JPS6296857A - 血液製剤中の不適合反応原因物質の試験法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、治療的および予防的に用いられる血液製剤中
の、不適合反応原因物質の試験方法およびこれらの製剤
の安全性を試験するための本方法の使用に関する。

本発明は、特に、ヒトに静脈内投与される免疫グロブリ
ン含有製剤の試験方法に関する。

免疫グロブリン含有製剤は原発性、および二次性の免疫
欠損、ガンマグロブリン血症、または低ガンマグロブリ
ン血症、抗体欠損症候群、ウィルス感染症または細菌性
感染症の場合に適用される。

ヒトまたは動物の血漿から免疫グロブリン含有製剤を得
るための種々の方法が既に知られており、例えばエタノ
ール沈澱法［オンクレイ（Ｊ、Ｌ。

ｏ　ｎｃｌｅｙ）、メリン（Ｍ、　Ｍｅｌｉｎ）、リチ
ャート（Ｄ。

Ａ、　Ｒｉｃｈａｒｔ）、カメロン（Ｊ　、　Ｗ、　Ｃ
ａｍｅｒｏｎ）およびグロス（ｐ、　Ｍ、　Ｇｒｏｓｓ
）のジャーナル・オン・アメリカン・ケミカル・ソサエ
ティ（Ｊ、Ａｍ。

Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、）７１　５４１（１９４９）］並び
に改良エタノール法［ドイチュ（Ｈ，Ｆ、　Ｄｅｕｔｓ
ｃｈ）、ゴスティング（Ｌ、　　Ｊ、　Ｇｏｓｔｉｎｇ
）、アルパーティ（Ｒ，Ａ、　Ａｌｂｅｒｔｙ）および
ウィリアムス（Ｊ、Ｗ。

Ｗｉｌｌｉａｍｓ）のジャーナル・オン・バイオロジカ
ル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）
上ｌ土　１０９（１９６４）、およびキストラ−（Ｐ、
　Ｋ１５ｔｌｅｒ）およびニッチュマン（Ｈ、Ｎ　ｉｔ
ｓｃｈｍａｎｎ）のフォックス・サンギニス（Ｖｏｘ　
　Ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）７　４１４（１９６２）］など
がある。

さらには、硫酸アンモニウムおよびポリエチレングリコ
ールを用いて血漿から免疫グロブリンを沈殿させる方法
が知られている［ポルソン（Ａ。

Ｐ　ｏｌｓｏｎ）、ホトジチル（Ｇ、　Ｍ、　Ｐｏｔｇ
ｉｔｅｒ）、ラルグリエール（Ｊ、　Ｆ、　Ｌａｒｇｒ
ｉｅｒ）、メール（Ｇ。

Ｅ、　Ｆ、　Ｍｅａｒｓ）およびジョルブ（Ｆ、　Ｊ、
　　Ｊｏｕｒｂｅｔ）のビオシミ力・工・ビオフィジカ
・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃ
ｔａ、　）８２　４６３（１９６４）］。その他、イオ
ン交換法を利用する方法も指摘されている［ピーターソ
ン（Ｅ、　Ａ、　Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）およびソーバー（
Ｈ，Ａ、　５ｏｂｅｒ）のジャーナル・オン・アメリカ
ン・ケミカル・ソサエティ（Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、
　Ｓｏｃ、　）７８　７５１（１９５６）］。

しかしながら、これらの方法に従って得られる製剤は筋
肉内投与にしか適さず、それらを静脈内投与すると望ま
しくない副反応を示す。

そこで、副反応または副作用を軽減する試みがなされて
おり、そのために、免疫グロブリン含有製剤類を可溶性
タンパク分解酵素類、即ちベプンン、プラスミン、パパ
インその他によって処理することが実行されている（ド
イツ特許第１．１４８．０３７号）。しかしながら、こ
の処理によると免疫グロブリン類の分子構造が変化し、
生物学的半減期が短縮されてしまう。また、製剤中に酵
素残渣が残存することも発見されており、これによって
も汚染されることになる。従って、保存性は低く、かつ
タンパク質の分解が進行する危険性が大きい。

本発明者らは、ヒトの血液から得た両分を水不溶性の担
体と結合した膵臓酵素類、すなわち、トリプシン、キモ
トリプシンまたは膵臓プロテアーゼなどによって処理し
、この処理画分を、所望により、さらに分画し濃縮する
ことによる静脈内投与用免疫グロブリン含有製剤の製造
方法を開発した。

