DD289204A5 - Verfahren zur entfernung und/oder gewinnung von immunglobulin m aus waessrigen loesungen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Entfernung und/oder Gewinnung von Immunglobulinen der Klasse M aus waeszrigen Loesungen, insbesondere aus Blutplasma oder Blutserum. Erfindungsgemaesz besteht das Verfahren aus der selektiven Adsorption spezieller Plasmaproteine, wie Immunglobilin M, an polymeren Adsorbentien auf der Basis von vernetzten Acrylnitril-Vinylacetat-Copolymeren, die durch Umsetzung mit Polyalkylenpolyaminen funktionalisiert wurden. Dadurch ist die Entfernung der genannten Substanzen aus der waeszrigen Ausgangsloesung moeglich. Die adsorbierten speziellen Proteine koennen durch Desorption gewonnen und mit ueblichen Techniken gegebenenfalls gereinigt werden. Die Anwendungsmoeglichkeiten der Erfindung liegen auf den Gebieten der Medizin, Medizintechnik und Proteinpraeparation.{Adsorbens, selektiv; Kunststoff; Proteine; Blut; Immunglobulin M; Praeparation; Medizintechnik}

Description

hergestellt werden, adsorbiert und angereichert und danach mittels einer Elektrolytlösung abgelöst und gegebenenfalls in einem zweiten Schritt durch herkömmliche Verfahren gereinigt werden.

Anwendungsgebiete der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Entfernung und/oder Gewinnung von Immunglobulinen der Klasse M aus wäßrigen Lösungen, insbesondere aus Blutplasma oder Blutserum und ist auf den Gebieten der Medizin, Medizintechnik und Proteinpräparation anwendbar.

Charakterisierung des bekannten Standes der Technik

Immunglobuline der Klasse M (IgM) sind die Antikörper der humoralimmunologischen Primärreaktion und spielen besonders für die Abwehr bakteriell verursachter Krankheitsprozesse eine wesentliche Rolle. IgM-Antikörper vermögen größere Partikel, wie Bakterien, große Viren und Zellen besonders gut zu agglutinieren und mit Hilfe des Komplements aufzulösen. Hier sind sie den IgG-Antikörpern überlegen (J.H.Humphrey und R.G.White: Kurzes Lehrbuch der Immunologie, Thieme-Verlag Stuttgart, 1971, S. 110-112). Diese ihre schon länger bekannten Fähigkeiten geraten neuerdings wieder in den Mittelpunkt des Interesses, seit Untersuchungen zeigten, daß in der Folge chirurgischer Eingriffe bei septischen (bakteriell-eitrigen) Erkrankungen die besonders häufigen Komplikationen durch die Gabe von IgM angereicherten Präparaten vermieden oder gemildert werden können (J.Seifert und D. Nietschke: .Immunglobulin M", Dtsch.Med.Wschr.112,1267-1271 (1987)).

Die Präparation polyklonaler IgM, möglichst aus Mischseren vieler Spender, gewinnt damit erneut an Interesse. Bisher erforderte diese Präparation mindestens vier Arbeitsschritte (J. Brock: „Präparation von Immunglobulinen" in: H.Friemel [Hrsg.]: Immunologische Arbeitsmethoden, Fischer, Jena, 3. Aufl. 1984, S. 432 ff.; K. Heide und H. G. Schwick: „Salt fractionation of immunglobulins" in: D. M. Weir (ed.): Handbook of Experimental Immunology, Blacwell Publication, Oxford, 3^rd edition, 1979, Chapter 7)

Im einzelnen sind folgende Arbeitsschritte zur Gewinnung von reinem IgM aus Blutplasma erforderlich:

1. Abtrennung der Lipoproteine durch Fällung mit Dextransulfat.

2. Fraktionierte Fällung der übrigen Plasmaproteine durch Salzzusatz oder Polyethylenglykol.

3. Chromatographische Trennung an DEAE-Sephadex und/oder Gel-Chromatographie.

4. Elektrophoretische Trennung.

Die bekannten Verfahren zur Gewinnung von IgM sind somit kompliziert, arbeitsaufwendig und kostenintensiv.

Bestimmte Antikörper, so die gegen blutgruppenspezifische Ervthrozyten-Strukturen (H, A, B) gerichteten sog. Isoagglutinine, ferner ein großer Teil der Rheumafaktoren, weiterhin monoklonale Antikörper bei bestimmten Tumoren des Knochenmarks (Waldenströmsche Krankheit) gehören der IgM-Klasse an.

