BR102012018861A2 - Substrato,método de tratar uma amostra compreendendo pelo menos uma substância biológica com substrato e método para separar pelo menos uma substância de uma amostra líquida - Google Patents

Substrato,método de tratar uma amostra compreendendo pelo menos uma substância biológica com substrato e método para separar pelo menos uma substância de uma amostra líquida Download PDF

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Abstract

LIGANDOS EM MODO MISTURADO. Substratos compreendendo um suporte sólido, um ligando, e um ligante que compreendem pelo menos um átomo de C, O, N ou S covalentemente ligando o suporte sólido ao ligando, são divulgados, juntamente com métodos de uso e preparação dos substratos, e dispositivos incluindo os substratos.

Description

“SUBSTRATO, MÉTODO DE TRATAR UMA AMOSTRA COMPREENDENDO PELO MENOS UMA SUBSTÂNCIA BIOLÓGICA COM UM SUBSTRATO E MÉTODO PARA SEPARAR PELO MENOS UMA SUBSTÂNCIA DE UMA AMOSTRA LÍQUIDA” REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS Este pedido de patente reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório U.S.
No. 61/512,097, depositado em 27 de Julho 2011, que é aqui incorporado para referência.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se geralmente a materiais cromatográficos de interação de modo misto ou multi-modais. A necessidade crescente de quantidades em massa de 10 moléculas biologicamente relevantes (isto é, biomoléculas), tais como proteínas, gerou uma variedade de técnicas para o isolamento de tais biomoléculas a partir de isolados fisiológicos. Uma metodologia de separação de particular interesse é a cromatografia líquida.
Há uma necessidade na técnica para materiais cromatográficos de modo misto que exibem capacidade de ligação elevada, especificidade e recuperação, e que podem ser regenerados extensivamente sem degradação do desempenho cromatográfíco.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO De acordo com modalidades de substratos e métodos de uso de substratos de acordo com a invenção, as substâncias biológicas, tais como imunoglobulinas (de 20 preferência, anticorpos monoclonais), são de preferência ligadas, enquanto que não se ligam a agregados. Em algumas modalidades, as imunoglobulinas IgA e/ou IgM são seletivamente ligadas. Vantajosamente, as substâncias biológicas podem ser purificadas enquanto simultaneamente removem agregados, permitindo uma purificação de uma etapa e remoção de agregados.
Em uma modalidade, a presente invenção provê um substrato compreendendo um
suporte sólido, um ligante, e um ligador. Em algumas modalidades, o Iigador compreende pelo menos um átomo de C, O, N ou S ligando covalentemente o suporte sólido ao ligante. Em uma modalidade, o ligante tem a fórmula
representa um grupo aromático ou heteroaromático, que pode ser
opcicionalmente substituído. Em algumas modalidades, o grupo aromático ou heteroaromático pode ser monocíclico ou bicíclico, tendo de 5 a 12 átomos no sistema aromático, e compreendendo de 0 a 3 heteroátomos selecionados a partir de O, N, e S. Em algumas modalidades, o ligante tem fórmula selecionada a partir do grupo
consistindo em
NH2 H2N
, / O
-J—Ç-NH—J)—NH2 Ç-NH—-f— C-NH-<^ /J
O
Il
Il
SO3H S "
o /=J 1~c -J-c-νη^ Jknh2
o /=
-NH
COOH COOH H2N
\\ // ‘ NH2 H2N NO2
NH2 /
0 W 0 r=L
1 I //v\ ■ ■ / \
-|-C-NH^J>--^-C-NH^^NH2 -I-C-NH^ >-NH2 -J-C-NH
O >c=\
^-ΝΗΛ )
NH2
C-NH-
NH,
W
N
NH2
0 N=
<> " C-NH
^ /
N
NH5
-f—C-NH-
M
NH2
W
N
Cl
O N
^c-nhXji
NH,
0
-|—C-NH-
NH,
9 H=(
/ \ 4-c-nh-(\ n
H2N NH2 * ^ //
NH2
/
O NH2
ο V—/
-f-C-NH-^"^^
0
Il
-}-C-NH-^ j)—NH2
0
s 11
-J-C-NH
NH2
OH
OH
H2N
OH
H?N
OH
NH,
NH, 10
ο
-η-νηΛ /)
ο
/—NH O
/ \ 1/
/-\ / \
OH
H2N
ΗΝ=(
NH
NH,
/^OH C-NH
O
Il
HN μ
Η,N
C-NH
NH .0
OHi e Η2Ν
acima indicam a posição no Iigante na qual o Iigador está conectado. Em outras modalidades, o Iigante tem a fórmula
0 ' * ' -NH2
, em que
. A linha ondulada nas formulas
4-C-NH-(A)-f
representa um anel aromático ou heteroaromático selecionado a partir do grupo consistindo em fenila, piridila, pirimidinila, e naftila, opcionalmente substituído por O a 4 substituintes selecionados a partir do grupo consistindo em
-H1 -(C1-C6) alquila, halogênio, -OH, -O(Ci-C6) alquila, -COOH, -COO(C1-C6) alquila, -SO3H, -PO3H, -NO2, -NH2, Oh tTl H
-C -N H -C -(C , -C g) alquil—S (C ,-C6) alquil —C -NH - ç -(C, -C ejalquil - CO OH
COOH COOH
O -C-NH-C -(C ,-C s) alquil—f~V-OH
-C-NH COOH ; COOH ^-
0 °
-C-NH-(C rC6)alquil-COOH ^ C-NH COOH ^ -C-NH —(C ,-C6) alquil —^~^>-C00H
H S H
—N -^1-C -(C I-C6JaIquiI-S(C1-C6) alquil NH,
H
,N
o H í 7^\ ? H
-C -NH -Ç -(C ,-C ^alquil - JLJ) —c -NH -Ç -(C ,-C6) alquil
COOH COOH
O O COOH
H li H I
: -NH-C -C -N-C-(C ,-C6JaIquiI-SCC,-C6)aquil Cc I-cS^aIquiI -S(C ,-C6) alquil
Nh
" H ,-,Hu
: -NH-c -(C,- C6) alquil -n—c —n H2
COOH
J
O H Λ o H
-C -NH -C -(C ,-C gjalquil —*-NH —C -NH -ç -(C ,-C ^5) alquil -O H COOH e COOH
(A)
Em algumas modalidades, v^ representa fenila, piridila, or naftila,
opcionalmente substituído por O a 1 substituintes selecionados a partir do grupo consistindo
A
em -H1 -COOH, e -S03H. Em outras modalidades, v—representa fenila, opcionalmente substituído por O a 1 substituintes selecionados a partir do grupo consistindo em -H, -
®
COOH, e -S03H. Em modalidades adicionais, ^ representa fenila, opcionalmente substituído por O a 1 substituintes selecionados a partir do grupo consistindo em H O
C-NH-C-(ClC6)aIqul-S(Cl-C6) alquil
COOH
H
O H ^
—C -NH -C -(C ,-C6JaIquiI ■
COOH
-NH—(x ,V-TOOH
\s. if
Em ainda outras modalidades, a invenção provê um substrato tendo uma fórmula selecionada a partir do grupo:
.NH2
COOH
10
W
I
.o.
N N NH2
0 ΓΓ
N N H
COOH
NH2 OH
NH2 HiN
SCHq
NH
Nh2 HN^NH2
H °Η2ΝΎ^1 η ο
.Ο. ^ ,S. JL ΛΑ .Ν. 1
N ^ H' ^ OH
H
O , e
em que ο retângulo preto representa um suporte sólido.
A invenção também provê a separação de pelo menos uma substância de uma 5 amostra. Em uma modalidade, um método de tratar uma amostra compreendendo pelo menos uma substância biológica com um substrato compreende colocar o substrato em contato com a amostra por um período de tempo suficiente para permitir que pelo menos uma substância biológica na amostra se ligue ao substrato. Em uma modalidade preferida, o método compreende (a) colocar em contato um substrato de acordo com uma modalidade 10 da invenção, com uma amostra líquida que compreende pelo menos uma substância, em que a substância adsorve ao substrato, e (b) ajustar o pH, força iônica, ou ambos de tal forma que a substância seja dessorvida do substrato. Em uma modalidade típica, o método compreende ainda lavar o substrato obtido em (a) com um tampão de equilíbrio.
Em uma outra modalidade, um processo para tornar o substrato é provido, que 15 compreende ativar o suporte sólido colocando em contato o suporte sólido com uma funcionalidade de um reagente bifuncional que compreende parte ou a totalidade do Iigador para ligar o reagente ao suporte sólido. O suporte sólido ativado é subsequentemente reagido com um reagente que compreende o Iigante para formar uma ligação entre o Iigador e o ligante.
BREVE DESCRIÇÃO DAS VÁRIAS VISTAS DO(S) DESENHO (S)
A Figura 1 é um gráfico que mostra a densidade do ligante variada e capacidade de ligação dinâmica (DBC), utilizando um substrato de acordo com uma modalidade da invenção.
A Figura 2 é um gráfico que mostra a densidade do ligante variando e a obtenção de IgG puro usando um substrato com um ligante de para-fenilenodiamina (PDA) de acordo com uma modalidade da invenção.
A Figura 3 é um gráfico que mostra o efeito de valores de pH e da condutividade na capacidade de ligação dinâmica (DBC) a 10% em avanço da BSA (albumina de soro bovino) pura, utilizando um substrato de acordo com uma modalidade da invenção. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Modalidades da presente invenção proveem substratos que são adsorventes eficazes para o uso na separação e isolamento de uma variedade de substâncias, incluindo substâncias biológicas de interesse. Substratos de acordo com modalidades da invenção podem ser utilizados, por exemplo, em técnicas preparativas, tais como cromatografia em coluna.
Uma vantagem de uma modalidade do substrato aqui descrito é a sua alta seletividade e especificidade para as substâncias biológicas, tais como proteínas. Alternativa ou adicionalmente, uma outra vantagem é a alta capacidade de ligação da 10 molécula biológica de modalidades dos substratos presentes. Deste modo, é possível manipular volumes menores de uma amostra, reduzir o tempo de processamento e/ou processar uma grande quantidade de uma amostra por unidade de volume da coluna. Outra vantagem de modalidades da invenção é a seletividade do substrato para as proteínas na presença de agregados de proteínas. Isto pode permitir uma purificação de uma etapa e
remoção dos agregados das amostras de proteína. Além disso, os substratos podem ser preparados de forma custo eficaz.
O substrato compreende um suporte sólido e um ligante que é covalentemente ligado ao suporte sólido via um ligador. Em algumas modalidades, o Iigador compreende pelo menos um átomo de C, O, N, ou S.
Em uma modalidade, o ligante tem a fórmula:
representa um grupo aromático ou heteroaromático, que pode ser opcicionalmente substituído. Em algumas modalidades, o grupo aromático ou heteroaromático pode ser monocíclico ou bicíclico, tendo 5 a 12 átomos no sistema de anel, e compreendendo 0 a 3 heteroátomos selecionados a partir de O, N, e S.
Em algumas modalidades, o ligante tem a fórmula selecionada a partir do grupo
, em que
consistindo em
COOH
COOH
H9N CM CN CM j X X X -TT ■7 JL φ μ. Γι I CM T X X _L Z Z I I X 0=0 0=0 Z I 0=0 r
Z
X -<>
O=O
J CM X) Φ X I X 2 Z I 0=0 0=0 •/vj^v !λ|λ/ ; Z O
V
I
Z
I
0=0
•Λ^Λ/
X X
ZZZ
V
X
Z
I
0=0
-NH
*Τ) Λ/ljfV' O=O
I
Λ/|ν
0=0
I
/VjrVr
0=0
I
X
ro
/v>|rv/'
O=O
O
X
13/61 Ο.
O
Il
O
V-NH O O
υ .... r=\ ^ H
W HN
\\ // \ H2N H3CS
M
H2N
OH
SCH,
HN=(
NH
NH9
V-NH 0
-μ-ΝΗ-0 Hh . *
H2N HNs^n
OH < ^ NH9 N
A linha ondulada das fórmulas acima indica a posição do ligante na qual o Iigador está ligado.
