KR101418232B1 - 혼합 모드 리간드 - Google Patents

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KR101418232B1
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프랭크 온예마우와
조나단 하이
사무엘 노춤손
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폴 코포레이션
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Abstract

고체 지지체, 리간드 및 링커를 포함하는 기질이 개시된다. 링커는 적어도 하나의 C, O, N 또는 S 원자를 포함하며, 고체 지지체를 리간드에 공유결합적으로 연결시킨다. 또한, 기질을 사용하는 방법, 기질을 제조하는 방법 및 기질을 포함하는 장치가 개시된다.

Description

혼합 모드 리간드{Mixed mode ligands}
본 특허 출원은 미국 임시특허출원 제 61/512,097 호(출원일: 2011년 7월 27일)의 이익을 주장한다. 또한, 미국 임시특허출원 제 61/512,097 호는 인용에 의하여 본 명세서에 통합된다.
본 발명은 전반적으로 혼합 모드(mixed-mode) 또는 다중 모드(multi-modal) 상호작용 크로마토그래피 재료에 관한 것이다.
예를 들어 단백질과 같은 생물학 관련 분자(즉, 생체 분자(biomolecules))를 대량으로 요구하는 수요가 증가함에 따라, 생체 유래 물질(physiological isolates)로부터 그러한 생체 분자를 분리하기 위한 다양한 기법이 개발되고 있다. 그 중에서도 특히 관심을 받고 있는 방법은 액체 크로마토그래피이다.
이 기술분야에서 사용되는 혼합 모드 크로마토그래피 재료는 높은 결합능력(binding capacity), 특이도(specificity) 및 회수율(recovery)을 나타낼 것이 요구되며, 또한, 이를 장기간 재생하여도 그 크로마토그래피 성능에 열화가 발생하지 않을 것이 요구된다.
본 발명에 따른 기질(substrates) 및 기질 사용 방법의 구현예들에 있어서, 바람직하게는, 예를 들어 면역글로불린(바람직하게는, 모노클로날 항체)과 같은 생물학적 물질은 결합되나 이때 응집체(aggregates)는 결합하지 않는다. 일부 구현예에 있어서, 면역글로불린 IgA 및/또는 IgM이 선택적으로 결합(selective binding) 된다. 유리하게는, 생물학적 물질을 정제함과 동시에 응집체를 제거할 수 있으며, 그에 따라, 단일 단계의 정제 및 응집체 제거 공정이 가능하게 된다.
일 구현예에 있어서, 본 발명에서 제공하는 기질은 고체 지지체, 리간드 및 링커(linker)를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 링커는 적어도 하나의 C, O, N 또는 S 원자를 포함하며, 고체 지지체를 리간드에 공유결합적으로 연결시킨다.
일 구현예에 있어서, 리간드는
Figure pat00001
의 화학식을 가지며, 여기서,
Figure pat00002
는 방향족 또는 헤테로방향족 기를 나타내고 선택적으로(optionally) 치환될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 상기 방향족 또는 헤테로방향족 기는 일환식 또는 이환식일 수 있으며, 고리 시스템에 5 내지 12 개의 원자를 가질 수 있고, 0 내지 3 개의 헤테로원자를 포함할 수 있으며, 여기서 헤테로 원자는 O, N 및 S 중에서 선택될 수 있다.
일부 구현예에 있어서, 리간드는 다음의 화학식들로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학식을 갖는다:
Figure pat00003
,
Figure pat00004
,
Figure pat00005
,
Figure pat00006
,
Figure pat00007
,
Figure pat00008
,
Figure pat00009
,
Figure pat00010
,
Figure pat00011
,
Figure pat00012
,
Figure pat00013
,
Figure pat00014
,
Figure pat00015
,
Figure pat00016
,
Figure pat00017
,
Figure pat00018
,
Figure pat00019
,
Figure pat00020
,
Figure pat00021
,
Figure pat00022
,
Figure pat00023
,
Figure pat00024
,
Figure pat00025
,
Figure pat00026
,
Figure pat00027
,
Figure pat00028
,
Figure pat00029
,
Figure pat00030
,
Figure pat00031
,
Figure pat00032
,
Figure pat00033
,
Figure pat00034
,
Figure pat00035
,
Figure pat00036
,
Figure pat00037
,
Figure pat00038
,
Figure pat00039
,
Figure pat00040
,
Figure pat00041
,
Figure pat00042
,
Figure pat00043
,
Figure pat00044
, 및
Figure pat00045
. 상기 화학식들에 있어서 물결선은, 링커가 연결되는 리간드 상의 위치를 표시한다.
다른 구현예에 있어서, 리간드는
Figure pat00046
의 화학식을 가지며, 여기서,
Figure pat00047
는 페닐, 피리딜(pyridyl), 피리미디닐(pyrimidinyl) 및 나프틸로 이루어진 군으로부터 선택되는 방향족 또는 헤테로방향족 고리를 나타내고, 다음의 기들로 이루어진 군으로부터 선택되는 0 내지 4 개의 치환기로 선택적으로(optionally) 치환될 수 있다: -H, -(C1~C6) 알킬, 할로겐, -OH, -O(C1~C6) 알킬, -COOH, -COO(C1~C6) 알킬, -SO3H, -PO3H, -NO2, -NH2,
Figure pat00048
,
Figure pat00049
,
Figure pat00050
,
Figure pat00051
,
Figure pat00052
,
Figure pat00053
,
Figure pat00054
,
Figure pat00055
,
Figure pat00056
,
Figure pat00057
,
Figure pat00058
,
Figure pat00059
,
Figure pat00060
,
Figure pat00061
,
Figure pat00062
, 및
Figure pat00063
.
일부 구현예에 있어서,
Figure pat00064
는 페닐, 피리딜 또는 나프틸을 나타내며, -H, -COOH 및 SO3H로 이루어진 군으로부터 선택되는 0 내지 1 개의 치환기로 선택적으로 치환될 수 있다. 다른 구현예에 있어서,
Figure pat00065
는 페닐을 나타내며, -H, -COOH 및 SO3H로 이루어진 군으로부터 선택되는 0 내지 1 개의 치환기로 선택적으로 치환될 수 있다. 또 다른 구현예에 있어서,
Figure pat00066
는 페닐을 나타내며,
Figure pat00067
,
Figure pat00068
, 및
Figure pat00069
로 이루어진 군으로부터 선택되는 0 내지 1 개의 치환기로 선택적으로 치환될 수 있다.
또 다른 구현예에 있어서, 본 발명은 하기의 화학식들로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학식을 갖는 기질을 제공한다:
Figure pat00070
,
Figure pat00071
,
Figure pat00072
,
Figure pat00073
,
Figure pat00074
,
Figure pat00075
,
Figure pat00076
,
Figure pat00077
,
Figure pat00078
,
Figure pat00079
,
Figure pat00080
,
Figure pat00081
,
Figure pat00082
,
Figure pat00083
,
Figure pat00084
,
Figure pat00085
,
Figure pat00086
,
Figure pat00087
,
Figure pat00088
,
Figure pat00089
,
Figure pat00090
,
Figure pat00091
,
Figure pat00092
,
Figure pat00093
,
Figure pat00094
,
Figure pat00095
,
Figure pat00096
,
Figure pat00097
,
Figure pat00098
,
Figure pat00099
,
Figure pat00100
,
Figure pat00101
,
Figure pat00102
,
Figure pat00103
,
Figure pat00104
,
Figure pat00105
,
Figure pat00106
,
Figure pat00107
,
Figure pat00108
,
Figure pat00109
,
Figure pat00110
,
Figure pat00111
, 및
Figure pat00112
,
여기서 검은색 사각형은 고체 지지체를 나타낸다.
본 발명은 또한, 샘플로부터 적어도 하나의 물질을 분리하는 방법을 제공한다. 일 구현예에 있어서, 적어도 하나의 생물학적 물질을 포함하는 샘플을 기질(substrate)로 처리하는 방법은, 상기 기질을 상기 샘플과, 상기 샘플 중의 상기 적어도 하나의 생물학적 물질이 상기 기질에 결합하도록 하기에 충분한 시간 구간 동안, 접촉시키는 단계를 포함한다. 바람직한 구현예에 있어서, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다: (a) 본 발명의 일 구현예에 따른 기질을 액체 샘플과 접촉시키는 단계로서, 상기 액체 샘플은 적어도 하나의 물질을 포함하고, 상기 물질은 상기 기질에 흡착되는 단계; 및 (b) pH, 이온강도, 또는 이들 모두를 조절하여 상기 물질이 상기 기질로부터 탈착하도록 하는 단계. 전형적인 구현예에 있어서, 상기 방법은 단계 (a)에서 얻은 상기 기질을 평형 완충액으로 세척하는 단계를 더 포함한다.
또 다른 구현예에 있어서, 기질을 제조하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 다음의 단계를 포함한다: 고체 지지체를, 링커의 일부 또는 전부를 포함하는 2 관능성 시약의 하나의 작용기와 접촉시켜서, 상기 시약을 상기 고체 지지체에 결합함으로써, 상기 고체 지지체를 활성화시키는 단계. 활성화된 고체 지지체는, 이어서, 리간드를 포함하는 시약과 반응하고, 그에 따라, 링커와 리간드 사이의 결합이 형성된다.
도 1은, 본 발명의 구현예에 따른 기질을 사용하여, 리간드 밀도 및 동적 결합 능력(DBC: dynamic binding capacity)의 변화를 보여주는 그래프이다.
도 2는, 본 발명의 일 구현예에 따른 파라-페닐렌디아민(PDA) 리간드를 갖는 기질을 사용하여, 리간드 밀도가 변화하는 것과 순수한 IgG를 획득하는 것을 보여주는 그래프이다.
도 3은, 본 발명의 구현예에 따른 기질을 사용하여, pH 및 전도도 값이 순수한 BSA(bovine serum albumin)의 10% 파과(breakthrough)에서의 동적 결합 능력(DBC)에 미치는 효과를 보여주는 그래프이다.
본 발명의 구현예에 따라 제공되는 기질은 효과적인 흡착제로서, 예를 들어 생물학적 물질(biological substances)과 같은 다양한 물질을 분리 및 단리하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 구현예에 따른 기질은, 예를 들면, 제조 기법에 사용될 수 있다. 제조 기법은, 예를 들면, 컬럼 크로마토그래피일 수 있다.
여기에서 설명되는 기질의 구현예의 하나의 이점은, 단백질과 같은 생물학적 물질에 대하여 높은 선택도(selectivity) 및 특이도(specificity)를 갖는다는 것이다. 이를 대체하는 또는 이에 부가되는 또 다른 이점은, 본 발명의 기질의 구현예가 높은 생물학적 분자 결합 능력을 갖는다는 것이다. 따라서, 더욱 작은 체적의 샘플을 조작하고, 처리 시간을 줄이고, 및/또는, 단위 컬럼 체적 당 더욱 많은 양의 샘플을 처리하는 것이 가능하게 된다. 본 발명의 구현예의 또 다른 이점은, 기질이, 단백질 응집체의 존재하에서 단백질에 대하여 선택도를 보인다는 것이다. 이는, 정제 및 단백질 샘플로부터의 응집체 제거를 단일 단계로 수행하는 것을 가능하게 한다. 게다가, 기질은 비용-효율적으로 제조될 수 있다.
기질은 고체 지지체 및 리간드를 포함하며, 리간드는 링커를 통하여 고체 지지체에 공유결합적으로 부착되어 있다. 일부 구현예에 있어서, 링커는 적어도 하나의 C, O, N, 또는 S 원자를 포함한다.
일 구현예에 있어서, 리간드는
Figure pat00113
의 화학식을 가지며, 여기서,
Figure pat00114
는 방향족 또는 헤테로방향족 기를 나타내고, 선택적으로(optionally) 치환될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 상기 방향족 또는 헤테로방향족 기는 일환식 또는 이환식일 수 있으며, 고리 시스템에 5 내지 12 개의 원자를 가질 수 있고, 0 내지 3 개의 헤테로원자를 포함할 수 있으며, 여기서 헤테로 원자는 O, N 및 S 중에서 선택될 수 있다.
일부 구현예에 있어서, 리간드는 다음의 화학식들로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학식을 갖는다:
Figure pat00115
,
Figure pat00116
,
Figure pat00117
,
Figure pat00118
,
Figure pat00119
,
Figure pat00120
,
Figure pat00121
,
Figure pat00122
,
Figure pat00123
,
Figure pat00124
,
Figure pat00125
,
Figure pat00126
,
Figure pat00127
,
Figure pat00128
,
Figure pat00129
,
Figure pat00130
,
Figure pat00131
,
Figure pat00132
,
Figure pat00133
,
Figure pat00134
,
Figure pat00135
,