Ihre Entfernung aus dem Blut ist u. U. als Therapiemaßnahme geboten, z. B. die Entfernung der Isoagglutinine vor Transplantationen, wenn zwischen Spender und Empfänger eine ABO-Inkompatibilität (Unverträglichkeit der Blutgruppen) besteht. Zu diesem Zweck wurden Immunadsorbentien entwickelt, deren Herstellung relativ kompliziert und aufwendig ist und die daher teuer sind (Bensinger, W.I., et. al.: „Immunadsorption for removal of A and B bloodgroup antibodies" New Engl. J.Med.304,160-162 [1981]; Bannen, A.D., et.al.: „Immunadsorption and renal transplant in two patients with an major ABO incompatibility". Transplantation 43,909-911 [1987]; Osterwalder, β., et.al.: „Immunadsorption for removal of anti-A und anti-B bloodgroup antibodies in ABO-incompatible bone marrow transplantation". Blut 53,379-390 [19861).

Diese Immunadsorbentien bestehen aus Siiikatpartikel, an die kovalent die entsprechenden Blutgruppenantigene gekoppelt sind. Diese, ihrer Struktur nach Oligosacchaiidantigene, können synthetisiert werden. Zur Entfernung der Isoagglutine aus dem Plasma wird letzteres durch Säulen geleitet, die Silikatgranula enthalten, beladen mit den spezifischen Blutgruppenantigen.

Daran binden die „passenden" IgM-lsoagglutinine (spezifischen IgM-Antikörper).

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, ein einfaches und kostengünstiges Verfahren zur Entfernung und/oder Gewinnung von IgM aus wäßrigen Lösungen, insbesondere Blutplasma und -serum auszuzeigen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, unter Verwendung selektiver polymerer Adsorbentien auf Kunststoffbasis ein Anreicherungsverfahren für Immunglobuline der Klasse M zu entwickeln, das die weitere Präparation vereinfacht. Erfindungsgemäß wurde die Aufgabe dadurch gelöst, daß IgM an polymere Adsorbentien, die durch Copolymerisation von Acrylnitril, Vinylacetat und einem Vernetzer in Gegenwart eines Füll- und/oder Quellmittels für das Copolymere nach dem Verfahren der Suspensionspolymerisation in einer Korngröße von 0,1-0,3 mm und anschließender Umsetzung mit einem Polyalkylenpolyamin der Formel

. R* R-

f = 2-8

H. R* R- = H oder Alkylgruppe

/ Π χ,

R* R^

ι ι

hergestellt werden, adsorbiert und angereichert und danach mittels einer Elektrolytlösung abgelöst und gegebenenfalls in einem zweiten Schritt durch herkömmliche Verfahren gereinigt werden.

In Inkubations- und Perfusionsexperimenten wurde festgestellt, daß diese Adsorbentien bestimmte Plasmaproteine selektiv binden, darunter Immunglobulin der Klasse M.

Vor der Anwendung sind die Adsorbentien auf pH-Werte von 5,5 bis 7,5 einzustellen. Zur Entfernung der Proteine aus dem Blutplasma oder -serum können die Adsorbentien darin direkt suspendiert oder als Packung in einer Chromatographiesäule angewendet werden. In beiden Fällen werden die Adsorbentien zunächst mehrfach mit Aqua dest. gewaschen und die Waschflüssigkeit, z. B. durch Zentrifugieren, weitgehend entfernt. Danach werden sie mit 0,1 M Glycin-HCI-Puffer, pH 2,8 oder mit 0,01 M HCI in Kontakt gebracht, nach Entfernen der sauren Lösungen mit phosphatgepufferter 0,15M NaCI-Lösung (PBS), pH 7,4 mehrfach gewaschen, bis der Adsorber im gewünschten pH-Bereich äquilibriert ist. Vor Gebrauch wird die PBS möglichst restlos entfernt und die restfeuchten Adsorbersubstanzen mit der proteinhaltigen wäßrigen Flüssigkeit, z. B. Serum, in Kontakt gebracht. Dieses kann in einfacher Weise so erfolgen, daß man die Adsorbentien im Serum suspendiert und unter leichtem Schütteln 10 bis 120min z. B. bei Raumtemperatur oder 37⁰C inkubiert. Dieses Verfahren kann Anwendung finden, um IgM zu präparieren. Zu diesem Zweck werden die Adsorbentien nach dem Kontakt mit Serum mit 0,15 M NaCI-Lösung gewaschen und anschließend die Desorption mit sauren Lösungen oder höher konzentrierten Salzlösungon, pH 4,5 bis 6,5, vorgenommen. Die Eluate enthalten neben dem hochmolekularen IgM noch einige Plasmaproteine mit Molekulargewichten unter 200000 Dalton wie die Komplementfaktoren C3, C4 und C9, Präalbumin, α,- und Ci₂-GIycoprotein sowie Coeruloplasmin. Sie können in einem Nachreinigungsschritt, z. B. mittels Gelchromatographie an Sephadex G 200, abgetrennt werden. Das beschriebene Verfahren zur IgM-Präparation stellt eine wesentliche Vereinfachung der bisher üblichen Verfahren dar, da statt der gemäß des Standes der Technik benötigten vier Verfahrensschritte nur noch zwei Schritte bis zur Gewinnung von reinem IgM erforderlich sind. Der entscheidende Schritt ist dabei die Anreicherung des IgM am eingesetzten Adsorber.