Em outras modalidades, o ligante tem a fórmula:
O
K"' ίΑλ k,U-2
—IrC-NH—NH2
em que
representa um anel aromático ou heteroaromático selecionado a partir do grupo consistindo em fenila, piridila, pirimidinila, e naftila, opcionalmente substituído por O a 4 substituintes selecionados a partir do grupo consistindo em
-H, -(C1-C6) alquila, halogênio, -OH, -O(C1-C6) alquila, -COOH, -COO(C1-C6) alquila, -SO3H, -PO3H, -NO2, -NH2, C-NH-C -(C ,-C gpfc**-SCC rCg) alquil —C -NH -C -(C , -Ce)alquil -COOH
OOH , COOH
η H /— \
0 —C -NH-C-(C1-C6)alquil—4 ρ—'OH
-r -MM-A=I-COOH COOH
C-C^)) ° /=N ©
I NS // —c -NH-CC1-C Δ alquil —i N — COOH — \_Jf
0
—C-NH-C
0 M
-C -NH—CC ,-C6) alquil -CO OH ^ H ^J~C °°H
-C1 -N H-CC ,-C6) alcIuil ——C OOH
H
H ?i H 0H
-N-C-ç— CCI-C6JaIquiI -S(C,-C6JaIquiI -C-NH-C-(Cl-C6)aIquiI-
NH2 , COOH
0 .. 0 .. COOH
Ti
-NH-
C 00 H (c I-Ce) alquil-s(C rCs) alquil
0 η H NH ° H ífS
—C -NH-C -CC ,-C6)alquil-N-C-NH2 —C -NH-C-(C ,-C6)a|qUj| -^NH COOH , C00H β
0 H
C -NH-C —CC, -C g) aiqui—0 H C0 0H
Em algumas modalidades, representa fenila, piridila, or naftila,
opcionalmente substituído por O a 1 substituintes selecionados a partir do grupo consistindo
(A)
em -H1 -COOH, e -S03H. Em outras modalidades, v—representa fenila, opcionalmente substituído por O a 1 substituintes selecionados a partir do grupo consistindo em -H1 -
(A)
COOH, e -S03H. Em modalidades adicionais, representa fenila, opcionalmente
substituído por O a 1 substituintes selecionados a partir do grupo consistindo em ο
H
25
—C -NH — Ç (C I-C6)alquil—S(C ,-C6) COOH
alauila
o
Il
: -NH-
-C OOH Θ
O
Il
H
í
X
—C -NH -C -(C ,-C6) alquil COOH
O Iigante é covalentemente ligado ao ligador, que liga o Iigante ao suporte sólido. O Iigador pode reduzir impedimento estérico e aumentar a acessibilidade do Iigante para a substância a ser ligada. A ligação entre o Iigante e o ligador pode ser, por exemplo, uma 5 ligação de amida.
O ligador compreende tipicamente pelo menos um átomo de C, O, N, ou S. Em uma modalidade, o ligador compreende (CH2)mX(CH2)n 0u
(CH2)mX1(CH2)nX2(CH2)p em qUe χ e χ2 são cada um independentemente selecionados a partir de O, S, NH, e uma ligação covalente; e m, n, e p são cada um
10 independentemente 0, 1,2, 3, 4, 5, ou 6. Em outra modalidade, 1, 2, ou 3 dos átomos de H na fórmula acima podem ser substituídos por um número equivalente de grupos OH e/ou grupos metila.
Em uma modalidade, o ligador compreende uma estrutura selecionada a partir do
grupo:
R® Rb Rcx Rd R\/Ra .
e ;
em que cada um de X1 e X2 é independentemente selecionado a partir de O, S, e NH; e cada um de Ra, Rb, Re, e Rd é independentemente selecionado a partir de H, OH, e metila.
Em outra modalidade, o ligador compreende uma estrutura selecionada a partir do
20 grupo:
O ligador liga o Iigante a um suporte sólido. O suporte sólido pode ser da forma geralmente usada para os meios de cromatografia, por exemplo, grânulos porosos ou não porosos ou partículas irregulares, de, por exemplo, cerca de 0,1 pma cerca de 1000 μηη de diâmetro. Estes grânulos ou partículas podem ser derivatizados com a combinação Iigante e ligador. Os grânulos ou partículas podem prover um meio de cromatografia de que se pode usar para embalar uma coluna, por exemplo Alternativamente, em algumas modalidades, o suporte sólido compreende fibras, membranas, ou materiais semelhantes a esponjas permeados com aberturas ou poros em, por exemplo, tamanhos de mícron a multi- milímetro.
Suportes sólidos adequados são conhecidos na técnica. Em uma modalidade, o suporte sólido pode compreender um material orgânico. Exemplos de materiais orgânicos são polissacarídeos, tais como celulose, amido, ágar, agarose, e dextrano. Os polímeros sintéticos são contemplados, incluindo poliacrilamidas substituídas ou não substituídas, 10 polimetacrilamidas, poliacrilatos, polimetacrilatos, polímeros polivinílicos tais como álcool polivinílico, poliestireno, polissulfona, e copolímeros de estireno e divinilbenzeno, e suas misturas. Em uma outra modalidade, os materiais inorgânicos podem ser utilizados como o material de suporte sólido. Tais materiais inorgânicos incluem, mas não estão limitados a materiais minerais porosos, tais como sílica; hidrogel contendo sílica, zircônia, titânia, 15 alumina, e outros materiais cerâmicos. Também é possível utilizar misturas destes materiais, ou materiais compósitos formados por copolimerização de ou por uma rede interpenetrada de dois materiais, tais como aquelas descritas nas Patentes US 5,268,097; 5,234,991; e 5,075,371.
Em uma modalidade, o substrato inventivo exibe densidades de Iigantes (número 20 de Iigantes por volume de substrato) de pelo menos cerca de 20 μιτιοΙ / ml de substrato, pelo menos cerca de 30 μιτιοΙ / ml, ou pelo menos cerca de 40 μιτιοΙ / ml, ou pelo menos cerca de 50 μιτιοΙ / ml. Em algumas modalidades, a densidade de Iigante é menos do que cerca de 180 pmol / ml, por exemplo, menos do que cerca de 150 μιτιοΙ / ml, ou menos do que cerca de 100 μιτιοΙ / ml, ou menos do que cerca de 80 pmol / ml, ou menos do que 25 cerca de 60 μιτιοΙ / ml, ou menos do que cerca de 50 μητοΙ / ml. A densidade de Iigante pode estar na faixa de cerca de 20 μιτιοΙ / ml a cerca de 180 μιτιοΙ / ml, de cerca de 30 μιτιοΙ / ml a cerca de 150 μηηοΙ / ml, ou de cerca de 40 μηηοΙ / ml a cerca de 100 μιτιοΙ / ml, ou de cerca de 50 μιτιοΙ / ml a cerca de 80 μιτιοΙ / ml, ou de cerca de 30 μηηοΙ / ml a cerca de 60 μιτιοΙ / ml, ou de cerca de 50 μιτιοΙ / ml a cerca de 60 μιτιοΙ / ml.
Outras modalidades da invenção são mostradas abaixo. Aqui e no todo, um
retângulo preto em uma fórmula representa um suporte sólido.
Em ainda outras modalidades, a invenção provê um substrato que tem uma fórmula selecionada a partir do grupo: O .0.
'N'
H
NH5
Ν" NH2
H
.Ov
I
ο
N N NH2 H
NH,
N N
H
W0'
NH2
I
0 N^N
NH5
NH2
COOH
COOH
N N NH2 H Em outra modalidade, a presente invenção compreende uma coluna de cromatografia, compreendendo um membro tubular tendo uma extremidade de entrada e uma extremidade de saída e embalado com uma modalidade do substrato aqui descrito. O membro tubular pode ser feito de qualquer material adequado, tal como vidro, plástico, ou metal. O substrato embalado pode ser confinado em uma extremidade, ou sobre cada extremidade, por membros porosos dispostos dentro do membro tubular, o qual mantém o substrato fixado no interior do membro tubular. Em algumas modalidades, o fluxo de gravidade de um líquido através de uma coluna é suficiente, poi exemplo, para contatar um substrato com uma amostra líquida, fluido de lavagem, e/ou eluente. Em outras modalidades, a coluna pode compreender um ou mais fluidos dispositivos que se deslocam para atingir um fluxo ascendente ou descendente de fluido através da coluna. Tais dispositivos incluem bombas, injetores, e qualquer outro dispositivo tipicamente empregado em associação com o equipamento de cromatografia, tal como é conhecido na técnica.
A coluna de cromatografia pode ser de qualquer volume adequado. Por exemplo, separações sobre uma escala de laboratório podem justificar um volume de coluna tão pequeno como, por exemplo, cerca de 1 mililitro ou mesmo cerca de 1 microlitro. Purificação em grande escala e isolamento das substâncias biológicas podem ser realizados em colunas tão grandes como, por exemplo, cerca de 5000 litros. Volumes mais típicos são, por exemplo, entre 1 litro e 100 litros. A coluna é tubular em forma geral, mas não está de outro modo particularmente limitada em comprimento ou diâmetro. Dependendo do contexto em que a coluna é empregue, o diâmetro da coluna pode variar entre, por exemplo, cerca de 0,5 mm a cerca de 1000 mm. Além disso, o comprimento da coluna pode variar entre, por exemplo, cerca de 50 mm a cerca de 1000 mm. Assim, a invenção contempla colunas de uma variedade de dimensões e volumes correspondentes.
Em uma modalidade adicional, a invenção inclui um processo para preparar o substrato. O método compreende geralmente ativar o suporte sólido colocando-o em contato com uma funcionalidade de um reagente bifuncional que compreende parte ou a totalidade do ligador para ligar o reagente ao suporte sólido. O suporte sólido ativado é subsequentemente reagido com um reagente que compreende o Iigante para formar uma ligação entre o ligador e o ligante. O reagente bifuncional pode compreender pelo menos dois grupos funcionais, incluindo, mas não se limitando a cloro, bromo, iodo, epóxido, carboxila, éster, aldeído, cetona, amido, alquenila, ciano, e imino.
Outra modalidade da invenção é um método para a separação de pelo menos uma substância a partir de uma amostra. Em uma modalidade, um método de tratamento de uma amostra compreendendo pelo menos uma substância biológica com um substrato compreende colocar em contato um substrato de acordo com uma modalidade da invenção com a amostra por um período de tempo suficiente para permitir que a pelo menos uma substância biológica na amostra para se ligar ao substrato. Em uma modalidade preferida, o método compreende (a) colocar o substrato em contato com uma amostra líquida que compreende pelo menos uma substância, em que a substância adsorve ao substrato, e (b) ajustar o pH, força iônica, ou ambos de tal forma que a substância seja dessorvida do substrato. Em uma modalidade típica, o método compreende ainda a lavagem do substrato obtido em (a) com um tampão de equilíbrio.
Outra modalidade da invenção inclui um processo para a preparação do substrato. O Iigante descrito acima é quimicamente imobilizado sobre o suporte sólido através da 5 formação de ligações covalentes entre o suporte sólido e o ligador, e entre o ligador e o ligante. Tipicamente, o suporte sólido é primeiro tratado com um reagente bifuncional que serve para introduzir no suporte sólido grupos reativos que formam parte ou a totalidade do ligador. Para alguns suportes sólidos, tais como celulose, compósitos que contêm um hidrogel, ou outros materiais que apresentam grupos hidroxila, pode ser vantajoso 10 desprotonar os grupos hidroxila com uma fonte de hidróxido, por exemplo, antes da reação com um reagente bifuncional. O reagente bifuncional é capaz de reagir tanto com o suporte sólido quanto com os reagentes que contêm o ligante. Reagentes bifuncionais ilustrativos, que contêm os mesmos grupos funcionais ou diferentes, incluem, mas não estão limitados
a, epibromidrina epicloridrina, dibromo- e dicloropropanol, dibromobutano, etileno glicol diglicidiléter, butanodiol diglicidiléter, divinil sulfona, alilglicidiléter, e brometo de alila. Compostos heterofunctionais de alila, tais como brometo de alila, são os reagentes bifuncionais preferidos.
