DE19818790A1 - Immunadsorptionsmatrix, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung - Google Patents

Immunadsorptionsmatrix, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine neue Immunadsorptionsmatrix, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung für therapeutische, diagnostische, präparative, analytische und medizintechnische Zwecke. DOLLAR A Unter Anwendung der Kopplung an ein Trägermaterial werden antigenbindende Strukturen unter Schutz der Antigenbindungsstelle mit funktionellen Gruppen, die sich zur Kopplung an eine chemisch aktivierte Matrix eignen oder selbst eine aktivierte Gruppe darstellen, derivatisiert und/oder aktiviert.

Description

Die Erfindung betrifft eine neue Immunadsorptionsmatrix, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung für therapeutische, diagnostische, präparative, analytische und medizintechnische Zwecke.
Als Immunadsorption wird ein affinitätschromatographisches Verfahren bezeichnet, bei dem die spezifische Bindung zwischen Antikörper und Antigen zur Isolierung eines der Reaktionspartner aus komplexen Mischungen biogenen Ursprungs genutzt wird (Carlsson, J. et al. 1989).
Ursprünglich wurde diese Methode eingesetzt, um mit an Trägermaterial (Matrix) fixiertem Antigen die Antikörper einer bestimmten Spezifität aus Serum zu gewinnen (Campbell, D. H. et al. 1951).
Umgekehrt war es mit dem Vorliegen aufgereinigter Antikörper einer bestimmten Spezifität möglich, diese als Liganden an Trägermaterial fixiert zur Gewinnung von Antigen einzusetzen.
Die Möglichkeit, über das Immunsystem spezifische Antikörper gegen eine Vielzahl von Molekülen zu produzieren, hat die Affinitätschromatographie mit Hilfe von an Trägermaterial fixierten Antikörpern zum Stand der Technik gemacht (Goding, J. W. 1986).
Neben ihrem Einsatz für analytische und präparative Zwecke in Forschung und Industrie gewinnt die Immunadsorption mit trägerfixierten Antikörpern auch zunehmende Bedeutung in der Medizin. Speziell auf dem Gebiet der Stoffwechsel- und Autoimmunerkrankungen sowie bei Transplantatabstoßungsreaktionen, deren komplexe Krankheitsbilder oft auf die Anwesenheit und Konzentration einer einzigen Substanz bzw. Substanzklasse in der Körperflüssigkeit zurückzuführen sind, läßt sich die Spezifität der Antigen-Antikörper-Reaktion extrakorporal therapeutisch nutzen.
Bei einer als Immunapherese bezeichneten Behandlungsmethode zirkuliert das Patientenplasma im geschlossenen Kreislauf durch Säulen mit spezifischen trägerfixierten Antikörpern, mit deren Hilfe die Konzentration der schädlichen Komponente im Plasma reduziert wird (Stoffel, W. 1981, Olbricht, C. J. 1991).
So gilt die Senkung des Serumcholesterins mit Hilfe der LDL-Immunadsorption mittlerweile als anerkanntes Behandlungsverfahren bei Patienten mit familiärer Hypercholesterinämie (Richter, W. O. und Schwandt, P. 1995, Jansen, M. et al. 1996).
Die spezifische Entfernung von Immunglobulinen aus dem Plasma von Patienten mit Autoimmunerkrankungen oder Patienten nach einer Transplantation ist ein relativ neues, sich aber ständig erweiterndes Anwendungsgebiet der Immunadsorption.
So führte die Reduktion von Autoantikörpern im Plasma zu einer deutlichen Verbesserung des Krankheitsbildes bei Patienten mit thrombotischer thrombozytopenischer Purpurea (Schlee, H. et al. 1996) oder dilatativer Kardiomyopathie (Dörffel, W. V. et al. 1996, Wallukat, G. et al. 1996). Bei weiteren Autoimmunerkrankungen zeichnet sich eine Verdrängung der bisherigen Plasmapherese durch die schonendere Immunadsorption ab (Richter, W. O. et al. 1995).