詳細には、この方法は、（１）０℃以下の温度でエタノ
ール処理することにより、ヒトの血漿から免疫グロブリ
ン含有沈殿を析出させる、（２）この沈殿を緩衝液で抽
出し、抽出液を更にエタノール処理することによりペー
スト状の免疫グロブリン濃縮物を回収する、（３）この
濃縮物を透析により精製する、（４）この精製免疫グロ
ブリン含有画分をトリプシン、キモトリプシンまたは膵
臓プロテアーゼからなる群から選ばれる、固定化酵素で
約３７℃において処理する、（５）この様に処理した画
分を、タンパク質沈殿剤、好ましくはポリエチレングリ
コール、で処理し実質的にＩｇＧ　からなる精製免疫グ
ロブリンを析出させる、（６）この沈殿を溶かし、その
溶液を滅菌濾過した後、最終的に凍結乾燥するという諸
工程からなるものである。

このようにして得られた製剤は、副反応または不適合反
応を惹起する物質をごく少量しか含んでいない。

しかしながら、医師によって多かれ少なかれ不適合反応
原因物質を含有している免疫グロブリン含有製剤が使用
される可能性があるので、簡単かつ迅速な方法により、
特に血管作用物質、白血球減少作用物質および気管支！
９作用物質の含有の有無という点で製剤の薬理学的特性
を調べることができる安全な試験方法を提供することが
、本発明の目的である。更に本発明苦らは、ヒトへの投
与前に免疫グロブリン含有製剤の安全性を試験するため
の有効な薬理学的に許容し得る限界値を得ようと努める
ものである。

本発明によれば、血液製剤をイヌに動脈内注射して血圧
低下を調べるか、血液製剤をイヌに動脈内注射して白血
球数の減少を調べるか、血液製剤をモルモットに動脈内
注射して呼吸圧の上昇を調べることでこの目的は達成さ
れる。

好都合なことに、免疫グロブリン含有血液製剤がこの試
験に使用される。

ここに示した方法は、イヌまたはモルモットに製剤を動
脈内注射した場合、副作用原因物質はヒトに静脈内投与
した場合の約１０倍強く現れるという知見に基いている
ので、この方法でヒトに静脈内投与される製剤中の許容
し得る不純物の無害な限界値を求めることができる。

ここに示した試験方法は、使用する可能性のある最大投
与量において、イヌの試験における血圧の有意な低下、
および／またはイヌの試験における白血球数の有意な減
少、および／またはモルモットの試験における呼吸圧の
有意な上昇が検出されない場合は十分な安全性があると
いう規定の下に、免疫グロブリン含有製剤の安全性を試
験することができるという点が特徴である。

血管作用を調べるための免疫グロブリン含有製剤の試験
では、５００　ｍ９／　ｋｇ体重以上の投与量で４匹の
動物の平均血圧低下が最大限３０％検出される場合は、
実質上安全であるということがわかつｆこ。

白血球減少作用を調べるための免疫グロブリン含有製剤
の試験では、５００　ｍ９／　ｋｇ体重以上の投与量で
４匹の動物の平均白血球数減少の検出値が最大限５０％
である場合、実質上安全であるということがわかった。

気管支痙孝作用を調べる免疫グロブリン倉荷製剤の試験
では、５００ｍｇ／ｋｇ体重以上の投与量で４匹の動物
の平均呼吸圧上昇の検出値か最大限３０％である場合、
実質上安全であるということがわかった。

上に示した限界値と被験動物の数の間には、被験動物の
数が増加すると許容し得る限界値が低下し、逆に、より
少ない被験動物では安全性の限界が高められるという相
互関係がある。

本発明によれば、血管作用効果は以下の方法で測定され
る・ ぜ験ｒｔｌｌ物（画性の雑種）の顆静脈および頚動脈を
麻酔下に切開する。麻酔をかけるに先立ち、少なくとも
１２時間の絶食時間を確保する。■試行につき、有資格
動物（イヌ）、即ち、標準化された筋肉内投与用免疫グ
ロブリン（「標準物質」）を、投与量５０ｍ９７体重（
ｋｇ）で動脈内投与した場合に、少くとも３０％の血管
１作用効果（血圧低下作用）があられれるような動物、
が４匹必要である。この標準化された筋注用免疫グロブ
リンは、オンクレイ（Ｊ、　Ｌ、　０ｎｃｌｅｙ）、メ
リン（Ｍ、　Ｍｅｌｉｎ）、リチャート（Ｄ、　Ａ、　
Ｒ４ｃｈａｒｔ）、カメロン（Ｊ、Ｗ、Ｃａｍｅｒｏｎ
）およびグロス（Ｐ、　Ｍ、　Ｇｒｏｓｓ）のジャーナ
ル・オン・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（Ｊ、　
Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　）７　Ｌ　５４１（１
９４９））により最初に報告された方法で調製される。