Uma vez funcionalizado, o suporte sólido é tipicamente subsequentemente lavado extensivamente com um ou mais solventes para remover o reagente bifuncional não reagido, os subprodutos da reação, ou ambos. Um solvente típico usado neste contexto é a água.
Os Iigantes podem ser introduzidos por meio de reagentes que reagem com os grupos funcionais apresentados pelo suporte sólido funcionalizado, tal como descrito acima. Os reagentes de Iigantes podem ser preparados por processos sintéticos conhecidos dos versados na técnica.
O emparelhamento particular de um reagente bifuncional com um reagente de ligante é guiado por químicas bem conhecidas. Por exemplo, suportes sólidos que são funcionalizados com epóxidos podem ser submetidos a reações com mercapto, hidróxi, ou amino, contendo reagentes para fornecer um substrato com grupos de ligação contendo 30 etileno. Outros suportes sólidos que são modificados com brometo de alila, por exemplo, grupos alqueno presentes, que podem ser reagidos diretamente com reagentes contendo mercapto, proporcionando assim Iigantes que contêm átomos de enxofre. Alternativamente, os grupos alqueno podem adicionalmente ser brominados para prover derivados de bromo reativos adequadamente. Em um outro método ilustrativo, um suporte sólido pode ser 35 deixado reagir com um reagente bifuncional contendo enxofre, tais como divinilsulfona (DVS). Neste exemplo, o reagente compreendendo o ligante precisa apenas reagir com o grupo vinila apresentado pelo suporte sólido ativado por DVS.
Em uma via alternativa, um suporte sólido, ativado como descrito acima, pode ser tratado com um reagente bifuncional intermediário. O produto desta reação pode 5 subsequentemente ser tratado com um reagente compreendendo o ligante. Um exemplo ilustrativo a este respeito é a reação entre um suporte sólido ativado por alila, como descrito acima, com ácido mercaptohexanoico. Os grupos carboxila pendentes resultantes pode ser reagidos com qualquer reagente de ligante conveniente que porta, por exemplo, uma amina primária. Em modalidades que utilizam esta metodologia, pode ser necessário utilizar 10 reagentes de acoplamento tais como N-etoxicarbonil-2-etóxi-1,2-di-hidroquinolina (EEDQ) ou carbodiimidas vulgarmente conhecidas tais como diciclohexilcarbodiimida (DCC), 1-etil- 3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), N, N'-diisopropilcarbodiimida (DIC), ou 4- (4,6- dimetóxi-1,3,5-triazin-2-íl)-4-metilmorfolinio (DM-TMM).
A concentração do ligador imobilizado e do ligante pode variar, como é conhecido 15 na técnica entre, por exemplo, uma fração de um micromol a várias centenas de micromoles por mililitro de suporte sólido, dependendo da concentração do reagente bifuncional usado para fazer o suporte sólido. Baixas concentrações do grupo imobilizado resultam tipicamente na baixa capacidade de separação do material cromatográfico, enquanto que concentrações elevadas conduzem geralmente a capacidade aumentada.
Em certas modalidades, o substrato da presente invenção pode ser usado para
separar e, se desejado, purificar, uma variedade de substâncias, incluindo moléculas biologicamente relevantes e substâncias biológicas, tais como anticorpos, proteínas, glicoproteínas, proteínas de fusão, proteínas recombinantes, proteínas rotuladas, enzimas e catalisadores biológicos, peptídeos, células, bactérias, vírus, partículas semelhantes a vírus 25 (VLPs), vacinas, ácidos nucléicos, carboidratos, e lípidos. Outras substâncias que são adequadas para a separação (e, se desejado, purificação) incluem oligo e polissacáridos, lipopolissacáridos, polipeptídeos, e polímeros sintéticos solúveis. As substâncias biológicas tipicamente se derivam a partir de, ou estão contidas em, fontes, incluindo, mas não limitadas a, amostras líquidas, tais como saliva, fluído biológico, urina, fluido linfático, fluido 30 prostático, fluido seminal, leite, soro de leite, extratos orgânicos, extratos vegetais, extratos celulares, culturas de células (incluindo linhagens de células), caldos de fermentação, soro, líquido de ascite e extratos de plantas transgênicas e animais. Como aqui utilizado, um fluido biológico inclui qualquer fluido tratado ou não tratado associado com organismos vivos, particularmente sangue, incluindo sangue inteiro, sangue quente ou frio, sangue do 35 cordão umbilical, e sangue armazenado ou fresco; sangue tratado, tal como sangue diluído com pelo menos uma solução fisiológica, incluindo, mas não se limitando a, soro fisiológico, I 25/61
nutrientes, e/ou soluções anticoagulantes; componentes do sangue, tais como concentrado de plaquetas (PC), plasma rico em plaquetas (PRP), plasma pobre em plaquetas (PPP), plasma livre de plaquetas, plasma, plasma fresco congelado (FFP), os componentes obtidos a partir de plasma, glóbulos vermelhos embalados (RPC), materiais de zona de transição ou 5 revestimentos de buffy (BC), produtos do sangue provenientes de sangue ou um componente do sangue ou derivado de medula óssea, leucócitos, células-tronco; células vermelhas separadas do plasma e ressuspensas em uma solução fisiológica ou um fluido crioprotetor; e plaquetas separadas do plasma e ressuspensas em uma solução fisiológica ou um fluido crioprotetor. Um fluido biológico inclui também uma solução fisiológica 10 compreendendo um aspirado de medula óssea. O fluido biológico pode ter sido tratado para remover alguns dos leucócitos antes de serem utilizados de acordo com a invenção. Produto de sangue ou fluido biológico refere-se aos componentes acima descritos, e com produtos sanguíneos semelhantes ou fluidos biológicos obtidos por outros meios e com propriedades semelhantes.
Neste contexto, uma classe particularmente preferida de substâncias biológicas é
imunoglobulinas. A categoria das "imunoglobulinas” engloba imunoglobulinas inteiras, incluindo anticorpos monoclonais e policlonais, bem como Fab, F(ab')2, fragmentos de Fc e Fv, e outras espécies de anticorpos de engenharia. Em uma modalidade, a imunoglobulina pode ser imunoglobulina G (IgG). Alternativa ou adicionalmente, um ou mais de qualquer 20 dos seguintes: IgA, IgM, IgD e IgE, pode ser ligado. Em algumas modalidades, IgA e/ou IgM são selectivamente ligados.
A separação cromatográfica de acordo com modalidades da invenção pode incluir, por exemplo, substratos compreendendo resinas cromatográficas de permuta iônica e cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), incluindo resinas, em algumas modalidades, 25 as que podem funcionar sob pH fisiológico e/ou força iônica. O substrato da invenção pode ser usado para separar substâncias de acordo com uma variedade de métodos, incluindo, por exemplo, os divulgados na Publicação Internacional No WO 2005/073711. Uma amostra líquida contendo uma ou mais substâncias biológicas é colocada em contato com uma modalidade do substrato da presente invenção durante um período de tempo suficiente para 30 permitir que pelo menos uma substância biológica seja ligada ao substrato. Tipicamente, o período de contato é entre cerca de 30 segundos a cerca de 12 horas.
Uma modalidade de um método de tratamento de uma amostra compreendendo pelo menos uma substância biológica compreende o contato de uma modalidade do substrato com a amostra por um período de tempo suficiente para permitir que pelo menos uma substância biológica na amostra se ligue ao substrato. Em uma outra modalidade, um método para a separação de pelo menos uma substância de uma amostra líquida compreende o contato de uma modalidade do substrato com uma amostra líquida compreendendo pelo menos uma substância, em que a substância adsorve ao substrato; e ajustar o pH, força iônica, ou ambos, de tal forma que a substância seja dessorvida do substrato.
Em uma modalidade do método, pelo menos uma substância compreende um anticorpo, por exemplo, IgG, IgA, ou um fragmento de anticorpo do mesmo.
Em algumas modalidades do método, a amostra compreende um fluido biológico, por exemplo, mas não limitado a, o plasma.
Em uma modalidade preferida do método, o substrato é disposto em uma coluna, e o método compreende fazer passar a amostra através da coluna.
Se necessário, o pH, força iônica, ou ambos, da amostra líquida pode ser ajustado antes do contato da amostra com o substrato. Adicional ou alternativamente, a amostra pode ser concentrada, diluída, ou misturada com aditivos, tal como sais. Os valores de pH de captura típicos para uma faixa de proteínas é de cerca de 4 a cerca de 10, embora o pH de captura possa ser maior ou menor. Tipicamente, um pH na faixa de cerca de 4 a cerca de 8 promove a adsorção de proteínas a esses substratos que incluem uma porção de permuta catiônica, ao passo que um pH na faixa de cerca de 6 a cerca de 10 irá realizar o mesmo, onde porções de permuta aniônica são utilizadas. Em algumas modalidades, o substrato pode ligar proteínas a um pH de cerca de 5,5; ou a um pH de cerca de 7,2; ou a um pH de cerca de 8,0. No entanto, o substrato pode ligar proteínas a um pH superior ou inferior.
Os substratos da invenção não são limitados pela força iônica da amostra, e podem ser usados com as amostras de baixas e altas forças iônicas. Muitas substâncias biológicas serão prontamente adsorvidas aos substratos em força iônica fisiológica. Força iônica fisiológica varia tipicamente de cerca de 15 a cerca de 20 mS / cm, embora a força iônica possa ser maior ou menor do que esses valores. Concentrações típicas de sal que correspondem a esta gama caem dentro de cerca de 0,1 a cerca de 0,2 M, de preferência de 0,14 a cerca de 0,17 M.
A temperatura à qual a amostra líquida é colocada em contato com o substrato varia entre amostras e um dado material cromatográfico como é conhecido na técnica. De preferência, a temperatura é ambiente, mas pode ser superior ou inferior à ambiente.
Depois de a amostra ser colocada em contato com o substrato, o substrato é de preferência lavado com um tampão de equilíbrio, como é conhecido na técnica. Um tampão de equilíbrio é um tampão que é de preferência do pH ao qual a amostra líquida foi colocada em contato com o substrato. Além disso, o tampão de equilíbrio lava a partir das substâncias de substrato que não adsorvem ao substrato. Tampões de equilíbrio adequados são conhecidos na técnica, e incluem, por exemplo, tampão de acetato e tampão de fosfato salino. A lavagem pode ser realizada por banhos, imersão, ou por imersão do substrato com a substância biológica ligada no tampão de equilíbrio. Alternativa 5 ou adicionalmente, o tampão de equilíbrio pode ser lavado, pulverizado, ou lavado sobre o substrato.
A substância biológica desejada é tipicamente uma que adsorve ao substrato. Em outras modalidades, a substância biológica de interesse pode ser removida na, por exemplo, lavagem de tampão de equilíbrio. Neste caso, a substância pode ser isolada do 10 tampão por métodos conhecidos na técnica. Em uma outra modalidade, a substância biológica desejada não adsorve ao substrato, mas a impureza a ser removidao adsorve ao substrato. Neste caso, a substância biológica desejada pode ser recuperada do tampão de tampão de carga ou lavagem por métodos conhecidos na técnica.
Substâncias biológicas que são adsorvidas ao substrato são subsequentemente 15 dessorvidas em uma modalidade, ajustando o pH para um valor em que a substância é dessorvida. O pH ao qual ocorre a dessorção dependerá da substância e de um determinado substrato. Por exemplo, para substratos que compreendem uma porção de permuta de ânions, a dessorção ocorre tipicamente ao longo de um gradiente de pH a partir de cerca de pH 8 e diminuindo a cerca de pH 3. Para substratos que compreendem uma 20 porção de permuta catiônica, o gradiente de pH aplicado geralmente começa a cerca de pH
4 e é aumentado para cerca de pH 11. Para substratos que possuem grupos hidrofóbicos principalmente, o gradiente de pH para a dessorção começa tipicamente a cerca de pH 7 e é reduzido para cerca de pH 3. Para substratos que possuem grupos hidrofóbicos principalmente, de preferência um gradiente de força iônica é também aplicado como 25 descrito abaixo. O pH pode ser ajustado por qualquer reagente habitualmente disponíveis, tais como soluções aquosas de Tris-HCI ou tampões de carbonato.