Die Abstoßung von Transplantaten durch präformierte anti-HLA- oder zytotoxische Antikörper im Plasma des Empfängers wurde mit Hilfe der Immunadsorption ebenfalls vermieden (Schaumann, D. et al. 1994, Leventhal, J. R. et al. 1995). Genauso konnte bei Hämophilie-Patienten mit hohem Antikörperspiegel gegen die Gerinnungsfaktoren V bzw. VIII nach Immunadsorption die Wirksamkeit der entsprechenden Präparate wieder hergestellt werden (Tribl, P. et al. 1995, Knöbl, P. et al. 1995).
Es ist damit zu rechnen, daß die Immunadsorption mit Antikörpern entsprechender Spezifität demnächst auch zur Entfernung von Toxinen und immunologischen Regulator-Substanzen (z. B. Zytokine bzw. Zytokin-Rezeptor-Kom­ plexe) aus dem Plasma eingesetzt wird.
Zur Fixierung an das Trägermaterial werden die Antikörper in der Regel über ihre primären Aminogruppen kovalent gebunden. Diese Kopplungsart setzt eine chemische Aktivierung der Matrix mit entsprechend reaktiven Gruppen voraus.
Eine bevorzugte Aktivierungsmethode ist die Bildung von Cyanatestern bzw. Imidocarbonaten nach der Einwirkung von Bromcyan auf eine Matrix mit vicinalen Hydroxylgruppen (Axen, R. und Ernback, S. 1971, Jacoby, W. V. und Wilchek, M. 1975). Weitere gebräuchliche reaktive Gruppen sind N-Hydroxysuccinimidester (Cuatrecasas, P. und Parikh, 1. 1972) oder auch N-Hydroxysuccinimid- und Imidazoyl­ carbonate (Wilchek, M. und Miron, T. 1985, Hearn, M. T. W. 1987), die eine Matrix mit Carboxyl- bzw. Hydroxyl-Gruppen voraussetzen. Seltener ist die Einführung von Aldehydgruppen in beispielsweise eine Polysaccharidmatrix (Sanderson, C. J. und Wilson, D. V. 1971).
Bevorzugte Trägermaterialien sind großporige Polymere auf Kohlenhydrat-, Acryl-, Acrylamid- oder Styrolbasis. Mischpolymerisate auf der Basis dieser Polymere werden ebenfalls genutzt.
In neuerer Zeit stehen als Trägermaterial auch sogenannte Perfusions- oder Hyperdiffusionsharze zur Verfügung, die bei der Chromatographie bis zu 50fach höhere Durchflußraten erlauben (Afeyan, N. B. et al. 1990, Fulton, S. P. et al. 1991).
Nach entsprechender Derivatisierung kann dieses Trägermaterial genauso wie herkömmliches Material aktiviert werden.
Erhältlich sind diese Materialien z. B. unter der Bezeichnung POROS® (Fa. Perseptive Biosystems) oder HYPER DTM (Fa. Biosepra).
Zur Immunadsorption können neben kompletten Antikörpern auch deren chemische oder enzymatische Spaltprodukte eingesetzt werden, sofern die antigenbindende Region funktionell intakt enthalten bleibt. Dazu gehören insbesondere die in der Literatur häufig beschrieben F(ab') - bzw. F(ab')2-Fragmente, die durch kontrollierte enzymatische Spaltung von Antikörpern entstehen. (Porter, R. R. 1959, Nisonoff, A. et al. 1961). Weitere Möglichkeiten bestehen in der Verwendung von sogenannten "single chain antibodies" (Davis, G. T. et al. 1991) oder auch synthetischen Oligo- oder Polypeptiden, die chemisch oder gentechnisch hergestellt werden können.
Für die Immunadsorption müssen diese antigenbindenden Strukturen über eine kovalente Bindung an ein Trägermaterial gekoppelt werden.
Die Zielstellung bei der Kopplung ist eine in Bezug auf die eingesetzte Menge hohe Ausbeute an gekoppelten antigenbindenden Strukturen, gepaart mit einem möglichst hohen Aktivitätserhalt in Bezug auf die spezifische Bindung für das Antigen.
