FR2942232A1 - Moyens pour la purification d'une proteine de la coagulation et procedes pour sa mise en oeuvre - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne un support d'affinité pour la fixation sélective d'une protéine de la coagulation, comprenant un matériau support solide sur lequel sont immobilisés des aptamères nucléiques se liant spécifiquement à ladite protéine de la coagulation.
Description
DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention se rapporte au domaine de la purification des protéines de la coagulation, utilisables comme principes actifs de médicaments ART ANTERIEUR Les protéines de la coagulation constituent depuis longtemps des principes actifs de médicaments. Parmi les protéines de la coagulation utilisées comme principes actifs de médicament, on peut citre notamment le facteur VII, le facteur VIII, la thrombine ou encore le facteur de Willebrand.
Jusqu'à une période récente, les protéines de la coagulation étaient exclusivement obtenues par purification à partir du plasma humain. Depuis quelques années, certaines protéines de la coagulation sont obtenues sous la forme de protéines recombinantes produites dans des fluides corporels de mammifères transgéniques, par exemple dans le lait de mammifères transgéniques.
Dans tous les cas, le matériel de départ contenant la protéine de la coagulation à purifier consiste en un matériel de constitution complexe, dans lequel la protéine d'intérêt est présente en combinaison avec de très nombreuses substances, y compris des protéines, des lipides, des glucides, des acides aminés, des sels minéraux, des débris cellulaires et des déchets métaboliques comme l'urée, l'acide urique ou la bilirubine. La mise au point d'un procédé de purification d'une protéine de la coagulation est donc un travail complexe, compte tenu des caractéristiques sanitaires et réglementaires exigées pour la mise sur le marché d'un médicament à usage humain.
On comprend que, dans un médicament destiné à la prévention ou au traitement des troubles de la coagulation, la protéine de la coagulation utilisée comme principe actif doit être présente sous une forme hautement purifiée et ne pas être associée à des substances indésirables susceptibles d'être délétères pour l'organisme, y compris d'autres protéines de la coagulation, de l'albumine, des immunoglobulines, ou encore des produits de dégradation des protéines précitées. On connait des procédés de purification de protéines de la coagulation variées, y compris des procédé de purification du Facteur VIII, de l'anti-thrombine-III, du plasminogène, du Facteur VII ou encore du facteur de Willebrand. L'ensemble des procédés connus comprennent une succession d'étapes de séparation sélective basées sur des étapes de précipitation des protéines, de passage sur des supports de chromatographie suivi d'étapes d'élution séquentielle, d'étapes de filtration en profondeur, d'ultrafiltration pu encore d'étapes de concentration. On précise que la mise au point de procédés de purification des protéines de la coagulation, que ces procédés soient entièrement nouveaux, ou bien que ces procédés soient des adaptations, même minimes, de procédés connus, nécessite de longues recherches et de nombreux contrôle de conformité des produits intermédiaires successifs, afin de s'assurer que le produit final sera obtenu avec une grande pureté, sous une forme non altérée, et sensiblement exempt de substances indésirables. Notamment, pour les protéines de la coagulation ayant une activité enzymatique, comme par exemple les facteurs VII, VII et XI, il est essentiel que la protéine finale purifiée ne soit pas activée. Or, l'activation d'une protéine de la coagulation est susceptible d'être induite au cours de l'une quelconque des étapes de purification, y compris durant les étapes de chromatographie, si des conditions de consigne prédéterminées, par exemple qualité des filtres ou du support chromatographique utilisés, concentration saline ou encore température, ne sont pas respectées. Ce qui précède explique, au moins en partie, pourquoi les procédés connus ne comprennent pas d'étape de chromatographie d'affinité, basée sur le principe d'immobilisation spécifique de la protéine de la coagulation d'intérêt sur un ligand greffé sur le support chromatograhique, puis récupération de la protéine purifiée dans l'éluat de chromatographie. L'absence d'étape de purification par chromatographie d'affinité, dans les procédés de purification de protéines d'intérêt thérapeutique est expliquée également par les inconvénients de cette technique dans laquelle on observe le détachement d'une partie des molécules de ligand greffées sur le support d'affinité, qui sont retrouvées associées à la protéine thérapeutique purifiée dans le volume de l'éluat. On comprend que la présence, dans un médicament, pour traiter les troubles de la coagulation, de substances constitutives d'un support de chromatographie, qui sont éventuellement délétères pour l'organisme, est proscrite par la réglementation médicale. Bien que les procédés connus de purification des protéines de la coagulation soient satisfaisants, il existe un besoin dans l'état de la technique pour des procédés alternatifs ou améliorés, par rapport aux procédés existants.35 RESUME DE L'INVENTION L'invention concerne un support d'affinité pour la fixation sélective d'une protéine de la coagulation, comprenant un matériau support solide sur lequel sont immobilisés des aptamères nucléiques se liant spécifiquement à ladite protéine de la coagulation. Dans certains modes de réalisation, lesdits aptamères nucléiques consistent en des aptamères désoxyribonucléiques L'invention a aussi pour objet un procédé pour immobiliser une protéine de la coagulation sur un support, comprenant une étape au cours de laquelle on met en w contact un échantillon contenant ladite protéine de la coagulation avec un support d'affinité. Elle est également relative à un procédé pour la purification d'une protéine de la coagulation comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact un échantillon contenant une protéine de la coagulation 15 avec un support d'affinité tel que défini ci-dessus, afin de former des complexes entre (i) les aptamères nucléiques immobilisés sur ledit support d'affinité et (ii) ladite protéine de la coagulation, et b) libérer la protéine à partir des complexes formés à l'étape a), et c) récupérer ladite protéine de la coagulation sous une forme purifiée. 20 Elle a aussi trait à une composition purifiée d'une protéine de la coagulation humaine recombinante comprenant au moins 99,9% en poids de ladite protéine humaine recombinante et qui est sensiblement exempte de protéines non humaines
DESCRIPTION DES FIGURES 25 La figure unique illustre un profil de chromatographie obtenu lors de la mise en oeuvre du procédé de purification d'un Facteur VII humain recombinant produit dans le lait de lapine avec le support d'affinité dans lequel sont immobilisés des aptamères nucléiques anti-FVII humain. En abscisse ; le temps ; en ordonnées : la valeur d'absorbance (D.O.) à 254 nanomètres. 30
DESCRIPTION DETAILLE DE L'INVENTION Après de longues recherches, le demandeur a mis au point un procédé de purification des protéines de la coagulation, comprenant une étape de 35 chromatographie au cours de laquelle a lieu une fixation spécifique de la protéine d'intérêt sur un ligand préalablement immobilisé sur le support de chromatographie, puis de libération de la protéine d'intérêt retenue sur ledit support et récupération de la protéine purifiée dans le volume de l'éluat.. Plus précisément, il est fourni selon l'invention un procédé pour la purification des protéines de la coagulation comprenant une étape de fixation spécifique de la protéine de la coagulation d'intérêt sur un support sur lequel sont immobilisés des aptamères nucléiques se liant spécifiquement à ladite protéine d'intérêt, suivie d'une étape de récupération de ladite protéine d'intérêt purifiée. De manière surprenante, on a montré selon l'invention que des supports de chromatographie d'affinité sur lesquels sont immobilisés des aptamères nucléiques spécifiques de la protéine de coagulation d'intérêt, c'est-à-dire y compris sous la forme de composés immobilisés comprenant de tels aptamères nucléiques, peuvent être utilisés avec succès dans des procédés d'obtention de protéines de la coagulation, utilisables comme principes actifs d'un médicament.
La présente invention est relative à un support d'affinité pour la fixation sélective d'une protéine de la coagulation, comprenant un matériau support solide sur lequel sont immobilisés des aptamères nucléiques se liant spécifiquement à ladite protéine de la coagulation, y compris sous la forme de composés comprenant de tels aptamères nucléiques.
Les molécules d'aptamère nucléique se liant spécifiquement à la protéine de coagulation d'intérêt, ainsi que les composés comprenant de tels aptamères nucléiques, constituent des sites de liaison spécifique de ladite protéine cible portés par ledit matériau support solide. Par aptamères nucléiques , on englobe des acides nucléiques monobrin ayant une longueur de 5 à 120 nucléotides de longueur et qui se lient spécifiquement à une protéine de la coagulation. Par composés comprenant un aptamère nucléique, on englobe également des composés qui comprennent dans leur structure lesdits acides nucléiques définis précédemment. Ainsi, les composés comprenant un acide désoxyribonucléique se liant spécifiquement à une protéine de la coagulation, humaine ou de mammifère, englobent les composés dans lesquels ledit acide nucléique est inclus dans une structure comprenant une molécule de biotine.