Em alguns casos, como mencionado acima, o ajuste da força iônica eluente pode aumentar a eficácia do substrato. Assim, para substratos que compreendem grupos hidrofóbicos principalmente, a força iônica pode ser diminuída concomitantemente com o 30 pH. Isto é especialmente verdade para os materiais que adicionalmente compreendem porções -NH-, o que pode dar origem a leves cargas iônicas que se tornam mais eficaz conforme a força iônica é diminuída. A utilização de gradientes de sal é bem conhecida na técnica. Tipicamente, as concentrações de sal para o substrato presente não tem de ser superior a cerca de 1,0 M, ou cerca de 0,5 M.
Tipicamente, a substância biológica dessorvida é subsequentemente recolhida, e
pode ser ainda processada, se desejado. Purezas típicas de substâncias biológicas, tais como anticorpos, que são purificados de acordo com modalidades da invenção são cerca de 70% ou mais. em algumas modalidades de cerca de 85% ou mais. e mais preferivelmente cerca de 90% a cerca de 99%.
Em algumas modalidades, o substrato da invenção pode ser usado para purificar substâncias biológicas e, simultaneamente, remover agregados, permitindo purificação de única etapa e remoção de agregados. Em algumas modalidades, o substrato preferencialmente se liga a substâncias biológicas, tais como imunoglobulinas (anticorpos monoclonais de preferência), embora não se ligando a agregados. Assim, uma amostra compreendendo uma substância biológica a ser purificada, pode ser colocada em contato com o substrato, como descrito acima, a substância biológica irá ser adsorvida ao substrato, e as impurezas e os agregados irão passar. A substância biológica purificada pode subsequentemente ser dessorvida e recolhida como descrito acima. Em algumas modalidades, as quantidades de agregados na substância biológica purificada são menos do que, por exemplo, cerca de 10%, tal como menos do que cerca de 5%, ou menos do que cerca de 2%, ou menos do que cerca de 1 %.
Muitas das modalidades acima mencionadas compreendem colocar uma solução contendo as substâncias biológicas em contato com o substrato, e seletivamente adsorver pelo menos uma substância biológica na solução pelo substrato. No caso de a substância (s) biológica (s) desejada (s) a ser(em) ligada(s) ao substrato, a eluição do último permite 20 que ela (s) seja(m) separada(s) e recolhida(s) em uma forma purificada e concentrada. Se a substância biológica desejada permanece na solução tratada (as outras substâncias biológicas sendo ligadas ao substrato), em seguida, a separação desejada pode ser obtida diretamente recolhendo o eluente.
Preferivelmente, os substratos de acordo com modalidades da invenção podem ser regenerados repetidamente sem degradação. Regeneração pode ser efetuada por procedimentos conhecidos dos versados na técnica. Por exemplo, após o uso, o substrato pode ser colocado em contato com uma solução de regeneração, tal como hidróxido de sódio aquoso. Em uma modalidade, o substrato é colocado em contato com cinco volumes de coluna de NaOH a 1M, para um tempo de contato mínimo de 30 minutos. Alternativa ou adicionalmente, substrato pode ser colocado em contato com uma solução ácida, tal como ácido clorídrico aquoso ou ácido acético aquoso. Em uma modalidade, o substrato é colocado em contato com cinco volumes de coluna de HCI a 0,1 M ou 0,1 M em ácido acético, por um tempo de contato mínimo de 30 minutos. Alternativa ou adicionalmente, substrato pode ser colocado em contato com uma solução de sal, tal como cloreto de sódio aquoso. Em uma modalidade, o substrato é colocado em contato com cinco volumes de coluna de NaCI a 1M, por um tempo de contato mínimo de 30 minutos. Antes de reutilização, o substrato é de preferência lavado com tampão de equilíbrio. O tempo de contato e a composição e concentração da solução de regeneração (s) pode ser selecionado por um versado na técnica com base na natureza do ligando e na composição da matéria-prima para assegurar que a regeneração seja eficiente.
Os métodos de separação ilustrativos descritos acima podem ser utilizados em
uma variedade de técnicas, incluindo, por exemplo, métodos preparativos que empregam leito fixo, leito fluidizado, e cromatografias em batelada. Alternativamente, os métodos podem ser praticados, por exemplo, no contexto de técnicas de elevada capacidade de separação que utilizam, por exemplo, menores dispositivos, tais como colunas de spin ou 10 formatos de placa de múltiplos poços, onde os volumes de dispositivo podem ser tão pequenos quanto alguns microlitros.
Ao se utilizar adsorção / separação em batelada, o substrato pode ser adicionado diretamente à solução de substâncias biológicas, e o substrato / mistura de substância biológica é tipicamente agitado suavemente durante um tempo suficiente para permitir que 15 as substâncias biológicas se liguem ao substrato. O substrato, com substâncias biológicas adsorvidas, pode ser subsequentemente removido por, por exemplo, centrifugação ou filtração, e as substâncias biológicas subsequentemente eluídas a partir do substrato em uma etapap separada.
Em uma outra modalidade, a cromatografia de coluna pode ser usada. Na cromatografia de coluna de leito fixo, o substrato é empacotado em uma coluna e a solução que contém as substâncias biológicas a ser separada é aplicada ao substrato vertendo-o através do substrato a uma taxa que permite que as substâncias biológicas se liguem ao substrato.
Em cromatografia de coluna de leito fluidizado, um fluxo de filtração subindo e 25 partículas grandes / densas são utilizados a fim de manter o equilíbrio contra as forças ascendentes. Uma coluna essencialmente vertical, tipicamente composta dentre 1 e 5 fases colocadas uma em cima da outra, é utilizada, e a solução sucessivamente passa através de cada fase e é retirada por um excesso da parte superior da fase superior. Preferivelmente, a coluna tem três fases. Cada fase, com a exceção da mais alta, é separada por dois 30 sistemas de distribuição, uma distribuição da solução na base da fase em questão, a outra distribuindo a solução para a fase localizada imediatamente acima.
Em uma modalidade, uma coluna compreendendo o substrato presente pode ser usada em conjunto com colunas compreendendo outros substratos, o que seria eficaz na eliminação de impurezas diferentes de uma amostra. Assim, uma ou mais vantagens da presente coluna podem ser vistas como sendo complementares às características de outras colunas ou colunas convencionais. Neste contexto, um tal arranjo em tandem de colunas iria conservar eluentes e tampão de equilíbrio, reduzindo assim, se não eliminar, a necessidade de manipulação e preparação de amostra adicional.
Os exemplos seguintes adicionalmente ilustram a invenção, mas, é claro, não devem ser interpretados como limitando de qualquer modo o seu escopo.
EXEMPL01
Este exemplo demonstra um processo para a síntese de um reagente ligante de 2 (3 - (terc-butoxicarbonilamino) -5 - (isopropoxicarbonilamino) benzamido)acetato de metila.
Cloridrato de metil éster de glicina (675 mg, 5 mmoles) é dissolvido em DMF (15 ml) e hidroxibenzotriazol (HOBt) (675 mg, 5 mmol), ácido 3 - (terc-butoxicarbonilamino) -5 - 10 (isopropoxicarbonilamino) benzóico (1,76 g, 5 mmoles) são adicionados. A mistura de reação é arrefecida até 0 0C e N, N'-diisopropilcarbodiimida (DIC) (1,54 mL, 10 mmoles) é adicionado lentamente. A mistura de reação é adicionalmente agitada a 0 0C durante 5 minutos e à temperatura ambiente durante a noite. Água (100 ml) é adicionada e a agitação continua durante mais 20 minutos, seguida pela adição de acetato de etila (100 ml). O 15 produto bruto é agitado durante um adicional de 5 minutos, e a camada orgânica é separada. A fase aquosa é adicionalmente extraída com 2 x 70 ml de acetato de etila, e a fase orgânica combinada é lavada com água, seca com Na2S04 e concentrada sob vácuo.
^cAnh
A cromatografia em coluna com gel de sílica em acetato de etila / hexano 1:1 rende 1,65 g, 3,9 mmoles de sólido branco, rendimento de 78%. 1H RMN (CDCI3) δ: 7,72 (s, 1H, aromático), 7,50 (s, 2H, aromático), 6,50 (s, 1H, amida), 6,60 (s, 2H, amida), 4,22 (dd, 2H,), 3,80 (s, 3H), 1,55 (s, 18H). LCMS (modo íon: ESI) m / z [M-H+] calculado 422,20, encontrado 422,00, [M + Na]+ 466,07.
EXEMPLO 2
Este exemplo demonstra um processo para a preparação de um derivado de para-
fenilenodiamina (PDA) de celulose.
100 ml de uma pasta fluida a 50% de grânulos de celulose são lavados extensivamente com uma solução de hidróxido de sódio a 1M e depois com água até pH neutro ser obtido. Para os 50 ml de grânulos drenados são adicionados 50 ml de solução de 30 hidróxido de sódio a pH 11-12 e 5 ml de ácido cloroacético. A mistura resultante é então agitada durante 24 h à 60 0C. A mistura de reação é deixada arrefecer até a temperatura ambiente, lavada para remover o ácido cloroacético que não reagiu e depois neutralizada. A densidade de COOH foi de 60 pmol / ml de grânulos e é determinada por titulação ácido-base para a fixação de várias funcionalidades.
ml dos grânulos de carboximetilcelulose a 60 pmol / ml de COOH são acoplados com N-Boc-p- fenilenodiamina (0,374 g, 1,8 mmol, 3 equivalentes) na presença de EDC (2,1 mmoles) em tampão MES a 0,1 M a pH 4,7. A mistura de reação é lavada para remover o excesso de Boc-p- fenilenodiamina e os produtos secundários. O grupo protetor Boc é removido com HCI a 3 M para dar o material mostrado abaixo:
determinada por análise elementar de nitrogênio. O produto é armazenado a 4-8 0C como uma pasta fluida a 50% em salina tamponada de fosfato (PBS) a pH 7.
EXEMPLO 3
Este exemplo demonstra um processo para a preparação de um derivado de para- fenilenodiamina (PDA) de celulose com um ligador contendo enxofre.
100 g de grânulos de celulose reticulados, secos por sucção em uma torta úmida,
são misturados com água (75 g), NaOH a 32% (19,5 g), e brometo de alila (18,75 g). A mistura é vertida durante 24 horas à temperatura ambiente.
Os grânulos são extensivamente lavados para remover o brometo de alila que não reagiu e derivados, obtendo-se alil-celulose como um substrato para a fixação de várias funcionalidades.
100 g de grânulos de alil-celulose, secos por sucção em uma torta úmida, são misturados com água (99 g) e ácido 2-mercaptoacético (1,0 g) a pH 11-12 e a mistura é tombada durante 48 h à temperatura ambiente. O derivado de carboxila resultante é lavado para remover os produtos secundários, obtendo-se ácido ativado de celulose como um 25 substrato para a fixação de várias funcionalidades. A densidade do ácido é determinada para ser 90 pmol / ml de grânulos por meio de análise elementar.
10,0 ml de uma pasta fluida a 50% dos grânulos ativados por ácido obtidos é então condensado com (0,562 g, 2,7 mmoles, 3 equivalentes) de Boc-p-fenilenodiamina em tampão MES a 0,1 M, pH 4,7, na presença de EDC (3 equivalentes). A mistura de reação é 30 agitada durante 12 h à temperatura ambiente. A mistura é lavada extensivamente para remover a Boc-p-fenilenodiamina que não reagiu e os produtos secundários da reação. O grupo protetor Boc é removido com HCI a 3M para dar o material mostrado abaixo:
O produto é branco, e a densidade do ligante foi de 40 pmol / ml de grânulos, NH2
N
H
O produto é branco, e a densidade do ligante p-fenilenodiamina é 78 pmol / ml de grânulos, determinada por análise elementar de nitrogênio. O produto pode ser armazenado a 4 a 0C como uma pasta fluida a 50% em tampão PBS a pH 7.
