JPS601136A - 血液製剤中の不適合反応原因物質不活化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、治療的および予防的に用いられる血液製剤中
の、不適合反応原因物質を不活性化する方法に関する。

本発明は、特に、ヒトまたは動物の血漿から静脈内投与
に適した新規な免疫グロブリンＧ含有画分類を製造する
に際し、上記の如き物質を不活性化する方法に関する。

免疫グロブリン含有製剤は原発性、または二次性の種々
の免疫欠損、無または、低γ（ガンマ）−グロブリン血
症、抗体欠損症候群、ウィルス感染症まだは細菌性感染
症の場合に適用される。

ヒトまたは動物の血漿から免疫グロブリン含有製剤を調
製するための種々の方法が知ら・れており、例えばエタ
ノール沈殿法（Ｊ　、Ｌ、０ｎｃｌｅｙ　、Ｍ　Ｍｅｌ
　ｉｎ。

Ｄ、Ａ、Ｒｉｃｈａｒｔ　％Ｊ、Ｗ、Ｃａｍｅｒｏｎお
よびＰ、Ｍ、Ｇｒｏｓｓ。

Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、７１５４１　（１９４９
））、改良エタノール法（Ｈ，Ｆ、ＤｅｕＬｓｃｈ　、
　Ｌ、Ｊ、Ｇｏｓｔｉｎｇ。

ＲｏＡ、Ａｌｂｅｒｔｙ　およびＪ、Ｗ、Ｗｉｌｌｉａ
ｍｓ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　１６４　１０９　（１９６４）　）、およ
びＰ。

Ｋ１５ｔｌｅｒおよびＨ，Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ　ｔ７
）方法（ＶｏｘＳａｎｇｕｉｎｉｓ　７．４１４　（１
９６２）　）などがある。

さらには、硫酸アンモニウムおよびポリエチレングリコ
ールを用いて血漿から免疫グロブリンを沈殿させる方法
が知られている（　Ａ、Ｐｏｌ　ｓｏｎ、　Ｇ。

Ｍ、Ｐｏｔｇｉ　ｔｅｒ　、　Ｊ　、Ｆ、Ｌａｒｇｒｉ
ｅｒ、　Ｇ、Ｅ、ＦｏＭｅａｒｓおよびＦ、Ｊ、Ｊｏｕ
ｒｂｅｔ　、　Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃ
ｔａ。

８２　４６３（１９６４））。その他、イオン交換法を
利用する方法も指摘されている（　Ｅ、Ａ、Ｐｅｔｅｒ
ｓｏｎおよびＨｏＡ、５ｏｂｅｒ　、　Ｊ、Ａｍ、Ｃｂ
ｅｍ、Ｓｏｃ、　７８．７５１（１９５６））。

これらの方法は、得られる製剤が筋肉内投与にしか適さ
ないという欠点を有しており、それらを静脈内投与する
と血管作用の如き望ましくない副反応を示す。

そこで、副反応または副作用を軽減する試みがなされて
おり、そのために、免疫グロブリン含有製剤類を可溶性
タンパク分解酵素類、即ちペプシン、プラスミン、パパ
インその他によって処理することが実行されている（ド
イツ特許第１．１４８゜０３７号）。しかしながら、こ
の処理によると免疫グロブリン類の分子構造が変化し、
生物学的半減期が短縮されてしまう。また、製剤中に酵
素残渣が残存することも発見されておシ、これによって
も汚染されることになる。従って、保存性は低くかつタ
ンパク質の分解が進行する危険性が大きい。

ドイツ公開公報第２９３６０４７号には、静ｊ派内投与
の可能な免疫グロブリン製剤の製造方法が記載されてお
シ、そこでは、可溶性炭水化物またはポリオールの存在
下での硫酸アンモニウムおよびポリエチレングリコール
による精製を組合せる方法が採用されている。この例で
は確かに血管作用性の副作用は消失しているが、静脈内
投与の場合の安全性並びに再現性という意味では、なお
一層の改善が望まれる。

先行技術のうち、日本特許出願に係る、特公昭筒５６−
７７２１号および第５６−１５２１５号、並びにドイツ
公開公報第３２２０３０９号（これらは静脈内投与の可
能な免疫グロブリン製剤類の製造方法を提供することを
目的とするものである）についてもふれておく。これら
の方法は、固定化プラスミンまたは固定化ペプシンによ
って処置するものであるが、それによって得られる結果
物もまた、好ましからざる高い抗補体活性を有するので
、満足すべきものとはいえない。

本発明は上記の如き従来法の欠点および困難を克服せん
とするものであって、不適合反応の原因物質を確実に除
去し得ると基に、治療または予防的に投与される製剤の
広範な安全性を確保できる方法を提供することを目的と
するものである。