この標準物質に何ら反応を示さないイヌは比較試験に用
いることができない。

標準物質１　’６０　ｍｇを注射用水１ｍρに溶かし、
これをＮａＣ１等張液で１６　、７ｍ９／ｍＱに希釈す
る。

この溶解後の試料は４時間以内に使用する。

また、試験する免疫グロブリン製剤を注射用水に、タン
パク含有量が１６５　ｍ９／ｍＱになるように溶かす。

この溶解した試料は４時間以内に使用する。

Ｎ　ｅｍｂｕｔａｌ　（パルピッレート）　４０　ｍｇ
／ｋｇの静脈内１回投与によって被検動物に麻酔をかけ
、外頚静脈を、分割した後、下顎の下側縁で切開し、カ
テーテルを挿入する。その後直ちに頚動脈を同じ皮膚切
開部分で露出させ、カテーテルを挿入する。

動脈切開術の後、安定した初期値（ｉｎｉｔｉａｌ　ｖ
ａｌｕｅＳ）を得るために３０分間待つ。圧力伝達針を
用いて、中央静脈圧（ｃｅｎｔｒａｌ　ｖｅｎｏｕｓ　
ｐｒｅｓｓｕｒｅ）は深層静脈カテーテルを介し、また
動脈圧は浅部動脈カテーテルを介して、それぞれ測定す
る。動脈カテーテルを通じて、まず最初に本発明方法に
よって試験する免疫グロブリンを、次いで標準物質を注
入する。

実験が行なわれている間中、収縮および拡張期の血圧を
、圧力伝達針を用いて動脈カテーテルを介して記録する
。

被検物質および標準物質注入前の平均血圧（収縮期およ
び拡張期圧）並びに白血球数を測定しておく。最大血圧
降下を、被検物質注入後２０分間、血圧測定することに
よって求める。

試験する免疫グロブリン製剤の血管作用は、イヌの体重
当たり５００　ｍ９／　ｋｇを４匹のイヌに注入し、そ
の収縮期並びに拡張期の平均血圧の減少を筋注用（ｉ、
　ｍ、　）標準物質の血圧減少効果と比較し、（％）で
表わすことによって決定される。

白血球減少活性は本発明に係る以下の方法で決定される
： 試験動物（両性の雑種）の頚静脈および頚動脈を麻酔下
に切開する。麻酔をかけるに先立ち、少くとも１２時間
の絶食時間を設ける。ｌ試行につき、有資格動物（イヌ
）、即ち、標準化された筋注用免疫グロブリン（標準物
質）を投与量５Ｑｍ９７体重（ｋｇ）で動脈内投与した
場合に少くとも５０％の白血球作用（白血球減少）があ
られれるような動物、が４匹必要である。標準物質に対
して何ら反応を示さないイヌは比較試験に用いることが
できない。

試験動物および被検物質は、上記と同様に調製する。

白血球数を調べるために血液標本を採取する。

初回の標本に関しては、血液４０μσをＩ　５ｏｔｏｎ
ｅ（ｎＸｃＯＵＬＴＥＲ）２０−およびＺ　ａｐｏｇｌ
ｏｂｉｎ（ＣＯＵＬＴＥＲ）６滴と共に混合し、ｃｏｕ
ｌｔｅｒ計数器内で測定する。引き続き、白血球数を測
定するためにｌ０１Ｉ５．１６．１７．１８および１９
分後に血液標本を採取する。次いで直ちに、静注用免疫
グロブリンを、免疫グロブリンの投与量５゜Ｏｍ９／体
重（ｋｇ）で、９０秒以内に動脈内注入する。

注入後ｌ、２．３．４．５．７．１０．１５および２０
分後に血液標本を採取する。

２０分後に、標準物質の免疫グロブリン５０肩９／体重
（ｋｇ）を９０秒以内に注入する。さらに、ｌ、２．３
．４．５．７、ｌ０１１５および２０分後に血液標本を
採取する。

白血球数の最大減少値は被検試料注入後１，２．３．４
．５．７．１Ｏ１１５および２０分後に採取した血液標
本に関する測定に基づいて決定する。

試験する免疫グロブリン製剤の白血球減少作用は、イヌ
に対する５００．π９／体重（ｋｇ）注入による白血球
の平均減少数を、筋注用標準物質の白血球減少作用下に
ある４匹のイヌにおけるそれらと比較しく％）で表すこ
とにより決定される。