Figure pat00136
,
Figure pat00137
,
Figure pat00138
,
Figure pat00139
,
Figure pat00140
,
Figure pat00141
,
Figure pat00142
,
Figure pat00143
,
Figure pat00144
,
Figure pat00145
,
Figure pat00146
,
Figure pat00147
,
Figure pat00148
,
Figure pat00149
,
Figure pat00150
,
Figure pat00151
,
Figure pat00152
,
Figure pat00153
,
Figure pat00154
,
Figure pat00155
,
Figure pat00156
, 및
Figure pat00157
. 상기 화학식들에 있어서 물결선은 링커가 연결되는 리간드 상의 위치를 표시한다.
다른 구현예에 있어서, 리간드는
Figure pat00158
의 화학식을 가지며, 여기서,
Figure pat00159
는 페닐, 피리딜, 피리미디닐 및 나프틸로 이루어진 군으로부터 선택되는 방향족 또는 헤테로방향족 고리를 나타내고, 다음의 기들로 이루어진 군으로부터 선택되는 0 내지 4 개의 치환기로 선택적으로(optionally) 치환될 수 있다: -H, -(C1~C6) 알킬, 할로겐, -OH, -O(C1~C6) 알킬, -COOH, -COO(C1~C6) 알킬, -SO3H, -PO3H, -NO2, -NH2,
Figure pat00160
,
Figure pat00161
,
Figure pat00162
,
Figure pat00163
,
Figure pat00164
,
Figure pat00165
,
Figure pat00166
,
Figure pat00167
,
Figure pat00168
,
Figure pat00169
,
Figure pat00170
,
Figure pat00171
,
Figure pat00172
,
Figure pat00173
,
Figure pat00174
, 및
Figure pat00175
.
일부 구현예에 있어서,
Figure pat00176
는 페닐, 피리딜 또는 나프틸을 나타내며, -H, -COOH 및 SO3H로 이루어진 군으로부터 선택되는 0 내지 1 개의 치환기로 선택적으로 치환될 수 있다. 다른 구현예에 있어서,
Figure pat00177
는 페닐을 나타내며, -H, -COOH 및 SO3H로 이루어진 군으로부터 선택되는 0 내지 1 개의 치환기로 선택적으로 치환될 수 있다. 또 다른 구현예에 있어서,
Figure pat00178
는 페닐을 나타내며,
Figure pat00179
,
Figure pat00180
, 및
Figure pat00181
로 이루어진 군으로부터 선택되는 0 내지 1 개의 치환기로 선택적으로 치환될 수 있다.
리간드는 링커에 공유결합적으로 연결되며, 링커는 리간드를 고체 지지체에 연결한다. 링커는 입체 장애를 저감시켜서, 결합대상 물질에 대한 리간드의 접근성을 향상시킬 수 있다. 리간드와 링커 사이의 연결은, 예를 들면, 아미드 결합일 수 있다.
링커는 통상적으로, 적어도 하나의 C, O, N, 또는 S 원자를 포함한다. 일 구현예에 있어서, 링커는,
Figure pat00182
또는
Figure pat00183
를 포함하며, 여기서, X, X1 및 X2 는 각각 독립적으로, O, S, NH 및 공유결합 중에서 선택되고; m, n 및 p 는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 이다. 또 다른 구현예에 있어서, 상기 화학식에서 1, 2 또는 3 개의 H 원자가 같은 수의 OH기 및/또는 메틸기로 치환될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 링커는 하기의 군으로부터 선택되는 구조를 포함한다:
Figure pat00184
및
Figure pat00185
;
여기서, X1 및 X2 각각은 독립적으로, O, S 및 NH로부터 선택되고; Ra, Rb, Rc, 및 Rd 각각은 독립적으로, H, OH, 및 메틸로부터 선택된다.
또 다른 구현예에 있어서, 링커는 다음의 군으로부터 선택되는 구조를 포함한다:
,
Figure pat00187
,
Figure pat00188
,
Figure pat00189
,
Figure pat00190
,
Figure pat00191
,
Figure pat00192
,
Figure pat00193
,
Figure pat00194
, 및
Figure pat00195
.
링커는 리간드를 고체 지지체에 연결한다. 고체 지지체는, 예를 들어, 다공성 또는 비다공성 비드 또는 부정형 입자와 같은 크로마토그래피 매질에 통상적으로 사용되는 형태일 수 있으며, 예를 들어, 약 0.1 ㎛ 내지 약 1000 ㎛의 직경을 가질 수 있다. 이들 비드 또는 입자는, 링커 및 리간드 조합체로 유도체화될 수 있다. 예를 들어, 이들 비드 또는 입자는 컬럼을 충진하는데 사용되는 크로마토그래피 매질로서 사용될 수 있다. 다른 대안으로서, 일부 구현예에 있어서, 고체 지지체는 섬유, 막, 또는 스폰지-형태의 재료를 포함하며, 예를 들어 마이크론 내지 수 밀리미터 크기로 형성되어 있는 개구부 또는 기공을 갖는다.
적합한 고체 지지체는 당 업계에 공지되어 있다. 일 구현예에 있어서, 고체 지지체는 유기 재료를 포함할 수 있다. 유기 재료는 예를 들면 폴리사카라이드일 수 있으며, 그 구체적인 예로서는, 셀룰로오스, 전분, 한천, 아가로스 및 덱스트란이 있다. 합성 고분자도 사용될 수 있으며, 그 구체적인 예로서는, 치환되거나 치환되지 않은 폴리아크릴아미드계, 폴리메타크릴아미드계, 폴리아크릴레이트계, 폴리메타크릴레이트계, 폴리비닐 폴리머계(예를 들어, 폴리비닐알코올, 폴리스티렌, 폴리술폰, 및 스티렌과 디비닐벤젠의 코폴리머계), 및 이들의 혼합물이 있다. 또 다른 구현예에 있어서, 고체 지지체 재료로서 무기 재료가 사용될 수 있다. 그러한 무기 재료의 비제한적인 예로서는, 실리카와 같은 다공성 광물 재료; 하이드로겔을 함유하는 실리카, 지르코니아, 티타니아, 알루미나; 및 기타 세라믹 재료;등이 있다. 이들 재료의 혼합물 또는, 두 재료의 공중합에 의하여 형성되거나 두 재료의 상호침투된 네트워크에 의하여 형성되는 복합재료를 사용하는 것도 가능하며, 이들은 예를 들면, 미국특허 제 5,268,097 호; 제 5,234,991 호; 및 제 5,075,371 호에 개시되어 있다.
일 구현예에 있어서, 본 발명의 기질의 리간드 밀도(기질 단위 체적 당 리간드의 개수)는 적어도 약 20 μmol/ml-기질, 적어도 약 30 μmol/ml, 또는 적어도 약 40 μmol/ml, 또는 적어도 약 50 μmol/ml 일 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 리간드 밀도는 약 180 μmol/ml 미만일 수 있으며, 더욱 구체적인 예를 들면, 약 150 μmol/ml 미만, 또는 약 100 μmol/ml 미만, 또는 약 80 μmol/ml 미만, 또는 약 60 μmol/ml 미만, 또는 약 50 μmol/ml 미만일 수 있다. 예를 들어, 리간드 밀도의 범위는 약 20 μmol/ml 내지 약 180 μmol/ml, 약 30 μmol/ml 내지 약 150 μmol/ml, 약 40 μmol/ml 내지 약 100 μmol/ml, 약 50 μmol/ml 내지 약 80 μmol/ml, 약 30 μmol/ml 내지 약 60 μmol/ml, 또는 약 50 μmol/ml 내지 약 60 μmol/ml 일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예들을 이하에서 보여준다. 여기에서 그리고 전체에 걸쳐서, 화학식 내의 검은색 사각형은 고체 지지체를 나타낸다.
또 다른 구현예에 있어서, 본 발명에서 제공하는 기질은 다음의 군으로부터 선택되는 화학식을 갖는다:
Figure pat00196
,
Figure pat00197
,
Figure pat00198
,
Figure pat00199
,
Figure pat00200
,
Figure pat00201
,
Figure pat00202
,
Figure pat00203
,
Figure pat00204
,
Figure pat00205
,
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,
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,
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,
Figure pat00211
,
Figure pat00212
,
Figure pat00213
,
Figure pat00214
,
Figure pat00215
,
Figure pat00216
,
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,
Figure pat00218
,
Figure pat00219
,
Figure pat00220
,
Figure pat00221
,
Figure pat00222
,
Figure pat00223
,
Figure pat00224
,
Figure pat00225
,
Figure pat00226
,
Figure pat00227
,
Figure pat00228
,
Figure pat00229
,
Figure pat00230
,
Figure pat00231
,
Figure pat00232
,
Figure pat00233
,
Figure pat00234
,
Figure pat00235
,
Figure pat00236
,
Figure pat00237
, 및
Figure pat00238
.
또 다른 구현예에 있어서, 본 발명은 크로마토그래피 컬럼을 제공하는데, 상기 컬럼은 입구 말단 및 출구 말단을 갖는 튜브형 부재를 포함하며, 상기 튜브형 부재는 여기에서 설명되는 기질의 구현예로 충진되어 있다. 튜브형 부재는 임의의 적합한 재료로 만들어질 수 있으며, 구체적인 예를 들면, 유리, 플라스틱 또는 금속일 수 있다. 충진된 기질은, 일 말단에서 또는 양 말단에서, 튜브형 부재 내부에 배치된 다공성 부재와 접경될 수 있으며, 다공성 부재는 기질이 튜브형 부재 내부에 고정되어 있도록 한다.
일부 구현예에 있어서, 중력에 의한 액체의 흐름이 컬럼을 통과하도록 하는 것으로도 충분히, 기질을 액체 샘플, 세척 유체 및/또는 용리액과 접촉시킬 수 있다. 다른 구현예에 있어서, 상기 컬럼은 하나 이상의 유체 이송 장치를 포함할 수 있다. 유체 이송 장치를 사용함으로써 상방향으로 또는 하방향으로 유체가 컬럼을 통하여 흐르도록 할 수 있다. 그러한 장치의 예로서는, 펌프, 인젝터 등이 있고, 또한, 크로마토그래피 장비와 결부되어 통상적으로 사용되는 임의의 기타 장치가 사용될 수 있으며, 이들은 당해 기술분야에서 공지되어 있다.
크로마토그래피 컬럼은 임의의 적합한 체적을 가질 수 있다. 예를 들어, 실험실 규모의 분리공정의 경우, 예를 들어, 약 1 밀리리터 또는 심지어 약 1 마이크로리터와 같은 작은 컬럼 체적도 가능하다. 생물학적 물질을 대규모로 정제 및 분리하는 경우에는, 예를 들어 약 5000 리터와 같은 큰 체적의 컬럼이 사용될 수 있다. 더욱 통상적으로는, 컬럼 체적은, 예를 들면, 1 리터 내지 100 리터일 수 있다. 컬럼은 전반적으로 튜브의 형상을 갖지만, 길이나 직경이 특별히 제한되지는 않는다. 컬럼이 사용되는 조건에 따라, 컬럼 직경은 달라질 수 있으며, 예를 들면, 약 0.5 mm 내지 약 1000 mm일 수 있다. 또한, 컬럼 길이도 달라질 수 있으며, 예를 들면, 약 50 mm 내지 약 1000 mm일 수 있다. 따라서, 본 발명에서는, 다양한 치수 및 그에 상응하는 체적을 갖는 컬럼이 예상될 수 있다.
또 다른 구현예에 있어서, 본 발명은 기질을 제조하는 방법을 제공한다. 이 방법은 전반적으로 다음의 단계를 포함한다: 고체 지지체를, 링커의 일부 또는 전부를 포함하는 2 관능성 시약의 하나의 작용기와 접촉시켜서, 상기 시약을 상기 고체 지지체에 결합함으로써, 상기 고체 지지체를 활성화시키는 단계. 활성화된 고체 지지체는, 이어서, 리간드를 포함하는 시약과 반응하고, 그에 따라, 링커와 리간드 사이의 결합이 형성된다. 2 관능성 시약은 적어도 두 개의 작용기를 포함할 수 있다. 작용기의 비제한적인 예로서는, 클로로, 브로모, 요오도, 에폭사이드, 카르복실, 에스테르, 알데하이드, 케톤, 아미도, 알케닐, 시아노, 이미노 등이 있다.
본 발명의 또 다른 구현예는, 샘플로부터 적어도 하나의 물질을 분리하는 방법이다. 일 구현예에 있어서, 적어도 하나의 생물학적 물질을 포함하는 샘플을 기질로 처리하는 방법은, 본 발명의 일 구현예에 따른 기질을 상기 샘플과, 상기 샘플 중의 상기 적어도 하나의 생물학적 물질이 상기 기질에 결합하도록 하기에 충분한 시간 구간 동안, 접촉시키는 단계를 포함한다. 바람직한 구현예에 있어서, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다: (a) 상기 기질을 액체 샘플과 접촉시키는 단계로서, 상기 액체 샘플은 적어도 하나의 물질을 포함하고, 상기 물질은 상기 기질에 흡착되는 단계; 및 (b) pH, 이온강도, 또는 이들 모두를 조절하여 상기 물질이 상기 기질로부터 탈착하도록 하는 단계. 전형적인 구현예에 있어서, 상기 방법은 단계 (a)에서 얻은 상기 기질을 평형 완충액으로 세척하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 기질을 제조하는 방법이 제공된다. 앞에서 설명한 리간드를 고체 지지체에 화학적으로 고정화하기 위하여, 고체 지지체와 링커의 사이 및 링커와 리간드의 사이에 공유결합을 형성시킨다. 통상적으로, 먼저, 고체 지지체를 2 관능성 시약으로 처리한다. 2 관능성 시약은 고체 지지체에 반응성 기를 도입하는 역할을 한다. 이때, 반응성 기는 링커의 일부 또는 전부를 형성한다. 일부 고체 지지체의 경우에, 즉, 예를 들어, 셀룰로오스, 하이드로겔 함유 복합재료 또는 기타 하이드록시기 제공 재료의 경우에, 하이드록시기를 하이드록사이드 공급원으로 탈양성자화(deprotonate)하는 것이 유리할 수 있다. 이는, 예를 들어, 2 관능성 시약과의 반응 전에 수행될 수 있다. 2 관능성 시약은 고체 지지체, 그리고, 리간드를 함유하는 시약의 양자 모두와 반응할 수 있다. 서로 같거나 다른 작용기들을 함유하는 2 관능성 시약의 비제한적인 예로서는, 에피클로로하이드린(epichlorohydrin), 에피브로모하이드린(epibromohydrin), 디브로모- 및 디클로로프로판올, 디브로모부탄, 에틸렌글리콜 디글리시딜에테르, 부탄디올 디글리시딜에테르, 디비닐 술폰, 알릴글리시딜에테르, 알릴 브로마이드, 등이 있다. 바람직하게는, 2 관능성 시약은 알릴 헤테로작용기 화합물이며, 그 구체적인 예로서는, 알릴 브로마이드 등이 있다. 일단 기능화되면, 통상적으로, 고체 지지체를 광범위하게 세척하는 과정이 이어진다. 세척에는, 하나 이상의 용매가 사용되며, 세척을 통하여, 미반응 2 관능성 시약, 반응 부산물, 또는 이들 모두가 제거된다. 세척에 사용되는 통상적인 용매는 물이다.