本発明はヒトまたは動物の血液から得た両分を水不溶性
の担体と結合した膵臓酵素類、すなわち、トリプシン、
キモトリプシンまたは膵臓プロテアーゼなど、によって
処理し、この処理画分を、所望によシ、さらに分画し濃
縮することによシ上記の目的を達成したものである。

水不溶性の担体としてはセファロ♂（Ｓｃｐｈａｒｏｓ
ｅ）４Ｂゲルが好適である。

水不溶性の担体と結合した酵素類で処理した免疫グロブ
リン含有画分から所望ならば望ましくない随伴物質を除
去した後、タンパク沈殿剤によって精製免疫グロブリン
を沈殿させ、これを最終製品に加工することができる。

以下に示す精製方法および濃縮方法の組合せが特に好都
合であることがわかった：すなわち、（１）０°Ｃ以下
の温度でエタノール処理することにより、ヒトまたは動
物の血漿から免疫グロブリン含有沈殿を析出させる、（
２）この沈殿を緩衝液で抽出し、抽出液を更にエタノー
ル処理することによシペースト状の免疫グロブリン濃縮
物を回収する、（３）この濃縮物を透析により精製する
、（４）この精製免疫グロブリン含有画分をトリプシン
、キモトリプシンまたは膵臓プロテアーゼからなる群か
ら選ばれる、固定化酵素で約３７°Ｃにおいて処理する
、（５）この様に処理した画分を、沈殿剤、好ましくは
ポリエチレングリコール、で処理し実質的にＩｇＧから
なる精製免疫グロブリンを析出させる、（６）この沈殿
を溶かし、その溶液を滅菌ｐ過しだ後、最終的に凍結乾
燥する。

本発明方法で調製した画分類について分子の微細構造を
調べだ結果、少くとも９０％がモノマー（単量体）Ｉｇ
Ｇ分子類であシ、且つ、少くとも９０％が機能損傷を受
けていないＩｇＧ分子類である、という新らしい特徴が
明らかになった。

モノマー分子類は、以下に示すゲｌし浸透クロマトグラ
フィー（ゲル濾過）法（［−１，Ｄｅ　ｔ　ｅ　ｒｍａ
ｎｎ　。

１’ｃｅｌ−ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｅＪ　、Ｓ
ｐｒ、ｐｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ。

Ｂｅｒｌｉｎ、１９６８）によって決定することができ
る： 各分子は分子量に従って分けられる。即ち膨潤したゲル
の最大の孔よシも大きい分子類はゲル内に浸透すること
ができず最初に溶離する（対応する溶離容量をｖＯとす
る）。一方、よシ小さい分子類はゲルの孔の中に浸透す
るのでもつと緩慢に移動する（対応する溶離容量をｖｅ
とする）。この様に、溶離容量（Ｖｅ）は物質の特徴的
な７　Ｎ６ラメーターである。物質の相対溶離容量、　
／■ｏは、カラムの役回学的な寸法およびカラムツイツ
チに依存しない。この測定は、例えば直径２．６ｍ、長
さ１００　ｃｍの分離カラムにゲル（例えばアガロース
ポリアクリルアミド、商品名Ｕｌｔｒａｇｅｌ　ＡｃＡ
３４）を充填しくリン酸ナトリウム−塩化ナトリウム緩
衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７，０）で膨潤させたもの）、この
カラムに免疫グロブリン製剤５０　”Ｉを詰め、りん酸
ナトリウムー塩化ナトリウム緩衝液（ｐＩｉ７．０）に
より、流速２０ｒｎｌ／時で溶１雛することによって行
なう。

溶離液を、４．５　ｍｌづつの画分として集め、ＵＶ検
出器を用いて２８０　ｎｍにおける溶離曲線をめる。溶
離図（ダイアダラム）を得るために、個々の成分を合わ
せ、溶離容量並びにタンパク濃度を測定する。

相対溶離容量　／／ｖｏが１．３０〜２．２０の免疫グ
ロブリン類はモノマー（単量体）ＩｇＧ分子類であると
されてお９、これが本発明に係る総タンノくりの少くと
も９０％を占めている。これに関連し、ｖｅ／ｖが１．
３０〜１．６５である免疫グロブリンはダイマー（二量
体）ＩｇＧ類であるとされていることも注目される。し
かしながら、これらのダイマーは■ｅ／ｖＯが１．６６
〜２．２０テあるモ／　７−　ＩｇＧと可逆平衡の関係
にあるので、これらもまた、モノマーと解釈すべきであ
る（　Ｊ、Ｓ、Ｆｉｎｌａｙｓｏｎ、Ｂ、Ｌ、Ａｒｍｓ
ｔｒｏｎｇおよびＡ、Ｍ、Ｙｏｎｇ　、　Ａｃ　ｔ　ａ
Ｒａｄｉｏｌｏｇｉｃａ　Ｓｕｐｐｌｅｔｎｅｔｕｍ　
３１０　（］　９７１　）、１１４参照）。