Este exemplo demonstra um processo para a preparação de um derivado de meta- fenilenodiamina de celulose com um ligador contendo enxofre.
ml de uma pasta fluida a 50% de grânulos de celulose ativados por ácido obtidos de acordo com o protocolo descrito acima no Exemplo 3 são condensados com (0,562 g, 2,7 mmoles, 3 equivalentes) de N-Boc-m-fenilenodiamina em tampão MES a 0,1 M a pH 4,7 na presença de EDC (3 equivalentes). O grupo protetor Boc é removido com HCI a 3M para dar o material mostrado abaixo:
O produto é branco. A densidade de ligante é 62 pmol / ml de grânulos, determinada por análise elementar de nitrogênio. O produto pode ser armazenado a 4-8 0C como uma pasta fluida a 50% em tampão PBS a pH 7.
O mesmo produto é preparado por acoplamento de m-fenilenodiamina em vez de N-Boc-m-fenilenodiamina, e a densidade de ligante é 64 μιτιοΙ / ml de grânulos.
EXEMPLO 5
Este exemplo demonstra um processo para a preparação de um derivado de orto-
fenilenodiamina de celulose com um ligador contendo enxofre.
10 ml de uma pasta fluida a 50% de grânulos de celulose ativados por ácido obtidos de acordo com o protocolo descrito acima no Exemplo 3 são condensados com (0,562 g, 2,7 mmoles, 3 equivalentes) de Boc-o-fenilenodiamina em tampão MES a 0,1 Ma 25 pH 4,7 na presença de EDC (3 equivalentes). A mistura de reação é agitada durante 24 h á temperatura ambiente. A mistura é lavada extensivamente para remover o Boc-o- fenilenodiamina que não reagiu e os produtos secundários da reação. O grupo protetor Boc é removido com HCI a 3M para dar o material mostrado abaixo:
5
EXEMPLO 4 O produto é branco e a densidade de ligante foi de 40 pmol / ml de grânulos, determinada por análise elementar. O produto é armazenado como uma pasta fluida a 50% em tampão PBS a pH 7.
EXEMPLO 6
Este exemplo demonstra um processo para a preparação de um derivado de 4,6-
diaminopirimidina de celulose com um ligador contendo enxofre.
10 ml de uma pasta fluida a 50% de grânulos de celulose ativados por ácido obtidos de acordo com o protocolo descrito acima no Exemplo 3 são condensados com (0,395 g, 2,7 mmoles, 3 equivalentes) de cloridrato de 4,6 diaminopirimidina em tampão 10 MES a 0,1 M a pH 4,7 na presença de EDC (3 equivalentes), durante 12 h à temperatura ambiente. O produto é lavado para remover a 4,6- diaminopirimidina que não reagiu, e os produtos secundários.
O N^N
Os grânulos derivatizados com a 4,6-diaminopirimidina são brancos. A densidade de ligante é determinada como sendo 30 μιτιοΙ / ml de grânulos. Os grânulos podem ser armazenados a 4-8 0C como uma pasta fluida a 50% em tampão PBS a pH 7.
EXEMPLO 7
Este exemplo demonstra um processo para a preparação de um derivado de 2,4,6- triaminopirimidina de celulose com um ligador contendo enxofre.
10 ml de uma pasta fluida a 50% de grânulos de celulose ativados por ácido
obtidos de acordo com o protocolo descrito acima no Exemplo 3 são lavados cuidadosamente com água para remover a solução de armazenamento e, em seguida, com tampão MES a 0,1 M a pH 4,7. Em seguida, os grânulos são misturados com 3,5 mmoleses de 2,4,6- triaminopirimidina dissolvidos em MES a 0,1 M (3 ml) e HCI a 2 M (1,75 ml), 25 seguido pela adição de EDC (1,5 mmol). A mistura de reação é tombada à temperatura ambiente durante três horas, e limpa extensivamente para remover os reagentes não reagidos e produtos secundários.
O produto é branco corci uma densidade de ligante de 30 pmol / ml de grânulos, determinada por análise elementar. O produto é armazenado como uma pasta fluida a 50% em tampão PBS a pH 7.
EXEMPLO 8 Este exemplo demonstra um processo para a preparação de um derivado de 1,5- diaminonaftaleno de celulose com um ligador contendo enxofre
10 ml de uma pasta fluida a 50% de grânulos de celulose ativados por ácido obtidos de acordo com o protocolo descrito acima no Exemplo 3 são condensados com 5 (0,427 g, 2,7 mmoles, 3 equivalentes) de 1,5 diaminonaftaleno em uma mistura de metanol e tampão MES a 0,1 M a pH 4,7 na presença de EDC (3 equivalentes), durante 12 h à temperatura ambiente. O produto é então lavado extensivamente para remover diamina não reagida e produtos secundários.
ligante é determinada por análise elementar para ser 41 μιτιοΙ / ml de grânulos. O produto é estável e pode ser armazenado a 4-8 0C como uma pasta fluida a 50% em tampão PBS a pH 7.
diaminopiridina de celulose com um ligador contendo enxofre.
ml de uma pasta fluida a 50% de grânulos de celulose ativados por ácido obtidos de acordo com o protocolo descrito acima no Exemplo 3 são condensados com (0,491 g, 3 mmoles, 3 equivalentes) dicloridrato de 2,5-diaminopiridina, em tampão MES a 0,1 M a pH 4,7 na presença de EDC (5 equivalentes). O produto é lavado extensivamente para remover os reagentes não reagidos e produtos secundários.
Os grânulos derivatizados com a 2,5-diaminopiridina são brancos. A densidade de ligante é 58 μιτιοΙ / ml de grânulos, determinada por análise elementar. O produto pode ser armazenado a 4-8 0C como uma pasta fluida a 50% em tampão PBS a pH 7.
EXEMPLO 10
Este exemplo demonstra um processo para a preparação de um derivado de 2,4,6- trimetil-1 ,3-benzenodiamina de celulose com um ligador contendo enxofre.
ml de uma pasta fluida a 50% de grânulos de celulose ativados por ácido obtidos de acordo com o protocolo descrito acima no Exemplo 3 são condensados com (0,405 g, 2,7 mmoles, 3 equivalentes) de 2,4,6-trimetil-1, 3-benzenodiamina em uma mistura
10
Os grânulos derivatizados por 1,5-diaminonaftaleno são rosados. A densidade de
EXEMPLO 9
15
Este exemplo demonstra um processo para a preparação de um derivado de 2,5- de metanol e tampão MES a 0,1 M a pH 4,7 na presença de EDC (3 equivalentes). O produto é lavado para remover os produtos secundários e os reagentes não reagidos.
Os grânulos derivatizados com 2,4,6-trimetil-1 ,3-benzenodiamina são brancos. A densidade de ligante é 72 pmol / ml de grânulos, determinada por análise elementar.
Este exemplo demonstra um processo para a preparação de um derivado de tetrametil-p-fenilenodiamina de celulose com um ligador contendo enxofre.
10 ml de uma pasta fluida a 50% de grânulos de celulose ativados por ácido obtidos de acordo com o protocolo descrito acima no Exemplo 3 são lavados cuidadosamente com água para remover a solução de armazenamento e, em seguida, com tampão MES a 0,1 M a pH 4,7. 2,3,5,6-tetrametiM ,4-fenilenodiamina (4,0 mmoles) dissolvidos em metanol (4 ml) é adicionado, seguido pela adição de EDC (4,0 mmoles) dissolvidos em MES a 0,1 M para os grânulos. Os grânulos são tombados durante a noite e lavados extensivamente para remover o excesso de diamina e de produtos secundários.
O produto é branco com uma densidade de ligante de 65 μηιοΙ / ml de grânulos, determinada por análise elementar. O produto é armazenado como uma pasta fluida a 50% em tampão PBS a pH 7.
Este exemplo demonstra um processo para preparar um derivado de ácido 3,5- diaminobenzóico de celulose com um ligador contendo enxofre.
10 ml de uma pasta fluida a 50% de grânulos de celulose ativados por ácido obtidos de acordo com o protocolo descrito acima no Exemplo 3 são condensados com (0,486 g, 2,7 mmoles, 3 equivalentes) de etil éster de ácido 3,5 diaminobenzóico em uma mistura 1:1 de metanol e tampão MES a 0,1 M a pH 4,7 na presença de EDC (3 equivalentes). A saponificação é então realizada utilizando NaOH a 1 M á temperatura ambiente durante 12 h para dar o produto mostrado abaixo:
EXEMPLO 11
EXEMPLO 12
COOH Os grânulos derivatizados com este ácido diaminobenzóico são esbranquiçados. A densidade de ligante é 40 μιηοΙ / ml de grânulos, determinada por análise elementar.
EXEMPLO 13
Este exemplo demonstra um processo para preparar um derivado de 2-metóxi-5- terc-butil-1,3-benzenodiamina de celulose com um ligador contendo enxofre.
10 ml de uma pasta fluida a 50% de grânulos de celulose ativados por ácido obtidos de acordo com o protocolo descrito acima no Exemplo 3 são lavados cuidadosamente com água para remover a solução de armazenamento e, em seguida, com tampão MES a 0,1 M a pH 4,7. 4-terc-butil-2, 6 diaminoanisol (4,0 mmoles) dissolvidos em 10 metanol (4 ml) é adicionado, seguido pela adição de EDC (4,0 mmoles) dissolvidos em MES a 0,1 M. Os grânulos são tombados durante a noite e lavados extensivamente para remover o excesso de diamina e de produtos secundários.
Este exemplo demonstra um processo para a preparação de um derivado de 2,6- diaminopiridina de celulose com um ligado contendo enxofre.
5,0 ml de uma pasta fluida a 50% de grânulos de celulose ativados por ácido 20 obtidos de acordo com o protocolo descrito acima no Exemplo 3 são lavados cuidadosamente com água para remover a solução de armazenamento e, em seguida, com tampão MES a 0,1 M a pH 4,7. Os grânulos são misturados com 2,6-diaminopiridina (382 mg, 3,5 mmoleses) dissolvidos em MES a 0,1 M (2 ml) e HCI a 2 M (1,75 ml). EDC (306 mg, 1,6 mmol) dissolvidos em MES a 0,1 M (1,5 ml) foi adicionado. Os grânulos são tombados 25 durante a noite à temperatura ambiente e lavados extensivamente para remover os reagentes não reagidos e produtos secundários.
úmidos através de análise elementar. O produto é branco e pode ser armazenado como uma pasta fluida a 50% em tampão PBS a pH 7.
Densidade do ligante acoplado é determinada para ser de 26 μιτιοΙ / ml de grânulos EXEMPLO 15
Este exemplo demonstra um processo para preparar um derivado de 4-nitro-1,2- fenilendiamina de celulose com um ligador contendo enxofre.
6,0 ml de uma pasta fluida a 50% de grânulos de celulose ativados por ácido 5 obtidos de acordo com o protocolo descrito acima no Exemplo 3 são lavados cuidadosamente com água para remover a solução de armazenamento e, em seguida, com tampão MES a 0,1 M a pH 4,7. 4-nitro-1,2-fenilendiamina (2,4 mmoles) dissolvidos em metanol (4 ml) é adicionado, seguido pela adição de EDC (2,4 mmoles, 458 mg) dissolvidos em MES a 0,1 M (2 ml). Os grânulos são tombados durante a noite e lavados 10 extensivamente para remover os reagentes não reagidos e produtos secundários.
NO2
NH2
O produto final é laranja e pode ser armazenado como uma pasta fluida a 50% em tampão PBS a pH 7.
EXEMPLO 16
Este exemplo demonstra um processo para a preparação de um derivado de 4,5,6-
triaminopirimidina de celulose com um ligador contendo enxofre.
5,0 ml de uma pasta fluida a 50% de grânulos de celulose ativados por ácido obtidos de acordo com o protocolo descrito acima no Exemplo 3 são lavados cuidadosamente com água para remover a solução de armazenamento e, em seguida, com
tampão MES a 0,1 M a pH 4,7. Sulfato de 4,5,6 triaminopirimidina-(3,2 mmoles, 702 mg) suspenso em MES a 0,1 M (4 ml) é adicionado, seguido pela adição de EDC (1,5 mmol, 280 mg) dissolvidos em MES a 0,1 M (1 ml). A mistura de reação é tombada durante três horas e lavada extensivamente para remover os reagentes não reagidos e produtos secundários.
