KR20110037930A - 단백질 정제용 분리제 및 단백질 정제방법 - Google Patents

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세이지 마스모토
카츠오 코미야
코지 나카무라
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토소가부시키가이샤
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Abstract

저염 농도의 완충액에서 용이하게 단백질을 흡착할 수 있고, 그 흡착량은 단백질을 정제하는데 충분한 양이며, 또한, 그 완충액의 pH를 변화시키는 것만으로 용이하게 단백질을 용리시킬 수 있는 단백질 정제용의 신규한 분리제, 그 간편하고도 경제적인 제조방법 및 그것을 이용한 단백질 정제방법을 제공한다. 하기 화학식 1로 표시되는 리간드 및 하기 화학식 2로 표시되는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 리간드를, 스페이서 아암을 개재하는 일없이, 담체 상에 우레탄 결합에 의해 고정화시킨다:
[화학식 1]
Figure pct00025

[화학식 2]
Figure pct00026

(상기 식들 중, m은 2 내지 6의 정수를 나타내고, R1 및 R2는 수소원자 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬기를 나타내며, n은 1 내지 6의 정수를 나타냄).

Description

단백질 정제용 분리제 및 단백질 정제방법{SEPARATING AGENT FOR PURIFICATION OF PROTEIN, AND PROTEIN PURIFICATION METHOD}
본 발명은 특정 리간드를 지닌 신규한 단백질 정제용 분리제와, 그 제조방법 및 그것을 이용한 단백질 정제방법에 관한 것이다.
표적 화합물의 수성 혼합물로부터의 분리 및 정제를 가능하게 하기 위하여, 최근, 몇 가지 기술이 개발 및/또는 최적화되어 가고있다. 이러한 분리 기술 및/또는 정제 기술로서, 예를 들어, 이온교환크로마토그래피, 소수성 상호작용크로마토그래피(HIC: Hydrophobic Interaction Chromatography)(예를 들어, 비특허문헌 1 참조), 흡착 크로마토그래피 등이 공지되어 있다. 이들 크로마토그래피 기술의 다양성은, 표적화합물을 분리 및/또는 정제하는 복잡함을 최소화하는 한편, 분리 및/또는 정제를 행하는 곤란함을 반영하고 있다. 그리고, 상기 각각의 기술은, 그들의 폭넓은 산업적 규모에서의 이용을 제한하고 있는 하나 이상의 결점을 지니고 있다.
예를 들어, 믹스 모드 크로마토그래피(mixed mode chromatography)용 수지는, 소수적인 조건하에서는 상기 수지가 표적화합물을 결합하는 것이 가능하고, 정전기적(이온적) 또는 친수성 조건하에서는 상기 수지로부터 표적화합물을 방출하는 것이 가능한 분야에서 이용되고 있다(예를 들어, 비특허문헌 2 내지 5 참조).
종래의 믹스 모드 크로마토그래피용 수지의 전형적인 문제의 하나는, 표적화합물의 용액에 있어서, 고염 농도가 이용되고 있지 않을 경우, 그다지 소수적이지 않은 표적화합물의 상기 수지에의 결합 효율이 그리 높지 않은 것이다.
예를 들어, 비특허문헌 2에 있어서는, 예비적인 레벨에서의 단백질의 상기 수지에의 결합은, 1M NaCl 용액을 사용함으로써 달성되고 있다. 표적화합물을 포함하고 있는 수성 용액에 염의 첨가를 필요로 하는 크로마토그래피 기술은, 산업적 규모에서의 수율을 달성하기 위해서는, 대량의 시약이 필요하고, 상당한 공정을 필요로 한다. 즉, 높은 농도의 염의 사용을 필요로 하는 크로마토그래피용 수지는, 이러한 표적화합물의 산업적인 양의 회수 및/또는 정제를 위한 가장 효과적이고도 비용 효과를 지닌 방법은 아니다.
이 때문에, 특허문헌 1은, 1개의 이온성 작용기 및 리간드(ligand)를 수지의 고체 지지 매트릭스에 공유결합으로 연결시키고 있는 1개의 스페이서로 이루어진 특정 이온성 리간드의 이용과, 조합된 믹스 모드 크로마토그래피용 수지 상의 고리간드 밀도의 이용에 의해, 표적화합물이 고이온 강도 및 저이온 강도로 수지에 결합하는 바와 같은, 충분한 소수성의 성질을 제공할 수 있는 것으로 하고 있다. 또, 특허문헌 1은, 표적화합물의 수지로부터의 방출의 달성이, 이온성 작용기를 개재한 수지 상의 전하의 양을 증가시켜, 단순하게 방출 용액의 pH를 변화시킴으로써, 친수적 또는 정전기적(이온성) 상호작용에 의해서 가능한 것으로 하고 있다.