機能損傷のないＩｇＧ分子類の分析はプロティンＡセフ
７０−ス法に従って行なう（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ
。

ＶＯｌ、２８　（１’Ｊ７２　）、７３頁以降：　Ｈ，
Ｉｌ−１ｊｅ１、Ｋ、Ｉ−Ｉｊｅ１ｍｌＩＪ＋Ｓｊ′６
ｑｕｉｓｔ　ｒ　５ＬａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓＡｕｒ
ｅｕｓからのプロティンＡ親和性クロマトグラフィーを
用いたその溶液、並びにその免疫グロブリン類単離のだ
めの免疫溶媒としての用途」）。この方法は、５Ｌａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　から得られるプ
ロティンＡがサブグループＩｇＧ１．２および４から選
ばれるＩｇＧ分子類と反応し、結合することに基づいて
いる。機能的に活性な部位は、１ｇ６分子のＩＩ鎖の部
分であるＣＨ２およびＣＨ３領域である。

ｅ ゲル濃過による分子量決定法で得た、／ｖｏが１．３０
〜２．２０である両分の混合物をあるタンパク濃度に調
節し、この製剤のタンパク１０１１１１Ｍ、を１０ｍ１
のプロティンＡセファロース（固定化フロティンＡ）を
用いたクロマトグラフにかける。次いて結合したＩｇＧ
１．２および４をｐＨ３，’　０のクエン酸ナトリウム
−クエン酸緩衝液で溶離する。

次いて結合した、および結合しないＩｇＧ類を計算する
。

好ましい実施態様では、本発明に係る両分の抗補体活性
は極めて低いので、その１ｃＨ５０（補体価）活性を中
和するのに必要なタンパク量は４０ｙｒｇ以下であるこ
とはない。

この様な特性値の測定は、［公衆衛生モノグラフＪＮ０
．７４；標準化した診断用捕体固定法および微量試験へ
の適用、ワシントン、１９６５、Ｅ。

Ａ、ＫａｂａｌおよびＭ、Ｍａｙｅｒ、並びに実験的免
疫ｒヒ学；第２版、Ｔｂｏｍａｓ　Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅ
ｌｄ　ｌ　９５１、に従って行なうことができる。

電気泳動分析法によると、本発明に従って得られる両分
中には少くとも９５％のγ−グロブリンが検出される。

この方法はＭｉｃｌｉａｃｌ　Ｄ、Ｇｅｂｏｔｔ。

ベックマンマイクロゾーンＴｊｌ気泳動マー１−−Ｌ　
−ｙ　／ｌ／、Ｂｅｃｋｍａｎｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎ
ｔｓ　１１ｎｃ、　ｌ　９７７．０１５−０８３６３０
−Ｃに従って行なうことができる。

さらに、本発明方法に従って調製される免疫グロブリン
Ｇ含有画分類の特徴は、その薬理学的性質にある：何故
ならば、それらは実質的に血管作用性並びに白血球減少
性活性を有さす、同様に気管支痙れん活性物質を含まな
いのである。これらの特徴を次に示す： ａ）　４匹の犬の平均１直で示されるこの動物における
血管作用に関する試験では、投与量が５０　Ｑ　ｍｙ／
体重（ｈ）以上の場合にのみ、最高３０％の血圧低下が
認められるにすきない、 ｂ）　４匹の犬の平均値で示されるこの動物における白
血球減少作用に関する試験では、投与量が５００　Ｍｅ
／体重（Ｉ（ｇ）の場合にのみ、最高５０％の白血球数
の減少が認められるにすぎない、ｃ）　４匹のモルモッ
トの平均暁で示されるこの動物における気管支痙れん作
用に関する試験では、投与量か５０（ＮＩＰ／体重（ｈ
）以上の場合にのみ、最高３０％の呼吸圧の減少が認め
られるにすぎない。

血管作用効果は以下の方法で測定される：試験動物（両
性の雑種）の頚静脈および頚動脈を麻酔下に切開する。

麻酔をかけるに先立ち、少くとも１２時間の絶食時間を
確保する。１試行につき、有資格動物（イヌ）、即ち、
標準化された筋肉内投与用免疫グロブリン（「標準物質
」）を、投与ｆｆｉ　５　Ｑ　ｗｒｙ　７体重（Ｋｇ）
で動脈内投与した場合に、少くとも３０％の血管作用効
果（血圧低下作用）があられれるような動物、が４匹必
要である。