O N^N
NH2
NH2
O produto final é branco e pode ser armazenado como uma pasta fluida a 50% em
tampão PBS a pH 7.
EXEMPLO 17
Este exemplo demonstra um processo para preparar um derivado de 4-cloro-2,6- diaminopiridina de celulose com um ligador contendo enxofre.
5,0 ml de uma pasta fluida a 50% de grânulos de celulose ativados por ácido
obtidos de acordo com o protocolo descrito acima no Exemplo 3 são lavados cuidadosamente com água para remover a solução de armazenamento e, em seguida, com tampão MES a 0,1 M a pH 4,7 Os grânulos são misturados com 4 cloro-2 ,6-diaminopiridina (3,5 mmoles) dissolvidos em MES a 0,1 M (3 ml) e HCI a 2 M (1,75 ml), seguido pela adição de EDC (1,5 mmol). A mistura de reação é então tombada à temperatura ambiente durante 5 três horas, e lavada extensivamente para remover os reagentes não reagidos e produtos secundários.
O produto final é branco e pode ser armazenado como uma pasta fluida a 50% em tampão PBS a pH 7.
Este exemplo demonstra um processo para a preparação de um derivado de 2,4- diaminopirimidina de celulose com um ligador contendo enxofre.
10,0 mL de uma pasta fluida a 50% de grânulos de celulose ativados por ácido obtidos de acordo com o protocolo descrito acima no Exemplo 3 são lavados 15 cuidadosamente com água para remover a solução de armazenamento e, em seguida, com tampão MES a 0,1 M a pH 4,7. Os grânulos são então misturados com 2,4 diaminopirimidina (7,0 mmoles) dissolvidos em MES a 0,1 M (6 ml) e HCI a 2 M (3,5 ml), seguido pela adição de EDC (3,0 mmoles). A mistura de reação é tombada à temperatura ambiente durante três horas, e lavada extensivamente para remover o excesso de 20 reagentes e produtos secundários.
O produto final é branco e pode ser armazenado como uma pasta fluida a 50% em tampão PBS a pH 7.
2,5-diaminobenzeno sulfônico de celulose com um ligador contendo enxofre.
5,0 ml de uma pasta fluida a 50% de grânulos de celulose ativados por ácido obtidos de acordo com o protocolo descrito acima no Exemplo 3 são lavados cuidadosamente com água para remover a solução de armazenamento e, em seguida, com 30 tampão MES a 0,1 M a pH 4,7. Os grânulos são, então, misturados com ácido 2,5 diaminobenzeno sulfônico (300 mg, 1,6 mmol) dissolvidos em MES a 0,1 M (3 ml) e 1 M de NaOH (1,5 ml), seguido pela adição de EDC (306 mg, 1,6 mmol) dissolvidos em MES a 0,1
Cl
10
EXEMPLO 18
r
25
EXEMPLO 19
Este exemplo demonstra um processo para a preparação de um derivado de ácido M (2 mi). Os grânulos são tombados à temperatura ambiente durante 24 horas e lavados
extensivamente para remover o excesso de reagentes e produtos secundários.
SO3H .NH2
tf Γ Ii .0.
I
A densidade do ligante é determinada para ser de 28 pmol / ml de grânulos por análise elementar. O produto final pode ser armazenado como uma pasta fluida a 50% em tampão PBS a pH 7.
EXEMPLO 20
Este exemplo demonstra um processo para preparar um derivado de ácido 3,4- diaminobenzóico de celulose com um ligador contendo enxofre.
10 ml de uma pasta fluida a 50% de grânulos de celulose ativados por ácido
obtidos de acordo com o protocolo descrito acima no Exemplo 3 são condensados com (0,486 g, 2,7 mmoles, 3 equivalentes) de etil éster de ácido 3,4 diaminobenzóico em uma mistura 1:1 de metanol e tampão MES a 0,1 M a pH 4,7 na presença de EDC (3 equivalentes). A saponificação é então realizada utilizando NaOH a 1 M à temperatura ambiente durante 12 h para dar o produto mostrado abaixo:
COOH
NH2
Os grânulos derivatizados com este ácido diaminobenzóico são esbranquiçados. A densidade de ligante é 70 μιτιοΙ / ml de resina, determinada por análise elementar.
EXEMPLOS 21-45
Derivados de celulose com Iigadores contendo enxofre e Iigantes como mostrado
na Tabela 1, abaixo, são preparados de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 8, substituindo os reagentes Iigantes apropriados pelo ácido 2,5 diaminobenzeno sulfônico no Exemplo 19.
Tabela 1
Exemplo Ligante 21 ° rrNHz ■ 22
NH,
■ 23 ο Λτνη* |.o^sJLnV ■ H 24 Ψ O (J) U IZ v>i /- M o=\ O ZI CO O X CO i I ° O^OH 26 OH 0 °γΝΗ ■^o^^s^ANXj ■ H IiH2 27 OH 0 ο^'γ''·......'^'Oh 0Ynh !,VvsJI^XjIbh2 28 H0Voh Υύ ■ H L2 37 NH2 HN-( Λ ° O^OH 38 HN-("Λ Γη «η Η0 Ο^ΌΗ 39 NH2 r---Αώ/Λ 40 H 0°γ0Η 'V^^sch, ^0^^s^naJ SCH3 ■ Η 1NH2 41 ^v-VSxAnY Νη " Η Ahi ΗΝΛΝΗ2 42 °HiNY^l H 0 ■.°^3^νΛ^Ν^οη ■ H Π 43 Ι^^ΑΙ N Η Wi ---AV Y^) cAoH Ν 44 XZ O tJ0 ZX °1 cη I ο ■ EXEMPLO 46
Este exemplo demonstra um método para isolar e purificar IgG a partir de plasma humano em bruto utilizando um substrato sólido de acordo com uma modalidade da invenção.
Uma coluna de 1 ml é embalada com o substrato sólido preparado de acordo com
o Exemplo 3. O substrato sólido é equilibrado com um tampão de fosfato de sódio a 20 mM a pH 7,2.
Em seguida, uma amostra de 10 ml de plasma humano em bruto é diluída 1:1 em tampão de equilíbrio, filtrada através de membrana de 0,2 μΜ, e 12 ml são carregados diretamente sobre a coluna. A coluna é então lavada com 20 mM de fosfato tamponada 0,5 M de NaCI, a pH 7,2, para garantir a eliminação de proteínas, não-adsorvidas. Impurezas ligadas são removidos por lavagem da coluna com 20 mM de tampão de fosfato a pH 7,2.
O IgG desejado é eluído com 20 mM de tampão de acetato a pH 4,0. 25 mg de IgG é recolhido e sua pureza foi estimada como sendo > 99%.
EXEMPLO 47
Este exemplo demonstra um método para isolar e purificar IgG a partir de plasma usando um substrato sólido de acordo com outra modalidade da invenção.
Uma coluna de 1 ml é embalada com o substrato sólido preparado de acordo com o Exemplo 9. O substrato sólido é equilibrado com um tampão de fosfato de sódio a 20 mM a pH 7,4.
Em seguida, uma amostra de 10 ml de plasma humano é diluída 1:1 em tampão de equilíbrio, filtrada através de uma membrana de 0,2 μΜ, e 20 ml são carregados diretamente sobre a coluna. A coluna é então lavada com NaCI a 0,15 M tamponado com fosfato a 20 mM a pH 7,2, para garantir a eliminação de proteínas não adsorvidas. 25 Impurezas ligadas são removidas por lavagem da coluna com 20 mM de tampão de fosfato a pH 7,2.
O IgG desejado é eluido com 20 mM de tampão de acetato de sódio a pH 5,0. 35 mg do IgG desejado é recolhido e sua pureza foi estimada como sendo > 99%.
EXEMPLO 48 Este exemplo demonstra que boa capacidade de ligação dinâmica pode ser alcançada com diferentes densidades de ligantes, utilizando substratos de acordo com modalidades da invenção.
Substratos sólidos são preparados de acordo com o Exemplo 3, exceto que as condições de acoplamento de p-fenilenodiamina com os grânulos ativados por ácido ativado (mudando a estequiometria de fenilenodiamina e EDC em função da densidade de ácido) são variadas para produzir amostras com densidade de ligantes variando.
Capacidade de ligação da proteína dinâmica IgG (DBC) para cada amostra do substrato é determinada em um AKTA Explorer 100 LC Workstation (GE Healthcare Biosciences, Pittsburgh, PA), de acordo com as instruções do software UNICORN. As taxas de fluxo de equilíbrio e de lavagem são 1 ml / min, e a taxa de fluxo de carregamento é de
0,33 ml / min (3 min de tempo de residência). IgG humano é carregado para a 50% adiantado (BT). Coluna HR 5/5 (5 mm de diâmetro e 5 cm de comprimento, volume = 1 ml) de Amersham 18-0383-01 é utilizada para a embalagem de resina, e leitura A280 é determinada utilizando Ultraspec 1000. IgG Comercial (SeraCare Life Sciences, número de lote G111RM-25B0802) a uma concentração de 2,0 mg / ml é usado. Tampão de carregamento para IgG é em 20 mM de NaH2PO4, pH 7,2 e equilíbrio e tampão de lavagem é também em NaH2PO4, 20 mM a pH 7,2. Tampão de eluição é de 0,1 M de ácido acético, pH 3,1. Capacidade de ligação dinâmica da eluição é calculada medindo a quantidade de proteína em todas as frações de eluição. A recuperação é calculada usando a quantidade de proteína na eluição dividida pela proteína efetivamente ligada à coluna (a quantidade de proteína ligada à coluna = quantidade de proteína carregada para a coluna - proteína na descoberta e lavagem). Capacidade de ligação ao avanço de 10% é calculada usando a equação: (concentração de proteína na carga) * (Vi0%BT-VVOid)· O volume vazio do sistema e da coluna é medido por injeção de acetona a 1%.
A densidade de ligante e capacidade de ligação dinâmica de uma amostra de substrato são mostrados na Figura 1. O substrato testado mostra a boa capacidade de ligação dinâmica, mesmo em baixas densidades de ligantes de cerca de 50 pmol / ml ou maior.
EXEMPLO 49
Este exemplo demonstra que a densidade de ligante pode ser variada, enquanto ainda obtém IgG puro utilizando substratos de acordo com modalidades da invenção.
Substratos sólidos são preparados de acordo com o Exemplo 3, exceto que as condições de acoplamento de p-fenilenodiamina com os grânulos ativados por ácido (mudando a estequiometria de fenilenodiamina e EDC em função da densidade de ácido) são variadas para produzir amostras com diferentes densidades de ligante de p- fenilenodiamina (PDA). Cada amostra de substrato sólido é carregada para uma coluna separada e usada para purificar IgG a partir de plasma humano como descrito no Exemplo 46.
A pureza IgG obtida a partir de cada amostra de substrato é mostrada na Figura 2.
Mesmo em densidades de ligantes tão baixas como 35 μηηοΙ / ml, IgG é obtido com pureza de 99%. Não houve aumento significativo na pureza de IgG com uma densidade de ligante sendo observada para substratos com densidades de ligantes de 35 pmol / ml ou maior.
EXEMPLO 50
Este exemplo demonstra IgG de ligação em função do tempo de residência, utilizando substratos de acordo com modalidades da invenção.
Substratos sólidos são preparados de acordo com o Exemplo 3. Cada amostra de substrato sólido é carregada para uma coluna separada e usada para ligar IgG puro de acordo com o seguinte procedimento: 2 mg / ml de IgG em tampão de fosfato a pH 7,2 e uma condutividade de 6 mS / cm é carregado para cada coluna até os 50% de BT é 15 atingido. A coluna é então lavada com 0,5 M de NaCI para remover IgG adsorvido aos grânulos. O IgG é então eluído utilizando tampão de ácido acético a 0,1 M a pH 3,1.
A quantidade de IgG ligado e eluído em avanço a 10%, juntamente com a percentagem de recuperação, a pH 3, para cada tempo de residência testado é mostrada na Tabela 2. O substrato exibe alta capacidade de ligação em 6 min de tempo de residência, e a recuperação de IgG é elevada para tempos de residência diferentes.