On a montré selon l'invention qu'un support d'affinité tel que défini ci-dessus permettait une immobilisation efficace de la protéine de la coagulation d'intérêt, qui peut aussi être appelée protéine cible , dans la présente description. Un support d'affinité tel que défini ci-dessus possède une haute capacité d'adsorption de la protéine cible, puisque la mise en contact du support solide avec une solution liquide contenant la protéine de la coagulation à purifier permet de saturer au moins 50 pour cent des sites cibles portés par le support solide. On a également montré selon l'invention que les molécules de la protéine de la coagulation qui sont fixées spécifiquement sur les molécules d'aptamères nucléiques, peuvent être ensuite éluées du support d'affinité avec un bon rendement, d'au moins 75 pour cent. De plus, on a montré que le support d'affinité de l'invention possède une grande spécificité pour la protéine de la coagulation d'intérêt, puisque ladite protéine de la coagulation peut être retrouvée avec un degré de pureté allant jusqu'à 99,95 pour cent en poids, par rapport au poids total des protéines contenues dans l'éluat. Comme cela est illustré dans les exemples, un accroissement de deux ordres de grandeur de la pureté de la protéine de la coagulation d'intérêt peut encore être obtenu avec un support d'affinité selon l'invention, en utilisant comme produit de départ une composition comprenant la protéine cible de la coagulation à un haut degré de pureté, par exemple à plus de 98% en poids, par rapport au poids total des protéines contenues dans ledit produit de départ. On précise qu'un tel accroissement de pureté est obtenu y compris lorsque les impuretés présentes dans le produit de départ possèdent des caractéristiques structurelles ou physico-chimiques très proches de celles de la protéine cible de la coagulation que l'on cherche à purifier.
De manière importante, on a montré que les caractéristiques ci-dessus de haute capacité d'absorption, de bon rendement et de haute spécificité du support d'affinité de l'invention étaient obtenues notamment pour la purification de la protéine coagulante d'intérêt à partir d'un milieu de départ de composition complexe, tel que du plasma sanguin ou encore un fluide biologique d'un mammifère transgénique pour ladite protéine coagulante d'intérêt. On a également montré que l'immobilisation des aptamères nucléiques sur le matériau support solide était irréversible et durable, puisque la présence d'aptamères nucléiques détachés du support n'est pas détectable dans la solution d'éluat. Notamment, on a montré que le support d'affinité de l'invention peut être régénéré , par élimination des protéines restées fixées sur le support après élution, de très nombreuses fois sans altération significative de (i) sa capacité d'absorption de la protéine de la coagulation cible, (ii) sa spécificité vis-à-vis de ladite protéine cible, ou encore (iii) son absence de relarguage des aptamères nucléiques immobilisés sur le matériau support solide. De plus, la régénération du support d'affinité de l'invention peut être réalisée selon des techniques connues et avec des agents de régénération connus, telle que l'urée.
Les acides nucléiques utilisés comme ligands de la protéine de la coagulation d'intérêt présentent de nombreux avantages. De par leur nature oligonucléotidique les aptamères possèdent une faible immunogénicité et une résistance importante à des conditions physico-chimiques stringentes (présence d'urée, de DMSO, d'un pH très acides ou très basique, utilisation de solvants organiques ou de température élevée) permettant des stratégies variées de contrôle de la sécurité sanitaire, en particulier de la sécurité vis-à-vis des virus ou d'agents pathogènes non conventionnels, dans le cadre d'un usage en tant que ligand d'affinité. De plus leur sélectivité est importante. Enfin, comme déjà mentionné, la production d'aptamères implique des coûts relativement limités. Ainsi, la combinaison de caractéristiques ci-dessus du support d'affinité de l'invention matérialisent l'aptitude dudit support d'affinité à être utilisé comme moyen pour la purification d'un protéine de la coagulation , puisque - ledit support d'affinité permet la mise en oeuvre de procédés de purification d'une protéine de la coagulation ayant un très haut degré de pureté, - ledit support d'affinité ne libère pas de manière détectable de substances indésirables, en particulier de molécules d'aptamères nucléiques, dans la solution d'éluat contenant la protéine de la coagulation purifiée, - l'éventuel détachement de molécules d'aptamères nucléiques n'entraîne pas d'inconvénients pour la santé humaine, - la fixation, puis l'élution de la protéine de la coagulation d'intérêt sur le support d'affinité, lorsqu'il s'agit d'une protéine de la coagulation à activité enzymatique, n'entraîne pas la formation de quantités détectables de la forme activée de ladite protéine de la coagulation, - ledit support d'affinité est peu onéreux à fabriquer, notamment en raison des coûts réduits de la production des aptamères nucléiques, et - la mise en oeuvre dudit support d'affinité pour la purification d'une protéine de la coagulation est elle-même peu onéreuse du fait de la longévité dudit support, due en particulier à la possibilité de le régénérer de nombreuses fois, et sur une longue période de temps. De plus, comme cela a été déjà mentionné, le support d'affinité de l'invention est apte à fixer sélectivement, de manière réversible, la protéine de la coagulation cible, avec un bon rendement et une bonne spécificité, dans des procédés de purification à partir de milieux de constitution complexe, en particulier à partir de milieux classiquement utilisés à l'échelle industrielle, tels que le plasma humain ou des milieux de culture ou des fluides biologiques contenant ladite protéine d'intérêt. De plus, comme cela sera détaillé plus loin dans la présente description, le support d'affinité de l'invention est apte au traitement de grands volumes de solution contenant la protéine de coagulation d'intérêt. Le support d'affinité de l'invention constitue donc un outil de purification d'une protéine de coagulation qui est parfaitement bien adapté à une utilisation à l'échelle industrielle. D'autres avantages du support d'affinité selon l'invention seront spécifiés ultérieurement dans la présente description, soit en relation avec la description du support d'affinité lui-même, soit en relation avec les procédés de purification d'un protéine de la coagulation dans lesquels ledit support d'affinité est utilisé. A la connaissance du demandeur, la présente invention décrit pour la première fois un support d'affinité comprenant des aptamères nucléiques immobilisés pour la purification d'une protéine de la coagulation dans des conditions d'utilisation à l'échelle industrielle. On connait par ailleurs dans l'état de la technique une variété d'aptamères nucléiques spécifiques de la thrombine, du Facteur VII et du Facteur IX (voir demande PCT n°WO 02/26932). Par fixation sélective , on entend aux fins de la présente description la liaison spécifique de manière non covalente de la protéine de la coagulation d'intérêt aux acides nucléiques immobilisés constitutifs du support d'affinité, et qui est réversible par mise en contact du support d'affinité sur lequel se sont formés des complexes non covalents entre lesdits acides nucléiques et ladite protéine d'intérêt avec une solution de constitution adaptée, qui peut être appelée aussi solution d'élution.
Par protéine de la coagulation , on entend selon l'invention toute protéine impliquée dans la chaîne de réactions en cascade aboutissant à la formation d'un caillot sanguin. Les protéines de la coagulation englobent le Facteur I (fibrinogène), le Facteur II (prothrombine), le Facteur V (proaccélérine), le Facteur VII (proconvertine), le Facteur VIII (facteur anti-hémophilique A), le Facteur IX (facteur anti-hémophilique B), le Facteur X (Facteur Stuart), le Facteur XI (Facteur Rosenthal ou PTA), le Facteur XII (Facteur Hageman), le Facteur XIII (Facteur stabilisant la fibrine ou FSF), la PK (Prékalicrine) le KHPM (kininogène de haut poids moléculaire), la thromboplastine tissulaire, le cofacteur II de l'héparine (HCII), la protéine C (PC), la thrombomoduline (TM), la protéine S (PS), le facteur de Willlerbrand (Wf) et l'inhibiteur de la voie du facteur tissulaire (TFPI), ou encore les facteurs tissulaires. Dans certains modes de réalisation, la protéine de la coagulation consiste en une protéine de la coagulation à activité enzymatique.
Les protéines de la coagulation à activité enzymatique englobent le Facteur Il (prothrombine), le Facteur VII (proconvertine), le Facteur IX (facteur antihémophilique B), le Facteur X (Facteur Stuart), le Facteur XI (Facteur Rosenthal ou PTA), le Facteur XII (Facteur Hageman), le Facteur XIII (Facteur stabilisant la fibrine ou FSF) et la PK (Prékalicrine).