Das Problem besteht darin, daß kovalente Bindungen auch im Bereich der antigenbindenden Region erfolgen können, dadurch die antigenbindenden Eigenschaften beeinträchtigen und die Aktivität verringern.
Ein weiteres Problem bei vielen Anwendungen ist eine unbefriedigende Bindungskapazität der Immunadsorptionsmatrix. Eine hohe Bindungskapazität ermöglicht die Verwendung kleinerer Säulenvolumina und führt damit zu Zeit- und Materialersparnis in der Routineanwendung.
Die Bindungskapazität wird üblicherweise angegeben in mg gebundenes Antigen pro ml Adsorptionsmatrix, oder pro mg gekoppelte antigenbindende Struktur. Sie ist abhängig von der Affinität der antigenbindenden Struktur zum Antigen und von der Beladungsdichte, d. h. der Menge an funktionell intakten antigenbindenden Strukturen, die an eine bestimmte Menge des Immunadsorptionsmaterials gekoppelt werden können. Die Beladungsdichte wird meist in mmol oder mg gekoppelte antigenbindende Struktur pro ml Säulenmatrix angegeben.
Eine hohe Beladungsdichte wird üblicherweise durch Verwendung eines Trägermaterials mit einer großen verfügbaren Matrixoberfläche und einer hohen Konzentration an funktionellen oder reaktiven Gruppen auf der Matrixoberfläche erreicht, an die die antigenbindenden Strukturen unter geeigneten Bedingungen gekoppelt werden können.
In der Regel geht mit maximalen Bedingungen für eine hohe Beladungsdichte eine mehrfache kovalente Bindung einer antigenbindenden Strukturen an die Matrix einher. Das beeinträchtigt einmal die Beweglichkeit des Liganden und zum anderen steigt die Wahrscheinlichkeit, daß eine der kovalenten Bindungen im Bereich der Antigenbindungsstelle erfolgt. Beides führt zu einer Verminderung der Bindungskapazität.
Eine maximal um den Faktor 1,7 höhere Bindungskapazität kann erwartet werden, wenn bei gleicher mengenmäßiger Beladung, angegeben in mg antigenbindende Struktur pro ml Trägermatrix, anstelle von kompletten Immunglobulinen deren F(ab')-Frag­ mente gekoppelt werden. Aufgrund des kleineren Molekulargewichts ist der prozentuale Anteil an Bindungsstellen für das Antigen höher. Das F(ab')-Fragmente weist dafür aber nur 1 Antigenbindungsstelle auf. Ähnliche Erhöhungen sollten auch bei der Kopplung von "single chain antibodies" oder Peptiden (mit einer Antigenbindungsstelle) im Vergleich zu kompletten Immunglobulinen gelten.
In der Literatur beschriebene Vergleiche der Bindungskapazitäten von gekoppelten F(ab')-Fragmenten bzw. "single chain antibodies" mit den korrespondierenden Antikörpern zeigten allerdings nicht die zu erwartende Kapazitätserhöhung. (Lebedin, Y. S. et al. 1991, Canaan-Haden, L. et al. 1995).
Aufgabe der Erfindung war es deshalb, eine effektive Immunadsorptionsmatrix mit einer möglichst hohen Bindungskapazität bereitzustellen, indem für das entsprechende Antigen spezifische antigenbindende Strukturen so an eine Trägermatrix gekoppelt werden, daß die Aktivität in bezug auf die Bindung des Antigens auch bei hoher Beladung nahezu vollständig erhalten bleibt.
Die Aufgabe wurde erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß zusätzliche funktionelle Gruppen in die antigenbindende Struktur eingeführt werden, währenddessen die Bindungsstelle für das Antigen geschützt war.
Alle Moleküle, die eine antigenbindende Region enthalten und im Sinne einer Antigen-Anti­ körper-Bindung reagieren können, werden im Folgenden als antigenbindende Struktur bezeichnet.