리간드는, 앞에서 설명한 바와 같은 기능화된 고체 지지체에 의하여 제공되는 작용기와 반응하는 시약을 통하여 도입될 수 있다. 리간드 시약은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 합성 공정에 의하여 제조될 수 있다. 2 관능성 시약과 리간드 시약의 구체적인 조합은 잘 알려진 화학지식에 의하여 안내받을 수 있다. 예를 들어, 에폭사이드로 기능화된 고체 지지체는, 메르캅토, 하이드록시 또는 아미노-함유 시약과 반응하여, 에틸렌-함유 링커기를 갖는 기질을 제공할 수 있다. 알릴 브로마이드로 개질된 다른 고체 지지체는 예를 들어 알켄기를 제공하는데, 알켄기는 메르캅토-함유 시약과 직접 반응할 수 있으며, 그에 따라, 황 원자를 함유하는 링커를 제공하게 된다. 다른 대안으로서, 알켄기는 추가적으로 브롬화되어, 적절하게 반응성있는 브롬화 유도체를 제공할 수 있다. 또 다른 구현예의 방법에 있어서, 고체 지지체는 디비닐술폰(DVS)과 같은 황-함유 2 관능성 시약과 반응하도록 허용될 수 있다. 이 경우에, 리간드를 포함하는 시약은 DVS로 활성화된 고체 지지체에 의하여 제공되는 비닐기와 반응하기만 하면 된다.
다른 대안으로서, 고체 지지체는, 앞에서 설명한 바와 같이 활성화된 상태에서, 중간(intermediate) 2 관능성 시약으로 처리될 수 있다. 이 반응의 생성물은, 이어서, 리간드를 포함하는 시약으로 처리될 수 있다. 이러한 경우에 대한 예로서는, 알릴-활성화 고체 지지체와, 앞에서 설명한 바와 같이, 메르캅토헥사노익 액시드 사이의 반응이 있다. 그 결과 생성된 펜던트(pendant) 카르복시 기는, 예를 들어 일차 아민을 함유하는 임의의 간편한 리간드 시약과 반응할 수 있다. 이러한 방법론을 채용하는 구현예에 있어서, 커플링제를 사용하는 것이 필요할 수 있다. 커플링제의 예로서는, N-에톡시카르보닐-2-에톡시-1,2-디하이드로퀴놀린(EEDQ) 또는 통상적으로 알려진 카르보디이미드 화합물이 있다. 카르보디이미드 화합물의 예로서는, 디시클로헥실카르보디이미드(DCC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC), N,N'-디이소프로필카르보디이미드(DIC), 또는 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄(DM-TMM)이 있다.
고정화된 링커 및 리간드의 농도는 당해 기술분야에서 알려진 바와 같이, 고체 지지체를 제조하는데 사용되는 2 관능성 시약의 농도에 따라, 예를 들어, 고체 지지체의 밀리리터 당 마이크로몰의 몇 분의 일 내지 수 백 마이크로몰의 범위에서, 달라질 수 있다. 통상적으로, 고정화된 작용기의 농도가 낮으면 크로마토그래피 재료의 분리 능력이 낮아지고, 반면에, 농도가 높으면 분리능력이 높아진다.
일부 구현예에 있어서, 본 발명의 기질은 생물학 관련 분자 및 생물학적 물질을 포함하는 다양한 물질을 분리하고, 원하는 경우에는 정제하는데, 사용될 수 있다. 그러한 물질의 예로서는, 항체, 단백질, 글리코단백질, 융합 단백질, 재조합 단백질, 태그화 단백질(tagged proteins), 효소 및 생물학적 촉매, 펩티드, 세포, 세균, 바이러스, 바이러스-형 입자(VLPs), 백신, 핵산, 탄수화물, 지질 등이 있다. 분리(및, 원하는 경우에는, 정제)에 적합한 다른 물질에는, 올리고당, 다당류, 리포다당류, 폴리펩티드, 용해성 합성 폴리머 등이 있다. 생물학적 물질이 그로부터 유도되거나 그 안에 함유되어 있는 통상적인 공급원의 비제한적인 예로서는, 타액, 생체액(biological fluid), 오줌, 림프액, 전립선액, 정액, 젖, 유장(milk whey), 조직 추출물(organ extracts), 식물 추출물, 세포 추출물, 세포 배양액(세포주(cell lines)포함), 발효액(fermentation broths), 혈청(serum), 복수액(ascites fluid), 유전자도입 식물 및 동물 추출물 등과 같은 액체 샘플이 있다. 본 명세서에 있어서, 생체액(biological fluid)은 생체 조직과 관련된 임의의 유체로서 처리되거나 처리되지 않은 유체를, 특히 혈액을, 포괄한다. 생체액의 예로서는, 전혈(whole blood), 따뜻하거나 차가운 혈액, 제대혈, 및 저장되거나 새로운 혈액; 적어도 하나의 생리 용액(physiological solution)(비제한적인 예를 들면, 염, 영양물질 및/또는 항응고제의 용액)으로 희석된 혈액과 같은 처리된 혈액; 혈소판 농축액(PC), 혈소판 풍부 혈장(PRP), 혈소판 빈약 혈장(PPP), 혈소판 무함유 혈장, 혈장, 신선 냉동 혈장(FFP), 혈장에서 얻은 성분 제제, 농축 적혈구(PRC), 이행대 물질(transition zone material) 또는 연막(buffy coat: BC)과 같은 혈액 성분; 혈액 또는 혈액 성분으로부터 유래되거나 골수로부터 유래된 혈액 제제; 백혈구, 줄기세포; 혈장에서 분리된 후 생리 용액 또는 항냉동 유체에 재현탁된 적혈구; 혈장에서 분리된 후 생리 용액 또는 항냉동 유체에 재현탁된 혈소판; 등이 있다. 생체액은 또한, 골수 흡인물을 포함하는 생리 용액을 포괄한다. 생체액은, 본 발명에 따라 사용되기 전에, 백혈구의 일부를 제거하기 위하여 처리되어 있을 수 있다. 혈액 제제 또는 생체액은, 앞에서 기술한 성분들 뿐만 아니라, 다른 수단에 의하여 얻어져서 유사한 특성을 갖는 유사한 혈액 제제 또는 생체액을 또한 지칭한다.
이러한 맥락에서, 생물학적 물질의 특히 바람직한 종류는 면역글로불린이다. "면역글로불린(immunoglobulins)"이라는 카테고리에는, 완전한 면역글로불린(예를 들어, 모노클로날 및 폴리클로널 항체를 포함) 뿐만 아니라 Fab, F(ab')2, Fc 및 Fv 절편(fragments)과 기타 인위조작된(engineered) 항체 종(species)이 포괄된다. 일 구현예에 있어서, 면역글로불린은 면역글로불린 G(IgG)일 수 있다. 이를 대체하여 또는 이에 부가하여, 하나 이상의 임의의 다음의 것들이 결합될 수 있다: IgA, IgM, IgD 및 IgE. 일부 구현예에 있어서, IgA 및/또는 IgM이 선택적으로(selectively) 결합될 수 있다.
본 발명의 구현예에 따른 크로마토그래피 분리(chromatographic separation)는, 예를 들면, 크로마토그래피용 이온교환수지 및 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 수지를 포함하는 기질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 이들 수지는 생리적 pH 및/또는 이온 강도 하에서 기능할 수 있는 것들을 포함한다. 본 발명의 기질은, 다양한 방법에 따라 물질을 분리하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 그러한 방법에는, 국제공개 WO　2005/073711 호에 개시된 것들이 포함된다. 하나 이상의 생물학적 물질을 함유하는 액체 샘플은, 본 발명의 기질의 구현예와, 적어도 하나의 생물학적 물질이 상기 기질에 결합하도록 하기에 충분한 시간 구간 동안, 접촉한다. 통상적으로, 접촉 시간은 약 30 초 내지 약 12 시간일 수 있다.
적어도 하나의 생물학적 물질을 포함하는 샘플을 처리하는 방법의 일 구현예는, 기질의 일 구현예를 상기 샘플과, 상기 샘플 중의 상기 적어도 하나의 생물학적 물질이 상기 기질에 결합하도록 하기에 충분한 시간 구간 동안, 접촉시키는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에 있어서, 적어도 하나의 물질을 액체 샘플로부터 분리하는 방법은 다음의 단계를 포함한다: 기질의 일 구현예를 액체 샘플과 접촉시키는 단계로서, 상기 액체 샘플은 적어도 하나의 물질을 포함하고, 상기 물질은 상기 기질에 흡착되는 단계; 및 pH, 이온강도, 또는 이들 모두를 조절하여 상기 물질이 상기 기질로부터 탈착하도록 하는 단계.
상기 방법의 일 구현예에 있어서, 적어도 하나의 물질은 항체를 포함한다. 이때, 항체는 예를 들면, IgG, IgA, 또는 이들의 항체 절편일 수 있다.
상기 방법의 일부 구현예에 있어서, 샘플은 생체액을 포함하며, 이때, 생체액은, 비제한적인 예를 들면, 혈장일 수 있다.
상기 방법의 바람직한 구현예에 있어서, 기질은 컬럼 내에 배치되고, 상기 방법은 샘플을 컬럼을 통하여 통과시키는 단계를 포함한다.
그렇게 하는 게 적절한 경우에는, 액체 샘플의 pH, 이온 강도, 또는 이들 모두가, 샘플을 기질과 접촉시키기 전에, 조절될 수 있다. 이에 부가하여 또는 이를 대체하여, 샘플은 농축되거나, 희석되거나, 또는 염(salts)과 같은 첨가제와 혼합될 수 있다. 다양한 단백질에 대한 통상적인 포획 pH 값은 약 4 내지 약 10 일 수 있다. 그러나, 포획 pH 값은 이 범위 보다 더 높거나 더 낮을 수도 있다. 통상적으로, 약 4 내지 약 8 의 범위의 pH는, 양이온 교환 모이어티를 포함하는 기질에 대한 단백질의 흡착을 촉진한다. 반면에, 약 6 내지 약 10 범위의 pH는 음이온 교환 모이어티가 사용되는 경우에 같은 목적을 달성할 수 있게 된다. 일부 구현예에 있어서, 기질은 단백질과, 약 5.5의 pH에서; 또는 약 7.2의 pH에서; 또는 약 8.0의 pH에서; 결합한다. 그러나, 기질은 단백질과, 이보다 더 높거나 더 낮은 pH에서, 결합할 수도 있다.
본 발명의 기질은 샘플의 이온 강도에 의한 제한을 받지 않으며, 낮거나 높은 이온 강도를 갖는 샘플과 함께 사용될 수 있다. 많은 생물학적 물질이, 생리 이온 강도에서, 기질에 용이하게 흡착될 것이다. 생리 이온 강도는 통상적으로 약 15 내지 약 20 mS/cm의 범위이다. 그러나, 생리 이온 강도는 이들 수치 보다 더 크거나 더 작을 수도 있다. 이 범위에 해당하는 통상적인 염 농도는 약 0.1 내지 약 0.2 M, 바람직하게는 약 0.14 내지 약 0.17 M 이다.
액체 샘플이 기질과 접촉하는 온도는 샘플 및 주어진 크로마토그래피 재료에 따라 달라지며, 이는 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다. 바람직하게는, 상기 온도는 대기(ambient) 온도이다. 그러나, 상기 온도는 대기 온도 보다 높거나 낮을 수도 있다.
샘플이 기질과 접촉한 후, 기질은 바람직하게는 평형 완충액(equilibration buffer)으로 세척된다. 평형 완충액은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다. 평형 완충액은, 바람직하게는, 액체 샘플이 기질과 접촉하던 상태에서의 pH를 갖는 완충액이다. 게다가, 평형 완충액은 기질로부터, 기질에 흡착하지 않은 물질을 세척한다. 적합한 평형 완충액은 당해 기술분야에서 공지되어 있다. 평형 완충액에는, 예를 들면, 아세테이트 완충액, 포스페이트 완충 식염수(phosphate buffered saline) 등이 있다. 세척은, 생물학적 물질이 결합되어 있는 기질을 평형 완충액 내로 입욕(bathing), 담금(soaking), 또는 빠뜨림(dipping)으로써 달성될 수 있다. 이를 대체하여 또는 이에 부가하여, 평형 완충액으로 기질을 헹구거나, 분무하거나 또는 씻어낼 수 있다.
바람직한 생물학적 물질은 통상적으로 기질에 흡착하는 물질이다. 다른 구현예에 있어서, 원하는 생물학적 물질이, 예를 들면, 평형 완충액 세척 중에 제거될 수 있다. 이 경우, 상기 물질은 상기 완충액으로부터, 당해 분야에 공지된 방법에 의하여, 분리될 수 있다. 또 다른 구현예에 있어서, 원하는 생물학적 물질이 기질에 흡착하지 않고, 제거되어야 하는 불순물이 기질에 흡착할 수 있다. 이 경우, 원하는 생물학적 물질은 적재 완충액(loading buffer) 또는 세척 완충액(washing buffer)으로부터, 당해 분야에서 공지된 방법에 의하여, 회수될 수 있다.
기질에 흡착된 생물학적 물질은 이어서 탈착되는데, 이를 위하여, 일 구현예에서는, pH를, 상기 물질이 탈착하게 되는 값으로 조절한다. 탈착이 발생하는 pH는, 물질에 따라 그리고 사용된 기질에 따라 달라진다. 예를 들어, 음이온 교환 모이어티를 포함하는 기질의 경우, 탈착은 통상적으로, 약 pH 8에서 시작하여 약 pH 3 까지 하강하는 pH 구배(gradient)에 걸쳐서 일어난다. 양이온 교환 모이어티를 포함하는 기질의 경우, 통상적으로 적용되는 pH 구배는 약 pH 4에서 시작하여 약 pH 11 까지 상승한다. 주로 소수성 기를 갖는 기질의 경우에는, 탈착을 위한 pH 구배는 통상적으로, 약 pH 7에서 시작하여 약 pH 3 까지 하강한다. 주로 소수성 기를 갖는 기질의 경우, 바람직하게는, 이온 강도 구배는 아래에 설명하는 바와 같이 적용될 수 있다. pH는 일상적으로 입수가능한 임의의 시약에 의하여 조절될 수 있으며, 그 예로서는, 트리스-HCl 또는 카보네이트 완충액의 수용액 등이 있다.
일부 사례에 있어서, 앞에서 언급한 바와 같이, 용리액 이온 강도의 조절은 기질의 유효성을 증가시킬 수 있다. 그리하여, 주로 소수성 기를 포함하는 기질의 경우, 이온 강도는 pH와 함께 감소될 수 있다. 이는, 추가적으로 -NH- 모이어티를 포함하는 재료의 경우에 특히 그러한데, -NH- 모이어티는 온화한 이온성 전하를 일으킬 수 있고, 온화한 이온성 전하는 이온 강도가 감소할 때 더욱 효과적이게 된다. 염 구배(salt gradients)의 사용이 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다. 통상적으로, 본 발명의 기질을 위한 염 농도는 약 1.0 M, 또는 약 0.5 M 을 초과할 필요는 없다.