Im Gegensatz zu den bekannten Adsorbern, wie z. B DEAE-Sephadex, werden am erfindungsgemäß eingesetzten Adsorber nur IgM und Plasmaproteine mit einem Molekulargewicht unter 200000 Dalton adsorbiert. Somit erhält man bereits nach den Verfahrensstufen Adsorption/Elution und Gelchromatographie reines IgM. In den folgenden Beispielen sollten die erfindungsgemäßen Adsorbentien und ihre Anwendung nähor beschrieben werden.

Beispiel 1

Bindungsmuster der Adsorbentien für Serumproteine

Das Adsorbermaterial wird zunächst dreimal mit jeweils ca. der fünffachen Menge (Gewichtsteile wasserfeuchter Adsorbersubstanzzu Gewichts- bzw. Volumenteilen Waschflüssigkeit) Aqua dest. gewaschen, danach zwei- bis dreimal mit ebenfalls der fünffachen Menge Glycin-HCI-Puffer, 0,1 M, pH 2,8 oder 0,01 M HCI behandelt und schließlich mit phosphatgepufferter 0,15 M NaCI-Lösung (PBS), pH 7,4, mehrmals gewaschen und auf einen pH-Wert von 7,2 bis 7,4 gebracht.

Durch Zentrifugation (5min, 1000g) und nachfolgendem Abdekantieren bzw. Absaugen über einer Fritte oder einem Filter wird das PBS entfernt und 1 g der restfeuchten Adsorbersubstanz mit 2ml Mischserum (gewonnen aus einer Mischung gleicher Volumina Serum von mind. 10 Blutspendern) versetzt und 30min bei 37"C im Schüttelwasserbad oder unter Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wird das Serum von den Adsorbentien abgetrennt und analysiert.

Die Bestimmung des Gesamteiweißes erfolgte mit der Biuret-Methode, die der Einzelproteine mittels einfacher radialer Immunodiffusion nach Mancini und Mitarbeitern. Da Mischserum vieler Einzelspender verwendet wurde, d. h. annähernd Werte der Normalbereiche angenommen werden konnten, erschien es ausreichend, die Werte des Mischserums vor und nach Inkubation zu vergleichen und die letzteren als Relativwerte der erstgenannten in % anzugeben.

Zur Ermittlung eines Kontrollbereiches wurden jeweils Transferrin, a_rMacroglobülin, ß-Lipoprotein und Immunglobulin G mitbestimmt, von denen eine selektive Bindung niemals beobachtet wurde. Die Erniedrigungen ihrer Werte nach Inkubation sind vielmehr Ausdruck der Verdünnung, die das Serum durch Reste des Suspensionsmittels (PBS) erfährt sowie einer anzunehmenden, geringgradigen unspezifischen Adsorption an den inneren und äußeren Oberflächen der porösen Partikel der Adsorbersubstanzen. Die Mittelwerte der vier Referanzproteine zuzüglich bzw. abzüglich der doppelten Standardabweichung (x ± 2 s) bilden den Kontrollbereich. Im allgemeinen liegt er bei 80 ± 10%. Eine selektive Bindung wird nur dann angenommen, wenn die Proteinwerte nach Inkubation (Mittelwerte aus drei Bestimmungen incl. der Standardabweichungen) unterhalb dieses Kontrollbereiches liegen.

Die Ergebnisse der Bestimmungen von Serumproteinen zeigt Tabelle 1.