Dans certains modes de réalisation préférés, la protéine de la coagulation consiste en une protéine de la coagulation humaine, naturelle ou recombinante. Dans des modes de réalisation préférés, la protéine de la coagulation est le Facteur VII humain, naturel ou recombinant. De manière générale, les supports solides sur lesquels peuvent être immobilisés les aptamères de l'invention englobent tout type de support ayant la structure et la composition retrouvée communément pour les supports de filtre, des membranes, etc. Les supports solides englobent notamment les résines, les résines pour colonne de chromatographie d'affinité, les billes de polymères, les billes magnétiques, les billes paramagnétiques, les matériaux supports de membrane filtrante, etc. Les supports solides englobent aussi notamment les matériaux à base de verre ou de métal, tels que l'acier, l'or, l'argent, l'aluminium, le cuivre, le silicium, le verre, la céramique. Les supports solides englobent aussi notamment des matériaux polymères, tels qu'un polyéthylène, un polypropylène, un polyamide, un fluorure de polyvinylidène, et des combinaisons de ceux-ci.
Dans certains modes de réalisation, le support solide peut être revêtu avec un matériau facilitant l'attachement, la fixation, la formation de complexes, l'immobilisation ou l'interaction avec les aptamères, ou avec les composés comprenant lesdits aptamères.
Dans certains modes de réalisation, le support solide est une lame de verre dont la surface est revêtue d'une couche d'or, d'une couche ayant subi un traitement par carboxyméthylation, d'une couche de dextran, de collagène, d'avidine, de streptavidine, etc. De cette manière, les aptamères selon l'invention, ou les composés comprenant les aptamères selon l'invention, peuvent être immobilisés sur le support solide par l'intermédiaire d'un revêtement d'attachement, comme par exemple décrit ci-dessus, soit par réaction chimique avec création de liaisons covalentes, soit par association par des liaisons non covalentes telles que des liaisons hydrogène, des forces électrostatiques, des forces de Van der Waals, etc.
Les exemples décrivent des modes de réalisation d'un support d'affinité selon l'invention dans lesquels les aptamères nucléiques sont immobilisés, par l'intermédiaire des composés dans la structure desquels ils sont inclus, par des liaisons non covalentes au matériau de support solide. Dans les exemples, on décrit notamment des supports d'affinité comprenant un matériau de support solide à la surface duquel sont greffées des molécules de streptavidine, les aptamères nucléiques étant inclus dans la structure de composés comprenant des aptamères couplés, à une de leurs extrémités, à une molécule de biotine, et lesdits aptamères étant immobilisés sur ledit matériau de support solide par immobilisation non covalente entre les molécules de streptavidine du matériau support et les molécules de biotine des composés comprenant lesdits aptamères nucléiques. Dans les exemples, on décrit un mode de réalisation d'un support d'affinité comprenant un matériau support sur lequel sont greffées des molécules de streptavidine. De tels matériaux support solide sont facilement disponibles dans le commerce. Par acides nucléiques se liant spécifiquement à une protéine de la coagulation , ou aptamères ou aptamères nucléiques , on entend des molécules d'ADN (acide désoxyribonucléique) ou d'ARN (acide ribonucléique) possédant la capacité à se lier à une protéine de coagulation d'intérêt donnée, supérieure à la capacité à se lier à toute autre protéine.
Dans certains modes de réalisation, les aptamères nucléiques constitutifs du support d'affinité selon l'invention ont la capacité à se lier à une protéine humaine de la coagulation donnée, supérieure à la capacité à se lier à toute autre protéine humaine.
Dans certains modes de réalisation, les aptamères nucléiques selon l'invention ont notamment la capacité à se lier à une protéine humaine de la coagulation donnée, supérieure à la capacité à se lier à toute autre protéine de la coagulation homologue codée par le génome d'un mammifère non humain. De manière illustrative, un aptamère nucléique spécifique du Facteur VII humain possède une capacité à se lier au Facteur VII humain supérieure à la capacité à se lier au Facteur VII provenant d'un mammifère non humain, y compris d'un Facteur Vil de lapin. Au sens de la présente description, un premier acide nucléique possède une capacité à se lier au Facteur VIINIla humain, supérieure à celle d'un second acide nucléique de masse équivalente, lorsque, en utilisant l'une quelconque des techniques de détection de liaison ci-dessus et dans les mêmes conditions d'essai, une valeur de signal de liaison supérieure statistiquement significative est obtenue avec le premier acide nucléique, par rapport à celle obtenue avec les second acide nucléique. De manière illustrative, lorsque la technique de détection de liaison utilisée est la technique Biacore , un premier acide nucléique possède une capacité à se lier au Facteur VIINIla humain, supérieure à celle d'un second acide nucléique de masse équivalente, lorsque la valeur de signal de résonance pour le premier acide nucléique, quelle que soit l'unité de mesure de résonance exprimée, est statistiquement supérieure à la valeur de signal de résonance mesurée pour le second acide nucléique. Deux valeurs de mesure statistiquement distinctes englobent deux valeurs qui on entre elles un écart supérieur à l'erreur de mesure de la technique de détection de liaison utilisée. Préférentiellement, un aptamère nucléique d'un support d'affinité de l'invention possède une forte affinité pour le protéine de la coagulation cible.
Préférentiellement, ledit aptamère nucléique possède une valeur de Kd, vis-à-vis de ladite protéine de la coagulation cible, inférieure à 500 nM. La valeur de Kd peut être mesurée selon la technique Biacore . A titre illustratif, on a montré que l'aptamère nucléique comprenant la séquence SEQ ID N° 1 a une capacité à se lier au Fa cteur VIINIla humain qui est 35 significativement supérieure à sa capacité de liaison à n'importe quel Facteur VIINIla provenant d'un mammifère non humain. En particulier, alors qu'un acide nucléique de séquence SEQ ID N° 1 possède une forte capacité à se lier à tout type de FacteurVllNlla humain, y compris un Facteur VIINIla naturel ou un Facteur VIINIla recombinant, il a une capacité faible ou nulle à se lier à un Facteur VIINIla codé par le génome d'un mammifère non humain, y compris un Facteur VIINIla de lapin Plus précisément, pour l'aptamère comprenant l'acide nucléique de séquence SEQ ID N° 1, on a déterminé selon la techn ique Biacoree, que la valeur de capacité de liaison au Facteur VIINIla humain, exprimée comme la constante de dissociation Kd, est d'environ 100 nM. De plus, ledit aptamère nucléique possède une capacité de liaison identique à la fois au Facteur VIINIla humain plasmatique et à un Facteur VIINIla humain recombinant, par exemple produit chez un lapin transgénique On a aussi montré que les complexes entre un acide nucléique de séquence SEQ ID N° 1 et un Facteur VIINIla humain sont stoechiométriques, c'est à dire que le rapport du nombre de molécules d'acide nucléique de séquence SEQ ID NI au nombre de molécules de Facteur VIINIla h umain complexées est d'environ 1::1 et peut être en particulier de 1::1. Comme cela a déjà été mentionné précédemment, le support d'affinité de l'invention peut être utilisé dans une étape d'un procédé de purification d'une protéine de la coagulation humaine recombinante produite par un mammifère transgénique non humain. Dans de tels modes de réalisation d'un procédé de purification d'une protéine de la coagulation, le milieu complexe de départ comprend la protéine recombinante humaine en mélange avec de nombreuses protéines produites naturellement par ledit mammifère transgénique, y compris, le cas échéant, la protéine de la coagulation homologue à la protéine recombinante humaine. On comprend que, dans de tels modes de réalisation, il est avantageux que les aptamères nucléiques constitutifs du support d'affinité de l'invention se fixent sélectivement sur la protéine humaine d'intérêt, et ne se fixe pas, dans les mêmes conditions opératoires, sur la protéine homologue produite naturellement par le mammifère non humain. Dans ces modes de réalisation particuliers des aptamères nucléiques constitutifs du support d'affinité de l'invention, la capacité desdits aptamères à se lier spécifiquement à la protéine humaine de la coagulation d'intérêt peut aussi être exprimé comme le rapport des constantes de dissociation Kd, respectivement pour la protéine humaine et pour la protéine homologue de mammifère non humain. Selon encore une autre caractéristique d'un aptamère nucléique constitutif du support d'affinité selon l'invention, la capacité dudit aptamère nucléique à se lier spécifiquement à la protéine humaine de la coagulation peut aussi être exprimée par la condition (A) suivante : Kd humain/Kd non-humain < 0,01 (A), dans laquelle : - Kd humain est la constante de dissociation d'un aptamère nucléique ladite 10 protéine humaine, exprimée en unités molaires, et - Kd non-humain est la constante de dissociation dudit aptamère nucléique pour la protéine homologue non humaine, exprimée dans les mêmes unités molaires. Préférentiellement, pour une mise en oeuvre optimale du support d'affinité de 15 l'invention dans des procédés de purification d'une protéine humaine recombinante de la coagulation, un aptamère nucléique se liant spécifiquement à ladite protéine humaine recombinante peut être défini aussi par un rapport Kd humain/Kd non-humain inférieur à 0,005. Les aptamères nucléiques constitutifs du support d'affinité de l'invention 20 peuvent être préparés selon la technique appelée SELEX. Le terme aptamère tel qu'utilisé englobe une molécule d'acide nucléique monobrin, ADN ou ARN, capable de se lier de manière spécifique à une protéine. Les aptamères comprennent généralement entre 5 et 120 nucléotides et peuvent être sélectionnés in vitro selon un procédé connu sous le nom de SELEX (Systematic Evolution of 25 Ligands by Exponential Enrichment), qui a été initialement décrit notamment dans la demande PCT Na WO 1991/019813). Le procédé SELEX de sélection des aptamères consiste à mettre en présence une protéine avec une librairie combinatoire d'acides nucléiques, ADN ou ARN (en général 1015 molécules), les acides nucléiques ne se liant pas à la cible sont éliminés, les acides nucléiques se 30 liant à la cible sont isolés et amplifiés. Le procédé est répété jusqu'à ce que la solution soit suffisamment enrichie avec les acides nucléiques ayant une bonne affinité pour la protéine d'intérêt (Tuerk et Gold, Systematic evolution of ligands by exponential enrichment : RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase (1990) Science, 249(4968) :505-10 et Ellington et Szostak, In vitro selection of 35 RNA molecules that bind specific ligands , (1990) Nature Aug 30;346(6287):818- 22). D'autres exemples de procédé SELEX sont donnés dans les documents EP 0 786 469, EP 668 931, EP 1 695 978, EP 1 493 825 dont les enseignements peuvent être repris dans la réalisation du procédé de sélection d'un aptamère nucléique utilisé selon l'invention.