통상적으로, 탈착된 생물학적 물질은 이어서 수집되며, 원하는 경우에는, 추가적으로 가공될 수 있다. 항체와 같은 생물학적 물질의 통상적인 순도는, 본 발명의 구현예에 따라 정제되면, 약 70 wt% 이상, 일부 구현예에서는 약 85 wt% 이상, 그리고 더욱 바람직하게는 약 90 wt% 내지 약 99 wt% 일 수 있다.
일부 구현예에 있어서, 본 발명의 기질은 생물학적 물질을 정제하고 동시에 응집체를 제거하는데 사용될 수 있으며, 그에 따라, 정제 및 응집체 제거를 하나의 단계로 수행하는 것이 가능해진다. 일부 구현예에 있어서, 기질은 생물학적 물질(예를 들어, 면역글로불린, 바람직하게는, 모노클로날 항체)과 우선적으로 결합하고, 반면에, 응집체와는 결합하지 않는다.
그리하여, 정제 대상물인 생물학적 물질을 포함하는 샘플을, 앞에서 설명한 바와 같이, 기질과 접촉시키면, 생물학적 물질은 기질에 흡착될 것이고; 불순물 및 응집체는 통과할 것이다. 정제된 생물학적 물질은 이어서, 앞에서 설명한 바와 같이, 탈착되고 수집될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 정제된 생물학적 물질 중의 응집체의 양은, 예를 들면, 약 10 wt% 미만, 약 5 wt% 미만, 약 2 wt% 미만, 또는 약 1 wt% 미만일 수 있다.
앞에서 언급한 구현예 중 많은 구현예는, 생물학적 물질을 함유하는 용액을 기질과 접촉시키는 단계, 및 상기 용액 중의 적어도 하나의 생물학적 물질을 기질에 선택적으로 흡착시키는 단계를 포함한다. 원하는 생물학적 물질(들)이 기질에 결합되는 경우, 후자의 용리(elution)는, 생물학적 물질(들)이 분리되고 수집되어 정제 및 농축된 형태를 갖도록 하는 것을 가능하게 한다. 만약 원하는 생물학적 물질이 처리된 용액 중에 잔류한다면(다른 생물학적 물질은 기질에 결합된다면), 원하는 분리는 용리액을 수집함으로써 곧바로 달성될 수 있다.
바람직하게도, 본 발명의 구현예에 따른 기질은 열화 없이 반복적으로 재생될 수 있다. 재생은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있는 절차에 의하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 사용 후에, 기질은 재생 용액과 접촉할 수 있다. 재생 용액은, 예를 들면, 수산화나트륨 수용액일 수 있다. 일 구현예에 있어서, 기질은 컬럼 체적 5개 분량의 1　M NaOH와 접촉할 수 있으며, 최소 접촉 시간은 약 30 분일 수 있다. 이를 대체하여 또는 이에 부가하여, 기질은 산 용액과 접촉할 수 있다. 산 용액은, 예를 들면, 염산 수용액 또는 아세트산 수용액일 수 있다. 일 구현예에 있어서, 기질은 컬럼 체적 5개 분량의 0.1　M HCl 또는 0.1 M 아세트산과 접촉할 수 있으며, 최소 접촉 시간은 약 30 분일 수 있다. 이를 대체하여 또는 이에 부가하여, 기질은 염 용액과 접촉할 수 있다. 염 용액은, 예를 들면, 염화나트륨 수용액일 수 있다. 일 구현예에 있어서, 기질은 컬럼 체적 5개 분량의 1 M NaCl과 접촉할 수 있으며, 최소 접촉 시간은 약 30 분일 수 있다. 재사용 전에, 바람직하게는, 기질은 평형 완충액으로 세척된다. 접촉 시간 및 재생 용액의 조성 및 농도는 당업자에 의하여, 리간드의 성질 및 공급원료의 조성에 기초하여, 재생이 효과적으로 이루어질 수 있도록, 선택될 수 있다.
앞에서 설명한 분리 방법의 예들은 다양한 기법으로 사용될 수 있다. 이들 기법에는, 예를 들면, 고정상(fixed bed), 유동상(fluidized bed) 및 회분식(batch) 크로마토그래피를 채용하는 조제 방법이 포함된다. 다른 대안으로서, 상기 방법은, 예를 들어, 높은 처리량의 분리 기법의 맥락으로 실시될 수 있다. 이러한 기법에서는, 예를 들면, 스핀 컬럼(spin columns) 또는 멀티웰 플레이트 형판(multiwell plate formats)과 같은 더 작은 장치가 이용될 수 있으며, 이때, 이들 장치의 체적은 수 마이크로리터 정도로 작을 수 있다.
회분식 흡착/분리를 사용하는 경우, 기질은 곧바로 생물학적 물질 용액에 첨가될 수 있고, 기질/생물학적 물질 혼합물은 통상적으로 부드럽게 교반되는데, 생물학적 물질을 기질에 결합시키기에 충분한 시간 동안 교반된다. 생물학적 물질이 흡착된 기질은 이어서, 예를 들면 원심분리 또는 여과에 의하여, 제거될 수 있고, 생물학적 물질은 이어서, 분리 단계에서, 기질로부터 용리될 수 있다.
또 다른 구현예에 있어서, 컬럼 크로마토그래피가 사용될 수 있다. 고정상 컬럼 크로마토그래피에 있어서, 기질은 컬럼 내로 충진되며, 분리 대상물인 생물학적 물질을 함유하는 용액을 기질에 가하기 위하여, 상기 용액을 기질 속으로, 생물학적 물질이 기질에 결합하는 것을 허용할 수 있는 속도로, 부어 넣는다.
유동상 컬럼 크로마토그래피에 있어서는, 상승하는 여과 흐름과 크고/치밀한 입자가 사용되며, 그에 따라, 상승하는 힘에 대항하여 평형이 유지된다. 본질적으로 수직인 컬럼이 사용되고, 컬럼에는 통상적으로 1 내지 5 개의 단(stage)이 하나 위에 다른 하나가 놓이는 방식으로 배치되며, 용액은 각 단을 차례로 통과한다. 이때, 용액은 상부 단의 상단부를 타고 넘는 오버플로우에 의하여 인출된다. 바람직하게는, 컬럼은 3 개의 단을 갖는다. 각 단은, 가장 위에 있는 단을 제외하고는, 두 개의 분배 시스템에 의하여 분리되는데, 그 중 하나는 용액을 해당 단의 바닥에서 분배하고, 다른 하나는 용액을 바로 위에 위치하는 단을 향하여 분배한다.
일 구현예에 있어서, 본 발명의 기질을 포함하는 컬럼은, 다른 기질을 포함하는 컬럼과 함께, 탠덤(tandem) 방식으로 사용될 수 있다. 이때, 다른 기질은 샘플로부터 다른 불순물을 제거하는데 효과적인 것일 수 있다. 따라서, 본 발명의 컬럼의 하나 이상의 이점이, 다른 또는 종래의 컬럼의 특성을 보완하는 것으로서, 고려될 수 있다. 이러한 맥락에서, 컬럼들의 그러한 탠덤 방식 배열은 용리액 및 평형 완충액을 보존하게 될 것이고, 그에 따라, 추가적인 샘플 조작 및 준비의 필요성을 제거하지는 못하더라도 저감시킬 수는 있게 될 것이다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 물론, 하기의 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 방식으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1
본 실시예는 하기 리간드 시약을 합성하는 공정을 예시한다: 메틸 2-(3-(터트-부톡시카르보닐아미노)-5-(이소프로폭시카르보닐아미노)벤즈아미도)아세테이트.
글리신 메틸 에스테르 하이드로클로라이드(675 mg, 5 mmol)를 DMF (15 ml)에 용해시킨 후, 하이드록시벤조트리아졸 (HOBt) (675 mg, 5 mmol), 3-(터트-부톡시카르보닐아미노)-5-(이소프로폭시카르보닐아미노)벤조산(1.76 g, 5 mmol)을 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 0 ℃로 냉각한 다음, N,N'-디이소프로필카르보디이미드(DIC)(1.54 mL, 10 mmol)를 천천히 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 0 ℃에서 5 분 동안, 그리고, 실온에서 밤새도록 추가적으로 교반하였다. 물 (100 ml)를 첨가한 다음, 추가적으로 20 분 동안 교반을 지속한 후, 에틸 아세테이트(100 ml)를 첨가하였다. 미정제 제품을 추가적으로 5 분동안 교반한 다음, 유기층을 분리하였다. 수계 상을 2 x 70 ml 에틸 아세테이트로 추가적으로 추출한 다음, 합쳐진 유기상을 물로 세척한 후, Na2SO4 로 건조하고, 진공하에서 농축하였다.
Figure pat00239
실리카겔을 사용하고 에틸아세테이트/헥산 1:1을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 1.65 g, 3.9 mmol의 백색 고체를 얻었으며, 수율은 78 wt%이었다. 1H NMR (CDCl3) δ: 7.72 (s, 1H, 방향족), 7.50 (s, 2H, 방향족), 6.50 (s, 1H, 아미드), 6.60 (s, 2H, 아미드), 4.22 (dd, 2H,), 3.80 (s, 3H), 1.55 (s, 18H). LCMS (이온 모드: ESI) m/z [M-H+] 계산. 422.20, 실제 422.00, [M+Na]+ 466.07.
실시예 2
본 실시예는 셀룰로오스의 파라-페닐렌디아민(PDA) 유도체를 제조하는 공정을 예시한다.
셀룰로오스 비드의 50 wt% 슬러리 100 ml를 1 M 수산화나트륨 수용액으로 광범위하게 세척한 다음 다시 물로 세척하여 pH가 중성이 되도록 하였다. 상기 배수된(drained) 50 ml의 비드에 pH 11-12인 50 ml의 수산화나트륨 수용액을 첨가한 후, 5 ml의 클로로아세트산을 첨가하였다. 이렇게 얻은 혼합물을 60 ℃에서 24 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온까지 냉각되도록 한 후, 세척하여, 미반응 클로로아세트산을 제거한 다음, 중화시켰다.
COOH의 밀도는 60 μmol/ml-비드이었다. COOH의 밀도는 다양한 작용기에 대한 산-염기 적정에 의하여 측정되었다.
COOH 밀도가 60 μmol/ml인 카르복시메틸셀룰로오스의 비드 10 ml를, pH 4.7의 0.1 M MES 완충액 중의 EDC (2.1　mmol)의 존재하에, N-Boc-p-페닐렌디아민 (0.374 g, 1.8 mmol, 3 당량)과 결합시켰다. 이 반응 혼합물을 세척하여, 과잉의 Boc-p-페닐렌디아민 및 부생성물을 제거하였다. BOC 보호기를 3 M HCl로 제거하여, 다음의 물질을 얻었다:
Figure pat00240
.
이 생성물은 백색이었으며, 리간드 밀도는 40 μmol/ml-비드이었고, 질소 원소 분석법에 의하여 측정되었다. 이 생성물을, 4~8 ℃에서, pH 7의 포스페이트 완충 식염수(PBS) 중의 50 wt% 슬러리의 형태로, 저장하였다.
실시예 3
본 실시예는 황-함유 링커를 갖는, 셀룰로오스의 파라-페닐렌디아민(PDA) 유도체를 제조하는 공정을 예시한다.
100 g의 가교된 셀룰로오스 비드(흡인 건조되어 습식 케이크 상태임)를 물(75 g), 32 wt% NaOH 수용액(19.5 g) 및 알릴 브로마이드(18.75 g)과 혼합하였다. 이 혼합물을 실온에서 24 시간 동안 회전통에 넣고 회전시켰다.
이 비드를 광범위하게 세척하여, 미반응된 알릴 브로마이드 및 부생성물을 제거함으로써, 알릴 셀룰로오스를 얻었으며, 이는 다양한 작용기의 부착을 위한 기질로서 사용된다.
100 g의 알릴-셀룰로오스 비드(흡인 건조되어 습식 케이크 상태임)를 물 (99　g) 및 2-메르캅토아세트산 (1.0 g)과 pH 11~12에서 혼합한 다음, 이 혼합물을 실온에서 48시간 동안 회전통에 넣고 회전시켰다. 이렇게 얻은 카르복실 유도체를 세척하여 부생성물을 제거함으로써, 산-활성화된 셀룰로오스를 얻었으며, 이는 다양한 작용기의 부착을 위한 기질로서 사용된다. 산 밀도를 원소 분석으로 측정한 결과 90 μmol/ml-비드이었다.
그 다음, 이렇게 얻은 산-활성화된 비드의 50 wt% 슬러리 10.0 ml를, EDC (3 당량)의 존재하에서, pH 4.7의 0.1 M MES 완충액 중의 Boc-p-페닐렌디아민(0.562 g, 2.7 mmol, 3 당량)으로 축합하였다. 이 반응 혼합물을 실온에서 12 시간 동안 진탕하였다. 이 반응 혼합물을 광범위하게 세척하여 미반응 Boc-p-페닐렌디아민 및 상기 반응의 부생성물을 제거하였다. BOC 보호기를 3 M HCl로 제거하여 하기의 물질을 얻었다:
Figure pat00241
.
이 생성물은 백색이었으며, 질소 원소 분석으로 측정된 p-페닐렌디아민 리간드의 밀도는 78　μmol/ml-비드이었다. 이 생성물은, 4~8 ℃에서, pH 7의 PBS 완충액 중의 50 wt% 슬러리의 형태로, 저장될 수 있다.
실시예 4
본 실시예는 황-함유 링커를 갖는, 셀룰로오스의 메타-페닐렌디아민 유도체를 제조하는 공정을 예시한다.
실시예 3에서 설명된 절차에 따라 얻어진 산-활성화된 셀룰로오스 비드의 50 wt% 슬러리 10 ml를 EDC (3 당량)의 존재하에서, pH 4.7의 0.1 M MES 완충액 중의 N-Boc-m-페닐렌디아민(0.562 g, 2.7 mmol, 3 당량)으로 축합하였다. BOC 보호기를 3 M HCl로 제거하여 하기의 물질을 얻었다:
Figure pat00242
.
이 생성물은 백색이었으며, 질소 원소 분석으로 측정된 리간드 밀도는 62　μmol/ml-비드이었다. 이 생성물은, 4~8 ℃에서, pH 7의 PBS 완충액 중의 50 wt% 슬러리의 형태로, 저장될 수 있다.
동일한 생성물이, N-Boc-m-페닐렌디아민 대신에 m-페닐렌디아민을 커플링함으로써 제조되었으며, 리간드 밀도는 64　μmol/ml-비드이었다.
실시예 5
본 실시예는 황-함유 링커를 갖는, 셀룰로오스의 오르쏘-페닐렌디아민 유도체를 제조하는 공정을 예시한다.
실시예 3에서 설명된 절차에 따라 얻어진 산-활성화된 셀룰로오스 비드의 50 wt% 슬러리 10 ml를 EDC (3 당량)의 존재하에서, pH 4.7의 0.1 M MES 완충액 중의 Boc-o-페닐렌디아민(0.562 g, 2.7 mmol, 3 당량)으로 축합하였다.
이 반응 혼합물을 실온에서 24 시간 동안 진탕하였다. 이 혼합물을 광범위하게 세척하여 미반응 Boc-o-페닐렌디아민 및 상기 반응의 부생성물을 제거하였다. BOC 보호기를 3 M HCl로 제거하여 하기의 물질을 얻었다:
Figure pat00243
.
이 생성물은 백색이었으며, 원소 분석으로 측정된 리간드 밀도는 40　μmol/ml-비드이었다. 이 생성물은, pH 7의 PBS 완충액 중의 50 wt% 슬러리의 형태로, 저장되었다.
실시예 6
본 실시예는 황-함유 링커를 갖는, 셀룰로오스의 4,6-디아미노피리미딘 유도체를 제조하는 공정을 예시한다.