Tabela 2
Tempo de residência Ligado (mg/ml) Eluído (mg/ml) Recuperação (%) (min) 3 24,4 23,5 96,3 4 31,0 29,6 95,5 6 40,9 37,7 92,3 EXEMPLO 51
Este exemplo demonstra o efeito do pH sobre a ligação de IgG e recuperação, usando substratos de acordo com modalidades da invenção.
Substratos sólidos foram preparados de acordo com o Exemplo 12. Cada amostra
de substrato sólido foi carregada para uma coluna separada e usada para purificar IgG a partir de plasma humano de acordo com o seguinte procedimento: 2 mg / ml de IgG em soluções de tampão com vários pH diferentes (5-8,5) (ver Tabela 2) e uma condutividade de
6 mS / cm, foi carregado para cada coluna até que o 10% de BT foi atingido. A coluna foi então lavada com 0,5 M de NaCI para remover IgG adsorvido aos grânulos. O IgG foi então eluido utilizando tampão de ácido acético a 0,1 M a pH 3,1
A quantidade de IgG ligada e eluída em avanço de 10%, juntamente com a percentagem de recuperação, para cada valor de pH testado é mostrada na Tabela 3. Em todos os valores de pH testados, pelo menos 98,8% do limite de IgG foi recuperado. pH 5,5 é o pH de carregamento ideal para este ligando.
Tabela 3
PH IgG ligado a 10% de IgG eluído a 10% de Recuperação (%) BT BT 5,0 19,2 19,2 100 5,5 25 24,8 99 6,0 24,3 24,0 98,8 7,2 19,1 19,0 -100 8,5 3 3 100 EXEMPLO 52
Este exemplo demonstra a reutilização de substratos para purificação de IgG a partir de plasma humano em bruto utilizando substratos de acordo com modalidades da invenção.
Um substrato sólido é preparado de acordo com o Exemplo 3 e é carregado em uma coluna e utilizado para tratar uma amostra de material biológico compreendendo IgG de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 46. Após eluição, o substrato sólido é 15 regenerado utilizando NaOH a 1 M a uma taxa de fluxo de 1 ml / minuto e novamente utilizado para tratar uma amostra de material biológico compreendendo IgG de acordo com o mesmo procedimento. O ciclo de regeneração e reutilização é repetido uma segunda vez, para três tratamentos totais de amostras biológicas.
A quantidade de ligação e pureza de IgG para cada ciclo é mostrada na Tabela 4. O substrato produz IgG de elevada pureza, mesmo após utilizações repetidas.
Tabela 4
Teste # Tempo de residência Ligação a partir de Pureza (%) (min) eluição (mg/ml) 1 3 25,1 98,3 2 3 22,0 99,4 3 6 23,0 99,7 EXEMPLO 53 Este exemplo demonstra a purificação de IgG a partir de plasma humano em bruto (3 minutos de tempo de residência), utilizando substratos de acordo com modalidades da invenção.
Substratos sólidos são preparados de acordo com os Exemplos 3, 4, 9, 10 e 11. Cada amostra de substrato sólido é carregada para uma coluna separada e usada para purificar IgG a partir de plasma humano como descrito no Exemplo 46.
A quantidade de IgG eluído e grau de pureza para cada substrato testado é mostrada na Tabela 5. Todos os substratos testaram rendimento de IgG de alta pureza.
Tabela 5
Ligante Eluição de IgG a partir Pureza (%) de plasma humano em bruto r_aNxr 25.5 mg/ml de resina >99 ■ CM 20 mg/ml de resina 91 0 ZX °1 CO ί O ■ CM 35 mg/ml de resina >99 b ZX °1 CO <: O Éi „ , S Ylf 9 mg/ml de resina >99 o yL"". 3 mg/ml de resina >99 EXEMPLO 54
Este exemplo demonstra ligação IgG puro e recuperação em avanço a 10% (3 minutos de tempo de residência), utilizando substratos de acordo com modalidades da invenção.
Substratos sólidos são preparados de acordo com os Exemplos 3, 10, 11 e 13. Cada amostra de substrato sólido é carregada para uma coluna separada e usada para ligar IgG puro, como descrito no Exemplo 50. A quantidade de IgG ligado e eluído em avanço a 10% e 3 minutos de tempo de residência, juntamente com a percentagem de recuperação, para cada substrato é mostrada na Tabela 6.
Tabela 6
Ligante Ligado Eluição Recuperação (mg/ml) (mg/ml) (%) ° ^NH2 24.9 23.7 95 |0^sJX(H! 26.4 24.2 91.3 Ο ΟγΝΗ, 21.5 19.8 92.3 . S JML 10 3.5 57 Z0 EXEMPLO 55
Este exemplo demonstra a ligação de Fab e recuperação em avanço a 10%, utilizando substratos de acordo com modalidades da invenção.
Substratos sólidos são preparados de acordo com os Exemplos 3, 4, 5 e 8. Cada amostra de substrato sólido é carregada para uma coluna separada e usada para ligar Fab 10 puro sob as seguintes condições: 0,5 mg / ml de solução de Fab em 100 mM de Tris-HCI, 10 mM de tampão de EDTA a pH 7,4 é carregado em cada coluna, até 10% de avanço ser atingido. As colunas são depois lavadas com o tampão de equilíbrio (100 mM de Tris-HCI 10 mM e EDTA a pH 7,4), e o Fab é eluído com 300 mM de tampão de glicina a pH 3.
A capacidade de ligação dinâmica do Fab (DBC) com avanço de 10% e 3 minutos de tempo de residência, juntamente com a recuperação percentual para cada substrato é mostrado na Tabela 7.
Tabela 7 Ligante DBC (mg/ml) Recuperação (%) ° nrNh2 10 83 24 81 ■ H NH2 0.4 90 23 55 EXEMPLO 56
Este exemplo demonstra ligação do anticorpo monoclonal contra o tempo de residência, utilizando substratos de acordo com modalidades da invenção.
Um substrato sólido é preparado de acordo com o Exemplo 3 e é carregado em
uma coluna e usado para ligar anticorpos monoclonais puros de acordo com o seguinte procedimento: 2 mg / ml de mAb em tampão de fosfato de sódio a pH 7,2 com uma condutividade de 6 ms / cm é carregado em cada coluna, até atingir avanço a 10% em tempos de residência diferentes. A coluna é lavada com 20 mM de tampão fosfato de sódio e 500 mM de NaCI, e o mAb é eluído com acetato de sódio 20 mM a pH 4,0.
As quantidades de anticorpos monoclonais que se ligam ao substrato e eluídas a partir do substrato, bem como a percentagem de recuperação são mostradas na Tabela 8.
O substrato exibe alta recuperação de anticorpos monoclonais em tempos de residência de curta duração.
Tabela 8
Tempo de residência Ligado (mg/ml) Eluído (mg/ml) Recuperação (%) (min) 3 41,0 40,3 98,2 4 46,7 46,5 99,6 6 62,0 58,3 94,0 EXEMPLO 57 Este exemplo demonstra ligação do anticorpo monoclonal contra o tempo de residência, utilizando substratos de acordo com modalidades da invenção.
Um substrato sólido é preparado de acordo com o Exemplo 20 e é carregado em uma coluna e usado para ligar anticorpos monoclonais puros de acordo com o seguinte 5 procedimento: 2 mg / ml de mAb em fosfato de sódio mais 150 mM de NaCI a pH 5,5 com uma condutividade de 15 mS / cm é carregado em cada coluna, até atingir avanço 10% em tempos de residência diferentes. A coluna é lavada com fosfato de sódio a 20 mM mais 150 mM de NaCI (com uma condutividade de 15 mS / cm), e o mAb é eluído com fosfato de sódio a 50 mM, mais 250 mM de NaCI (com uma condutividade de 25 mS / cm), a pH 8,0.
As quantidades de anticorpos monoclonais que se ligam ao substrato, bem como a
percentagem de recuperação são mostradas na Tabela 9. O substrato exibe alta recuperação de anticorpos monoclonais em tempos de residência de curta duração.
Tabela 9
Tempo de Residência (min) Ligado (mg/ml) Recuperação (%) 3 37.3 -98 4 47.0 -95 6 68.3 -92 EXEMPLO 58
Este exemplo demonstra ligação do anticorpo monoclonal e recuperação em
avanço 10% e um tempo de residência de 3 minutos, utilizando substratos de acordo com modalidades da invenção.
Substratos sólidos são preparados de acordo com os Exemplos 3, 4, 8 e 9. Cada amostra de substrato sólido é carregada para uma coluna separada e usada para tratar uma amostra de material biológico compreendendo anticorpos monoclonais como descrito no Exemplo 56.
A capacidade de ligação dinâmica do mAb (DBC) com avanço de 10% e 3 minutos de tempo de residência, juntamente com a recuperação percentual para cada substrato é mostrada na Tabela 10.
Tabela 10
Ligante DBC (mg/ml) Recuperação (Densidade de Ligante) (%) o s i rxNH2 41 >95 (78 gmol/ml) s ° O 39 >95 ■ ^ ^ ^ N' ^ NH2 (68 μηηοΙ/ml) [f^TNH2 35 83 (41 pmol/ml) s fYNH2 44.9 >94 (58 pmol/ml) EXEMPLO 59
Este exemplo demonstra a remoção de agregados utilizando substratos de acordo com modalidades da invenção.
Substratos sólidos são preparados de acordo com os Exemplos 4 e 5. Cada amostra de substrato sólido é carregada para uma coluna separada e usada para tratar uma amostra de material biológico compreendendo 75,5% de anticorpos monoclonais e 24,5% de agregados de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 56.
As quantidades de anticorpos monoclonais e agregados nas amostras após o tratamento com um substrato são mostradas na Tabela 11. Após o tratamento com o 10 substrato descrito no Exemplo 3, o produto resultante tem 91,9% de anticorpos monoclonais e 8,1% de agregados. Um aumento ainda maior na proporção de anticorpos monoclonais em comparação com agregados é observado para a amostra tratada com o substrato descrito no Exemplo 3, que tem 99,0% de anticorpos monoclonais e 1,0% de agregados após o tratamento.
Tabela 11
mAb (%) Agregados (%) Material mAb de partida 75.5 24.5 Carga a pH 7.4 e 15 mS/cm / Eluição a pH 4 91.9 8.1 Carga a pH 7.4 e 15 mS/cm / Eluição a pH 4 99.0 1.0 raâb(%) âgceaadas (%) Material deRârtótó 75.5 24.5 Carga apil7.4 e 15njS/cm/£lyjeâfia pH4 91.9 8.1 o f^Y^2 CargaaRH74 e 15mS/cm/EJujglQa pH4 990 10 j? f^j) EXEMPLO 60
Este exemplo demonstra capacidades de ligação estática de IgG utilizando substratos de acordo com modalidades da invenção.
Substratos sólidos são preparados de acordo com os Exemplos 3-12, 14, 15 e 19- 45. A análise de ligação estática de IgG é efetuada por dissolução de 27 mg de aproximadamente 94% de IgG puro humano Iiofilizado (SeraCare Life Sciences, número de lote G111RM-25B0802) em 10 ml de PBS para fazer 2,5 mg / ml de solução de IgG. Uma diluição em série da solução de IgG é preparada em duplicada, e a absorvância de UV é determinada a 280 nm. Os valores de absorvância são utilizados para traçar um gráfico em função das concentrações nominais, e a inclinação deste gráfico é usada para calcular as concentrações reais de IgG das diluições usando 1,43 como o coeficiente de extinção de IgG. 50 pL de 1:1 de pasta fluida de cada amostra de grânulos em PBS é pipetado em tubos de 1,5 ml de microcentrífuga separados em duplicado, e 1 ml de 2,5 mg / ml em PBS IgG é adicionado a cada tubo. Os tubos são rodados durante duas horas e centrifugados durante dois minutos. 120 pL de cada amostra é então pipetado em placas de 96 poços, e a absorvância de UV é lida a 280 nm.
A capacidade de ligação estática e a densidade de ligante para cada substrato são mostradas na Tabela 12. Os substratos apresentam alta capacidade de ligação estática mesmo em baixas densidades de ligando.