この標準化された筋注用免疫グロブリンは、Ｊ　、Ｌ。

Ｏｎｃ　ｌ　ｅｙ　、　Ｍ、Ｍｅ　ｌ　ｉｎ　、　Ｄ、
Ａ、Ｒｉ　ｃｈａ　ｒ　ｔ　１Ｊ　、Ｗ、Ｃａｍｅｒｏ
ｎおよびＰｏＭ、Ｇｒｏｓｓ（Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓ
ｏｃ、　７１．５４１（１９４９））によシ最初に報告
された方法で調製される。この標準物質に何ら反応を示
さないイヌは比較試験に用いることができない。

標準物質１６０ｑを注射用水１１ｎｌに溶かし、これを
ＮａＣ１等張面で１６．７　ｗｒｙ　７．．１に希釈す
る。この溶解後の試料は４時間以内に使用する。

また、本発明に係る静注用免疫グロブリンＧを注射用水
に、タンパク含有量が１６５　ＴＶ／ｍｌになるように
溶かず。この溶解した試料は４時間以内に使用する。

Ｎｅ−ｍｂ　ｕ　Ｌ　ａ　ｌ　（ハ）ｖピッレート）　
４　Ｑ　Ｍｆｌ／Ｉ＜ｆｌ（Ｄ静脈内１回投与によって
被検動物に麻酔をかけ、外頚静脈を、分割した後、下顎
の下側縁で切開し、カテーテルを挿入する。その後直ち
に頚動脈を同じ皮膚切開部分で露出させ、カテーテルを
挿入する。動脈切開術の後、安定した初期（ｉ（ｉｎｉ
Ｌｉａｌｖａｌｕｅｓ）を得るために３０分間待つ。圧
力伝達計を用いて、中火静脈圧（ｃｅｎｔｒａｌ　ｖｅ
ｎｏｕｓｐｒｅｓｓｕｒｅ）は深層静脈カテーテルを介
し、また動脈圧は浅部動脈カテーテルを介して、それぞ
れ測定する。動脈カテーテルを通じて、まず最初に本発
明に係る静注可能な免疫グロブリンＧを、次いで標準物
質を注入する。

実験が行なわれている間中、収縮および拡張期の血圧を
、圧力伝達計を用いて動脈カテーテルを介して測定する
。

被検物質および標準物質注入前の平均血圧（収縮期およ
び拡張期圧）並びに白血球数を測定しておく。最大血圧
降下を、被検物質注入後２０分間、血圧測定することに
よってめる。

本発明に係る静注用（ｉ、ｖ、）免疫グロブリンＧの血
管作用は、イヌの体重光だ、ｊｌ）　５００　Ｍｆ／／
ＫＦＩを４匹のイヌに注射し、その収縮期並びに拡張期
の平均血圧の減少を筋注用（ｉ、ｔｎ、）標準物質の血
圧減少効果と比較し、（％）で表わすことによって調べ
る。

白血球減少活性は以下の方法で決定される：試験動物（
両性の雑種）の頚静脈および頚動脈を麻酔下に切開する
。麻酔をかけるに先立ち、少くとも１２時間の絶食時間
を設ける。１試行につき、有資格動物（イヌ）、即ち、
標準化された筋注用免疫グロブリン（標準物質）を投与
量５０■／体重（Ｋｇ）で動脈内投与した場合に少くと
も５０％の白血球作用（白血球減少）があられれるよう
な動物、が４匹必要である。標準物質に対して何ら反応
を示さないイヌは比較試験に用いることができない。

試験動物および被検物質は、上記と同様に調製する。

白血球数を調べるだめに血液標本を採取する。

初回の標本に関しては、血液４０ｐ＃をｌ５ｏｔｏｎｅ
（ＩＩ）（ＣＯＵＬＴＥＲ）　２Ｑ、、１およびＺａｐ
ｏｇｌｏｂｉｎ　（ＣＯＵＬＴＥＲ）５滴と共に混合し
、ｃｏｕｌｔｅｒ計数器内で測定する。引き続き、白血
球数を測定するために１０，１５．１６．１７．１８お
よび１９分後に血液標本を採取する。次いで直ちに、本
発明に係る静注用免疫グロブリンＧを、免疫グロブリン
ノ投与量５００ｆｆｌＦ／体重（Ｉ（ｇ）テ、９０秒以
内に動脈内注入する。注入後１．２．３．４．５．７．
１０．１５および２０分後に血液標本を採取する。２０
分後に、標準物質の免疫グロブリン５０＋ＩＩｐ　／体
重（Ｋｙ）を９０秒以内に注入する。さらに、１．２．
３．４．５．７．１０．１５および２０分後に血液標本
を採取する。