Pour son utilisation dans un moyen de purification du Facteur VIINIIa humain, un acide nucléique se liant spécifiquement à une protéine de la coagulation d'intérêt est préférentiellement inclus dans une structure chimique, aussi appelée composé dans la présente description, comprenant également un moyen espaceur et, le cas échéant, un moyen d'immobilisation sur un support solide.
Dans certains modes de réalisation, l'aptamère nucléique est inclus dans la structure d'un composé de formule (I) suivante : [FIX]X [SPAC]ÿ [APT] (I), dans laquelle : - [FIX] signifie un composé d'immobilisation sur un support, - [SPAC] signifie une chaîne espaceur, - [APT] signifie un acide nucléique se liant spécifiquement à une protéine de la coagulation, aussi désigné aptamère nucléique, - x est un entier égal à 0 ou 1, et - y est un entier égale à 0 ou 1. Dans certains modes de réalisation du composé de formule (I), [APT] consiste en un acide désoxyribonucléique de séquence SEQ ID N°1. La chaîne espaceur désignée [SPAC] dans le composé de formule (I) peut être de tout type connu. Ladite chaîne espaceur a pour fonction d'éloigner physiquement l'acide nucléique de la surface du support solide sur lequel ledit composé peut être immobilisé et de permettre une mobilité relative de l'acide nucléique par rapport à la surface du support solide sur lequel il peut être immobilisé. La chaîne espaceur limite ou évite que des encombrements stériques, dus à une trop grande proximité du support solide et de l'acide nucléique, gênent les évènements de liaison entre ledit acide nucléique et des molécules de protéine de la coagulation susceptibles d'être mises en contact avec celui-ci.
Dans le composé de formule (I), la chaîne espaceur est liée préférentiellement à l'extrémité 5' ou à l'extrémité 3' de l'acide nucléique aptamère. Avantageusement la chaîne espaceur est liée à la fois à une extrémité de l'aptamère et au support solide. Cette construction avec espaceur a pour avantage de ne pas immobiliser directement l'aptamère sur le support solide. De préférence la chaîne espaceur est un oligonucléotide non spécifique ou du Polyéthylène Glycol (PEG). Lorsque la chaîne espaceur consiste en un oligonucléotide non spécifique, ledit oligonucléotide comprend avantageusement au moins 5 nucléotides de longueur, de préférence entre 5 et 15 nucléotides de longueur. Dans les modes de réalisation d'un composé de formule (I) dans lesquels la chaîne espaceur consiste en un Polyéthylène Glycol, ladite chaîne espaceur englobe un polyéthylène glycol de type PEG(C18), commercialisé par exemple par la Société Sigma Aldrich. Pour immobiliser l'aptamère sur la chaîne espaceur, l'acide nucléique peut être modifié chimiquement avec différents groupements chimiques tels que des groupements permettant d'immobiliser ledit acide nucléique de façon covalente, tels que des thiols, des amines ou tout autre groupement capable de réagir avec des groupements chimiques présents sur le support solide. Dans le composé de formule (I) le composé [FIX] consiste en un composé choisi parmi (i) un composé capable de former une ou plusieurs liaisons covalente(s) avec le matériau de support solide et (ii) un composé capable de se lier spécifiquement sur le support solide par l'intermédiaire de liaison faibles non covalentes, y compris des liaisons hydrogènes, des forces électrostatiques ou des forces de Van der Waals. Le premier type de composé [FIX] englobe les agents de couplage bifonctionnels, comme le glutaraldéhyde, le SIAB ou encore le SMCC. Le composé SIAB, décrit par Hermanson G.T. (1996, Bioconjugate techniques, San Diego : Academic Press, pp 239-242), est le composé de formule (I) suivante : o (I)
Le composé SIAB comprend deux groupes réactifs, respectivement un groupe iodoacétate et un groupe ester Sulfo-NHS, ces groupes réagissant 30 respectivement sur des groupes amino et sulfhydryl.
Le composé SMCC, qui est décrit par Samoszuk M.K. et al. (1989, Antibody, Immunoconjugates Radiopharm., 2(1) : 37-46), est le composé de formule (II) suivante : (II) Le composé SMCC comprend deux groupes réactifs, respectivement un groupe ester Sulfo-NHS et un groupe maléimide, qui réagissent respectivement avec un groupe amino et un groupe sulfhydryl.
Le second type de composé [FIX] englobe la biotine, qui est capable de se lier de manière spécifique non covalente à des molécules d'avidine ou de streptavidine présentes sur le support mobile. Une fois immobilisé sur le support solide via l'espaceur, l'aptamère est avantageusement modifié à son extrémité libre (extrémité non liée à l'espaceur) grâce à, et sans s'y limiter, un nucléotide chimiquement modifié (tel que 2'omethyl ou 2'fluoropyrimidine, 2' ribopurine, phosphoramidite), un nucléotide inversé ou un groupement chimique (PEG, polycations, cholestérol). Ces modifications permettent de protéger l'aptamère des dégradations enzymatiques. Un acide nucléique se liant spécifiquement à une protéine de la coagulation, 20 aussi désigné aptamère nucléique aux fins de la présente description, est choisi parmi un ADN et un ARN. On connaît déjà dans l'état de la technique des aptamères nucléiques capables de se lier à diverses protéines impliquées dans la voie de la coagulation sanguine, y compris des aptamères liant le Facteur de Willebrand (Demande PCT 25 n°WO 2008/150495), des aptamères liant l'alpha-thrombine (demande de brevet euopéen n° EP 1 972 693) ou la thrombine (Zhao et a I., 2008, Anal Chem, Vol. 80(19) : 7586-7593), des aptamères liant le Facteur IX/lXa (Subash et al., 2006, Thromb Haemost, Vol. 95 : 767-771; Howard et al., 2007, Atherioscl Thromb Vasc Biol, Vol. 27 : 722-727; Demande PCT n°WO 2002/096 926; Brevet aux Etats-Unis 30 n° US 7,312,325), des aptamères liant le Facteur X/Xa ( Demande PCT n°WO 2002/096926; Brevet aux Etats-Unis n°US 7,312,325) .