Tabela 12
Substrato Densidade de Capacidade de Ligante Ligação (pmol/ml) Estática (mg/ml) S λ rrNH2 78 94 CM I 62 93 0 ZI 0I CO 0 O Éi ■ H Ah2 40 77 NO2 ND 92 í.0 r---5^aV NH2 30 72 1 O N N ^ NH2 O N"^N 30 82 nh2 ^NH2 41 100 r-^4® s frm 58 95 ^°^3-Λ^Χη2 72 91 W 26 76 O \ CO IZ 0 Z I IO COOH 30 58 ο A ■ H COOH 70 100 ■ H L2 SO3H 28 51 ■ Ji^c 65 98 U H T s frNHz 54 40 |,o^sJlNÀNJ ■I H NH2 78 30 ■ w^xàr 85 35 ■ H NH2 61 70 r^asIÍVrr"‘ ° O^OH QH2N^. SCH3 103 88 ° O^OH O
H9N.
,SCH3
HG ^ ,S. ^ N. / 64 75 ■---r n 0O^OH OH 0 98 80 ΟγΝΗ ■ H Ah2 OH 0 94 78 0<ί^γ^ν'^^0Η O^NH |-o----s^ij ΑΛνη2 hV0H 72 90 0X^s m,o^^s^ANjÇ!l ■ H Jh2 OH 62 95 °Vn ΟγΝΗ I^oh S JML NH2 56 87 H ° O^OH NH2 60 40 r ^..jt,iiv«jd' ■ H0 NH2 70 82 rs r\ ^ M t |_| O ■ Η O NH2 134 90 ■.0^^δ^ΛΝΧίγΝ^Χ0Η ■ Η S NH2 65 65 “ O U^A^oh O X 49 55 O Í-(J° ZX °1 CO ί O ■ O^OH 55 60 Λ .SCH3 ■.0^^3^νΧΛνΛ^ ■ Η Η JlHi NH2 ΗΝ-Ζ^λ 110 95 mm,ο^^3ΜΝΧίγΝ^Γ ■ Η 5 X O^OH hnN^ 72 74 m * ι |^o^sJ1.nJVyY Η ο O^OH NH2 64 78 η °°r0H 68 72 cx ,n. A a 'T Y N ~ SCH3 i/A" !/O^svAnAJ SCH3 ■ H NH2 oXÂ 55 48 ^nh ■ H NH2 Λ 2 HN^NH2 o”2^ H O 92 85 0H2N_^ 46 60 CriOH N IZ O 65 82 CO ί O ■ í? fu 0H 61 76 ■ H L2 EXEMPLO 61
Este exemplo demonstra capacidades de ligação estática de BSA (albumina de soro bovino) utilizando substratos de acordo com modalidades da invenção.
Substratos sólidos são preparados de acordo com os Exemplos 22-26, 29-31, 34, 35, 37, 38, 41, 42, e 44. A análise de ligação estática de BSA é efetuada por dissolução de 22 mg de aproximadamente 96% de BSA puro em pó (Sigma Aldrich, número de lote 106K0687) em 10 ml de MES a 0,1 M a pH 4,7 para fazer uma solução de 2mg/ml de BSA. Uma diluição em série da solução de BSA é preparada em duplicada, e a absorvância de UV é determinada a 280 nm. Os valores de absorvância são utilizados para traçar um gráfico em função das concentrações nominais, e a inclinação deste gráfico é usada para calcular as concentrações de BSA reais das diluições usando 0,625 como o coeficiente de extinção de BSA. 50 μΙ_ de 1:1 de pasta fluida de cada amostra de grânulos em 0,1 M de MES a pH 4,7 é pipetado em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml separados em duplicado, e
1 ml de 2 mg / ml de BSA em 0,1 M de MES a pH 4,7 é adicionado a cada tubo. Os tubos são rodados durante duas horas e centrifugadas durante dois minutos. 120 μΐ_ de cada amostra é então pipetado em placas de 96 poços, e a absorvância de UV é lida a 280 nm.
A capacidade de ligação estática e a densidade de ligando para cada substrato são mostradas na Tabela 13. Os substratos apresentam alta capacidade de ligação estática mesmo em baixas densidades de ligando.
Tabela 13
Substrato Densidade de Capacidade de Ligante(pmol/ml) Ligação Estática (mg/ml) NH2 78 5 j fV ■1 H CM 85 5 -b ZI °1 CO j λ NH2 61 45 QTOtW oH2NYS h fSCH3 103 65 64 45 OH 0 98 50 -^oh ΟγΝΗ ■ H Ah2 OH 62 72 °γΝΗ 1^oh ο , ϊ Λ ■ H cU 56 60 XZ O °T CO ί O ■ NH2 60 50 ,^UUOjO^ ■ H § NH2 65 54 O ^X.OH O X 49 35 O Is iA ZX °1 CO i O ■ NH2 HnV^ 110 75 |.o^sjiní5yS^J ■ H o X OxOH 72 50 " H -2 HNANHz 55 55 0^nYY h o 92 50 tn^oh NH2 65 35 η ς S Λ ü H W ^rY> ° CJ^OH N EXEMPLO 62
Este exemplo demonstra o efeito de valores de pH e a condutividade de ligação
dinâmica de albumina de soro bovino pura (BSA) em avanço de 10%, utilizando substratos de acordo com modalidades da invenção.
Um substrato sólido é preparado de acordo com o Exemplo 20. Cada amostra de
substrato sólido é carregada para uma coluna separada e utilizada para determinar a capacidade de ligação dinâmica (DBC) de BSA de acordo com o seguinte procedimento: 2 mg / ml de BSA em soluções de tampão com vários pH diferentes (3,4-8,5) e condutividade variável (0-80 mS / cm) é carregado em cada coluna até que o avanço de 10% seja 10 alcançado (Figura 3). A coluna é então lavada com o tampão de carga (por exemplo, pH 4,7 e uma condutividade de 15 mS / cm) para remover BSA adsorvida no substrato. A BSA é então eluída utilizando 50 mM de tampão de fosfato de sódio a pH 8,0 e 250 mM de NaCI.
A quantidade de BSA ligada ao avanço de 10% para cada pH testado e combinação de condutividade é mostrada na Figura 3. Para valores de pH maiores do que 15 ou igual a 6,0, nenhuma ligação de BSA foi observada a condutividade superior a 5 mS / cm. A um pH 3,4, a capacidade de ligação a BSA aumenta com o aumento da condutividade. Para este ligante, pH 4,7 é o pH de carga ideal, com uma condutividade inferior a ou igual a 15 mS / cm. Todas as referências, incluindo as publicações, pedidos de patentes, e patentes, aqui citados são aqui incorporadas por referência na mesma medida como se cada referência fosse individualmente e especificamente indicada para ser incorporada por referência e fosse estabelecida na sua totalidade aqui.
O uso dos termos referentes "a/o", "um/uma" e "pelo menos um" e similares no
contexto da descrição da invenção (especialmente no contexto das reivindicações seguintes) devem ser interpretados no sentido de cobrir tanto o singular quanto o plural, salvo indicação em contrário neste documento ou em clara contradição com o contexto. O uso do termo "pelo menos um", seguido de uma lista de um ou mais itens (por exemplo, "pelo menos um de A e B") deve ser interpretado para significar um item selecionado a partir dos itens listados (A ou B) ou qualquer combinação de dois ou mais dos itens listados (A e B), a menos que indicado de outra forma aqui ou claramente contrariado pelo contexto. Os termos "compreendendo", "tendo", "incluindo" e "contendo" devem ser interpretados como termos de finalidade aberta (ou seja, que significa "incluindo, mas não limitado a"), salvo indicação em contrário. Recitação das faixas de valores aqui descritas é meramente destina a servir como um método de forma abreviada de se referir individualmente a cada valor separado estando dentro da faixa, a menos que indicado de outra forma aqui, e cada valor separado é incorporado na especificação como se fosse individualmente recitado aqui. Todos os métodos aqui descritos podem ser realizados em qualquer ordem apropriada, a menos que indicado de outra forma ou de outra forma aqui claramente contrariado pelo contexto. O uso de qualquer e todos os exemplos, ou linguagem exemplar (por exemplo, "tal como") previsto aqui, destina-se apenas a iluminar melhor a invenção e não representa uma limitação no escopo da invenção, salvo de outra maneira reivindicado. Nenhuma linguagem na especificação deve ser interpretada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da invenção.
As modalidades preferidas desta invenção são aqui descritas, incluindo o melhor modo conhecido pelos inventores para a realização da invenção. Variações das referidas modalidades preferidas podem tornar-se evidentes para os versados comuns na técnica após a leitura da descrição anterior. Os inventores esperam que os versados na técnica 30 empreguem tais variações, conforme apropriado, e os inventores pretendem que a invenção seja praticada, exceto quando especificamente aqui descrito. Assim, a presente invenção inclui todas as modificações e os equivalentes da material recitada nas reivindicações anexas, conforme permitido pela Iei aplicável. Além disso, qualquer combinação dos elementos descritos acima em todas as variações possíveis dos mesmos está englobada 35 pela invenção, a menos que indicado de outra forma ou de outra forma aqui claramente contrariado pelo contexto.

Claims (14)

1. Substrato CARACTERIZADO por compreender: (a) um suporte sólido: (b) um ligante de fórmula: <formula>formula see original document page 63</formula> (c) um ligador que compreende pelo menos um átomo de C, O, N ou S ligando covalentemente o suporte sólido ao ligante na posição indicada pela linha ondulada; onde: <formula>formula see original document page 63</formula> representa um anel aromático ou heteroaromático selecionado a partir do grupo consistindo em fenila, piridila, pirimidinila, e naftila, opcionalmente substituídas por0-4substituintes selecionados a partir do grupo consistindo em -H1 -(Ci-C6) alquila, halogênio, -OH, -O(C1-C6) alquila, -COOH, -COO(Ci-C6) alquila, -SO3H1-PO3H1-NO2, -NH2l <formula>formula see original document page 63</formula> <formula>formula see original document page 64</formula>
2. Substrato, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de representar fenila, piridila, ou naftila, opcionalmente substituídas por 0-1 substituintes selecionados a partir do grupo consistindo em -H1-COOH, e -SO3H.
3. Substrato, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de v— representar fenila, opcionalmente substituída por 0-1 substituintes selecionados a partir o grupo consistindo em -H1-COOH, e -SO3H.
4. Substrato, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de ® N— representar fenila, opcionalmente substituída por 0-1 substituintes selecionados a partir o grupo consistindo em: <formula>formula see original document page 64</formula>
5. Substrato, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato do ligante ter uma fórmula selecionada a partir do grupo consistindo em: <formula>formula see original document page 64</formula> <formula>formula see original document page 65</formula> <formula>formula see original document page 66</formula> <formula>formula see original document page 67</formula>
6. Substrato, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por ter uma fórmula selecionada a partir do grupo consistindo em: <formula>formula see original document page 67</formula> <formula>formula see original document page 68</formula> <formula>formula see original document page 69</formula> <formula>formula see original document page 70</formula> onde o retângulo preto representa o suporte sólido.
7. Método de tratar uma amostra compreendendo pelo menos uma substância biológica com um substrato conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1-6, CARACTERIZADO por compreender o contato do substrato com a amostra por um período de tempo suficiente para permitir que pelo menos uma substância biológica na amostra se ligue ao substrato.
8. Método para separar pelo menos uma substância de uma amostra líquida CARACTERIZADO por compreender o contato do substrato conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1-6 com uma amostra líquida, compreendendo pelo menos uma substância onde a substância adsorve ao substrato; e, ajustar o pH, a intensidade iônica, ou ambos, de tal forma que a substância seja dessorvida do substrato.
9. Método, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, CARACTERIZADO pelo fato de pelo menos uma substância compreender um anticorpo.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 - 9, CARACTERIZADO por compreender ligar seletivamente IgG, IgM e/ou IgA.
11. Método, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, CARACTERIZADO por compreender pelo menos uma substância que compreende um fragmento de anticorpo.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7-11, CARACTERIZADO pelo fato da amostra compreender um fluido biológico.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato da amostra compreender plasma.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7-13, CARACTERIZADO pelo fato do substrato ser disposto em uma coluna, e do método passar a amostra através da coluna.
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