Beispiel 2

Bindung von Isoagglutininen der Immunglobulinklasse M

Das Beispiel 1 zeigte die Bindung polyklonaler und polyspezifischer IgM des menschlichen Serums. Aber auch definierte IgM-Spezifitäten werden gebunden, wie das fo'gende Experiment belegt.

Die natürlicherweise vorkommenden Antikörper, gerichtet gegen Strukturen menschlicher Erythrozyten der Blutgruppe O, A

oder B, die sog. Isoagglutinine, gehören der IgM-Klasse an. Bis zu Serumverdünnungen von 1:128 bis 1:256 wurden rote Blutkörperchen in 1%iger Suspension der entsprechenden Blutgruppen agglutinlert; Α-Serum agglutiniert 8-Erythrozyten und umgekehrt, O-Serum sowohl A- als auch B-Erythrozyten. Tabelle 2 zeigt, daß nach analoger Vorbereitung der Adsorbentien und Inkubation mit den Serumproben, wie in Beispiel 1 ausgeführt, die Agglutinatlonstiter um zwei bis drei Stufen sinken. Das entspricht einer 75- bis 87%igen Isoagglutinin-Bindung, d. h. Entfernung spezifischer IgM-Antikörper, aus den Serumproben.

Beispiel 3

Bindung von Rheumafaktoren (RF)

Nach analoger Vorbereitung des Adsorbers und Inkubation mit Serumproben von drei Patienten, die an Rheumatoidarthritiden litten, wie. im Beispiel 1 ausgeführt, war ein Titerabfall der RF wiederum um zwei bis drei Stufen mit den Tests nach Podliachouk und Harboe, dem Latexfixations-Test und dem Acrylfixations-Test feststellbar. Das Gesamt-lgM fiel ebenfalls auf 12 bis 21 % der Ausgangskonzentration ab.

Beispiel 4

Regeneration der Adsorbentien und wiederholter Einsatz

Analog Beispiel 1 wurde die erste Inkubation mit Serum ausgeführt, danach wurden die Adsorbermaterialien einmal mit 0,15 M NaCI-Lösung gewaschen, nach Entfernen dieser Lösung mit ca. dem fünffachen Volumen Glycin-HCI-Puffer 0,1 M, pH 2,8,15 min bei Raumtemperatur inkubiert und geschüttelt, dann die Pufferflüssigkeit entfernt und durch frische Lösung ersetzt. Diese Behandlung wurde insgesamt dreimal vorgenommen. Danach wurden die Kunststoffe in gleicher Weise mit PBS, pH 7,4, behandelt, bis der pH-Wert des überstehenden PBS 7,2-7,4 betrug.

Nach Entfernen des PBS konnte erneut Serum zur Adsorption auf die regenerierten Adsorbentien gegeben werden. Insgesamt wurden zehn Adsorptionen an den insgesamt neunmal regenerierten Adsorberstoffen vorgenommen. Die Tabelle 4 weist aus, daß die Adsorbentien immer wieder regenerierbar waren. Ein Abfall ihrer Bindungskapazitäten war nicht erkennbar.

Die Regeneration ist ebenfalls im Perfusionsverfahren durchführbar, wenn die Adsorbentien als Säulenpackungen eingesetzt

werden. Anstelle des Glycin-HCI-Puffers kann mit mindestens gleicher Wirksamkeit 0,5 M NaCI, gelöst in SÖRENSEN-Puffer, VisM, pH-Wertbereich 5 bis 6, eingesetzt werden. In den Eluaten lassen sich 60-70% des Serum-lgM nachweisen.

Beispiel 5

Präparation von Immunglobulin M

Vor der Anwendung des Harzes wird es in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise auf einen pH-Wert von 7,2 bis 7,4 eingestellt.

Nach Erreichen des gewünschten pH-Wertes wird das Adsorberharz durch Filtration vom Puffer getrennt. Der feuchte Adsorber wird bei Zimmertemperatur in die zweifache Menge Serum eingerührt. Unter gelegentlichem leichtem Umrühren läßt man 30min einwirken, trennt dann den Adsorber durch Filtration vom Serum und wäscht zweimal mit 0.15M NaCILösung.

Die Desorption der gebundenen Proteine erfolgt durch mehrmalige Behandlung mit 0,5M NaCI-Lösung, gepuffert mit ¹AsM Phosphat-Puffer, pH 5,5. Die vereinigten Eluate enthalten als Hauptbestandteil IgM, daneben Proteine mit Molekulargewichten unter 200000 Dalton. Nach dem Einengen der Eluate erfolgt eine Feinreinigung mit Hilfe der Gelfiltration an einer Sephadex G-200-Säule in gewohnter Weise.