Antigenbindende Strukturen können polyklonale oder monoklonale Antikörper (z. B. Einzelkettenantikörper "single chain antibodies") oder Fragmente davon sein. Es können aber auch rekombinante oder synthetisch hergestellte Peptide bzw. Proteine sein.
Die antigenbindenden Strukturen können gegen die unterschiedlichsten Antigene oder Haptene gerichtet sein, wobei man unter Haptenen Verbindungen versteht, die alleine im Organismus keine Antikörperproduktion bewirken, sondern erst nach Kopplung an einen polymeren Träger. Sie können aber trotzdem sehr effizient durch antigenbindende Strukturen gebunden werden.
Vorzugsweise werden Trägermaterialien verwendet, an welche die antigenbindenden Strukturen kovalent gebunden werden. Insbesondere handelt es sich um Matrizes als Trägermaterial, welche aus organischen, anorganischen, synthetischen Polymeren oder aus Mischpolymeren bestehen und die ggf. chemisch aktiviert werden.
Die eingeführten funktionellen Gruppen können sich entweder zur Kopplung an eine chemisch aktivierte Matrix eignen oder selbst eine aktivierte Gruppe darstellen, die an eine geeignete funktionelle Gruppe einer Matrix koppeln kann.
Es gibt eine Reihe von chemischen Gruppen und chemischen Methoden, mit denen diese Aufgabe gelöst werden kann.
Die Aminogruppen der antigenbindenden Strukturen können z. B. mit Bernsteinsäureanhydrid umgesetzt und die eingeführten Carboxylgruppen nach Aktivierung mit z. B. 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) an eine aminohaltige Matrix gekoppelt werden. Vernetzungen der antigen-bindenden Strukturen untereinander sind durch die Umsetzung mit Bernsteinsäureanhydrid unterbunden.
Es können aber auch die Carboxylgruppen der antigenbindenden Strukturen mit EDC und einem geeignetem Diamin umgesetzt und über die eingeführte Aminogruppe an z. B. eine N-Hydroxysuccinimid- oder Bromcyan-aktivierte Matrix gekoppelt werden.
Nach Reaktion mit Succinimidyl 3(2-pyridyldithio) propionate (SPDP) und nachfolgender Reduktion mit z. B. Dithiothreitol (DTT), oder nach Reaktion mit dem Traut'schen Reagenz (2-Iminothiolan) können SH-Gruppen eingeführt werden, die z. B. an eine Maleimidogruppen-tragende Matrix gekoppelt werden können.
Eine weitere Möglichkeit zur Einführung von SH-Gruppen ist die Umsetzung mit N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat (SATA) und Nachbehandlung mit Hydroxylamin. SPDP und SATA haben gegenüber dem Traut'schen Reagenz den Vorteil, daß die SH-Gruppe erst nach Abtrennung vom Antigen freigesetzt wird.
Für die Immunapherese interessante Antigene sind z. B. Autoantikörper, Low density lipopintein (LDL), β2-Mikroglobulin, Fibrinogen, Antikörper gegen Faktor VIII oder Endotoxin. Für andere Anwendungen wie z. B. zur Präparation von monoklonalen Antikörpern können die Fc-Fragmente von Immunglobulinen der Maus geeignete Antigene darstellen.
In allen Fällen wird der Bindungsbereich der antigenbindenden Struktur erfindungsgemäß während der Durchführung der Derivatisierung durch temporäre, reversible Bindung an das Antigen geschützt und nach Abtrennung vom Antigen über die neu eingeführten funktionellen Gruppen an eine geeignete, entsprechend derivatisierte Matrix gebunden.
Die erfindungsgemäß hergestellten Matrizes zeigen überraschend wesentlich erhöhte Bindungskapazitäten. So weisen sie einen unerwarteten Anstieg bis zum Faktor 3,69 auf.
Die erfindungsgemäßen Matrizes sind somit hervorragend für eine Anwendung zu therapeutischen, diagnostischen, präparativen, analytischen und medizintechnischen Zwecken geeignet.