Des aptamères nucléiques se liant au facteur VIINIla humain ont aussi été décrits dans l'état de la technique (Rusconi et al., 2000, Thromb Haemost, Vol. 84(5) : 841-848; Layzer et al., 2007, Spring, Vol. 17 : 1-11. On précise qu'aucun des aptamères ci-dessus n'est décrit pour son utilisation pour purifier la protéine cible sur laquelle il se lie. De manière surprenante, il est montré selon l'invention que l'on peut fabriquer un support d'affinité tel que défini dans la présente description en utilisant, comme aptamères nucléiques, des aptamères ADN, pourtant considérés dans l'état de la technique comme des acides nucléiques ligands dont la mise en oeuvre est malaisée, et dont la spécificité pour la protéine cible est moindre que la spécificité de la molécule d'ARN de séquence correspondante. Notamment, il est admis dans l'état de la technique que le ADN ligands ont une flexibilité moindre que l'ARN correspondant et qu'en conséquence sont moins aptes que les ARN ligands à subir des changements de conformation. On rappelle que lorsqu'un aptamère nucléique se lie à la protéine cible, il se produit un changement de conformation. Il a aussi été décrit que plus le changement de conformation de l'aptamère nucléique est rapide et plus l'affinité dudit aptamère nucléique pour la protéine cible est élevée (Michaud et al., 2003, Anal Chem, Vol. 76 : 1015-1020 ; Brumbt et al., 2005, Anal Chem, Vol. 77 : 1993-1998).
Dans certains modes de réalisation d'un support d'affinité selon l'invention, les aptamères nucléiques consistent en des aptamères ADN. En conséquence, dans certains modes de réalisation d'un support d'affinité selon l'invention, lesdits acides nucléiques immobilisés, le cas échéant inclus dans la structure d'un composé de formule (I), consistent en des acides désoxyribonucléiques. Dans certains autres modes de réalisation d'un support d'affinité selon l'invention, lesdits acides nucléiques consistent, pour une première partie d'entre eux, en des acides désoxyribonucléiques, et pour la partie restante en des acides ribonucléiques.
Un autre avantage des aptamères nucléiques concerne leur facilité de fabrication, comparée aux difficultés de synthèse des aptamères ARN, ainsi que leur prix de revient qui est significativement plus réduit que le prix de revient d'un aptamère ARN. Ces modes de réalisation spécifiques sont illustrés dans les exemples.
La présente invention a également pour objet un dispositif de chromatographie d'affinité pour la purification d'une protéine de la coagulation, comprenant un conteneur dans lequel est disposé une quantité adaptée d'un support d'affinité tel que défini dans la présente description.
Des formes variées de conteneurs pour supports de chromatographie sont connus dans l'état de la technique et sont englobés par la signification du terme conteneur ci-dessus. Les caractéristiques importantes d'un tel conteneur englobent la présence d'un moyen d'alimentation du dispositif de chromatographie d'affinité en échantillon de départ et d'un moyen de sortie du liquide après sa mise en contact avec le support d'affinité. La présente invention a aussi pour objet un procédé pour immobiliser une protéine de la coagulation sur un support, comprenant une étape au cours de laquelle on met en contact un échantillon contenant ladite protéine de la coagulation avec un support d'affinité tel que défini ci-dessus.
Par échantillon contenant une protéine de la coagulation , on entend en général tout type de solution liquide dans laquelle ladite protéine de la coagulation est en suspension ou est solubilisée. Des modes de réalisation spécifiques d'un tel échantillon, en particulier en relation avec le procédé de purification décrit ci-après, seront définis ultérieurement dans la présente description.
La présente invention est aussi relative à un procédé pour la purification d'une protéine de la coagulation comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact un échantillon contenant une protéine de la coagulation avec un support d'affinité tel que défini dans la présente description, afin de former des complexes entre (i) les aptamères nucléiques immobilisés sur ledit support d'affinité et (ii) ladite protéine de la coagulation, et b) libérer la protéine à partir des complexes formés à l'étape a), et c) récupérer ladite protéine de la coagulation sous une forme purifiée. Dans certains modes de réalisation préférés, ledit échantillon contient une protéine de coagulation humaine. Avantageusement, dans ces modes de réalisation, l'échantillon contenant une protéine de la coagulation d'intérêt consiste en un échantillon liquide qui contient ladite protéine d'intérêt, y compris un échantillon liquide comprenant ladite protéine d'intérêt et qui est susceptible de contenir aussi des molécules de la protéine de coagulation homologue d'un mammifère non humain. Dans certains modes de réalisation du procédé de purification ci-dessus, ledit échantillon consiste en une solution biologique, tels qu'un fluide corporel, une cellule, un broyat cellulaire, un tissu, un broyat tissulaire, un organe ou un organisme entier. Dans certains modes de réalisation du procédé de purification ci-dessus, ledit échantillon consiste en une solution biologique liquide provenant d'un animal tel que du sang, un dérivé du sang (dérivé sanguin), du lait de mammifère ou un dérivé du lait de mammifère. Ledit échantillon peut consister en du plasma, du cryoprécipité du plasma, du lait clarifié ou leurs dérivés. Dans des modes de réalisation particulièrement préférés du procédé de purification ci-dessus, ledit échantillon provient d'un animal transgénique pour la protéine d'intérêt humaine. Avantageusement la solution est du lait de mammifère ou un dérivé du lait de mammifère transgénique pour ladite protéine d'intérêt humaine. Au sens de l'invention, les animaux transgéniques englobent (i) les mammifères non humains tels que les vaches, les chèvres, les lapins, les porcs, les singes, les rats ou les souris, (ii) les oiseaux ou encore (iii) les insectes tels que les moustiques, les mouches ou les vers à soie. Dans certains modes de réalisation préférés, l'animal transgénique pour la protéine d'intérêt humaine est un mammifère transgénique non humain, de manière tout à fait préférée une lapine transgénique pour ladite protéine d'intérêt humaine. Avantageusement, le mammifère transgénique produit ladite protéine d'intérêt humaine recombinante dans ses glandes mammaires, du fait de l'insertion dans son génome d'une cassette d'expression comprenant acide nucléique codant ladite protéine d'intérêt qui est placé sous le contrôle d'un promoteur spécifique permettant l'expression de la protéine transgénique dans le lait dudit mammifère transgénique. Une méthode de production de ladite protéine humaine de la coagulation dans le lait d'un animal transgénique peut comprendre les étapes suivantes : une molécule d'ADN comprenant un gène codant la protéine d'intérêt, ledit gène étant sous le contrôle d'un promoteur d'une protéine sécrétée naturellement dans le lait (tels que le promoteur de la caséine, de la béta-caséine, de la lactalbumine, de la béta-lactoglobuline ou le promoteur WAP) est intégrée dans un embryon d'un mammifère non humain. L'embryon est ensuite placé dans une femelle de mammifère de la même espèce. Une fois que le mammifère issu de l'embryon s'est suffisamment développé, la lactation du mammifère est induite, puis le lait collecté. Le lait contient alors la protéine humaine recombinante d'intérêt. Un exemple de procédé de préparation de protéine dans le lait d'une femelle de mammifère autre que l'être humain est donné dans le document EP 0 527 063, dont l'enseignement peut être repris pour la production de la protéine de l'invention. Un plasmide contenant le promoteur WAP (Whey Acidic Protein) est fabriqué par introduction d'une séquence comportant le promoteur du gène WAP, ce plasmide étant réalisé de manière à pouvoir recevoir un gène étranger placé sous la dépendance du promoteur WAP. Le plasmide contenant le promoteur et le gène codant pour la protéine de l'invention sont utilisés pour obtenir des lapines transgéniques, par micro-injection dans le pronucléus mâle d'embryons de lapines. Les embryons sont ensuite transférés dans l'oviducte de femelles hormonalement préparées. La présence des transgènes est révélée par la technique de Southern à partir de l'ADN extrait des lapereaux transgéniques obtenus. Les concentrations dans le lait des animaux sont évaluées à l'aide de tests radio-immunologiques