého z nároků 1 až 4 , vyznačující se tím, že se komplex AT III/ heparin, popřípadě AT III/heparinoid, podrobí dvoustupňovému chromatografickému čištění, přičemž se v prvním stupni adsorbuje komplex na aniontoměničový materiál a eluuje se při pH v rozmezí 6,0 až 7,5 .

   ·· »· «· ···· «· β· »99 9 · · · · 9 9 ···· · 9 9 9 9 9 9 9 9

   - ΐ2 ···· 99 99 999 99 9 ·)
6. 6. Způsob podle některého z nároků 1 až 5 , vyznačující se tím, že se provede krok pro inaktivaci virů.
7. 7. Způsob podle některého z nároků 1 až 6 , vyznačující se tím, že se do lidské plasmy nebo do frakce plasmy, obsahující AT III , přidá heparin nebo heparinoid pro vytvoření komplexu heparin/AT III, popřípadě heparinoid/AT III a tento komplex se podrobí tepelnému zpracování pro inaktivaci infekčních agens, popřípadě za přítomnosti stabilisujících organických vícemocných solí, výhodně citrátu a/nebo amoniumsulfátu, při teplotě v rozmezí 40 °C až 70 °C po dobu 3 až 30 hodin, výhodně při teplotě okolo 60 °C po dobu 10 hodin.
8. 8. Způsob podle některého z nároků 1 až 7 , vyznačující se tím, že se vychází z lidské plasmy nebo z frakce plasmy, obsahující AT III , výhodně z plasmy chudé na kryoprecipitát.