In einer bevorzugten Ausführungsvariante werden F(ab')-Fragmenten aus Antikörpern vom Huhn (Immunglobulin Y) derivatisiert, deren Spezifität gegen humanes Immunglobulin gerichtet ist.
Mit Hilfe von 2-Iminothiolan werden an die an Antigen gebundenen F(ab')-Fragmente Sulfhydryl-Gruppen addiert, über die sie an eine mit m-Maleimidobenzoyl-Gruppen aktivierte Sepharose 4B als Matrix koppeln.
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Ausführungsbeispiel Arbeitsschritt 1
Die zur Kopplung von Immunglobulin Y (IgY) oder dessen F(ab')-Fragmente (IgY-F(ab')) vorzugsweise verwendete Matrix m-Maleimidobenzoyl-Sepharose 4B wird wie nachstehend beschrieben hergestellt.
Getrocknete bromcyanaktivierte Sepharose 4B wird in 1 mM HCl suspendiert und mit dem 70fachen Volumen 1 mM HCl gewaschen. Anschließend wird die bromcyanaktivierte Sepharose 4B mit dem 2fachen Volumen 0,5 M Diaminoethan, mit 1 M HCl auf pH 8,2 eingestellt, versetzt und 18 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Die so hergestellte Amino-Sepharose 4B wird mit physiologischer phosphatgepufferter Kochsalzlösung (phosphate buffered saline, PBS) gewaschen und kann in PBS mit einem Zusatz von 0,05% Natriumazid bei 2-8°C aufbewahrt werden.
Zur weiteren Verarbeitung wird die Amino-Sepharose 4B mit dem 50fachen Volumen 0,1 M Natriumphosphat pH 8,0 gewaschen und mit dem 2fachen Volumen einer Mischung aus 50% (v/v) Dimethylsulfoxid und 50% (v/v) 0,1 M Natriumphosphat pH 8,0 resuspendiert. Der pH-Wert wird nötigenfalls durch Zugabe von 1 M NaOH nachgestellt. Dann wird je 1 ml Amino-Sepharose 4B eine Lösung von 10 mg m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimid in 0,2 ml Dimethylsulfoxid zugegeben und der Reaktionsansatz 18 h bei Raumtemperatur geschüttelt.
Die m-Maleimidobenzoyl-Sepharose 4B wird unmittelbar vor der Weiterverarbeitung mit dem 10fachen Volumen Dimethylsulfoxid gewaschen und in 0,1 M Natriumphosphat pH 6,5 resuspendiert.
Arbeitsschritt 2
Für die Kopplung an m-Maleimidobenzoyl-Sepharose 4B werden vorzugsweise in IgY-F(ab') (spezifisch gegen humanes Immunglobulin) wie nachstehend beschrieben zusätzliche Sulfhydryl-Gruppen eingeführt.
Dazu wird an Sepharose 4B gekoppeltes humanes Immunglobulin bis zur maximalen Beladung in einer Lösung aus IgY-F(ab') inkubiert.
Die mit IgY-F(ab') beladene Matrix wird mit PBS gewaschen, in einen alkalischen Puffer wie z. B. Triethylamin-HCl-Puffer pH 8,0 (50 mM Triethylamin, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA-Na2) umgepuffert und im 2fachen Volumen desselben Puffers resuspendiert. Die Suspension wird unter N2-Atmosphäre mit 2-Iminothiolan-HCl (Traut'sches Reagenz, Jue, R. et al. 1978) versetzt, dessen molare Menge vorzugsweise dem 8fachen der vorliegenden Menge an gebundenem IgY-F(ab') entspricht.
Nach 1 h Reaktion unter N2-Begasung bei Raumtemperatur wird die mit IgY-F(ab') beladene Matrix mit 0,1 M Natriumphosphat pH 6,5, vorbegast mit N2, gespült. Anschließend werden die mit 2-Iminothiolan derivatisierten IgY-F(ab') (IgY-F(ab')-SH) mit 0,1 M Natriumphosphat-HCl pH 2,5 (mit N2 vorbegast) von der Matrix eluiert.