spécifiques. D'autres documents décrivent des procédés de préparation de protéines dans le lait d'une femelle de mammifère autre que l'homme. On peut citer, sans s'y limiter les documents US 7,045,676 (souris transgénique) et EP 1 739 170. (production de facteur von Willebrand dans un mammifère transgénique). Le procédé de purification de l'invention est également parfaitement adapté à l'obtention d'une protéine purifiée de la coagulation à partir d'un échantillon de plasma sanguin humain, ou d'une fraction de plasma sanguin humain, par exemple la fraction cryoprécipitée de plasma sanguin humain. Dans certains modes de réalisation du procédé de purification ci-dessus, la protéine de la coagulation cible est humaine. Dans certains modes de réalisation du procédé de purification ci-dessus, l'échantillon comprend au moins une protéine de la coagulation non-25 humaine. Dans certains modes de réalisation du procédé de purification ci-dessus, ladite protéine de la coagulation humaine est homologue à ladite protéine de la coagulation non-humaine. Dans certains modes de réalisation du procédé de purification ci-30 dessus, ladite protéine de la coagulation humaine est l'homologue de ladite protéine de la coagulation non-humaine Dans certains modes de réalisation du procédé de purification ci-dessus, l'échantillon de départ peut consister en le matériel brut, soit I 'échantillon de plasma sanguin humain, ou une fraction de celui-ci, soit le fluide corporel d'un 35 mammifère non humain transgénique pour la protéine d'intérêt, et qui contient ladite protéine d'intérêt à purifier. Les fluides corporels d'un mammifère non humain transgénique englobent le lait ou une fraction du lait, par exemple une fraction délipidée du lait ou bien encore une fraction appauvrie en micelles de caséine. Toutefois, le mode de réalisation ci-dessus n'est pas le mode de réalisation privilégié du procédé de purification de l'invention, notamment en raison du risque de colmatage du support d'affinité par les nombreuses protéines présentes dans l'échantillon brut de départ. Dans des modes de réalisation préférés, ledit échantillon de départ consiste en une solution liquide contenant la protéine de la coagulation d'intérêt en suspension dans ladite solution, ladite solution liquide consistant en un produit intermédiaire généré au cours d'un procédé de purification multi-étapes d'une protéine de la coagulation. A titre illustratif, pour un procédé de purification d'une protéine de la coagulation à partir d'un fluide corporel d'un mammifère non humain transgénique pour ladite protéine, l'échantillon de départ peut consister en un éluat d'une chromatographie d'échange d'ions pratiquée à partir d'un filtrat de lait dudit mammifère transgénique non humain. Ce mode particulier de réalisation d'un procédé de purification selon l'invention est illustré dans les exemples. De la même manière, pour un procédé de purification de la protéine de la coagulation d'intérêt à partir de plasma humain, l'échantillon de départ peut consister en un filtrat d'une étape de filtration en profondeur pratiquée sur la fraction cryoprécipitée d'un échantillon de plasma humain. De manière générale, les conditions d'utilisation du support d'affinité pour réaliser le procédé de purification de l'invention sont très similaires aux conditions d'utilisation conventionnelles d'un support de chromatographie classique, par exemple du type support d'immuno-affinité sur lequel sont immobilisé des anticorps ligands. L'homme du métier peut par exemple se référer à l'ouvrage de Bailon et al. (Pascal Bailon, George K. Ehrlich, Wen-Jian Fung and Wolfgang Berthold, An Overview of Affinity Chromatography, Humana Press, 2000).
Toutefois, comme cela sera détaillé dans la suite de la description, les conditions de l'étape c) d'élution du procédé de l'invention sont très avantageuses, pour la purification d'une protéine de la coagulation. A l'étape a), un volume approprié de l'échantillon à purifier est mis en contact avec le support d'affinité. Des complexes sont formés entre (i) les aptamères nucléiques immobilisés sur ledit support d'affinité et (ii) la protéine de la coagulation d'intérêt contenue dans l'échantillon à purifier. L'étape b) consiste en une étape d'élution des molécules de la protéine de la coagulation d'intérêt ayant formé des complexes avec les aptamères nucléiques au 5 cours de l'étape a). Comme cela est illustré dans les exemples, un avantage spécifique du procédé de purification ci-dessus est la possibilité de réaliser l'étape d'élution par mise en contact des complexes formés entre (i) les aptamères nucléiques immobilisés sur ledit support d'affinité et (ii) ladite protéine de la coagulation, avec 10 un agent chélateur des ions divalents, comme l'EDTA. Cet avantage technique, qui est rendu possible, grâce aux caractéristiques du support d'affinité de l'invention, permet l'élution de la protéine de la coagulation sans nécessiter un quelconque recours à l'utilisation de conditions drastiques d'élution, susceptibles de dénaturer, au moins partiellement, la protéine de 15 coagulation d'intérêt. Lesdites condition drastiques qui sont évitées englobent l'utilisation d"un pH acide pour l'étape d'élution, ce qui est couramment pratiqué pour les procédés de purification de protéines sur les supports d'affinité connus, et tout particulièrement sur les supports d'affinité comprenant des anticorps immobilisés. 20 Ainsi, dans certains modes de réalisation du procédé de purification ci-dessus, l'étape b) est réalisée par mise en contact du support d'affinité avec un tampon d'élution contenant un agent chélateur des ions divalents, de préférence l'EDTA. A titre illustratif, le tampon d'élution peut contenir une concentration finale 25 d'EDTA d'au moins 1 mM et d'au plus 30 mM. L'expression au moins 1 mM englobe au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 mM. L'expression au plus 30 mM englobe au plus 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 ou 11 mM. 30 A l'étape c), on récupère la protéine de la coagulation d'intérêt est purifiée en collectant le liquide d'éluat obtenu à la fin de l'étape b). A la fin de l'étape c), on obtient une composition liquide purifiée de la protéine de la coagulation d'intérêt. Ladite composition liquide purifiée peut ensuite être traitée de manière appropriée, selon toute technique connue de 35 conditionnement et de conservation des protéines, y compris par flaconnage direct ou après dilution avec une solution adaptée, ou encore par lyophilisation, préférentiellement dans des conditions stériles et apyrogènes, puis conservation dans des conditions appropriées, à température ambiante, à -4'C ou bien à basse température, selon le type de conditionnement choisi.
Comme cela a déjà été mentionné précédemment dans la présente description, le support d'affinité de l'invention peut, avec les cycles successifs d'utilisation pour la purification d'une protéine de la coagulation d'intérêt, subir une réduction de sa capacité d'absorption, par exemple du fait que l'étape c) d'élution ne permet pas systématiquement de libérer la totalité des molécules de protéine de la coagulation, ce qui réduit le nombre de sites aptamères libres pour les cycles ultérieurs de purification. Comme pour la totalité des supports de chromatographie connus, il est donc nécessaire, à des moments appropriés, de réaliser une étape de régénération du support d'affinité, afin de libérer la totalité des molécules de protéine coagulante dudit support, et d'éliminer toute substance pouvant être liée au matériau solide du support d'affinité, en général par fixation non spécifique. Ainsi, dans certains modes de réalisation, le procédé de purification de l'invention comprend une étape additionnelle d) de régénération du support d'affinité, par mise en contact dudit support d'affinité avec une solution de régénération. Des tampons variés pour la régénération de support de chromatographie, en particulier de supports de chromatographie d'affinité sont bien connus par l'homme du métier, qui peuvent être utilisés à l'étape d) du procédé. L'homme du métier peut se référer par exemple à l'ouvrage de Mohr et al. ( Affinity Chromatography: Practical and Theoretical Aspects, Peter Mohr, Klaus Pommerening, Edition: illustrated, CRC Press, 1985). A titre illustratif, l'étape d) de régénération du support d'affinité peut être réalisée par mise en contact dudit support avec une solution tampon de Tris 50 mM, Ethylène Glycol 50%, comme cela est illustré dans les exemples.