白血球数の最大減少値は、被検試料注入後１．２．３．
４．５．７．１０．１５および２０分後に採取した血液
標本に関する測定に基づいて決定する。

静注用免疫グロブリンＧの白血球減少作用は、イヌに列
する５　００　ＩＱ／体重（Ｋｇ）注入による白血球の
平均減少数を、筋注用標準物質の白血球減少作用下にあ
る４匹のイヌにおけるそれらと比較しく％）で表わすこ
とにより決定される。

モルモットにおける気管支痙れん（呼吸圧の増加）作用
の決定は、下記の方法で行われる：試験動物（雄のモル
モット）の気管を咽頭部位で麻酔下に切開する。挿管し
た後、試験動物を、レヌピレーターを用いて該動物の体
重に対応させた呼吸容量で、呼吸頻度８０７分で呼吸さ
せる。

その後、同様の皮肋切開によ！ｌｌ頚動脈を露出させる
。被検物質を動脈内に注入し、呼吸圧を連続的に測定す
る。

この試験には、体重５００〜７００１の雄性実験用モル
モットを用いる。１試行について４匹の有資格動物、即
ち、標準化された筋注用免疫グロブリン（標準物質）を
、投与量５０　Ｔｒｉ／／　／体重（Ｋｇ）で動脈内投
与した場合に、少くとも３０％の呼吸圧の増加があられ
れる様な動物、が４匹必要である。標準物質に対して何
ら反応を示さないモルモットは比較試験に用いることが
できない。

標準物質１６０ダを注射用水１ｒｎＩＶに溶かし、これ
をＮ　ａ　Ｃ，１等張液で１６．７１ノア９７ｍ１に希
釈する。この溶解させた溶液は４時間以内に使用する。

また、本発明に係る静注用免疫グロブリンＧを注射用水
に、タンパク含量が１６５　”Ｉ／ｍｌになるように溶
かす。この溶解しだ試４：、１は４時間以内に使用する
。

動物に麻酔をかける；次いで咽頭部位で気管を切開し、
気管カニユーレを挿入する。レスビレ−ターによって、
試験動物を、該動物の体重に対応せしめた呼吸量並びに
頻度８０／分で呼吸させる。

レスビレ−ターは、Ｈａｒｖａｒｄポンプ６８１型を使
用する。

そこで直ちに、同様の皮膚切開によシ頚動脈を露出させ
、カテーテルを挿入する。Ｔ−ピースによって気管と連
結させた圧力伝達機を用いて呼吸圧を記録する。

切開術後、安定した初期値を得るために少くとも１０分
間待つ。その後、ゼロ点を定め、さらに２〜３分経って
から静注用免疫グロブリンＧを、免疫グロブリンの投与
ｍ　１５０１７７１／体重（ｈ）で、カテーテルを介し
て９０秒以内に動脈内注入する。

２０分後に、標準物質５０り／体重（ｈ）を９０秒以内
で動脈内に注入する。

試剥注入後２０分間における呼吸圧上昇の最高値をめ、
初期（開始時）の平均鎮と比較する。

静注用免疫グロブリンＧの気管支痙れん作用は、モルモ
ットに対する５００１ｆ／体重（Ｋｇ）注入時における
呼吸圧の平均値を、筋注用標準物質の呼吸圧上昇作用下
にある４匹のモルモットにおけるそれらと比較し、（％
）で表わすことによシ決定される。

以下に製造例及び実施例を挙げて本発明に係る画分の製
造方法を詳細に説明する。

固定化酵素製造のだめの製造例 製造例１ セフ　７　ロー　ｙ、　（５ｅｐｈａｒｏｓｅ）４　Ｂ
−ゲル（Ｐｈａｒ−ｔｎａｃｉａ）　ｌ　ｌを蒸留水４
１で洗浄した後、アセトニトリル１００ｍ１に溶かした
ブロモシアン２００！　、！＝　ｐＨ１１，０において
混合する。混合物を水浴中で冷却する。液相を除去した
後、このゲルを、０．２Ｍ−ＮａＨＣＯ３１１に溶かし
たトリプシン（Ｓｉｇｍａ）８００”Ｗと混合する。濾
過し、非結合トリプシンを、ゲルと結合しているトリプ
シンから分ける。