モルモットにおける気管支症１（呼吸圧の増加）作用の
決定は、下記の方法で行われる；弐験動物（雄のモルモ
ット）の気管を咽頭部位で麻酔下に切開する。挿管した
後、試験動物を、レスビレ−ターを用いて該動物の体重
に対応させた呼吸容量で、呼吸頻度８０／分で呼吸させ
る。その後、同様の皮膚切開により頚動脈を露出させる
。

被検物質を動脈内に注入し、呼吸圧を連続的に測定する
。

この試験には、体重５００〜７００ｇの雄性実験用モル
モットを用いる。１試行について４匹の有資格モルモッ
ト、即ち、標準化された筋注用免疫グロブリン（標準物
質）を、投与！５０′Ｒｇ／体重（ｋｇ）で動脈内投与
した場合に、少くとも３０％の呼吸圧の増加があられれ
ろ様な動物、が４匹必要である。標準物質に対して何ら
反応を示さないモルモットは比較試験に用いることがで
きない。

標準物質１６０ｍｇを注射用水１ｍｆ２に溶かし、これ
をＮａＣ１等張液で１６　、　７　ｒｘｖ／ｍＱに希釈
する。

この溶解させた試料は４時間以内に使用する。

また、本発明に従って試験する免疫グロブリン製剤を注
射用水に、タンパク含量が１６５　ｍ９／ｍＱになるよ
うに溶かす。この溶解した試料は４時間以内に使用する
。

動物に麻酔をかける；次いで咽頭部位で気管を切開し、
気管カニニー１ノを挿入する。レスビレ−ターによって
、試験動物を、該動物の体重に対応せしめた呼吸量並び
に頻度８０／分で呼吸させる。

レスビレ−ターは、Ｈａｒｖａｒｄポンプ６８１型を使
用する。

そこで直ちに、同様の皮膚切開により頚動脈を露出させ
、カテーテルを挿入する。Ｔ−ピースによって気管と連
結させた圧力伝達機を用いて呼吸圧を記録する。

切開術後、安定した初期値を得るために少くとも１０分
間待つ。その後、ゼロ点を定め、さらに２〜３分経って
から静注用免疫グロブリンを、免疫グロブリンの投与量
１５０ｘｙ／体重（ｋｇ）で、カテーテルを介して９０
秒以内に動脈内注入する。

２０分後に、標準物質５０Ｒ９／体重（ｋｇ）を９０秒
以内で動脈内に注入する。

試料注入後２０分間における呼吸圧上昇の最高値を求め
、初期（開始時）の平均値と比較する。

試験する免疫グロブリン製剤の気管支痙市作用は、モル
モットに対する５００ｘｙ／体重（ｋｇ）注入時におけ
る呼吸圧の平均値を、筋注用免疫グロブリン標準物質の
呼吸圧上昇作用下にある４匹のモルモットにおけるそれ
らと比較し、（％）で表わすことにより決定される。

以下にごく少量の不適合反応原因物質しか含有していな
い免疫グロブリン画分の製造方法およびその試験法を例
示する。

寒皇桝 セファロース（Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓｅ）　４　Ｂ−ゲル
（Ｐｈａｒ−ｍａｃｉａ）　Ｉ　Ｑを蒸留水４Ｑで洗浄
した後、アセトニトリル１００ｍ（２に溶かしたブロモ
シアン２００ｇとｐｉ（１１，０において混合する。混
合物を水浴中で冷却する。液相を除去した後、このゲル
を、０．２Ｍ　　ＮａＨＣＯｓｌＱに溶かしたトリプシ
ン（Ｓ　ｉｇｍａ）　８００１１１９と混合する。濾過
し、非結合トリプシンを、ゲルと結合しているトリプシ
ンから分けろ。

このゲル（固定化）トリプシンをＩＭ−グリシン溶液Ｉ
Ｑと混合した後、０．２Ｍ　　ＮａＨＣＯｓ溶液により
遊離のタンパクを完全に洗い流す。最後に、ゲル（固定
化）トリプシンを０．９％ＮａＣ１溶液ＩＱに！；％局
すれば、免疫グロブリン画分のインキュベーションに用
いることのできる固定化酵素が得られる。

ヒト血漿をｐＨ７，２、温度−２°Ｃで８％エタノール
と、混合する。沈殿を分離した後、エタノール濃度を２
５％に上げると同時に温度を一６°Ｃに下げろ。免疫グ
ロブリンを含有する沈殿を、ホスフェート・アセテート
バッファーで抽出することによりさらに精製し、ｐＨ５
，４、温度−２°Ｃで１２％エタノールと混合する。