Das Eluat wird mit 0,5 M Natriumphosphat pH 9,1, vorbegast mit N2, auf pH 6,5 gebracht und sofort für die Kopplung an die m-Maleimidobenzoyl-Sepharose 4B eingesetzt.
Arbeitsschritt 3
Entsprechend der gewünschten Beladung wird ein definiertes Volumen der vorbereiteten IgY-F(ab')-SH-Lösung mit einem definiertem Volumen der vorbereiteten m-Maleimidobenzoyl-Sepharose 4B gemischt. Der Ansatz wird 18 h bei 2-8°C geschüttelt. Nicht gebundenes IgY-F(ab')-SH wird danach mit 0,1 M Natriumphosphat pH 6,5 eluiert. Aus der Quantifizierung der Restmenge IgY-F(ab')-SH kann auf die Menge des gekoppelten IgY-F(ab')-SH und damit auf die Beladung der m-Maleimidobenzoyl-Sepharose 4B (mg Protein/ml Gel) geschlossen werden.
Zur Abreaktion überschüssiger reaktiver Gruppen wird die m-Maleimidoben­ zoyl-Sepharose 4B mit dem 2fachen Volumen 0,1 M Cystein-HCl in 0,1 M Natriumphosphat pH 6,5 versetzt und 2 h bei Raumtemperatur geschüttelt.
Anschließend wird das Kopplungsprodukt (IgY-F(ab')-SH/S 4B) mit dem 50fachen Volumen 0,1 M Natriumbicarbonat pH 8,2 enthaltend 0,5 M NaCl und dem 50fachen Volumen 0,1 M Glycin-HCl pH 2,5 gewaschen. Zur Lagerung bei 2-8°C wird es in PBS mit 0,05% Natriumazid umgepuffert.
Arbeitsschritt 4
Auf Säulen mit jeweils 1 ml des Kopplungsproduktes wird Humanserum im Überschuß aufgetragen, um die maximale Beladung zu erreichen.
Nach einer Spülung der Säule mit PBS wird das gebundene humane Immunglobulin mit 0,1 M Glycin-HCl-Puffer eluiert.
Nach anschließender Neutralisation mit 2 M Tris wird die Menge des eluierten Proteins spektrophotometrisch bestimmt und seine Identität (<90% humanes Immunglobulin) im ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) bestätigt.
Der Quotient aus der Menge an eluiertem humanen Immunglobulin und dem Volumen des Kopplungsproduktes wird als Bindungskapazität bezeichnet (mg Human-IgG/ml Gel).
Arbeitsschritt 5
Das in den Arbeitsschritten 1 bis 4 beschriebene Verfahren wird auch auf die Kopplung von IgY an Sepharose 4B angewandt (Kopplungsprodukt IgY-SH/S 4B).
Arbeitsschritt 6
Zum Vergleich der Bindungskapazitäten wird IgY ohne vorhergehende Derivatisierung an bromcyanaktivierte Sepharose 4B gekoppelt.
Dazu wird getrocknete bromcyanaktivierte Sepharose 4B in 1 mM HCl suspendiert und mit dem 70fachen Volumen 1 mM HCl gewaschen. Gereinigtes IgY wird in 0,1 M Natriumbicarbonat pH 8,2 enthaltend 0,5 M NaCl umgepuffert. Ein definiertes Aliquot der Lösung wird mit einem definierten Volumen der vorbereiteten Matrix gemischt und 18 h bei 2-8°C geschüttelt. Nicht gebundenes IgY wird danach mit dem Kopplungspuffer eluiert. Aus der Quantifizierung der Restmenge IgY kann auf die Menge des gekoppelten IgY und damit auf die Beladung der Sepharose (mg Protein/ml Gel) geschlossen werden.
Zur Abreaktion überschüssiger reaktiver Gruppen wird das Kopplungsprodukt mit dem 2fachen Volumen 0,1 M Ethanolamin-HCl pH 8,0 versetzt und 2 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach einer anschließenden Wäsche mit dem 50fachen Volumen 0,1 M Natriumbicarbonat pH 8,2/0,5 M NaCl und dem 50fachen Volumen 0,1 M Glycin-HCl pH 2,5 wird es in PBS mit 0,05% Natriumazid umgepuffert und bei 2-8°C gelagert.