그러나, 특허문헌 1에 기재된 방법에 있어서는, 담체(고체 지지 매트릭스)와 리간드와의 사이에 스페이서 아암을 개재하므로, 그 제조방법에 있어서 매우 복잡하고 많은 프로세스를 거치기 때문에, 제조 비용이 매우 높아진다고 하는 문제가 있다.
즉, 특허문헌 1에 기재된 방법에 있어서, 스페이서 아암이란, 이온성 작용기를 고체 지지 매트릭스에 공유결합적으로 부착되는 원자단 또는 치환체를 의미한다. 이러한 스페이서 아암으로서는, 알킬렌기, 방향족 기, 알킬 방향족 기, 아마이드기, 아미노기, 유레아기, 카바메이트기, R1 및 R2가 각각 1개의 알킬렌기(예를 들면 C1 내지 C6)이고, Y가 산소 또는 황인 -R1-Y-R2-기 및 그들과 유사한 것이 예시되어 있다.
그리고, 상기 스페이서 아암의 담체에의 부착(결합)방법으로서는, 예를 들어, 고체 지지 매트릭스를 카보닐다이이미다졸(CDI)을 이용해서 활성화시키고, 아미노카프론산과 반응시켜, 우레탄 중성결합을 형성시키는 방법이 실시되어 있다(특허문헌 1 참조).
또한, 상기 스페이서 아암에의 리간드의 부착(결합)방법으로서는, 예를 들어, 카보다이이미드(EDC)를 이용해서, 아민 리간드를 아미노카프론산 수지와 커플링 반응시켜, 아마이드 결합을 형성시키는 방법이 실시되어 있다(특허문헌 1 참조).
이와 같이, 특허문헌 1에 기재된 방법에서는, 크로마토그래피용 수지의 제조에 있어서, 번잡한 프로세스를 거칠 필요가 있다. 또, 리간드, 스페이서 아암 및 고체 지지 매트릭스의 선택에 따라서, 최적 pH 범위로 제어할 필요가 있어, 프로세스가 더욱 번잡화된다고 하는 문제도 생긴다.
한편, 종래의 단백질 정제용의 크로마토그래피용 충전제는, 단백질을 흡착할 때의 완충액 중에 대량의 염을 첨가할 필요가 있고, 나중에 이것을 제거하기 위해서, 비용과 노동력이 필요하기 때문에, 염의 양을 저감시키는 간편한 조작으로 단백질을 흡착할 수 있는 충전제의 개발이 기대되고 있다.
JPH(일본국 특표평)10-506987 A
Biochimie, Vol. 60, 1~15쪽(1978) J. Chromatogr., Vol. 510, 149~154쪽(1990) J. Chromatogr., Vol. 296, 329~337쪽(1984) Chem. Rev., Vol. 89, 309~319쪽(1989) J. Chromatogr., Vol. 317, 251~261쪽(1984)
본 발명은 상기 배경기술을 감안하여 이루어진 것으로서, 그 목적은, 저염 농도의 완충액에서 용이하게 단백질을 흡착할 수 있고, 그 흡착량은 단백질을 정제하는데 충분한 양이며, 또한, 그 완충액의 pH를 변화시키는 것만으로 용이하게 단백질을 용리시킬 수 있는 단백질 정제용의 신규한 분리제, 그 간편하고도 경제적인 제조방법 및 그것을 이용한 단백질 정제방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은, 단백질 정제용의 분리제에 대해서 예의 검토를 거듭한 결과, 우레탄 결합에 의해 결합된 특정 리간드를 담체 상에 지닌 분리제가, 본 발명의 목적을 달성하는 것을 찾아내어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은, 이하에 나타낸 바와 같은 단백질 정제용 분리제 및 그것을 이용한 단백질 정제방법이다.
[1] 하기 화학식 1로 표시되는 리간드 및 하기 화학식 2로 표시되는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 리간드가, 담체 상에 우레탄 결합에 의해 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 단백질 정제용 분리제:
[화학식 1]
Figure pct00001
(상기 화학식 1 중, m은 2 내지 6의 정수를 나타냄);
[화학식 2]
Figure pct00002
(상기 화학식 2 중, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소원자 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬기를 나타내고, n은 1 내지 6의 정수를 나타냄).
[2] 상기 화학식 1로 표시되는 리간드가 하기 화학식 3으로 표시되는 것을 특징으로 하는 상기 [1]항에 기재된 단백질 정제용 분리제:
[화학식 3]
Figure pct00003
(상기 화학식 3 중, m은 2 내지 4의 정수를 나타냄).
[3] 상기 화학식 2로 표시되는 리간드가 하기 화학식 4로 표시되는 것을 특징으로 하는 상기 [1]항 또는 [2]항에 기재된 단백질 정제용 분리제:
[화학식 4]
Figure pct00004