この固定化トリプシンをＩＭ−グリシン溶′ｇＩＩＥと
混合した後、０．２　Ｍ　−ＮａＨ（１：：０３溶液に
より遊離のタンパクを完全に洗い流す。最後に、固定化
トリプシンを０．９％ＮａＣ１溶液１１に懸濁すれハ、
免疫グロブリン画分のインキュベーションに用いること
のできる固定化酵素が得られる。

製造例２ トリプシンの代シに膵臓プロテアーゼ（Ｍｅｒｃｋ）を
用いて、製造例１と同様にして固定化酊素を製造する。

製造例３ トリプシンの代シにキモトリプシン（Ｓ　ｉ　ｇｍａ　
）を用いて、製造例１の操作を繰返して行なう。

免疫グロブリンＧ含有画分製造のだめの実施例実施例１ ヒト血漿をｐＨ７，２、温度−２°Ｃで８％エタノール
と混合する。沈殿を分離した後、エタノール濃度を２５
％に上げると同時に温度を一６°Ｃに下げる。免疫グロ
ブリンを含有する沈殿を、ホスフェート・アセテートバ
ッファーで抽出することによシさらに精製し、ｐＨ５，
４、温度−２°Ｃで１２％エタノールと混合する。

α−およびβ−グロブリンを含む沈殿を除去する。上清
のエタノール濃度をｐＨ７，２、温度−１０°Ｃで２５
％に上げる。析出するペースト状の免疫グロブリンを集
め、透析してエタノールを除く。

次いで、この透析物にＰＨ６，２５において硫酸アンモ
ニウムを１７０９／ｌの割合で加え、沈殿を分離して捨
てる。さらに、上清に硫酸アンモニウムを、ＰＨ７，２
において２８０　ｆ／ｌの濃度に達するまで加える。沈
殿を水に溶かし、硫酸アンモニウムを除去するために透
析する。

透析後、この免疫グロブリン溶液のイオン強度を０．１
５に調節する。

免疫グロブリン１００ｆを、製造例１で得た固定化トリ
プシン３０ｍ／によシ、３７°Ｃにおいて７２時間、処
理する。固定化トリプシンを除去した後、処理した免疫
グロブリンを１３５ｆ／ＩＩのポリエチレングリコ−／
Ｌ／４０００で沈殿させる。沈殿を０．９％ＮａＣ１に
溶かし、滅菌濾過して容器に充填し、凍結乾燥して保存
用とする。

実施例２ 免疫グロブリン含有画分の回収は実施例１と同様にして
行う。

製造例２に従って調製された固定化膵臓プロテアーゼを
用いてインキュベートする。免疫グロブリン１００ｆを
、ゼラチン状の固定化膵臓プロテアーゼ７０−によシ処
堆し、７０時間、３７°Ｃに保持する。ゲルを除去した
後、上清を７５ｆ／１のポリエチレングリコール４００
０と混合し、不純物を含有する沈殿を捨てる。

上澄みに、最終濃度８５　ｆ／ｌに達するまでポリエチ
レングリコール４０００を追加する。析出する沈殿を捨
てる。

ポリエチレングリコールの濃度を１３５　ｆ／１に増加
させることによシ析出する純化免疫グロブリンを、実施
例１と同様にして保存し得る形にする。

実施例３ 実施例１と同様にして免疫グロブリンＧ含有画分を回収
し、固定化α−キモトリプシンによシ、３７°Ｃで７２
時間処理する。

実施例１〜３に従って調製される本発明の、免疫グロブ
リンＧ含有画分に関するデーター、即ちモノマーＩｇＧ
分子の含有量、機能損傷のないＩｇＧ分子の含有量およ
び抗補体活性並びに電気泳動法での分離に基づくγ−グ
ロブリン含有量は下記の様にしてめた。これらの値は、
以下の表並びに添付の第１図に示されている。

第１図は、指示した条件下における１５０〜４００ｒｎ
ｌの間の溶離曲線および相対溶離容量ｖｅ／Ｖ。

を示すものである。この曲線は、２８０　ｎｍにおける
吸光度に基づいて測定した各両分中のタンパク含有量を
表わしている。

下記の表１には、図中の溶離曲線に含まれる個々の範囲
ごとに行なったゲル浸透クロマトグラフィーに基づ＜ｖ
ｅ／／Ｖｏ比が示されている。この表から、Ｖｅ／Ｖｏ
比は、その９０％以上が１．３０〜２．２０の範囲内に
あることがわかる。

表２にはプロ、ティンＡに結合したＩｇｃ−分子類と、
結合していないＩｇＧ分千類の比率が示されておシ、こ
の結合分子類は、機能損傷のないものに和尚する。この
表から明らかな様に、機能損傷のない■（分子類の全両
分中の含有量は９０％以上である。