Jeweils 1 ml des Kopplungsproduktes (IgY/S 4B) wird wie in Arbeitsschritt 4 beschrieben getestet.
Ergebnisse
Ergebnisse der Kopplungen von komplettem IgY und den korrespondierenden IgY-(Fab')-Fragmenten sowie Vergleiche in Bezug auf die Bindungskapazität der daraus resultierenden Immunadsorptionsmaterialien sind in Tabelle 1 dargestellt.
Immunadsorptionsmaterialen auf der Basis von Sepharose 4B und konventionell mit BrCN durchgeführten Kopplungen von komplettem Igy-anti-Human-IgG erreichten Bindungskapazitäten von 0,23 bis 0,27 mg Human-IgG pro mg gebundenem IgY.
Die Bindungskapazität der korrespondierenden IgY-F(ab')-Fragmente, beide unter gleichen Bedingungen an Bromcyan-aktivierte Sepharose gekoppelt, ergaben unter Berücksichtigung der Test-bedingten Fehlerbreite die erwartete Erhöhung der Bindungskapazität. Ein Vergleich der Versuche 9 und 7 bzw. 8 und 6 in Tabelle 1 zeigt bei der Bindung von Human-IgG pro mg IgY-F(ab')-Fragment jeweils eine Erhöhung um ungefähr 1,7 gegenüber dem Wert des gekoppelten kompletten Immunglobulins (IgY).
Nach Derivatisierung von komplettem IgY mit Thiolgruppen unter Schutz der Antigenbindungsstelle und nachfolgender Kopplung an MBS-aktivierte Sepharose 4B konnte die Bindungskapazität des Immunadsorptionsmaterials bereits auf 0,30 mg bis 0,38 mg Human-IgG gesteigert werden.
Anhand der bisherigen Überlegungen wäre bei der Kopplungsmethode nach Schutz der Antigenbindungsstelle für das Immunadsorptionsmaterial mit F(ab')-Fragmenten eine Bindungskapazität von etwa 0,65 mg IgG pro mg gekoppeltem F(ab')-Fragment zu erwarten gewesen. Diese Erhöhungen entsprechen den Ergebnissen, die bei den Versuchen mit BrCN-aktivierter Sepharose gefunden wurden.
Überraschenderweise zeigte sich, daß die so mit den IgY-F(ab')-Fragmenten hergestellten Immunadsorptionsmaterialien mit 1,28 mg bis 1,48 mg eine wesentlich höhere Bindungskapazität aufwiesen.
Für die Anwendung in der Immunadsorption ergeben sich durch das erfindungsgemäße Kopplungsverfahren mit derivatisierten Antikörperfragmenten entscheidende Vorteile. Wie in Tabelle 1 dargestellt ist, können anhand des vorgestellten Ausführungsbeispiels Immunadsorptionsmaterialien hergestellt werden, die Bindungskapazitäten von über 19 mg Human-IgG pro ml Sepharose 4B aufweisen. (Siehe Versuch 3 in Tabelle 1). Diese Kapazität konnte mit herkömmlichen Kopplungsverfahren auch bei Einsatz weit höherer Konzentrationen an antigenbindenden Strukturen nicht erreicht werden. (Siehe Versuch 7 in Tabelle 1).
Diese Erhöhung der Bindungskapazität ermöglicht bei gegebener Kapazität eine Verringerung des Volumens einer Immunadsorptionssäule und erlaubt damit kürzere Zeiten beim Beladen mit dem Antigen, beim Spülen, beim Eluieren des Antigens und bei der Regeneration der Säule. Empfindliche Antigene werden durch die kürzere Verweilzeit im meist schädlichen Elutionspuffer geschont. Andererseits können bei einem gegebenen Säulenvolumen in gleicher Zeit größere Ausbeuten erzielt werden.