(상기 화학식 4 중, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소원자 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬기를 나타내고, n은 1 내지 4의 정수를 나타냄).
[4] 상기 담체 상의 리간드의 함유량이 100 μmol/㎖-담체 이상인 것을 특징으로 하는 상기 [1]항 내지 [3]항 중 어느 한 항에 기재된 단백질 정제용 분리제.
[5] 상기 담체가 가교 고분자로 이루어진 담체인 것을 특징으로 하는 상기 [1]항 내지 [4]항 중 어느 한 항에 기재된 단백질 정제용 분리제.
[6] 상기 [1]항 내지 [5]항 중 어느 한 항에 기재된 단백질 정제용 분리제를 제조하는 방법으로서,
담체를 유기용매 중에서 활성화제와 반응시켜, 담체 표면의 수산기를 활성화시킨 후, 얻어진 활성화 담체를 유기용매 중에서 하기 화학식 5로 표시되는 1급 아민 및 하기 화학식 6으로 표시되는 1급 아민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 아민과 반응시키는 것을 특징으로 하는 단백질 정제용 분리제의 제조방법:
[화학식 5]
Figure pct00005
(상기 화학식 5 중, m은 2 내지 6의 정수를 나타냄);
[화학식 6]
Figure pct00006
(상기 화학식 6 중, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소원자 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬기를 나타내고, n은 1 내지 6의 정수를 나타냄).
[7] 상기 화학식 5로 표시되는 1급 아민이 하기 화학식 7로 표시되는 것을 특징으로 하는 상기 [6]항에 기재된 단백질 정제용 분리제의 제조방법:
[화학식 7]
Figure pct00007
(상기 화학식 7 중, m은 2 내지 4의 정수를 나타냄).
[8] 상기 화학식 6으로 표시되는 1급 아민이 하기 화학식 8로 표시되는 것을 특징으로 하는 상기 [6]항 또는 [7]항에 기재된 단백질 정제용 분리제의 제조방법:
[화학식 8]
Figure pct00008
(상기 화학식 8 중, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소원자 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬기를 나타내고, n은 1 내지 4의 정수를 나타냄).
[9] 상기 활성화제가 카보닐다이이미다졸인 것을 특징으로 하는 상기 [6]항 내지 [8]항 중 어느 한 항에 기재된 단백질 정제용 분리제의 제조방법.
[10] 정제 목적의 단백질을 제1완충액에 용해시켜, 얻어진 단백질 용액을, 상기 [1]항 내지 [5]항 중 어느 한 항에 기재된 단백질 정제용 분리제와 접촉시켜서 단백질을 흡착시킨 후, 상기 제1완충액과는 pH가 다른 제2완충액을 상기 분리제에 흐르게 해서, 상기 분리제에 흡착된 단백질을 용출시키는 것을 특징으로 하는 단백질 정제방법.
본 발명의 단백질 정제용 분리제는, 이온 교환성 및 소수성을 지니는 특정 리간드가, 스페이서 아암을 개재하는 일없이, 담체 상에 우레탄 결합에 의해 결합되어 있기 때문에, 간편하고도 경제적인 제조방법에 의해 조제할 수 있다.
또, 본 발명의 단백질 정제용 분리제에 있어서, 상기 리간드는, 단백질을 흡착하기 위해서 충분한 양이 담체에 고정화되어 있고, 이온 교환성 및 소수성의 양쪽의 성질을 지니고 있기 때문에, 저농도의 완충액에서 용이하게 단백질이 흡착되어, 그 양도 단백질 정제용으로서 충분한 흡착량으로 된다. 또한, 상기 리간드는, 완충액의 pH를 변화시키는 것만으로 용이하게 흡착된 단백질을 탈리시키는 것이 가능하여, 본 발명의 분리제는, 단백질 정제용의 크로마토그래피용 충전제로서 특히 유용하다.
이하에 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 단백질 정제용 분리제는, 하기 화학식 1로 표시되는 리간드 및 하기 화학식 2로 표시되는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 리간드가, 스페이서 아암을 개재하는 일없이, 담체 상에 우레탄 결합에 의해 결합되어 있는 것을 특징으로 한다:
[화학식 1]
Figure pct00009
(상기 화학식 1 중, m은 2 내지 6의 정수를 나타냄);
[화학식 2]
Figure pct00010
(상기 화학식 2 중, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소원자 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬기를 나타내고, n은 1 내지 6의 정수를 나타냄).