실시예 3에서 설명된 절차에 따라 얻어진 산-활성화된 셀룰로오스 비드의 50 wt% 슬러리 10 ml를 EDC (3 당량)의 존재하에서, pH 4.7의 0.1 M MES 완충액 중의 4,6-디아미노피리미딘 하이드로클로라이드(0.395 g, 2.7 mmol, 3 당량)으로, 실온에서 12 시간 동안, 축합하였다. 이 생성물을 세척하여 미반응 4,6-디아미노피리미딘 및 부생성물을 제거하였다.
Figure pat00244
.
4,6-디아미노피리미딘으로 유도된 이 비드는 백색이었다. 측정된 리간드 밀도는 30　μmol/ml-비드이었다. 이 비드는, 4~8 ℃에서, pH 7의 PBS 완충액 중의 50 wt% 슬러리의 형태로, 저장될 수 있다.
실시예 7
본 실시예는 황-함유 링커를 갖는, 셀룰로오스의 2,4,6-트리아미노피리미딘 유도체를 제조하는 공정을 예시한다.
실시예 3에서 설명된 절차에 따라 얻어진 산-활성화된 셀룰로오스 비드의 50 wt% 슬러리 10 ml를 물로 철저하게 세척하여 저장 용액을 제거한 후, pH 4.7의 0.1 M MES 완충액으로 세척하였다. 그 다음, 이 비드를 0.1 M MES (3 ml) 중에 용해된 3.5　mmol 2,4,6-트리아미노피리미딘 및 2 M HCl (1.75 ml) 과 혼합한 후 EDC (1.5 mmol)를 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 텀블링(tumbling)한 후, 광범위하게 세척하여 미반응 시약 및 부생성물을 제거하였다.
Figure pat00245
.
이 생성물은 백색이었으며, 원소 분석으로 측정된 리간드 밀도는 30　μmol/ml-비드이었다. 이 생성물은, pH 7의 PBS 완충액 중의 50 wt% 슬러리의 형태로, 저장되었다.
실시예 8
본 실시예는 황-함유 링커를 갖는, 셀룰로오스의 1,5-디아미노나프탈렌 유도체를 제조하는 공정을 예시한다.
실시예 3에서 설명된 절차에 따라 얻어진 산-활성화된 셀룰로오스 비드의 50 wt% 슬러리 10 ml를, EDC (3 당량)의 존재하에서, 메탄올 및 pH 4.7의 0.1 M MES 완충액의 혼합물 중의 1,5-디아미노나프탈렌(0.427 g, 2.7 mmol, 3　당량)으로, 실온에서 12 시간 동안, 축합하였다. 그 다음, 이 생성물을 광범위하게 세척하여 미반응 디아민 및 부생성물을 제거하였다.
Figure pat00246
.
1,5-디아미노나프탈렌으로 유도된 이 비드는 바랜 핑크색(off-pink)이었다. 원소 분석으로 측정된 리간드 밀도는 41　μmol/ml-비드이었다. 이 생성물은 안정하였으며, 4~8 ℃에서, pH 7의 PBS 완충액 중의 50 wt% 슬러리의 형태로, 저장될 수 있다.
실시예 9
본 실시예는 황-함유 링커를 갖는, 셀룰로오스의 2,5-디아미노피리딘 유도체를 제조하는 공정을 예시한다.
실시예 3에서 설명된 절차에 따라 얻어진 산-활성화된 셀룰로오스 비드의 50 wt% 슬러리 10 ml를, EDC (5 당량)의 존재하에서, pH 4.7의 0.1 M MES 완충액 중의 2,5-디아미노피리딘 디하이드로클로라이드(0.491 g, 3 mmol, 3 당량)으로 축합하였다. 이 생성물을 광범위하게 세척하여 미반응 시약 및 부생성물을 제거하였다.
Figure pat00247
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2,5-디아미노피리딘으로 유도된 이 비드는 백색이었다. 원소 분석으로 측정된 리간드 밀도는 58　μmol/ml-비드이었다. 이 생성물은 4~8 ℃에서, pH 7의 PBS 완충액 중의 50 wt% 슬러리의 형태로, 저장될 수 있다.
실시예 10
본 실시예는 황-함유 링커를 갖는, 셀룰로오스의 2,4,6-트리메틸-1,3-벤젠디아민 유도체를 제조하는 공정을 예시한다.
실시예 3에서 설명된 절차에 따라 얻어진 산-활성화된 셀룰로오스 비드의 50 wt% 슬러리 10 ml를, EDC (3 당량)의 존재하에서, 메탄올 및 pH 4.7의 0.1 M MES 완충액의 혼합물 중의 2,4,6-트리메틸-1,3-벤젠디아민(0.405 g, 2.7 mmol, 3　당량)으로, 축합하였다. 이 생성물을 세척하여 부생성물 및 미반응 시약을 제거하였다.
Figure pat00248
.
2,4,6-트리메틸-1,3-벤젠디아민으로 유도된 이 비드는 백색이었다. 원소 분석으로 측정된 리간드 밀도는 72　μmol/ml-비드이었다.
실시예 11
본 실시예는 황-함유 링커를 갖는, 셀룰로오스의 테트라메틸-p-페닐렌디아민 유도체를 제조하는 공정을 예시한다.
실시예 3에서 설명된 절차에 따라 얻어진 산-활성화된 셀룰로오스 비드의 50 wt% 슬러리 10 ml를 물로 철저하게 세척하여 저장 용액을 제거한 후, pH 4.7의 0.1 M MES 완충액으로 세척하였다. 메탄올 (4 ml) 중에 용해된 2,3,5,6-테트라메틸-1,4-페닐렌디아민 (4.0 mmol)을 첨가한 다음, 0.1　M　MES에 용해된 EDC (4.0 mmol)를 비드에 첨가하였다. 이 비드를 밤새도록 텀블링한 후, 광범위하게 세척하여 미반응 디아민 및 부생성물을 제거하였다.
Figure pat00249
.
이 생성물은 백색이었으며, 원소 분석으로 측정된 리간드 밀도는 65　μmol/ml-비드이었다. 이 생성물은, pH 7의 PBS 완충액 중의 50 wt% 슬러리의 형태로, 저장되었다.
실시예 12
본 실시예는 황-함유 링커를 갖는, 셀룰로오스의 3,5-디아미노벤조산 유도체를 제조하는 공정을 예시한다.
실시예 3에서 설명된 절차에 따라 얻어진 산-활성화된 셀룰로오스 비드의 50 wt% 슬러리 10 ml를, EDC (3 당량)의 존재하에서, 메탄올 및 pH 4.7의 0.1 M MES 완충액의 1:1 혼합물 중의 3,5-디아미노벤조산의 에틸 에스테르(0.486 g, 2.7 mmol, 3　당량)으로 축합하였다. 그 다음, 비누화(saponification)를 1　M　NaOH를 사용하여 실온에서 12 시간 동안 수행하여 하기의 생성물을 얻었다:
Figure pat00250
.
디아미노벤조산으로 유도된 이 비드는 바랜 백색(off-white)이었다. 원소 분석으로 측정된 리간드 밀도는 40　μmol/ml-비드이었다.
실시예 13
본 실시예는 황-함유 링커를 갖는, 셀룰로오스의 2-메톡시-5-터트-부틸-1,3-벤젠디아민 유도체를 제조하는 공정을 예시한다.
실시예 3에서 설명된 절차에 따라 얻어진 산-활성화된 셀룰로오스 비드의 50 wt% 슬러리 10 ml를 물로 철저하게 세척하여 저장 용액을 제거한 후, pH 4.7의 0.1 M MES 완충액으로 세척하였다. 메탄올 (4 ml) 중에 용해된 4-터트-부틸-2,6-디아미노아니솔 (4.0 mmol)을 첨가한 다음, 0.1　M　MES에 용해된 EDC (4.0 mmol)를 비드에 첨가하였다. 이 비드를 밤새도록 텀블링(tumbling)한 후, 광범위하게 세척하여 과잉의 디아민 및 부생성물을 제거하였다.
Figure pat00251
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이 생성물은 백색이었으며, pH 7의 PBS 완충액 중의 50 wt% 슬러리의 형태로, 저장되었다.
실시예 14
본 실시예는 황-함유 링커를 갖는, 셀룰로오스의 2,6-디아미노피리딘 유도체를 제조하는 공정을 예시한다.
실시예 3에서 설명된 절차에 따라 얻어진 산-활성화된 셀룰로오스 비드의 50 wt% 슬러리 5.0 ml를 물로 철저하게 세척하여 저장 용액을 제거한 후, pH 4.7의 0.1 M MES 완충액으로 세척하였다. 이 비드를 0.1 M MES (2 ml) 및 2 M HCl (1.75 ml) 중에 용해된 2,6-디아미노피리딘 (382 mg, 3.5 mmol)과 혼합하였다. 0.1 M MES (1.5 ml)에 용해된 EDC (306 mg, 1,6 mmol)를 첨가하였다. 이 비드를 밤새도록 실온에서 텀블링한 후, 광범위하게 세척하여 미반응 시약 및 부생성물을 제거하였다.
Figure pat00252
.
원소 분석으로 측정된 커프링된 리간드의 밀도는 26　μmol/ml-습식비드이었다. 이 생성물은 백색이었으며, pH 7의 PBS 완충액 중의 50 wt% 슬러리의 형태로, 저장되었다.
실시예 15
본 실시예는 황-함유 링커를 갖는, 셀룰로오스의 4-니트로-1,2-페닐렌디아민 유도체를 제조하는 공정을 예시한다.
실시예 3에서 기술된 절차에 따라 얻어진, 산-활성화된 셀룰로오스 비드의 50 wt% 슬러리 6.0 ml를 물로 완전히 세척하여, 저장 용액을 제거한 후, 0.1M의 MES 완충액으로 pH 4.7에서 완전히 세척하였다. 메탄올(4 ml)에 용해된 4-니트로-1,2-페닐렌디아민(2.4 mmol)을 첨가하고 나서, 0.1 M MES (2 ml)에 용해된 EDC(2.4 mol, 458 mg)을 첨가하였다. 이 비드를 밤새 텀블링한 후, 충분하게 세척하여 미반응 반응물 및 부생성물을 제거하였다.
Figure pat00253
.
최종 생성물은 주황색이었고, pH 7에서 PBS 완충액 중의 50 wt% 슬러리로서 저장될 수 있었다.
실시예 16
본 실시예는 황-함유 링커를 갖는, 셀룰로오스의 4,5,6-트리아미노피리미딘 유도체를 제조하는 공정을 예시한다.
실시예 3에서 기술된 절차에 따라 얻어진 산-활성화된 셀룰로오스 비드의 50 wt% 슬러리 5.0ml를 물로 완전히 세척하여 저장 용액을 제거한 후, 0.1M MES 완충액으로 pH 4.7에서 세척하였다. 0.1M MES(4ml)에 현탁된 4,5,6-트리아미노피리미딘 황산염(3.2mmol, 702mg)을 첨가한 후, 0.1M MES (1 ml)에 용해된 EDC (1.5 mmol, 280 mg)을 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 3시간 동안 텀블링한 후, 충분히 세척하여 미반응 반응물 및 부생성물을 제거하였다.
Figure pat00254
.
최종 생성물은 흰색이었고, pH 7의 PBS 완충액에서 50 wt% 슬러리로서 저장될 수 있었다.
실시예 17
본 실시예는 황-함유 링커를 갖는, 셀룰로오스의 4-클로로-2,6-디아미노피리딘 유도체를 제조하는 공정을 예시한다.
실시예 3에서 기술된 절차에 따라 얻어진 산-활성화된 셀룰로오스 비드의 50wt% 슬러리 5.0ml를 물로 완전히 세척하여 저장 용액을 제거한 후, pH 4.7에서 0.1M MES 완충액으로 세척한다. 이 비드는 0.1M MES (3ml) 및 2M HCl (1.75ml) 내에 용해된 4-클로로-2,6-디아미노피리딘(3.5 mmol)과 함께 혼합된 후, EDC(1.5mmol)이 첨가된다. 이 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 회전한 후, 충분하게 세척하여 미반응 반응물 및 부생성물을 제거한다.
Figure pat00255
.
이 최종 생성물은 흰색이고, pH 7의 PBS 완충액 중의 50 wt% 슬러리로서 저장될 수 있다.
실시예 18
본 실시예는 황-함유 링커를 갖는, 셀룰로오스의 2,4-디아미노피리미딘 유도체를 제조하는 공정을 예시한다.
실시예 3에서 기술된 절차에 따라 얻어진 산-활성된 셀룰로오스 비드의 50 wt% 슬러리 10.0 ml를 물로 완전히 세척하여 저장 용액을 제거한 후, 0.1 M MES 완충액으로 pH 4.7에서 세척한다. 이 비드를 0.1 M MES (6 ml) 및 2 M HCl (3.5 ml) 내에 용해된 2,4-디아미노피리미딘(7.0 mmol)과 함께 혼합한 후, EDC(3.0 mmol)를 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 텀블링한 후, 충분하게 세척하여 미반응 반응물 및 부생성물을 제거하였다.
Figure pat00256
.
이 최종 생성물은 흰색이었고, pH 7의 PBS 완충액 중의 50 wt% 슬러리로서 저장될 수 있었다.
실시예 19
본 실시예는 황-함유 링커를 갖는, 셀룰로오스의 2,5-디아미노벤젠 술폰산 유도체를 제조하는 공정을 예시한다.
실시예 3에서 기술된 절차에 따라 얻어진 산-활성된 셀룰로오스 비드의 50 wt% 슬러리 5.0ml를 물로 완전히 세척하여 저장 용액을 제거한 후, 0.1M MES 완충액으로 pH 4.7에서 세척하였다. 이 비드를 0.1 M MES (3 ml) 및 1 M NaOH (1.5 ml) 내에 용해된 2,5-디아미노벤젠 술폰산(300mg, 1.6 mmol)과 함께 혼합한 후, 0.1 M MES(2 ml) 내에 용해된 EDC(306 mg, 1.6 mmol)를 첨가하였다. 이 비드를 실온에서 24시간 동안 텀블링한 후, 충분하게 세척하여 미반응 반응물 및 부생성물을 제거하였다.
Figure pat00257
.
이 리간드의 밀도는 원소분석에 의해 28μmol/ml 비드로 측정되었다. 이 최종 생성물은 pH 7의 PBS 완충액 중의 50 wt% 슬러리로서 저장될 수 있었다.
실시예 20
본 실시예는 황-함유 링커를 갖는, 셀룰로오스의 3,4-디아미노벤조산 유도체를 제조하는 공정을 예시한다.
위의 실시예 3에서 기술된 절차에 따라 얻어진 산-활성된 셀룰로오스 비드의 50 wt% 슬러리 10 ml를 EDC(3 당량) 존재하에 pH 4.7 에서 메탄올 및 0.1 M MES 완충액 1:1 혼합물 내에서 3,4-디아미노벤조산의 에틸 에스테르(0.486 g, 2.7 mmol, 3　당량)로 축합시켰다. 12시간동안 실온에서 1 M NaOH를 사용하여 비누화가 수행되었고, 아래와 같은 생성물이 생성되었다:
Figure pat00258
.
이 디아미노벤조 산으로 유도된 비드는 옅은 황백색(off-white)이었다. 이 리간드의 밀도는 70μmol/ml-수지로, 원소 분석에 의해 측정되었다.
실시예 21-45
아래의, 표 1에 나타낸 바와 같이, 실시예 19의 2,5-디아미노벤젠 술폰산에 대한 적절한 리간드 시약을 대체하여, 황-함유 링커 및 리간드를 갖는 셀룰로오스 유도체가, 실시예 8에 기술된 절차에 따라 제조되었다.
실시예 리간드
21
Figure pat00259
22
Figure pat00260
23
Figure pat00261
24
Figure pat00262
25
Figure pat00263
26
Figure pat00264
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Figure pat00265
28
Figure pat00266
29
Figure pat00267
30
Figure pat00268
31
Figure pat00269
32
Figure pat00270
33
Figure pat00271
34
Figure pat00272
35
Figure pat00273
36
Figure pat00274
37