Comme cela est illustré dans les exemples, le procédé de purification ci-dessus permet l'obtention d'une protéine de la coagulation à un très haut degré de pureté, éventuellement à une degré de pureté supérieur à 99,95% en poids, par rapport au poids total des protéines contenues dans le produit final purifié. Un autre avantage du procédé de purification ci-dessus, en particulier dans les modes de réalisation dans lesquels l'échantillon de départ consiste en un échantillon comprenant la protéine humaine de la coagulation d'intérêt sous forme recombinante en mélange avec des protéines produites naturellement par le mammifère transgénique non humain, est que la composition finale comprenant la protéine humaine recombinante d'intérêt à haut degré de pureté est sensiblement exempte de protéines provenant dudit mammifère transgénique, et en particulier sensiblement exempte de protéines dudit mammifère, homologues de ladite protéine humaine recombinante. A titre illustratif, on a montré dans les exemples que du facteur VII humain recombinant produit dans le lait d'une lapine transgénique, puis purifié avec le procédé de purification défini dans la présente description, comprend moins de 1,5% en poids des protéines dudit mammifère transgénique, par rapport au poids desdites protéines contenues initialement dans l'échantillon de départ. Dans la même exécution du procédé de purification selon l'invention, 85% en poids du facteur VII humain recombinant présent dans l'échantillon de départ était contenu dans le produit final à haut degré de pureté en Facteur VII humain recombinant, supérieur à 99,95% du poids des protéines présentes. La présente invention a aussi pour objet une composition purifiée d'une protéine de la coagulation humaine recombinante comprenant au moins 99,9% en poids de ladite protéine humaine recombinante et qui est sensiblement exempte de protéines non humaines. La présente invention est aussi relative à une composition purifiée d'une protéine de la coagulation humaine recombinante comprenant au moins 99,9% en poids de ladite protéine humaine recombinante et au plus 0,1 % en poids de protéines non humaines, les pourcentages en poids étant exprimés par rapport au poids total en protéines de ladite composition purifiée. Dans la composition purifiée ci-dessus, au moins 99,9% englobe au moins 99,91%, 99,92%, 99,93%, 99,94%, 99,95%, 99,96%, 99,97%, 99,98% et 99,99%. Dans la composition purifiée ci-dessus, au plus 0,1% englobe au plus 0,09%, 0,08%, 0,07%, 0,06%, 0,05%, 0,04%, 0,03%, 0,02% et 0,01%. La présente invention est aussi relative à une composition purifiée telle que définie ci-dessus, utilisable comme médicament. L'invention concerne encore une composition pharmaceutique comprenant une composition purifiée d'une protéine de la coagulation humaine recombinante telle que définie ci-dessus, en combinaison avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables. L'invention a aussi trait à une composition purifiée telle que définie ci-dessus pour le traitement des troubles de la coagulation.
L'invention est également relative à l'utilisation d'une composition purifiée telle que définie ci-dessus pour la fabrication d'un médicament pour le traitement des troubles de la coagulation. La présente invention est en outre illustrée par les exemples suivants.
Exemple 1 : préparation d'un support d'affinité Le support d'affinité a été réalisé à partir d'un matériau de support solide consistant en une matrice sur laquelle on a greffé de la streptavidine (streptavidin- agarose ù Novagen ). On a introduit un volume de 1 ml de gel dans une conteneur consistant en une colonne (i.d. 11 mm). On a lavé le gel avec de l'eau purifiée, pour éliminer le solvant de stockage Les caractéristiques du qel sont : - Capacité d'adsorption de biotine : >_ 85 nanomole / ml de gel - Test fonctionnel : Capture >99% de thrombine biotinylée en 30 minutes à TA - Autres tests : Protease-free , endo/exonucléase-free, RNase-free. - Conservateur: 100 mM sodium phosphate pH7,5 + NaN3 0,02
La sortie de la colonne conditionnée ( packée ) (Hauteur de lit de gel = 1 cm) est connectée à un détecteur d'absorbance équipé d'un filtre UV à 254 nm et d'un enregistreur.
Les aptamères nucléiques anti-FVII humain biotinylés de séquence SEQ ID N° l sont solubilisés dans de l'eau purifiée à la concentration finale de 0,5 mg/0,187 ml, soit une concentration molaire finale de 0,1 mM. La solution d'aptamères nucléiques a été activée à 95'C selon le cycle stan dard, pour l'immobilisation des aptamères sur le matériau support solide..35 La solution d'aptamères nucléiques a été préalablement diluée par 4,8 ml d'eau purifiée puis 1,5 ml de tampon Me' (5 x concentré). Le détecteur d'absorbance est ajusté à 1 AUFS (Absorbance Unit Full Scale) et on enregistre la DO à 254 nm de cette solution à 0,575 UA254.
La solution d'aptamères nucléiques biotinylés est injectée sur le gel streptavidin-agarose pré-conditionnée ( prépackée ) et mise en recirculation avec une pompe péristaltique à un débit de 2,5 ml/minute, soit un temps de contact sur le gel de 24 secondes (entrée/sortie E/S). Dans ces conditions, la DO à 254 nm se stabilise rapidement à 0,05 UA254, soit une valeur de 91% de couplage théorique, c'est-à-dire 0,455 mg d'aptamères nucléiques par millilitre de gel. Un lavage avec un tampon 10 mM CaCl2 + 4 mM MgCl2 puis en NaCl 2M est réalisé, afin d'éliminer les aptamères nucléiques qui ne sont pas fixées spécifiquement aux molécules de streptavidine greffées sur le matériau de support solide.
Example 2 : Procédé de purification du Facteur VII recombinant humain Les supports d'affinité aptamères ont été testés à partir d'une préparation purifiée en FVII/FVIla préparée selon la technique décrite dans la demande PCT n° WO2008/099077.
Préparation de l'échantillon à purifier La matière biologique de départ est du lait de lapine transgénique contenant du FVII humain recombinant. La cassette d'expression comprend le transgène FVII 25 humain placé sous le contrôle du promoteur du gène de la 3-caseine. Brièvement, 140 millilitres de lait ont été collectés sur 2 lapines en première lactation entre le Jour 4 et le Jour 12 après mise bas. Le titre moyen en FVII amidolytique (FVII biologiquement activable) dans le lait collecté est de 928 Ul/ml. Les laits sont conservés à une température de -80'C. 30 Pour l'essai, les laits de lapine sont décongelés au bain-marie à la température de 37'C, puis sont dilués par une solut ion de Citrate de Sodium pour une concentration finale [de citrate de sodium ?] en protéines de 62 g/I à un pH de 7,5 . Le traitement par le citrate de sodium permet la déstabilisation des micelles 35 phosphocalciques de caséines.
La solution protéique riche en lipides du lait est ensuite clarifiée sur une séquence de filtres, respectivement (i) filtre profondeur de 15 à 0,5 pm de seuil de porosité puis (i) filtre membrane à 0,2 pm. Un volume de 360 ml de solution filtrée ayant un titre en FVII de 198 Ul/ml, soit 36 mg de FVII transgénique, est pré-purifié sur un gel de chromatographie MEP-HyperCel (Pals BioSepra) d'un volume de 16 mL.. Ce gel de capture permet d'éliminer 95% des protéines du lait, dont la plus grande partie des caséines, tout en conservant 60% de la quantité de FVII initiale. Une quantité de 17,5 mg de FVII de faible pureté (ù5%) obtenu à la fin de l'étape ci-dessus est purifiée par chromatographie d'échanges d'ions, en utilisant un gel de Q-sepharose XL (GE Healthcare) d'un volume de 20 mL, Le FVII humain est élué avec un volume de 78 ml de tampon comprenant 5 mM de chlorure de calcium. La concentration en FVII amydolitique est de 337 Ul/ml, soit 0,17 mg de FVII/ml et la concentration en protéines totales est estimée à 0,18 mg/ml par mesure de DO à 280 nm et El% = 13, soit une pureté en FVII de 94%. Les protéines résiduelles provenant du lait de lapine sont difficilement séparables du FVII à ce stade, soit parce qu'il existe des homologies de structures telles que des protéines à GLA-domaines ou à domaine EGF, ou bien des homologies physico-chimiques (charge ionique et/ou taille moléculaire proche). Les techniques classiques permettent une amélioration de la pureté jusqu'à 99,95% par des techniques orthogonales (combinaison de séparation sur gel d'hydroxyapatite et par chromatographie d'exclusion de taille). Cependant, pour l'injection répétée à l'homme, la charge en protéines exogènes admises pour les protéines de recombinaison génétique ne doivent pas dépasser 50 ppm soit une pureté > 99,995%. Une telle pureté ne semble atteignable qu'après purification sur matrice d'affinité.
Etape de purification du FVII recombinant humain sur le support d'affinité de l'invention Un volume de 6 ml de la solution de FVII humain purifié (1,1 mg de FVII) obtenue à la fin de l'étape précédente est utilisée pour l'étape de purification à un haut niveau de pureté du FVII humain recombinant avec le support d'affinité de l'invention. La solution de FVII obtenue à l'étape précédente, préalablement ajustée à 4 mM MgCl2 et 10 mM CaCl2 et pH 7,5, est injectée sur le gel Aptamère-agarose (support d'affinité) avec une pompe péristaltique à un débit de 0,1 ml/minute soit un temps de contact avec le support d'affinité de 10 minutes (E/S). Après injection, le gel est lavé en tampon tris 50 mM + NaCl 50mM + 4 mM MgCl2 + 10 mM CaCl2 à pH 7,5.