Die hier angewandte Methode der Kopplung von antigenbindenden Strukturen kann problemlos von der Sepharose auf andere Trägermaterialien übertragen werden.
Bei der Immunapherese zur Entfernung von Immunglobulinen oder auch LDL aus dem Blut von Patienten können die Behandlungszeiten verkürzt werden oder bei gleicher Behandlungszeit die Konzentrationen der zu entfernenden Substanz deutlich weiter abgesenkt werden.

Claims (15)

1. Verfahren zur Herstellung einer effektiven Immunadsorptionsmatrix, dadurch gekennzeichnet, daß man antigenbindende Strukturen unter Schutz der Antigenbindungsstelle mit funktionellen Gruppen, die sich zur Kopplung an eine chemisch aktivierte Matrix eignen oder selbst eine aktivierte Gruppe darstellen, derivatisiert und/oder aktiviert und nachfolgend an ein Trägermaterial koppelt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die antigenbindenden Strukturen vor ihrer Derivatisierung an eine polymere Matrix gebunden werden, an welches das Antigen kovalent gekoppelt ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die antigenbindenden Strukturen nach ihrer Derivatisierung an das Trägermaterial gekoppelt werden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Trägermaterialien verwendet werden, an welche die antigenbindenden Strukturen kovalent gebunden werden.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß Matrizes als Trägermaterial verwendet werden, welche aus organischen, anorganischen, synthetischen Polymeren oder aus Mischpolymeren bestehen die ggf. chemisch aktiviert werden.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als antigenbindende Strukturen F(ab')-Fragmente von Immunglobulinen, F(ab')2-Fragmente von Immunglobulinen, andere Fragmente von Immunglobulinen, Einzelkettenantikörper, synthetische Peptide, die eine Antigenbindungsstelle enthalten, oder Gemische davon, eingesetzt werden.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die F(ab')-Fragmente oder F(ab')2-Fragmente oder anderen Fragmente von Immunglobulinen, die eine Antigenbindungsstelle enthalten, aviären oder mammaliären Ursprungs, oder Mischungen aus beiden, sind.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Derivatisierung und/oder Aktivierung der zu koppelnden antigenbindenden Strukturen nach adsorptiver Bindung oder nach an das Antigen erfolgter Bindung zum Schutze der Antigenbindungsstelle durchgeführt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß als funktionelle Gruppen Sulfhydryl-, Amino- oder Carboxylgruppen eingeführt werden.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß F(ab')-Fragmente mit Sulfhydrylgruppen unter Schutz der Antigenbindungsstelle derivatisiert und anschließend an eine Maleimido-aktivierte Sepharosematrix gekoppelt werden.
11. Verwendung einer Immunadsorptionsmatrix hergestellt nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zu therapeutischen, diagnostischen, präparativen, analytischen und medizintechnischen Zwecken.
12. Immunadsorptionsmatrix gekennzeichnet durch ein an sich bekanntes Trägermaterial, das ggf. chemisch aktiviert vorliegt und an das mit funktionellen Gruppen derivatisierte antigenbindende Strukturen unter Erhalt der Antigenbindungsstelle gekoppelt sind.
13. Immunadsorptionsmatrix nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß antigenbindende Strukturen F(ab')-Fragmente von Immunglobulinen, F(ab')-Fragmente von Immunglobulinen, andere Fragmente von Immunglobulinen, Einzelkettenantikörper, synthetische Peptide, die eine Antigenbindungsstelle enthalten, oder Gemische davon sind, die mit Sulfhydryl-, Amino- oder Carboxylgruppen derivatisiert vorliegen.
14. Immunadsorptionsmatrix nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial aus organischen, anorganischen, synthetischen Polymeren oder aus Mischpolymeren besteht und ggf. chemisch aktiviert wurde.
15. Immunadsorptionsmatrix nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie IgY-F(ab')-Fragmente, die mit Sulfhydrylgruppen derivatisiert sind, und die gekoppelt an eine Maleimido-aktivierte Sepharosematrix sind, enthält.
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