Figure pat00275
38
Figure pat00276
39
Figure pat00277
40
Figure pat00278
41
Figure pat00279
42
Figure pat00280
43
Figure pat00281
44
Figure pat00282
45
Figure pat00283
실시예 46
본 실시예는 본 발명의 구현예에 따라 고체 기질을 사용하여 미처리 인간 혈장으로부터 IgG를 분리 및 정제하는 방법을 예시한다.
1 ml 컬럼이 실시예 3에 따라 제조된 고체 기질로 채워졌다. 이 고체 기질은 pH 7.2에서 20 mM 인산염 완충액으로 평형 상태를 이루었다.
그 다음, 미처리 인간 혈장의 샘플 10ml를 평형상태 완충액 내에서 1:1로 희석하고, 0.2 ㎛ 막을 통과해 여과시킨 후, 12 ml를 곧바로 컬럼으로 적재하였다. 그런 후, 칼럼을 pH 7.2에서 20 mM 인산염으로 완충된 0.5 M NaCl로 세척하여, 비-흡착된 단백질을 확실히 제거하였다. 결합된 불순물들은 pH 7.2에서 20 mM 인산염 완충액으로 컬럼을 세척하므로써 제거되었다.
원하는 IgG이 pH 4.0에서 20 mM 아세트산염 완충액에 용리된다. 25 mg의 IgG이 수집되었고, 그 순도는 99%보다 높을 것으로 추정되었다.
실시예 47
본 실시예는 본 발명의 다른 구현예에 따라서, 고체 기질을 사용하여 혈장으로부터 IgG를 분리 및 정제하는 방법을 예시한다.
1 ml 칼럼이, 실시예 9에 따라 제조된 고체 기질로 채워졌다. 이 고체 기질은 pH 7.4에서 20 mM 인산염 완충액으로 평형 상태를 이루었다.
그 다음, 10 ml의 인간 혈장이 평형 상태 완충액에서 1:1로 희석되고, 0.2 ㎛의 막을 통해 여과되고, 20 ml가 곧바로 칼럼으로 적재되었다.
이후에, 이 칼럼을 pH 7.2에서 20 mM 인산염으로 완충된 0.5 M NaCl로 세척하여, 비-흡착된 단백질을 확실히 제거하였다. 결합된 불순물들은 pH 7.2에서 20 mM 인산염 완충액으로 컬럼을 세척하므로써 제거되었다.
원하는 IgG이 pH 5.0에서 20 mM 나트륨 아세트산염 완충액에 용리되었다. 35 mg의 원하던 IgG이 수집되었고, 그 순도는 99%보다 높을 것으로 추정되었다.
실시예 48
본 실시예는, 본 발명의 구현예에 따른 기질을 사용하여, 다양한 리간드 밀도를 가지고, 우수한 동적 결합 능력(good dynamic binding capacity)이 얻어질 수 있음을 예시하고 있다.
고체 기질은 실시예 3에 따라서 제조되었으나, 산-활성화된 비즈와 p-페닐렌디아민의 커플링 조건(산 밀도에 대한 페닐렌디아민 및 EDC의 화학양론을 변화시킴)이 다양한 리간드 밀도를 갖는 샘플을 생산하기 위해 변화되는 것은 제외하였다.
각각의 기질 샘플에 대한 IgG 동적 단백질 결합 능력(DBC)이 "UNICORN software" 지시에 따라서 "AKTA Explorer 100 LC Workstation(GE Healthcare Bioscience, Pittsburgh, PA)"에서 측정되었다. 평형 및 세척 유속은 1 ml/min 이었고, 부하 유속은 0.33 ml/min (3분 체류 시간)이었다. 인간의 IgG는 50% 파과(BT) 지점까지 적재되었다. Amersham 18-0383-01 으로부터 HR 5/5 칼럼 (5 mm 지름 및 5 cm 길이, 부피 = 1　ml)이 수지 충전에 사용되었고, A280 리딩이 UltraSpec 1000에 의해 측정되었다. 20.0 mg/ml 농도의 상업적 IgG (SeraCare Life Sciences, lot number G111RM-25B0802)이 사용되었다. IgG에 대한 적재 완충액은 pH 7.2에서 20 mM NaH2PO4 에 있으며, 평형 및 세척 완충액도 또한 pH 7.2에서 20 mM NaH2PO4 에 있다. 용리 완충액은 0.1 M 아세트산으로, pH 3.1 이었다. 용리로부터의 동적 결합 능력은 모든 용리 분획에서 단백질의 양을 측정하므로써 계산되었다. 회수는 실제로 칼럼에 결합된 단백질에 의해 나누어진 용리 내의 단백질의 양(칼럼에 결합된 단백질의 양 = 칼럼에 적재된 단백질의 양 - 파과 및 세척 안의 단백질)을 사용하여 계산되었다. 10% 파과(BT)에서의 결합 능력은 방정식을 사용하여 계산되었다:(적재 안의 단백질 농도)*(V10%BT-Vvoid). 시스템 및 칼럼의 공극 부피는 1% 아세톤의 주입에 의해 측정되었다.
실험된 기질은 약 50 μ㏖ 이상의 낮은 리간드 밀도에서조차 훌륭한 동적 결합 능력을 보여주었다.
실시예 49
본 실시예는 본 발명의 구현예에 따른 기질을 사용하여 순수한 IgG를 얻는 동안에도 리간드 밀도가 변화할 수 있다는 것을 예시한다.
고체 기질은 실시예 3에 따라서 제조되었으나, 산-활성화된 비즈와 p-페닐렌디아민의 커플링 조건(산 밀도에 대한 페닐렌디아민 및 EDC의 화학양론을 변화시킴)이 다양한 p-페닐렌디아민(PDA) 리간드 밀도를 갖는 샘플을 생산하기 위해 변화되는 것은 제외하였다. 각각의 고체 기질 샘플은 별개의 칼럼 속으로 적재되었고, 실시예 46에 기술된 바와 같이 인간 혈장으로부터 IgG를 정제하는데 사용되었다.
각각의 기질 샘플로부터 얻어진 IgG 순도는 도 2에 나타나 있다. 35 μ㏖/ml의 낮은 리간드 밀도에서조차, IgG는 99%의 순도로 얻어졌다. 35 μ㏖/ml 이상의 리간드 밀도를 갖는 기질에 대하여, 리간드 밀도에 따른 IgG 순도의 의미있는 증가는 관찰되지 않았다.
실시예 50
본 실시예는 본 발명의 구현예에 따른 기질을 사용하여 체류 시간에 대한 IgG 결합을 예시한다.
고체 기질은 실시예 3에 따라 제조되었다. 각각의 고체 기질 샘플은 별개의 칼럼 속으로 적재되었고, 다음의 절차에 따라 순순한 IgG를 결합하는 데 사용되었다. 50% 파과(BT)에 이를 때까지, pH 7.2 및 6　mS/cm의 전도도에서 인산염 완충액 내의 IgG 2 mg/ml이 적재되었다. 이후에 칼럼을 0.5 M NaCl로 세척하여, 비즈에 흡착된 IgG를 제거하였다. 이후에 IgG는 pH 3.1의 0.1 M 아세트산 완충액을 사용하여 용리되었다.
실험된 각각의 체류 시간에 대한, pH 3에서 회수 퍼센트에 따라, 10% 파과에서 결합 및 용리된 IgG의 양을 표 2에 나타내었다. 기질은 6분의 체류 시간에서 높은 결합 능력을 보여주었으며, IgG 회수는 여러 체류 시간에 대해 높게 나타났다.
체류 시간 (min) 결합 (mg/ml) 용리 (mg/ml) 회수　(%)
3 24.4 23.5 96.3
4 31.0 29.6 95.5
6 40.9 37.7 92.3
실시예 51
본 실시예는 본 발명의 구현예에 따른 기질을 사용하여, IgG 결합 및 회수에 대한 pH의 영향을 예시한다.
고체 기질이 실시예 12에 따라서 제조되었다. 각각의 고체 기질 샘플은 별개의 칼럼 속으로 적재되었고, 다음의 절차에 따라 인간 혈장으로부터 IgG를 정제하는 데 사용되었다: 다양한 pH(5-8.5)(표 2 참조)를 갖는 다양한 완충액 용액 안의 IgG 2 mg/ml가 10% BT에 이를 때까지 각각의 칼럼으로 적재되었다. 이후에 칼럼을 0.5 M NaCl로 세척하여, 비즈에 흡착된 IgG를 제거하였다. 이후에 IgG는 pH 3.1의 0.1 M 아세트 산 완충액을 사용하여 용리되었다.
실험된 각각의 pH에 대한, 회수 퍼센트에 따라, 10% 파과에서 결합 및 용리된 IgG의 양을 표 3에 나타내었다. 실험된 모든 pH 값에서, 적어도 98.8%의 IgG 결합이 회수되었다. pH 5.5 는 이 리간드에 대한 최적의 적재 pH이었다.
pH IgG 결합 @ 10% BT IgG 용리 @ 10% BT 회수　(%)
5.0 19.2 19.2 100
5.5 25 24.8 99
6.0 24.3 24.0 98.8
7.2 19.1 19.0 ~100
8.5 3 3 100
실시예 52
본 실시예는 본 발명의 구현예에 따른 기질을 사용하여 미처리 인간 혈장으로부터 IgG 정제용 기질의 재사용을 예시한다.
고체 기질은 실시예 3에 따라 제조되었고, 실시예 46에 기술된 절차에 따라 칼럼속으로 적재되어 IgG를 함유하는 생물학적 재료의 샘플을 처리하는데 사용되었다. 용리에 이어, 고체 기질은 1 ml/분 유속에서 1 M NaOH를 사용하여 재생되었고, 같은 절차에 따라, 다시 IgG를 함유하는 생물학적 재료의 샘플을 처리하는데 사용되었다. 생물학적 샘플을 총 3개 처리하는 동안, 재생 및 재사용 싸이클은 두번 반복되었다.
각각의 싸이클에 대한 IgG 결합량 및 순도가 표 4에 나타나 있다. 반복된 사용 후에 조차도, 기질은 높은 순도의 IgG를 생산했다.
시험 # 체류 시간 (min) 용리로부터 결합(mg/ml) 순도　(%)
1 3 25.1 98.3
2 3 22.0 99.4
3 6 23.0 99.7
실시예 53
본 실시예는 본 발명의 구현예에 따른 기질을 사용하여, 미처리 인간 혈장으로부터의 IgG 정제(체류 시간 3 분)를 예시한다.
고체 기질이 실시예 3, 4, 9, 10 및 11에 따라 제조되었다. 실시예 46에 기술된 바와 같이, 각각의 고체 기질 샘플은 별개의 칼럼으로 적재되었고, 인간 혈장으로부터 IgG를 정제하는데 사용되었다.
용리된 IgG의 양 및 각각의 실험된 기질에 대한 순도가 표 5에 나타나있다. 실험된 모든 기질이 높은 순도의 IgG를 생산하였다.
리간드 미처리 인간 혈장으로부터 IgG 용리 순도(%)
Figure pat00284
 25.5 mg/ml-수지 >99
Figure pat00285
 20 mg/ml-수지 91
Figure pat00286
 35 mg/ml-수지 >99
Figure pat00287
 9 mg/ml-수지 >99
Figure pat00288
 3 mg/ml-수지 >99
실시예 54
본 실시예는 본 발명의 구현예에 따른 기질을 사용하여, 10% 파과(체류 시간 3분)에서의 순수한 IgG 결합 및 회수를 예시한다.
고체 기질이 실시예 3, 10, 11 및 13에 따라 제조되었다. 실시예 50에서 기술된 바와 같이, 각각의 고체 기질 샘플은 별개의 칼럼으로 적재되었고, 순수한 IgG를 결합하는데 사용되었다.
회수율에 따라, 각각의 기질에 대한, 10% 파과 및 3 분의 체류 시간에서의 결합 및 용리된 IgG의 양을 표 6에 나타내었다.
리간드 결합(mg/ml) 용리 (mg/ml) 회수　(%)
Figure pat00289
 24.9 23.7 95
Figure pat00290
 26.4 24.2 91.3
Figure pat00291
 21.5 19.8 92.3
Figure pat00292
 10 3.5 57
실시예 55
본 실시예는 본 발명의 구현예에 따른 기질을 사용하여, 10% 파과에서의 Fab 결합 및 회수를 예시한다.
고체 기질이 실시예 3, 4, 5 및 8에 따라 제조되었다. 다음의 조건하에서, 각각의 고체 기질 샘플은 별개의 칼럼으로 적재되었고, 순수한 Fab를 결합하는데 사용되었다: 10% 파과에 이를 때까지, 100 mM Tris-HCl 내의 0.5 mg/ml Fab 용액, pH 7.4의 10 mM EDTA 완충액이 각각의 칼럼에 적재되었다. 이후에, 칼럼은 평형상태 완충액(100 mM Tris-HCl 및 pH　7.4의 10 mM EDTA)으로 세척되었고, Fab는 pH 3의 300 mM 글리신(glycine) 완충액으로 용리되었다.
각각의 기질에 대한 회수율에 따른, 10% 파과 및 3분 체류시간에서의 Fab의 동적 결합 능력(DBC)을 표 7에 나타냈다.
리간드 DBC (mg/ml) 회수　(%)
Figure pat00293
 10 83
Figure pat00294
 24 81
Figure pat00295
 0.4 90
Figure pat00296
 23 55
실시예 56
본 실시예는 본 발명의 구현예에 따른 기질을 사용하여, 체류 시간에 대한 모노클로날 항체 결합을 예시한다.
고체 기질이 실시예 3에 따라서 제조되었고, 칼럼 속에 적재되어, 다음의 절차에 따라서, 순수한 모노클로날 항체를 결합하는 데 사용되었다: 6 mS/cm의 전도도를 갖는 pH 7.2의 나트륨 인산염 완충액 내의 2　mg/ml의 mAb가 여러 체류 시간에서 10% 파과에 이를 때까지 각각의 칼럼으로 적재된다. 칼럼은 20 mM 나트륨 인산염 완충액 및 500 mM NaCl로 세척되고, mAb는 pH 4.0의 20 mM 나트륨 아세트산염에 용리되었다.
회수율은 물론 기질에 결합된 모노클로날 항체 및 기질로부터 용리된 모노클로날 항체의 양이 표 8에 나타나 있다. 짧은 체류 시간에서 기질은 모노클로날 항체의 높은 회수를 보여주고 있다.
체류 시간 (min) 결합 (mg/ml) 용리 (mg/ml) 회수　(%)
3 41.0 40.3 98.2
4 46.7 46.5 99.6
6 62.0 58.3 94.0
실시예 57
본 실시예는 본 발명의 구현예에 따른 기질을 사용하여, 체류 시간에 대한 모노클로날 항체 결합을 예시한다.
고체 기질이 실시예 20에 따라서 제조되었고, 칼럼 속에 적재되어, 다음의 절차에 따라서, 순수한 모노클로날 항체를 결합하는 데 사용되었다: 15 mS/cm의 전도도를 갖는 pH 5.5의, 나트륨 인산염 완충액에 더해진 150 mM NaCl내의 2　mg/ml의 mAb 가 여러 체류 시간에서, 10% 파과에 이를 때까지 각각의 칼럼으로 적재된다. 칼럼은 20 mM 나트륨 인산염에 더해진 150 mM NaCl(15 mS/cm의 전도도를 갖는)로 세척되고, mAb는 pH 8.0의 50 mM 나트륨 아세트산염에 더해진 250 mM NaCl (25 mS/cm의 전도도를 갖는)에 용리되었다.
회수율과 더불어 기질에 결합한 모노클로날 항체의 양을 표 9에 나타내었다. 짧은 체류 시간에서, 기질은 모노클로날 항체의 높은 회수를 보였다.
체류 시간 (min) 결합 (mg/ml) 회수(%)
3 37.3 ~98
4 47.0 ~95
6 68.3 ~92
실시예 58
본 실시예는 본 발명의 구현예에 따른 기질을 사용하여, 10% 파과 및 3 분의 체류 시간에서 모노클로날 항체 결합 및 회수를 예시한다.
고체 기질이 실시예 3, 4, 8 및 9에 따라 제조되었다. 각각의 고체 기질 샘플은 실시예 56에 기술된 절차에 따라, 별개의 칼럼에 적재되었고, 모노클로날 항체를 함유하는 생물학적 재료의 샘플을 처리하는데 사용되었다.
각각의 기질에 대한 회수율에 따라서, 10% 파과 및 3 분의 체류시간에서의 mAB 동적 결합 능력(DBC)을 표 10에 나타냈다.
리간드
(리간드 밀도)		 DBC (mg/ml) 회수　(%)
Figure pat00297