Un volume de 10 ml de solution non adsorbé est collecté. Le FVII est élué par un tampon tris 50mM + EDTA 10 mM à pH 7,5. La collecte du pic d'élution est réalisée suivant le profil de DO. Selon les calculs molaires, la quantité d'aptamères nucléiques immobilisés dans le support d'affinité est de 17 nanomoles, ce qui correspond, pour une interaction mole à mole avec les molécules de FVII, à une capacité absolue du support d'affinité de 0,9 mg de FVII.
La figure 1 illustre un profil de chromatographie du FVII humain recombinant produit dans le lait de lapine, avec un suivi en continu des valeurs d'absorbance (D.O.) à 254 nanomètres. Sur la Figure 1, l'inflexion (2) de la courbe d'absorption, après le moment de l'injection (1) illustre le début de la saturation du support d'affinité avec le FVII humain recombinant. Au temps (3) l'injection de FVII humain recombinant est stoppée. Pour illustrer l'échelle linéaire des temps sur la Figure 1, on indique que la durée entre le temps de début d'injection (1) et le temps de fin d'injection (2) est de 10 minutes. Le support d'affinité continue de se saturer avec la protéine de la coagulation d'intérêt : des complexes entre (i) les aptamères nucléiques anti-FVII du support d'affinité et (ii) les molécules de FVII humain recombinant initialement contenues dans la composition à purifier ont été formés. Après passage de la composition à purifier, on procède à une étape de lavage (6) de la colonne avec le tampon de lavage spécifié précédemment. Puis on réalise l'étape d'élution, par injection au temps (4) de la solution tampon comprenant une concentration finale de 10 mM en EDTA. Le pic d'absorption illustre la libération du FVII humain recombinant à partir des complexes Aptamères nucléiques/FVII recombinant. On note que les molécules de FVII humain recombinant sont libérées rapidement et donc dans un faible volume. En conséquence, grâce au support d'affinité de l'invention, on obtient une solution d'élution de forte concentration en protéine FVII humain recombinant. Au temps (5), on a réalisé une étape de régénération du support d'affinité, avec un tampon Tris à 50 mM. Le pic d'absorbance visible en (7) correspond aux substances libérées du support d'affinité du fait de l'étape de régénération.
Capacité dynamique d'absorption du support d'affinité Le tableau 1 ci-dessous présente les résultats de l'essai, qui montrent une capacité dynamique d'adsorption de 0,45 à 0,49 mg/ml des matrices d'affinité soit 50 à 55% de ligands bio-disponibles. En EDTA, on calcule un rendement dynamique d'élution d'environ 75%.
Tableau 1 : bilan FVII recombinant humain et Protéines totales des essais de matrices Aptamères-aqarose: FVII recombinant Protéines (total mg) DBC DE(%) (mg/m)l Départ 2228 100% 1,42 100% Final Non 924 41 % 0,57 40% adsorbé éluat 971 44% 0,61 43% 0,49 74% Résultats 85% 83% pondéraux Départ : échantillon de départ Final : composition des fractions BDC : capacité dynamique d'absorption (pour Dynamic Binding Capacity ) DE : Rendement dynamique d'élution (pour Dynamic Elution ) ; qui représente le rapport entre le FVII recombinant élué et le FVII recombinant adsorbé, exprimé en pourcentage Capacité de séparation spécifique du support d'affinité Les supports d'affinité ont été évalués en spécificité par un dosage ELISA spécifique des protéines du lait de lapines.
Les résultats sont représentés dans le Tableau 2 ci-dessous.
Tableau 2 : bilan de la spécificité des supports d'affinité : (total FVII recombinant Protéines du lait de RMP % pureté mg) (ppm) FVII lapine (RMP) Départ 1,11 100% 16992 100% 16782 98,32% Final Non 0,46 41% 14590 40% 34738 96,53% adsorbé éluat 0,49 44% 217 43% 492 99 ,95% Résultats 85% 83% pondéraux Les résultats du Tableau 2 ci-dessus montrent que l'on obtient une moyenne de 2 logo d'élimination des Aptamères-agarose portant la pureté du FVII humain transgénique de 98,3% à 99,95%. Ceci montre une bonne spécificité des aptamères vis-à-vis du FVII humain et très peu d'interactions aux protéines résiduelles du lait de lapines.
Une amélioration est possible par des lavages intermédiaires avant élution par des solutions telles que NaCl 2M et/ou Propylène Glycol ou Ethylène Glycol à 50% si dans ces conditions le FVII ne s'élue pas.
Les résultats de l'exemple 2 illustrent les excellentes caractéristiques des supports d'affinité sur gel Aptamère-agarose (Apta-2) avec une capacité dynamique d'adsorption d'au moins 1 mg de FVII par mg de ligand avec un rendement d'élution d'au moins 75%. La spécificité est également bien établie avec une nette amélioration de la pureté (û99,95%), une élimination de 2 logo des RMP rabbit milk proteins résiduelles. Le taux final s'établit à environ 500 ppm sur ces 2 essais non optimisés.
Claims (14)
- REVENDICATIONS1. Support d'affinité pour la fixation sélective d'une protéine de la coagulation, comprenant un matériau support solide sur lequel sont immobilisés des aptamères nucléiques se liant spécifiquement à ladite protéine de la coagulation.
- 2. Support d'affinité selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits aptamères nucléiques consistent en des aptamères désoxyribonucléiques.
- 3. Support d'affinité selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que lesdits aptamères nucléiques sont inclus dans la structure d'un composé de formule (I) suivante : [FIX]X [SPAC]y- [APT] (I), dans laquelle : - [FIX] signifie un composé d'immobilisation sur un support, - [SPAC] signifie une chaîne espaceur, - [APT] signifie un acide nucléique se liant spécifiquement à une protéine de la coagulation, - x est un entier égal à 0 ou 1, et - y est un entier égale à 0 ou 1.
- 4. Support d'affinité selon la revendication 3, caractérisé en ce que, dans le composé de formule (I), [APT] consiste en un acide désoxyribonucléique de séquence SEQ ID N° 1.
- 5. Support d'affinité selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la protéine de la coagulation est choisie parmi le Facteur I (fibrinogène), le Facteur II (prothrombine), le Facteur V (proaccélérine), le Facteur VII (proconvertine), le Facteur VIII (facteur anti-hémophilique A), le Facteur IX (facteur anti-hémophilique B), le Facteur X (Facteur Stuart), le Facteur XI (Facteur Rosenthal ou PTA), le Facteur XII (Facteur Hageman), le Facteur XIII (Facteur stabilisant la fibrine ou FSF), la PK (Prékalicrine) le KHPM (kininogène de haut poids moléculaire), la thromboplastine tissulaire, le cofacteur II de l'héparine (HCII), la proteine C (PC), la thrombomoduline (TM), la proteine S (PS), le facteur de Willlerbrand (Wf) et l'inhibiteur de la voie du facteur tissulaire (TFPI), ou encore les facteurs tissulaires 5
- 6. Support d'affinité selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le matériau support solide est choisi parmi les résines, les billes de polymères, les billes magnétiques, les billes paramagnétiques, les matériaux supports de membrane filtrante, et les matériaux polymères.
- 7. Procédé pour immobiliser une protéine de la coagulation sur un support, comprenant une étape au cours de laquelle on met en contact un échantillon contenant ladite protéine de la coagulation avec un support d'affinité selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 10
- 8. Procédé pour la purification d'une protéine de la coagulation comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact un échantillon contenant une protéine de la coagulation avec un support d'affinité selon l'une des revendications 1 à 6, afin de former des 15 complexes entre (i) les aptamères nucléiques immobilisés sur ledit support d'affinité et (ii) ladite protéine de la coagulation, et b) libérer la protéine à partir des complexes formés à l'étape a), et c) récupérer ladite protéine de la coagulation sous une forme purifiée. 20
- 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que ledit échantillon est choisi parmi du plasma sanguin humain, ou une faction de celui-ci, ou du lait d'un mammifère transgénique pour ladite protéine de la coagulation, ou une fraction de celui-ci. 25
- 10. Procédé selon l'une des revendications 8 et 9, caractérisé en ce que la protéine du plasma sanguin est humaine.
- 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'échantillon comprend au moins une protéine du plasma sanguin non-humaine
- 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que ladite protéine du plasma sanguin humaine est homologue à ladite protéine du plasma non-humaine. 30 32 2942232
- 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que ladite protéine du plasma sanguin humaine est l'homologue de ladite protéine du plasma non-humaine.
- 14. Procédé selon l'une des revendications 8 à13, caractérisé en ce que l'étape b) est réalisée par mise en contact du support d'affinité avec un tampon d'élution contenant un agent chélateur des ions divalents, de préférence l'EDTA
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