α−およびβ−グロブリンを含む沈殿を除去する。上清
のエタノール感度をｐＨ７，２、温度−１０℃で２５％
に上げる。析出するペースト状の免疫グロブリンを集め
、透析してエタノールを除く。

次いで、この透析物にｐＨ６，２５において硫酸アンモ
ニウムを１７０ｇ／Ｑの割合で加え、沈殿を分離して捨
てる。さらに、上清に硫酸アンモニウムを、ｐＨ７，２
において２８０ｇ／１２の濃度に達するまで加える。沈
殿を水に溶かし、硫酸アンモニウムを除去するために透
析する。透析後、この免疫グロブリン溶液のイオン強度
を０，１５に調節する。

このようにして得た免疫グロブリン１００ｇを、固定化
トリプシン３０ｍｆ２により、３７℃において７２時間
、処理する。ゲル（固定化）トリプシンを除去した後、
処理した免疫グロブリンを１３５ｇ／Ｑのポリエチレン
グリコール４０００で沈殿させる。沈殿を０．９％Ｎａ
Ｃｌに溶かし、滅菌濾過して容器に充填し、凍結乾燥し
て保存用とする。

上記の方法に従って得られる免疫グロブリンを、血管作
用および白血球減少作用はイヌによる実験で、気管支痙
常作用はモルモットによる実験で、それぞれ前述の方法
で試験する。得られた値を以下に示す。

イヌ４匹に於ける、免疫グロブリン製剤注入（５００ｘ
９／　ｋｇ体重）後の平均血圧の初期値に対する割合（
％） グロブリン イヌ４匹に於ける、免疫グロブリン製剤注入（５００Ｈ
／　ｋｇ体重）後の平均白血球数の初期値に対する割合
（％） 実施例の免疫グロブリン　　　　７３％モルモット４匹
に於ける、免疫グロブリン製剤注入（５００ｍ９７ｋｇ
体重）後の平均呼吸圧の初期値に対する増加率（％） 実施例の免疫グロブリン　　　　１０２％得られた値か
ら、試験した免疫グロブリンはヒトに静脈内投与するの
に適しており、かつ安全であることがわかる。

特許出願人　イムノ・アクチェンゲゼルンヤフト・フユ
ール・ヘミシューメディ ツイニツシエ・プロデュクテ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、治療および予防的に用いられる血液製剤中の不適合
   反応の原因となる血管作用物質の試験方法であって、該
   血液製剤をイヌに動脈内注射し、その血圧低下を測定す
   ることを特徴とする方法。 ２、治療および予防的に用いられる血液製剤中の不適合
   反応の原因となる白血球減少作用物質の試験方法であっ
   て、該血液製剤をイヌに動脈内注射し、その白血球数の
   減少を測定することを特徴とする方法。 ３、治療および予防的に用いられる血液製剤中の不適合
   反応の原因となる気管支痙攣作用物質の試験方法であっ
   て、該血液製剤をモルモットに動脈内注射し、その呼吸
   圧上昇を測定することを特徴とする方法。 ４、免疫グロブリン含有血液製剤を試験に使用すること
   を特徴とする第１項〜第３項のいずれかに記載の方法。 ５、使用する可能性のある最大量に於いて、イヌの試験
   における血圧の有意な低下および／またはイヌの試験に
   おける白血球数の有意な減少および／またはモルモット
   の試験における呼吸圧の有意な上昇が検出されない場合
   には、十分な安全性があるという規定の下に、免疫グロ
   ブリン含有血液製剤の安全性を第１項〜第４項に記載の
   方法に従って試験する方法。 ６、血管作用の試験において、５００ｍｇ／ｋｇ体重以
   上の用量で４匹の動物の平均血圧低下の検出値が最大限
   ３０％であるという規定の下で、第４項の免疫グロブリ
   ン含有血液製剤の安全性を第１項に記載の方法に従って
   試験する方法。 ７、白血球減少作用の試験において、５００ｍｇ／ｋｇ
   体重以上の用量で４匹の動物の平均白血球減少の検出値
   が最大限５０％であるという規定の下で、第４項の免疫
   グロブリン含有血液製剤の安全性を第２項に記載の方法
   に従って試験する方法。 ８、気管支痙攣作用の試験において、５００ｍｇ／ｋｇ
   体重以上の用量で４匹の動物の平均呼吸圧上昇の検出値
   が最大限３０％であるという規定の下で、第４項の免疫
   グロブリン含有血液製剤の安全性を第３項に記載の方法
   に従って試験する方法。