(78 μmol/ml)		 41 >95
Figure pat00298

(68 μmol/ml)		 39 >95
Figure pat00299

(41 μmol/ml)		 35 83
Figure pat00300

(58 μmol/ml)		 44.9 >94
실시예 59
본 실시예는 본 발명의 구현예에 따른 기질을 사용하여 응집체 제거를 예시한다.
고체 기질이 실시예 4 및 5에 따라서 제조되었다. 실시예 56에 기술된 절차에 따라서, 각각의 고체 기질 샘플이 별개의 컬럼으로 적재되어, 75.5% 모노클로날 항체 및 24.5% 응집체를 함유하는 생물학적인 재료의 샘플을 처리하는 데 사용되었다.
기질로 처리한 후의 샘플 내의 모노클로날 항체 및 응집체의 양을 표 11에 나타냈다. 실시예 3에서 기술된 기질로 처리 후, 결과로 생긴 산물은 91.9%의 모노클로날 항체 및 8.1%의 응집체를 갖고 있다. 실시예 3에서 기술된 기질을 가지고 처리된 샘플에 대하여, 응집체에 비해 모노클로날 항체의 비율이 훨씬 더 큰 증가를 보여, 처리 후에 99.0%의 모노클로날 항체 및 1.0%의 응집체를 포함하게 되었다.
mAb (%) 응집체　(%)
초기의 mAb 재료 75.5 24.5
적재 @ pH 7.4 및 15 mS/cm / 용리 @ pH 4
Figure pat00301
 91.9 8.1
적재 @ pH 7.4 및 15 mS/cm / 용리 @ pH 4
Figure pat00302
 99.0 1.0
실시예 60
본 실시예는 본 발명의 구현예에 따른 기질을 사용하여, IgG 정적 결합 능력(static binding capacities)을 예시한다.
고체 기질이 실시예 3-12, 14, 15 및 19-45에 따라서 제조되었다. IgG 정적 결합 분석은, 10 ml의 PBS에 약 94%의 순수한 인간의 동결 건조된 IgG (SeraCare Life Sciences, lot number G111RM-25B0802) 27 mg를 용해시켜 2.5 mg/ml IgG 용액을 만들어 수행되었다. IgG 용액의 단계 희석이 두 벌 제조되었고, UV 흡광도는 280nm에서 측정되었다. 흡광도 값은 명목상 농도(nominal concentrations)에 대해 그래프를 그리는 데 사용되고, 이 그림의 기울기가 IgG의 흡광 계수로 1.43을 사용하여 희석된 실제의 IgG 농도를 계산하는데 사용된다. PBS 내의 각각의 비즈 샘플의 1:1 슬러리 50 μL를 피펫으로, 두 벌 준비된 별개의 1.5ml 원심분리기 튜브에 넣고, 각각의 튜브에 PBS 내의 2.5 mg/ml의 IgG를 1 ml 첨가한다. 튜브들을 두 시간동안 회전시키고, 2분 동안 선회 감속하였다. 각각 샘플의 120 μL를 96-well 플레이트에 피펫으로 넣고, 280nm에서 UV 흡광도 값을 읽었다.
각각의 기질에 대한 정적 결합 능력 및 리간드 밀도는 표 12에 나타냈다. 기질은 낮은 리간드 밀도에서도 높은 정적 결합 능력을 보였다.
기질 리간드 밀도
(μ㏖/ml)		 정적 결합 능력 (mg/ml)
Figure pat00303
 78 94
Figure pat00304
 62 93
Figure pat00305
 40 77
Figure pat00306
 ND 92
Figure pat00307
 30 72
Figure pat00308
 30 82
Figure pat00309
 41 100
Figure pat00310
 58 95
Figure pat00311
 72 91
Figure pat00312
 26 76
Figure pat00313
 30 58
Figure pat00314
 70 100
Figure pat00315
 28 51
Figure pat00316
 65 98
Figure pat00317
 54 40
Figure pat00318
 78 30
Figure pat00319
 85 35
Figure pat00320
 61 70
Figure pat00321
 103 88
Figure pat00322
 64 75
Figure pat00323
 98 80
Figure pat00324
 94 78
Figure pat00325
 72 90
Figure pat00326
 62 95
Figure pat00327
 56 87
Figure pat00328
 60 40
Figure pat00329
 70 82
Figure pat00330
 134 90
Figure pat00331
 65 65
Figure pat00332
 49 55
Figure pat00333
 55 60
Figure pat00334
 110 95
Figure pat00335
 72 74
Figure pat00336
 64 78
Figure pat00337
 68 72
Figure pat00338
 55 48
Figure pat00339
 92 85
Figure pat00340
 46 60
Figure pat00341
 65 82
Figure pat00342
 61 76
실시예 61
본 실시예는 본 발명의 구현예에 따른 기질을 사용하여 BSA(bovine serum albumin) 정적 결합 능력을 예시한다.
고체 기질이 실시예 22-26, 29-31, 34, 35, 37, 38, 41, 42, 및 44에 따라 제조되었다. BSA 정적 결합 능력 분석은 약 96%의 순수한 BSA 분말(Sigma Aldrich, batch number 106K0687) 22 mg을 pH 4.7의 0.1M MES 10 ml에 용해시켜 2mg/ml BSA 용액을 만들어 수행되었다. BSA 용액의 단계 희석이 두 벌 제조되었고, UV 흡광도는 280 nm에서 측정되었다. 흡광도 값은 명목상 농도(nominal concentrations)에 대해 그래프를 그리는 데 사용되고, 이 그림의 기울기는 BSA의 흡광 계수로 0.625를 사용하여 희석된 실제의 BSA 농도를 계산하는데 사용된다. pH 4.7의 0.1M MES 내의 각각의 비즈 샘플의 1:1 슬러리 50 μL를 피펫으로, 두 벌 준비된 별개의 1.5ml 원심분리기 튜브에 넣고, 각각의 튜브에 pH 4.7의 0.1M MES 내의 2 mg/ml의 BSA를 1 ml 첨가한다. 튜브들을 두 시간동안 회전시키고, 2분 동안 선회 감속하였다. 각각 샘플의 120 μL를 96-우물 플레이트에 피펫으로 넣고, 280nm에서 UV 흡광도 값을 읽었다.
각각의 기질에 대한 정적 결합 능력 및 리간드 밀도는 표 13에 나타냈다. 기질은 낮은 리간드 밀도에서도 높은 정적 결합 능력을 보였다.
기질 리간드 밀도
(μ㏖/ml)		 정적 결합 능력(mg/ml)
Figure pat00343
 78 5
Figure pat00344
 85 5
Figure pat00345
 61 45
Figure pat00346
 103 65
64 45
Figure pat00347
 98 50
Figure pat00348
 62 72
Figure pat00349
 56 60
Figure pat00350
 60 50
Figure pat00351
 65 54
Figure pat00352
 49 35
Figure pat00353
 110 75
Figure pat00354
 72 50
Figure pat00355
 55 55
Figure pat00356
 92 50
Figure pat00357
 65 35
실시예 62
본 실시예에서는, 본 발명의 구현예에 따른 기질을 사용하여, 10% 파과에서, pH 및 전도도 값이 순수한 BSA(bovine serum albumin) 동적 결합 능력에 미치는 효과를 예시한다.
고체 기질은 실시예 20에 따라 제조되었다. 각각의 고체 기질 샘플은 별개의 컬럼에 적재되어, 다음의 절차에 따라, BSA의 동적 결합 능력(DBC)을 측정하는데 사용되었다: 다양한 pH (3.4-8.5) 및 다양한 전도도 (0-80 mS/cm)를 갖는 다양한 완충액 용액 중의 BSA 2 mg/ml를, 10% 파과에 도달될 때까지 각 컬럼에 적재하였다(도 3). 그 다음, 이 컬럼을 적재 완충액(즉, pH 4.7 및 15 mS/cm의 전도도)으로 세척하여, 기질에 흡착된 BSA를 제거하였다. 그 다음, pH 8.0의 50 mM 소듐 포스페이트 완충액 및 250 mM NaCl을 사용하여, BSA를 용리하였다.
10% 파과에서 결합된 BSA 양을, 시험된 각각의 pH 및 전도도 조합에 대하여, 도 3에 나타내었다. pH 값이 6.0 이상인 경우, 5 mS/cm 보다 큰 전도도에서는, BSA 결합이 관찰되지 않았다. pH 3.4에서는, BSA 결합 능력이 전도도의 증가에 따라 증가하였다. 이 리간드의 경우에, 15 mS/cm 이하의 전도도에서는, pH 4.7이 최적의 적재 pH이다.
본 명세서에서 언급된, 간행물, 특허출원 및 특허를 포함한 모든 인용문헌은, 마치, 각 인용문헌이 개별적으로 그리고 구체적으로 인용에 의하여 통합되는 것으로 표시된 것과 마찬가지의 정도로, 그리고, 그 전체가 본 명세서에 기재되어 있는 것과 마찬가지의 정도로, 인용에 의하여 본 명세서에 통합된다.
단수 형태, "상기", "적어도 하나의" 등과 같은 용어와 이와 유사한 지시어들의 사용은, 본 발명을 설명하는 문맥 상에서(특히, 하기의 청구항의 문맥 상에서), 달리 표시되거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 단수와 복수를 모두 포괄하는 것으로 추정된다. 그 뒤에 하나 이상의 항목의 목록이 뒤따르는 "적어도 하나의"라는 용어의 사용은(예를 들어, "적어도 하나의 A 및 B"와 같은 용어의 사용은), 달리 표시되거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 열거된 항목들 중에서 선택된 하나의 항목(즉, A 또는 B)을 의미하거나, 열거된 항목들 중의 둘 이상의 임의의 조합(즉, A 및 B)을 의미하는 것으로 간주된다. "포함하는(comprising 또는 including)", "갖는(having)" 및 "함유하는(containing)"과 같은 용어는, 달리 표시되지 않는 한, 말단 개방형 용어(open-ended terms)로 간주된다(즉, "포함하지만 그에 제한되지 않는"을 의미함). 본 명세서에서의 수치 범위의 언급은, 달리 표시되지 않는 한, 단지, 그 범위에 들어오는 각각의 개별적인 수치를 개별적으로 언급하는 것을 대신하는 약칭 방법의 역할을 하는 것으로 의도된다. 또한, 각각의 개별적인 수치는, 마치 본 명세서에 개별적으로 언급된 것과 마찬가지로, 본 명세서에 통합된다. 본 명세서에 설명된 모든 방법들은, 달시 표시되거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 임의의 그리고 모든 예들, 또는 예시적 표현(즉, "와 같은")의 사용은 단순히 본 발명을 더욱 잘 보여주려는 의도이며, 달리 주장되지 않는 한, 본 발명의 범위에 제한을 가하려는 의도는 아니다. 본 명세서 상의 어떠한 표현도, 임의의 청구되지 않은 요소가 본 발명의 실시에 본질적인 것이라고 표시하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
본 명세서에는, 본 발명의 수행을 위한, 본 발명자들에게 알려져 있는 베스트 모드를 포함하는, 본 발명의 바람직한 구현예가 기술되어 있다. 그러한 바람직한 구현예들의 변형은, 앞에 기술된 상세한 설명을 읽으면, 당업자에게 명백해질 것이다. 본 발명자들이 예상하기에는 숙련된 기술자는 그러한 변형을 적절히 채용할 수 있을 것이며, 본 발명자들의 의도하기에는 본 발명이 본 명세서에서 구체적으로 설명된 것과 다른 방식으로 실시될 수도 있다. 따라서, 본 발명은, 적용 법률에 의하여 허용되는 바에 따라, 첨부된 청구항에 기재된 사항의 모든 변형예 및 균등물을 포함한다. 게다가, 모든 가능한 변형예에서의 앞에서 설명된 요소들의 임의의 조합은, 달시 표시되거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 본 발명에 포함된다.