본 발명에 있어서, 리간드란, 분리·정제를 목적으로 하는 물질과 특이적으로 결합하는 물질을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 리간드로서는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 하기 화학식 3으로 표시되는 리간드가 바람직하고, 4-피리딜에틸기[화학식 3 중, m=2]가 특히 바람직하다:
[화학식 3]
Figure pct00011
(상기 화학식 3 중, m은 2 내지 4의 정수를 나타냄).
또, 본 발명에 있어서, 상기 화학식 2로 표시되는 리간드로서는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 하기 화학식 4로 표시되는 리간드가 바람직하고, 4-아미노벤질기[화학식 4 중, R1 및 R2는 수소원자, n=1]가 특히 바람직하다:
[화학식 4]
Figure pct00012
(상기 화학식 4 중, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소원자 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬기를 나타내고, n은 1 내지 4의 정수를 나타냄).
본 발명의 단백질 정제용 분리제에 사용하는 담체로서는, 칼럼 크로마토그래피용의 충전제로서 사용되는 공지의 담체를 사용할 수 있고, 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 다공질 유리, 다공질 실리카겔 등의 무기 다공질 재료; 아가로스, 덱스트란, 셀룰로스 등의 다당류; 폴리아크릴아마이드, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리비닐알코올, 스타이렌-다이비닐벤젠 공중합체 등의 합성 고분자 등을 바람직한 것으로서 들 수 있다.
본 발명에 있어서는, 상기 리간드를, 스페이서 아암을 개재하는 일없이, 우레탄 결합에 의해 담체 상에 결합시키므로, 상기 담체의 표면에 수산기를 갖는 것이 바람직하다. 또한, 담체의 표면에 종래 공지의 방법에 의해 수산기를 도입해도 된다.
본 발명의 단백질 정제용 분리제를 공업적 규모로 사용할 경우에는, 정제 조작 후에 충전제의 알칼리 세정이 실시되므로, 담체로서는, 알칼리에 대해서 내성이 있는 다당류나, 합성 고분자로 이루어진 담체가 바람직하다. 합성 고분자로서는, 친수성 비닐 폴리머나, (메타)아크릴레이트 가교공중합체 등의 가교 고분자가 특히 바람직하다.
본 발명에 있어서, 담체의 형상으로서는, 그 사용 형태에 따라 다르므로, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 구형상 입자, 비구형상 입자, 막, 모놀리스(monolith)(연속체) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 칼럼 크로마토그래피용의 충전제로서 이용할 경우에는, 입자 형상으로 하는 것이 바람직하고, 칼럼 중에 균일한 충전을 행하기 위해서는 구형상 입자로 하는 것이 더욱 바람직하다. 또, 연속한 일체형의 원기둥 형상의 다공질체를 칼럼에 장착한 것이어도 된다. 또한, 막 형상의 분리제를 이용한 크로마토그래피도 가능하다.
담체의 형상을 입자 형상으로 해서 사용할 경우, 그 크기는, 사용 조건에 따라서 적당한 크기를 선택하는 것이 바람직하고, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, HPLC(High Performance Liquid Chromatography)용의 충전제로서 이용할 경우에는, 평균 입자 직경이 5 내지 15㎛ 정도인 것을 이용하는 것이 바람직하고, 8 내지 12㎛인 것이 보다 바람직하다. 또한, 소량의 분취를 목적으로 할 경우에는, 통상 15 내지 50㎛, 바람직하게는 20 내지 30㎛이며, 공업 프로세스에서 사용할 목적에서는, 통상 50 내지 300㎛ 정도, 바람직하게는 50 내지 100㎛의 평균 입자 직경인 것을 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 충전제에 있어서, 상기한 리간드를, 담체 상에 우레탄 결합으로 고정화시키는 방법으로서는, 종래 공지의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 담체를 유기용매 중에서 활성화제와 반응시켜서, 담체의 표면에 지니거나 또는 도입되어 있는 수산기를 활성화한 후, 그 활성화 담체를 유기용매 중에서, 하기 화학식 5로 표시되는 1급 아민 및 하기 화학식 6으로 표시되는 1급 아민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 아민과 반응시킴으로써, 우레탄 결합을 형성하고, 상기 리간드를 우레탄 결합에 의해 담체 상에 고정화시킬 수 있다:
[화학식 5]
Figure pct00013
(상기 화학식 5 중, m은 2 내지 6의 정수를 나타냄);
[화학식 6]
Figure pct00014
(상기 화학식 6 중, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소원자 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬기를 나타내고, n은 1 내지 6의 정수를 나타냄).
상기 방법에 의해, 간편하고도 경제적으로 본 발명의 단백질 정제용 분리제를 조제할 수 있다.
이 고정화 방법에 있어서, 활성화제로서는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 카보닐다이이미다졸(CDI) 등을 바람직한 것으로서 들 수 있다.
또, 상기 화학식 5로 표시되는 1급 아민으로서는, 하기 화학식 7로 표시되는 1급 아민이 바람직하고, 4-(2-아미노 에틸)피리딘[화학식 7 중, m=2]이 특히 바람직하다:
[화학식 7]
Figure pct00015
(상기 화학식 7 중, m은 2 내지 4의 정수를 나타냄).
상기 화학식 6으로 표시되는 1급 아민으로서는, 하기 화학식 8로 표시되는 1급 아민이 바람직하고, 4-아미노벤질아민[화학식 8 중, R1 및 R2는 수소원자, n=1]이 특히 바람직하다:
[화학식 8]
Figure pct00016
(상기 화학식 8 중, R1 및 R2는, 각각 독립적으로 수소원자 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬기를 나타내고, n은 1 내지 4의 정수를 나타냄).
이들 일련의 반응에 이용하는 유기용매는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 1,4-다이옥산이나 다이메틸설폭사이드 등의 비프로톤성 용매를 통상 이용한다. 담체를 CDI에서 활성화시키는 반응은, 통상은 15 내지 30℃, 바람직하게는 20 내지 25℃의 범위에서 실시하고, 반응시간은 통상 1시간 내지 3시간의 범위이다. CDI에서 활성화시킨 담체를, 상기 화학식 5로 표시되는 1급 아민 및 상기 화학식 6으로 표시되는 1급 아민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 아민과 반응시켜, 상기한 리간드를 우레탄 결합에 의해 담체 상에 고정화시키는 반응은, 통상은 15 내지 30℃, 바람직하게는 20 내지 25℃의 범위에서 실시하고, 반응시간은, 통상 18 내지 30시간의 범위이다.
담체 상의 리간드의 함유량은, 단백질 흡착 효율을 현저하게 향상시키기 위해서는, 담체 1㎖당, 상기 1급 아민이 100 μmol 이상(이하, "100 μmol/㎖-담체 이상"이라 표기함)인 것이 바람직하고, 200 μmol/㎖-담체 이상인 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 단백질 정제용 분리제로 정제할 수 있는 단백질로서는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 면역글로불린 G(IgG), 면역글로불린 A(IgA), 면역글로불린 M(IgM), 면역글로불린 E(IgE), 알부민, 키모트립시노겐 A, 키모트립시노겐 B, 키모트립시노겐 C, 키모트립신 Aα, 키모트립신 C, 키모트립신 인히비터, 트립신, 트립신 인히비터, 리소자임, 리보뉴클레아제 A, 리보뉴클레아제 T1, 리보뉴클레아제 T2, 아스파라기나제, α-아밀라제, β-아밀라제, α-아밀라제 인히비터 I, α-아밀라제 인히비터 II, 아르기나제, 인슐린, 인터페론, 유리카제(uricase), 유로키나제, 에스트로겐 리셉터 I, 에놀라제, 엘라스타제, 에리트로포이에틴, 황체형성 호르몬, 카탈라제, 칼리크레인(kallikrein), 칼리크레인 인히비터, 칼시토닌, 키모신, 프로키모신, 파파인, 키모파파인 A, 키모파파인 B, 글루카곤, α-글루코시다제, β-글루코시다제, 혈액응고인자, 갑상선자극호르몬, 콜린에스테라제, 콘카나발린 A, 사이토크롬 b5, 사이토크롬 b562, 사이토크롬 c, 사이토크롬 c2, 사이토크롬 c550, 사이토크롬 f, 서브틸리신(subtilisin), 성장 호르몬, 셀룰라제, 세룰로플라스민(ceruloplasmin), 티로글로불린, DNA 폴리메라제, RNA 폴리메라제, 데옥시리보뉴클레아제 I, 데옥시리보뉴클레아제 II, 데옥시리보뉴클레아제 인히비터 