表３には抗補体活性および電気泳動の結果が示されてお
シ、この表から、すべての実施例で得られる製剤につい
て、その抗補体活性は、Ｃ／Ｈ−５Ｑ単位を中和するの
に５０ダ以上の免疫グロブリンＧ含有画分が必要とされ
る程度の値であること、並びに電気泳動法的に得られた
精製γ−グロブリン測定値は９７％以上であることがわ
かる。

実施例１〜３に従って得られる本発明に係る免疫グロブ
リンＧ含有画分類の薬理学的な性質およびデーター（血
管作用および白血球減少作用はイヌによる実験で、気管
支痙れん作用はモルモットによる実験で、それぞれ前述
の方法で測定した）に関する値を以下の表に示す。

表　５　イヌ４匹に於ける、本発明製剤注入（５００２
Ｊｊｉ／Ａｆ！＞後の平均白血球数の初期値に対する割
合実施例１　７３％ 実施例２　６２％ 実施例３　５２％ ５００　雫Ａｆｌ　）後の平均呼吸気圧の初期値に対す
る増加率実施例１　１０２％ 実施例２　１１０％ 実施例３　１２５％ 添付の第■図〜第１Ｖ図から明らかな様に、本発明に係
る静注用（ｉ、ｖ、）免疫グロブリンＧ含有製剤は周知
の筋注用（ｉ　、ｍ、　）製剤よりも優れた性質を有す
る。

第■図は、使用した４匹のイヌの収縮期および拡張期に
おける血圧測定に基つく血圧曲線を示しだものであって
、動物の体重轟りの″投与量　ＣＭｙＡ＜ｑ）が横軸に
プロットされている。範囲Ａ、Ｂにおける実線は、本発
明に係る静注用免疫グロブリンＧ含有製剤の静脈内投与
に伴なう血圧変化の過程に対応し、Ａ、Ｃにおける曲線
（実線および破線）は、筋注用標準物質の投与に伴な°
う血圧変化の過程に対応する。図から明らかな様に、筋
注用標準物質の場合には、投与量５１１９／に９にょシ
血圧が３０％減少するのに対し、本発明に係る製剤の場
合には、投与量が６００１”＆／Ｋｌｉになって初めて
上記の如き血圧減少が起こるとｂうこと、即ち、本発明
に係る静注用免疫グロブリンの血管作用効果は、その他
の条件を同一にした場合、筋注用製剤の１／１００以下
であるといえる。

第■図は、イヌを用いた試験での白血球減少作用を、本
発明に係る静注用製剤と、標準化された筋注用標準製剤
との、４匹の動物における平均備の比較で示したもので
ある。範囲Ａ、Ｂの実線は静注（ｉ、■、）用免疫グロ
ブリンＧ含有製剤の、またＡ、Ｃの線（実線および破線
）は筋注（ｉｏｍ、）用標準物質の投与に伴なう血圧変
化曲線をそれぞれ表わしている。図から・明らがな様に
、筋注用標準物質の場合には白血球が５０％減少するの
に対し、本発明に係る製剤の場合には、投与量５００Ｉ
ｎｙ　／　Ｋｙによってはじめてこの様な減少が起こる
ということ、即ち、との静注用免疫グロブリンＧ含有製
剤の白血球減少作用は、その他の条件を同一にした場合
、周知の筋注用製剤の１／１，０００以下であるといえ
る。

同様のことが第１ｖ図のモルモットを用いた試験での気
管支痙れん作用についても認められる。図中、Ａ−Ｂの
曲線（実線）部分は本発明に係る静注用（ｉ、■、）製
剤に、またＡ−Ｃの曲線（実線および破線）部分は標準
化された筋注用（ｉ　、ｍ、　）製剤にそれぞれ対応す
る。周知の筋注用製剤によれば、３０％の呼吸圧上昇は
投与量２１１１７Ｋｇですでに現れているが、本発明の
静注用製剤によれば、同様の上昇は投与量５００　Ｍ９
／に９においてはじめて認められ、従って、本発明に係
る製剤の気管支痙れん副作用は前者の１／２５０以下で
あることがわかる。