Claims (20)

  1. 다음을 포함하는 기질:
    (a) 고체 지지체
    (b)
    Figure pat00358
    의 화학식으로 표시되는 리간드; 및
    (c) 적어도 하나의 C, O, N 또는 S 원자를 포함하는 링커로서, 상기 링커는 상기 고체 지지체를 상기 리간드에, 물결선으로 표시된 상기 리간드 상의 위치에서, 공유결합적으로 연결시키는 링커;
    여기서,
    Figure pat00359
    는 페닐, 피리딜, 피리미디닐 및 나프틸로 이루어진 군으로부터 선택되는 방향족 또는 헤테로방향족 고리를 나타내고, 다음의 기들로 이루어진 군으로부터 선택되는 0 내지 4 개의 치환기로 선택적으로 치환된다: -H, -(C1~C6) 알킬, 할로겐, -OH, -O(C1~C6) 알킬, -COOH, -COO(C1~C6) 알킬, -SO3H, -PO3H, -NO2, -NH2,
    Figure pat00360
    ,
    Figure pat00361
    ,
    Figure pat00362
    ,
    Figure pat00363
    ,
    Figure pat00364
    ,
    Figure pat00365
    ,
    Figure pat00366
    ,
    Figure pat00367
    ,
    Figure pat00368
    ,
    Figure pat00369
    ,
    Figure pat00370
    ,
    Figure pat00371
    ,
    Figure pat00372
    ,
    Figure pat00373
    ,
    Figure pat00374
    , 및
    Figure pat00375
    .
  2. 제 1 항에 있어서,
    Figure pat00376
    가 페닐, 피리딜 또는 나프틸을 나타내며, -H, -COOH 및 -SO3H로 이루어진 군으로부터 선택되는 0 내지 1 개의 치환기로 선택적으로 치환된 것을 특징으로 하는 기질.
  3. 제 1 항에 있어서,
    Figure pat00377
    가 페닐을 나타내며, -H, -COOH 및 -SO3H로 이루어진 군으로부터 선택되는 0 내지 1 개의 치환기로 선택적으로 치환된 것을 특징으로 하는 기질.
  4. 제 1 항에 있어서,
    Figure pat00378
    가 페닐을 나타내며,
    Figure pat00379
    ,
    Figure pat00380
    , 및
    Figure pat00381
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 0 내지 1 개의 치환기로 선택적으로 치환된 것을 특징으로 하는 기질.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 리간드는 다음의 화학식들로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학식을 갖는 것을 특징으로 하는 기질:
    Figure pat00382
    ,
    Figure pat00383
    ,
    Figure pat00384
    ,
    Figure pat00385
    ,
    Figure pat00386
    ,
    Figure pat00387
    ,
    Figure pat00388
    ,
    Figure pat00389
    ,
    Figure pat00390
    ,
    Figure pat00391
    ,
    Figure pat00392
    ,
    Figure pat00393
    ,
    Figure pat00394
    ,
    Figure pat00395
    ,
    Figure pat00396
    ,
    Figure pat00397
    ,
    Figure pat00398
    ,
    Figure pat00399
    ,
    Figure pat00400
    ,
    Figure pat00401
    ,
    Figure pat00402
    ,
    Figure pat00403
    ,
    Figure pat00404
    ,
    Figure pat00405
    ,
    Figure pat00406
    ,
    Figure pat00407
    ,
    Figure pat00408
    ,
    Figure pat00409
    ,
    Figure pat00410
    ,
    Figure pat00411
    ,
    Figure pat00412
    ,
    Figure pat00413
    ,
    Figure pat00414
    ,
    Figure pat00415
    ,
    Figure pat00416
    ,
    Figure pat00417
    ,
    Figure pat00418
    ,
    Figure pat00419
    ,
    Figure pat00420
    ,
    Figure pat00421
    ,
    Figure pat00422
    ,
    Figure pat00423
    , 및
    Figure pat00424
    .
  6. 제 1 항에 있어서, 하기의 화학식들로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학식을 갖는 것을 특징으로 하는 기질:
    Figure pat00425
    ,
    Figure pat00426
    ,
    Figure pat00427
    ,
    Figure pat00428
    ,
    Figure pat00429
    ,
    Figure pat00430
    ,
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    여기서, 검은 사각형은 상기 고체 지지체를 나타낸다.
  7. 적어도 하나의 생물학적 물질을 포함하는 샘플을, 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 기질로 처리하는 방법으로서, 상기 기질을 상기 샘플과, 상기 샘플 중의 적어도 하나의 생물학적 물질이 상기 기질에 결합하도록 하기에 충분한 시간 동안, 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 처리는 상기 샘플 중의 적어도 하나의 생물학적 물질이 상기 기질에 결합하도록 하는 것을 의미하는 방법.
  8. 적어도 하나의 물질을 액체 샘플로부터 분리하는 방법으로서, 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 기질을 상기 액체 샘플과 접촉시키는 단계로서, 상기 액체 샘플은 상기 적어도 하나의 물질을 포함하고, 상기 물질은 상기 기질에 흡착되는 단계; 및, pH, 이온강도, 또는 이들 모두를 조절하여 상기 물질이 상기 기질로부터 탈착하도록 하는 단계를 포함하는 방법.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 물질은 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 물질은 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 7 항에 있어서, IgG, IgM 및/또는 IgA를 선택적으로 결합(selective binding)하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 8 항에 있어서, IgG, IgM 및/또는 IgA를 선택적으로 결합(selective binding)하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 7 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 물질이 항체 절편(antibody fragment)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 8 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 물질이 항체 절편(antibody fragment)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 7 항에 있어서, 상기 샘플이 생체액(biological fluid)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 8 항에 있어서, 상기 샘플이 생체액(biological fluid)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 7 항에 있어서, 상기 샘플이 혈장을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 8 항에 있어서, 상기 샘플이 혈장을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 7 항에 있어서, 상기 기질은 컬럼 내에 배치되고, 상기 방법은 상기 샘플을 상기 컬럼을 통하여 통과시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 8 항에 있어서, 상기 기질은 컬럼 내에 배치되고, 상기 방법은 상기 샘플을 상기 컬럼을 통하여 통과시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8802448B2 (en) 2011-07-27 2014-08-12 Pall Corporation Mixed mode ligands
GR1008348B (el) * 2013-07-12 2014-11-11 Εκεφε "Δημοκριτος", Παραγωγα του 3,4-διαμινο βενζοϊκου οξεως ως αναστολεις των αμινοπεπτιδασων του ενδοπλασματικου δικτυου 1,2 (erap1, erap2) και της αμινοπεπτιδασης που ρυθμιζεται απο την ινσουλινη (irap) και χρησεις τους
CN104469945B (zh) * 2013-09-12 2019-01-25 索尼公司 Nct scc的激活控制装置和方法、管理方法、以及基站装置
EP3052226B1 (en) * 2013-09-30 2019-07-03 GE Healthcare Bio-Sciences AB Method for preparation of liquid mixtures
CN105793301A (zh) * 2013-11-17 2016-07-20 纽波庭塔克有限公司 制备层析材料的方法
JP6520044B2 (ja) * 2014-10-24 2019-05-29 日本電気株式会社 無線端末、ネットワーク装置、及びこれらの方法
CN105792158B (zh) * 2014-12-22 2019-06-11 杭州华为数字技术有限公司 一种小区中的信息传输的方法及装置
US20160220952A1 (en) * 2015-02-02 2016-08-04 Clemson University Biodegradable waste remediation method and system
US11835501B2 (en) 2015-07-13 2023-12-05 Sartorius Stedim Chromatography Systems Ltd. Optimizing operating binding capacity for a multiple column chromatography process
CN109689189B (zh) 2016-09-09 2022-02-01 3M创新有限公司 官能化共聚物及其使用
WO2018187388A1 (en) * 2017-04-04 2018-10-11 Scarab Genomics, Llc Improved purification of crm 197 from bacteria
JP7318640B2 (ja) * 2018-04-09 2023-08-01 日産化学株式会社 非水電解液用添加剤、非水電解液、及びリチウムイオン二次電池
JP7315561B2 (ja) * 2018-08-30 2023-07-26 Jsr株式会社 クロマトグラフィー担体

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998008603A1 (en) * 1996-08-30 1998-03-05 Upfront Chromatography A/S Isolation of immunoglobulins
US20040124149A1 (en) * 2002-09-13 2004-07-01 Ciphergen Biosystems, Inc. Preparation and use of mixed mode solid substrates for chromatography adsorbents and biochip arrays
EP2301950A1 (en) * 2008-06-23 2011-03-30 Tosoh Corporation Separating agent for purification of protein, and protein purification method

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4043869A (en) 1972-07-13 1977-08-23 Koch-Light Laboratories, Ltd. Water insoluble biologically active material
US5234991A (en) 1975-07-29 1993-08-10 Pasteur Merieux Serums And Vaccines Porous mineral support coated with an aminated polysaccharide polymer
JPS5670028A (en) 1979-11-12 1981-06-11 Teijin Ltd Polymer bonding with albumin
FR2616437B1 (fr) 1987-06-11 1990-09-07 Ibf Polymeres composites, leur preparation et leur utilisation en chromatographie liquide
AT397723B (de) 1989-08-21 1994-06-27 Epipharm Allergie Service Verfahren zur herstellung radiokonjugierter polymerer und verwendung derselben
DD289204A5 (de) 1989-11-30 1991-04-25 Bitterfeld Chemie Verfahren zur entfernung und/oder gewinnung von immunglobulin m aus waessrigen loesungen
US5268097A (en) 1992-06-19 1993-12-07 Sepracor Inc. Passivated and stabilized porous mineral oxide supports and method for the preparation and use of same
US5652348A (en) 1994-09-23 1997-07-29 Massey University Chromatographic resins and methods for using same
US5789578A (en) * 1996-01-11 1998-08-04 Massey University Methods for the preparation of resins with ligands attached thereto through a linking group comprising sulfide, sulfoxide or sulfone functionality
DE60029794T2 (de) 1999-04-23 2007-10-18 Nexttec Gmbh Verwendung von mit polymer beschichtetem sorptionsmittelkomposit zur trennung, reinigung, entsalzung und konzentrierung von biopolymeren
US6908556B2 (en) 1999-12-02 2005-06-21 The University Of Tulsa Methods for forming microcultures within porous media
US20010039043A1 (en) 2000-02-08 2001-11-08 Lihme Allan Otto Fog Novel resin materials and their use for recovering proteins or peptides
US7371852B2 (en) * 2003-01-22 2008-05-13 Serenex, Inc. Alkyl-linked nucleotide compositions
US7658994B2 (en) 2003-12-30 2010-02-09 3M Innovative Properties Company Substrates and compounds bonded thereto
JP4801598B2 (ja) 2004-01-20 2011-10-26 ポール・コーポレーション 生理的イオン強度でタンパク質を吸着させるためのクロマトグラフィー材料
US7750129B2 (en) 2004-02-27 2010-07-06 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Process for the purification of antibodies
EP2277912B1 (en) 2004-06-07 2016-09-28 Therapure Biopharma Inc. Isolation of plasma proteins
US7402243B2 (en) * 2004-09-10 2008-07-22 Dionex Corporation Organosilanes and substrate bonded with same
RU2541429C2 (ru) 2004-10-21 2015-02-10 Джи-И Хелткер Байо-Сайенсиз АБ Хроматографический лиганд
GB0511799D0 (en) * 2005-06-10 2005-07-20 Prometic Biosciences Ltd Protein binding ligands
US20080220968A1 (en) * 2005-07-05 2008-09-11 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab [1, 2, 4] Triazolo [1, 5-A] Pyrimidine Derivatives as Chromatographic Adsorbent for the Selective Adsorption of Igg
US20110155668A1 (en) * 2008-07-08 2011-06-30 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Separation medium for chromatography of various biomolecules
JP2010133734A (ja) * 2008-12-02 2010-06-17 Tosoh Corp アフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体、及びそれを用いたアフィニティークロマトグラフィー用分離剤
JP5396933B2 (ja) * 2009-03-11 2014-01-22 東ソー株式会社 液体クロマトグラフィー用充填剤、及び生体高分子の分離精製方法
KR20100070994A (ko) 2008-12-18 2010-06-28 토소가부시키가이샤 액체 크로마토그래피용 충전 재료 및 해당 충전 재료에 의한 생체고분자의 분리·정제 방법
JP2010158624A (ja) * 2009-01-08 2010-07-22 Asahi Kasei Chemicals Corp 多孔質吸着膜、及び当該多孔質吸着膜を用いたたんぱく質の精製方法
WO2011044637A1 (en) 2009-10-15 2011-04-21 Monash University Affinity ligands and methods for protein purification
US8802448B2 (en) 2011-07-27 2014-08-12 Pall Corporation Mixed mode ligands

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998008603A1 (en) * 1996-08-30 1998-03-05 Upfront Chromatography A/S Isolation of immunoglobulins
US20040124149A1 (en) * 2002-09-13 2004-07-01 Ciphergen Biosystems, Inc. Preparation and use of mixed mode solid substrates for chromatography adsorbents and biochip arrays
EP2301950A1 (en) * 2008-06-23 2011-03-30 Tosoh Corporation Separating agent for purification of protein, and protein purification method
KR20110037930A (ko) * 2008-06-23 2011-04-13 토소가부시키가이샤 단백질 정제용 분리제 및 단백질 정제방법

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Publication number Publication date
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US8802448B2 (en) 2014-08-12

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