II, 트란스페린, 트립시노겐, 트롬빈, 프로트론빈, 뉴클레아제, 노이라미니다제(neuraminidase), 판크레아틴, 피브리노겐, 부갑상선 호르몬, 부신피질자극호르몬, 플러스미노겐, 플라스민, 플라스민 인히비터, 프로테아제, 프로테아제 인히비터, 프로테인키나제, 프롤락틴, 헥소키나제, 펩시노겐, 펩신, 헤모글로빈, 헤모시아닌, 헤모펙신, 퍼옥시다제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글리세로뮤타제, 포스포리파제 A2, 포스포리파제 C, 포스포릴라제 a, 포스포릴라제 b, 포스포릴라제키나제, 폴리아민옥시다제, 미오글로빈, 메탈로티오네인(metallothionein), 모노아민옥시다제, α-락트알부민, β-락토글로불린, 락토페린, 리파제, 렉틴, 레닌, 로돕신(rhodopsin) 등을 들 수 있다. 이들 단백질은, 천연에서 유래된 형태이어도 재조합형이어도 된다.
본 발명의 단백질의 정제방법은, 정제 목적의 단백질을 생리식염수 정도의 농도의 염을 함유하는 제1완충액에 용해시키고, 얻어진 단백질 용액을 본 발명의 단백질 정제용 분리제와 접촉시켜서, 단백질을 흡착시킨 후, 제1완충액과는 pH가 다른 제2완충액을 상기 분리제에 흐르게 하여, 상기 분리제에 흡착된 단백질을 용출시키는 것을 그 특징으로 한다.
본 발명의 정제방법에 있어서, 정제 목적의 단백질을 단백질 정제용 분리제와 접촉시키는 방법으로서는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 종래 공지의 칼럼크로마토그래피에 의한 방법을 사용할 수 있다. 즉, 본 발명의 단백질 정제용 분리제를 칼럼에 충전시키고, 단백질 용액을 단백질 정제용 분리제가 충전된 칼럼에 부여하고, 그 후, 상기 단백질을 용출시킨다.
본 발명의 정제방법에 있어서, 본 발명의 단백질 정제용 분리제에 흡착된 단백질을 용출시키는 방법으로서는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 용리액의 염농도 및 용리액의 pH를 직선적으로 변화시키고, 흡착된 단백질을 용출 시키는 방법(선형 구배 용출), 용리액의 염농도 및 용리액의 pH를 단계적으로 변화시키고, 흡착한 단백질을 용출시키는 방법(단차방식 구배 용출) 등을 사용할 수 있다.
실시예
이하의 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정해서 해석되는 것은 아니다.
또한, TSKgel 토요펄 HW 타입(상품명; 토소사 제품)은 친수성 비닐 폴리머를 기재로 한 중속 사이즈 배제 크로마토그래피용 충전제이며, 실시예에 있어서 담체로서 사용한 TSKgel 토요펄 HW-65(상품명; 토소사 제품)는, 단백질 배제 한계 분자량이 약 5,000,000인 친수성 비닐 폴리머를 기재로 한 중속 사이즈 배제 크로마토그래피용 충전제이다.
(리간드 고정화량의 측정 방법)
토소사 제품 UV-8010 검출기와 토소사 제품 CCPM-II 펌프에, 토소사 제품 TSKgel ODS-80Ts(내경 0.46㎝, 길이 15㎝) 칼럼을 장착하였다. 40(v/v)% 아세토나이트릴 수용액에, 0.5(v/v)%로 되도록 트라이플루오로아세트산을 첨가한 용리액을 별도로 조제하였다. 용리액을 0.5㎖/min의 유속에서 칼럼에 흐르게 하고, 1 급 아민의 고정화 실시 전후의 현탁액 50㎕를 채취하고, 2㎖의 용리액으로 희석된 상청액 10㎕를 주입해서, UV-8010의 파장 254㎚에서 검출했을 때, 약 3.0분에 출현하는 피크 높이의 비율로부터, 고정화에 사용된 1급 아민의 양(μmol/㎖-담체)을 구하여, 리간드 고정화량으로 하였다.
(IgG 결합량의 측정방법)
실시예에 나타낸 단백질 정제용 분리제를 제조 후, 그 0.5㎖를 오픈 칼럼(내경 0.8㎝, 길이 10㎝)에 충전시키고, 완충액 B(50mM 구연산 나트륨, pH 3.0) 3㎖, 이어서 완충액 A(0.15M 염화나트륨을 함유하는 50mM 인산 나트륨, pH 7.2) 5㎖를 3회 흐르게 해서 평형화시켰다. 150mg/㎖의 IgG를 함유한 인간 γ-글로불린(화학과 혈청요법연구소(The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute) 제품)을, 완충액 A로 10mg/㎖의 농도로 되도록 조제한 용액 5㎖를 칼럼에 첨가하고, 밀폐 후 실온에서 1시간 온화하게 진탕시켜, 충전제에 IgG를 결합시켰다. 완충액 A 5㎖로 칼럼을 세정 후, 완충액 B 5㎖를 흐르게 해서 IgG를 탈착 회수하고, 히타치제작소사 제품 U-2010 자외가시 분광광도계로 280㎚의 파장에서의 흡광도로부터, 단백질 정제용 분리제 1㎖에 흡착된 IgG의 양(μmol/㎖-분리제)을 구하여, IgG 결합량으로 하였다.