Mit dem beschriebenen Verfahren ist es möglich, reines IgM in einfacher Weise zu isolieren. Die Ausbeute an reinem IgM beträgt 24-31 %, bezogen auf die im Ausgangsmaterial (Serum) vorhandene Menge.

Tabelle 1

Proteinmengen im Plasma nach Inkubation mit den Adsorbern 1 und 2, bezogen auf die Eiweißmengen vor der Adsorption des Plasma (= 100, angegeben in %)

Protein	Adsorber 1	Adsorber 2
Präalbumin	0	0
Albumin	73 ±0	67 ±6
α,-Glycoprotein	40 ±6	-
dj-Glycoprotein	30 ±6	-
Haptoglobin	67 ±1	53 ±4
Hämopexin	79 ±7	88 ±3
Coeruloplasmin	0	0
a2-Macroglobulin	78 ±5	84 ±4
Transferrin	86 ±5	81 ±3
ß-Lipoproiein	85 ±3	80 ±1
IgG	79 ±5	84±3
IgA	70 ±4	72 ±4
IgM	17±0	20 + 2
IgD	90110	90 + 2
IgE	79 + 3	85 ±3
C,q	76 ±4	76 ±9
C4	0	—
C3	32 + 6	5±0
C9	0	_
C 1INA	26 ±4	—
C3-Aktivator	85 ±4	-

Adsorber 1 Acrylnitril-Vinylacetat-Divinylbenzen-Copolymerisat, funktionalisiert durch Umsetzung mit 1,3 Diaminopropan.

Adsorber 2 Acryinitril-Vinylacetat-Divinylbenzen-Copolymerisat, funktionalisiert durch Umsetzung mit 3-Dimethylamino-i-propylamin.

Tabelle 2

	Erythro	Agglutinationstiter	nach Inkubation mit	Adsorber 2
Serum ·	zyten	vor Inkubation	Adsorber 1	1:32
	B		1:32	1:16
A	A	1:128	1:16	1:64
B	A	1:128	1:64	1:32
O	B	1:256	1:32
O	1:128

Tabelle 3 a

RF-Titer in den Seren von 3 Patienten vor (oberer Wort) und nach Inkubation (unterer Wert) am Adsorber 1 ermittelt in verschiedenen Tests

Patient

Podhachouk-	Latexfixa-	Acrylfixa-	Titerstufen
Harboe-Test	tions-Test	tions-Test	abfall
1:128	1:256	1:256
			2,3,3
1:32	1:32	1:32
1:512	1:1024	1:1024
			2,2,2
1:128	1:256	1:256
1:256	1:256	1:256
			2,3,3

1:64

1:32

1:32

Tabelle 3 b

IgM-Konzentrationen (g/l) in den Seren der Patienten vor und nach Inkubation am Adsorber

Patient

vor

IgM Adsorption

nach

Konzentration des IgM nach Adsorption (vor = 100%)

K. G

M.L

K. E.

1,46 2,55 1,36

0,21 0,54 0,16

14 21 12

Tabelle 4

Relative IgM-Konzentrationen nach wiederholten Adsorptionen an regenerierten Adsorbentien (in %, jeweils im Vergleich zu den Serumproben vor Inkubation = 100%)

Adsorber	Adsorption 1.	3.	5.	7.	9.	10.
1 2	29 ±5 24 ±5	46 + 1 39 + 1	30 ±3 16 + 3	29 ± 1 19 ±2	33 ±2 26 + 1	31 ±2 2<» ±3

Claims (1)

1. Verfahren zur Entfernung und/oder Gewinnung von Immunglobulinen der Klasse M aus wäßrigen Lösungen, gekennzeichnet dadurch, daß das Immunglobulin an polymeren Adsorbentien auf Kunststoffbasis, die durch Copolymerisation von Acrylnitril, Vinylacetat und einem Vernetzer in Gegenwart eines Füll- und/oder Quellmittels für das Copolymere nach dem Verfahren der Suspensionspolymerisation in einer Korngröße von 0,1 bis 0,3 mm und anschließender Umsetzung mit einem α/ω-Polyalkylenpolyamin der Formel

   H ft, R₁β H oder Alkylgruppe

   ^SN-(CH₂)_n-N^ η s 2 bis 8