化学的組成並びに薬理学的性質を考慮したとき、本発明
に係る免疫グロブリンＧ含有画分類は、原発性および二
次性の種々の免疫欠損、無−または低γ−グロブリン血
症、抗体欠損症候群、ウイルヌ感染症または細菌性感染
症、更に自己免疫疾患並びに免疫複合体症の治療に極め
て有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明に係る静注用（ｉ、ｖ、）免疫グロブ
リンＧ含有画分の、ゲル浸透クロマトグラフィーによる
溶離容量および相対溶離容量（ＶＣ／Ｖｏ）とタンパク
濃度との関係を示すグラフであシ、第■図は本発明に係
る静注用（ｉ−ｖ、）免疫グロブリンＧ含有製剤および
筋注用（ｉ、ｍ、）標準物質の投与に伴なうイヌ４匹に
おける平均の収縮期圧、並びに拡張期圧の初期値に対す
る割合（％）、第■図は同じく平均白血球数の初期値に
対する割合、同様に第■図はモルモット４匹における呼
吸圧の上昇の初期値に対する割合（％）を、それぞれ示
すグラフである。 特許出願人　イムノ・アクチェンゲゼルシャフト・フユ
ール・ヘミシュ〜メデイツイニツシエ・プロチークチ化
　理−人　弁理士　青白　葆　外】各昭和５９年　７月
１２日 特許庁　長　官　殿 ■、事件の表示　適 昭和５５〕年特許願第　５０８０４　万２発明の名称 血液製剤中の不適合反応原因物質 不活化法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　オーストリア国１２２０ウィーン、インダストリ
ーストランセフ２番 名称　イムノ・アクチェンゲゼルシャフト・７ユール・
ヘミシューメデイツイニッシェ・プロデュクテ４代理人 住所　大阪府大阪市東区本町２−１０　木釘ビル内１、
明細書中、次の箇所を補正致します。 １）発明の詳細な説明の棚 イ）第２７真下４行記載の「第１Ｉ図」を「第２図」と
補正する。 口）第２７真下８行記載の「第２図〜第４図」を「第２
図〜第４図」と補正する。 ハ）第２８頁ｍ１３行記載の「第■図」をｒｔｉＳ３図
」と補正する。 二）第２９頁第８行記載の「第■図」を「第４図」と補
正する。 ２）図面の簡単な説明の欄 イ）第３０頁第７行記載の「第１図」を「第１図」と補
正する。 口）第３０頁第１１行記載の「■図」を「２図」と補正
する。 ハ）第３０頁第１４行記載の「第■」を「第３」と補正
する。 二）第３０頁第１１６行記載の「第■図」を「第４図」
　−と補正する。 ２、図面を別紙の通り補正致します。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、治療または予防的に用いられる血液製剤中の不適合
   反応原因物質の不活化法であって、ヒトまたは動物の血
   液から得た画分を水不溶性担体と結合した膵臓酵素類に
   よって処理し、処理画分を得ることを特徴とする方法。 ２、膵臓酵素がトリプシン、キモトリプシンおよび膵臓
   プロテアーゼからなる群から選択されるものである第１
   項に記載の方法。 ３、処理画分をさらに分画し、濃縮する工程を含む第１
   項に記載の方法。 ４、水不溶性担体がセファロース４Ｂゲルであるｉｓ　
   １項に記載の方法。 ５、水不溶性担体と結合した酵素類で処理した該山分が
   免疫グロブリンを含有しており、該免疫グロブリンを精
   製し、タンパク沈殿剤によって該免疫グロブリンを沈殿
   させ、更に該免疫グロブリンを加工して最終製品にする
   ことを特徴とする第１項に記載の方法。 ６、望ましくない随伴物質を除去した後、免疫グロブリ
   ンを沈殿させることを特徴とする第５項に記載の方法。 ７、第１項〜第６項のいずれかに記載の免疫グロブリン
   含有画分の製造方法であって、温度０°Ｃ以下でエタノ
   ール処理することによシヒトまたは動物の血漿から免疫
   グロブリン含有沈殿を析出させ、該沈殿を緩衝液で抽出
   して第１溶液を得、該第１溶液からエタノール処理によ
   りペースト状の免疫グロブリン濃縮物を回収し、該濃縮
   物を透析によシ精製して精製免疫グロブリン含有画分を
   得、該免疫グロブリン含有画分をトリプシン、キモトリ
   プシンおよび膵臓プロテアーゼからなる群から選択され
   る酵素の固定化酵素によシ約３７°Ｃに高められた温度
   で処理することによシ処理画分を得、該処理画分からタ
   ンパク質沈殿剤によシ、笑質的にＩｇＧからなるｔｔＨ
   免疫グロブリンの沈殿を析出させ、該沈殿を溶解させて
   第２溶液を得、この第２溶液を滅菌涯過し、凍結乾燥す
   る、諸工程の組合わせからなることを特徴とする方法。 ８、タンパク質沈殿剤がポリエチレングリコールである
   第７項に記載の方法。