실시예 1
TSKgel 토요펄 HW-65를 분급 후, 1,4-다이옥산으로 치환하고, 그 10g을 100㎖의 세퍼러블 플라스크에 칭량해서, 거기에 CDI를 0.70g/g-건조 토요펄량이 되도록 첨가하였다. 거기에 1,4-다이옥산 20㎖를 첨가하고, 200rpm의 회전수로, 실온 중 1.5시간 교반날개로 교반해서 활성화를 행하였다. 얻어진 CDI활성화 토요펄을 100㎖의 1,4-다이옥산으로 세정 후, 100㎖의 세퍼러블 플라스크에 옮기고, 1,4-다이옥산 20㎖를 첨가 후, 건조 토요펄 1g당 0.61g으로 되도록, 1급 아민으로서 4-아미노벤질아민을 첨가해서(이하, "0.61g/g-건조 토요펄량"으로 표기함), 200rpm의 회전수로, 실온 중 24시간 교반날개로 교반해서 고정화를 행하여, 본 발명의 단백질 정제용 분리제를 제조하였다.
4-아미노벤질아민이 고정화된 단백질 정제용 분리제를 75질량%의 1,4-다이옥산 수용액 30㎖, 33질량%의 1,4-다이옥산 수용액 20㎖, 순수 100㎖, 0.1N HCl 수용액 20㎖ 및 순수 100㎖의 순으로 세정하였다. 그 후, 전술한 방법에 의해, IgG의 결합량을 측정한 바, 50mg/㎖-충전제였다. 또한, 전술한 방법에 의해, 리간드 고정화량을 구한 바, 404 μmol/㎖-담체였다.
또한, 제조한 단백질 정제용 분리제를 스테인레스 칼럼(내경 0.75㎝, 길이 7.5㎝)에 충전시키고, 0.15M 염화나트륨을 함유한 50mM 인산 나트륨 완충액(pH 7.2)으로 평형화시키고, IgG, 트립신 인히비터, 인간 혈청알부민, 소 혈청 알부민, 리보뉴클레아제 A, α-락트알부민의 각각 2.5mg/㎖, 및 α-키모트립시노겐 A, 리소자임의 각각 2.0mg/㎖의 200㎕를 각각 단독으로 주입했을 때, 주입한 단백질은 모두 단백질 정제용 분리제에 흡착되었다. 그 후, 50mM 구연산 나트륨 완충액(pH 3.0)으로 단차방식으로 전환시켰을 때, 단백질 정제용 분리제에 흡착된 단백질이 탈착 회수되었다.
실시예 2
고정화에 이용하는 4-아미노벤질아민의 양을 0.31g/g-건조 토요펄량으로 되도록 한 이외에는, 실시예 1과 마찬가지로 실시하여, 본 발명의 단백질 정제용 분리제를 제조하였다.
제조한 단백질 정제용 분리제를, 실시예 1과 마찬가지로 세정한 후, 전술한 방법에 의해, IgG의 결합량을 측정한 바, 29mg/㎖-분리제였다. 또한, 전술한 방법에 의해, 리간드 고정화량을 구한 바, 118 μmol/㎖-담체였다.
또한, 제조한 단백질 정제용 분리제를 스테인레스 칼럼(내경 0.75㎝, 길이 7.5㎝)에 충전시키고, 실시예 1과 마찬가지로 단백질을 칼럼에 주입한 바, IgG, 트립신 인히비터, α-키모트립시노겐 A 및 리소자임의 어느 쪽의 단백질도 충전제에 흡착되었고, 그 밖의 단백질은 그대로 통과하였다. 50mM 구연산 나트륨 완충액(pH 3.0)으로 단차방식으로 전환시켰을 때, 단백질 정제용 분리제에 흡착된 단백질이 탈착 회수되었다.
실시예 3
1급 아민으로서 4-(2-아미노에틸)피리딘을 0.76g/g-건조 토요펄량으로 되도록 이용한 이외에는, 실시예 1과 마찬가지로 실시하여, 본 발명의 단백질 정제용 분리제를 제조하였다.
제조한 단백질 정제용 분리제를, 실시예 1과 마찬가지로 세정한 후, 전술한 방법에 의해, IgG의 결합량을 측정한 바, 19mg/㎖-충전제였다.
또한, 제조한 단백질 정제용 분리제를 스테인레스 칼럼(내경 0.75㎝, 길이 7.5㎝)에 충전시키고, 실시예 1과 마찬가지로 단백질을 칼럼에 주입한 바, IgG, 트립신 인히비터, α-키모트립시노겐 A 및 리소자임의 어느 쪽의 단백질도 충전제에 흡착되었고, 그 밖의 단백질은 그대로였다. 50mM 구연산 나트륨 완충액(pH 3.0)으로 단차방식으로 전환시켰을 때, 단백질 정제용 분리제에 흡착된 단백질이 탈착 회수되었다.
본 발명의 단백질 정제용 분리제는, 이온 교환성 및 소수성을 지닌 특정 리간드가 담체 상에 우레탄 결합에 의해 결합되어 있기 때문에, 간편하고도 경제적인 제조방법에 의해 조제할 수 있다. 상기 단백질 정제용 분리제는 이온 교환성 및 소수성의 양쪽의 성질을 지니고 있기 때문에, 저농도의 완충액에서 용이하게 단백질을 흡착하고, 또한 완충액의 pH를 변화시키는 것만으로 용이하게 흡착된 단백질을 탈리하는 것이 가능해서, 단백질 정제용의 분리제로서 산업상 매우 유용하다.
또한, 2008년 6월 23일에 출원된 일본 특허출원 제2008-163478호의 명세서, 특허청구범위 및 요약서의 전체 내용을 여기에 인용하되, 이 기초출원은 본 발명의 명세서의 개시로서 원용되는 것이다.

Claims (10)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 리간드 및 하기 화학식 2로 표시되는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 리간드가, 담체 상에 우레탄 결합에 의해 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 단백질 정제용 분리제:
    [화학식 1]
    Figure pct00017

    상기 화학식 1 중, m은 2 내지 6의 정수를 나타낸다;
    [화학식 2]
    Figure pct00018

    상기 화학식 2 중, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소원자 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬기를 나타내고, n은 1 내지 6의 정수를 나타낸다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 리간드는 하기 화학식 3으로 표시되는 것을 특징으로 하는 단백질 정제용 분리제:
    [화학식 3]
    Figure pct00019

    상기 화학식 3 중, m은 2 내지 4의 정수를 나타낸다.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 화학식 2로 표시되는 리간드는 하기 화학식 4로 표시되는 것을 특징으로 하는 단백질 정제용 분리제:
    [화학식 4]
    Figure pct00020

    상기 화학식 4 중, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소원자 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬기를 나타내고, n은 1 내지 4의 정수를 나타낸다.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 담체 상의 리간드의 함유량이 100 μmol/㎖-담체 이상인 것을 특징으로 하는 단백질 정제용 분리제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 담체는 가교 고분자로 이루어진 담체인 것을 특징으로 하는 단백질 정제용 분리제.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 단백질 정제용 분리제를 제조하는 방법으로서,
    담체를 유기용매 중에서 활성화제와 반응시켜, 담체 표면의 수산기를 활성화시키는 단계; 및
    그 후, 얻어진 활성화 담체를 유기용매 중에서 하기 화학식 5로 표시되는 1급 아민 및 하기 화학식 6으로 표시되는 1급 아민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 아민과 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 정제용 분리제의 제조방법:
    [화학식 5]
    Figure pct00021

    상기 화학식 5 중, m은 2 내지 6의 정수를 나타낸다;
    [화학식 6]
    Figure pct00022

    상기 화학식 6 중, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소원자 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬기를 나타내고, n은 1 내지 6의 정수를 나타낸다.
  7. 제6항에 있어서, 상기 화학식 5로 표시되는 1급 아민은 하기 화학식 7로 표시되는 것을 특징으로 하는 단백질 정제용 분리제의 제조방법:
    [화학식 7]
    Figure pct00023

    상기 화학식 7 중, m은 2 내지 4의 정수를 나타낸다.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 화학식 6으로 표시되는 1급 아민은 하기 화학식 8로 표시되는 것을 특징으로 하는 단백질 정제용 분리제의 제조방법:
    [화학식 8]
    Figure pct00024

    상기 화학식 8 중, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소원자 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬기를 나타내고, n은 1 내지 4의 정수를 나타낸다.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성화제는 카보닐다이이미다졸인 것을 특징으로 하는 단백질 정제용 분리제의 제조방법.
  10. 정제 목적의 단백질을 제1완충액에 용해시키는 단계;
    얻어진 단백질 용액을, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 단백질 정제용 분리제와 접촉시켜서 단백질을 흡착시키는 단계; 및
    그 후, 상기 제1완충액과는 pH가 다른 제2완충액을 상기 분리제에 흐르게 해서, 상기 분리제에 흡착된 단백질을 용출시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 정제방법.
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